DIAGNOSTYKA ENZYMOLOGICZNA

DIAGNOSTYKA ENZYMOLOGICZNA Badanie enzymów w płynach ustrojowych jest w przeważającej części przypadków badaniem pośrednim, gdyż właściwym miejscem działania tych enzymów są tkanki i narządy a nie krew, mocz, czy płyny z jam ciała. Enzymy przedostają się do płynów ustrojowych drogą naturalnego metabolizmu komórek i reutylizacji składników, głównie w wątrobie (Ryc.1). Nowoczesna diagnostyka enzymologiczna zakłada, że uszkodzenie narządu pociąga za sobą uszkodzenie struktur subkomórkowych lub/i zmiany przepuszczalności błon komórkowych. W tych warunkach dochodzi do ucieczki enzymów z tkanek do płynów ustrojowych, gdzie obserwowana jest ich zwiększona aktywność (lub zmniejszona, jeżeli uszkodzeniu ulega miejsce syntezy białka enzymatycznego). W oparciu o powyższe założenia, dokonano praktycznego podziału enzymów na 3 grupy, wiążąc ich miejsce występowania i rolę biologiczną ze znaczeniem diagnostycznym (Tab. I, Ryc.2). Ryc. 1. Drogi przechodzenia enzymów do płynów ustrojowych. Tabela I. Kliniczny podział enzymów Enzymy komórkowe (wskaźnikowe) sekrecyjne (wydzielnicze) Enzymy pozakomórkowe ekskrecyjne (wydalnicze, trawienne) LDH, AlAT, AspAT, CPK, GLDH, GGTP, fosfataza kwaśna i zasadowa L-CAT, pseudocholinesteraza, czynniki krzepnięcia krwi proteolityczne, lipolityczne, glikolityczne, nukleazy, fosfataza kwaśna i zasadowa

2 Enzymy wskaźnikowe (komórkowe): ich większa aktywność w płynach ustrojowych wskazuje na uszkodzenie narządu/tkanki i jest proporcjonalna do stopnia uszkodzenia (np. aminotransferazy ALT i AST w zapaleniu wątroby, LDH w zawale serca). Enzymy sekrecyjne (wydzielnicze): wytwarzane w komórkach wątroby, swoją rolę biologiczną spełniają w osoczu, np. czynniki krzepnięcia krwi. Uszkodzenie wątroby przez proces zapalny lub niedobór witaminy K, która jest koenzymem szlaku syntezy protrombiny i czynników VII, IX i X oraz białek C i S, powoduje spadek aktywności tych enzymów. Enzymy ekskrecyjne (wydalnicze): w warunkach prawidłowych obecne są w wydzielinach ustroju, np. żółci, ślinie, soku trzustkowym itp. W przypadku zaistnienia przeszkody w drogach odprowadzających wydzielinę i jej zastoju, enzymy wydalnicze pojawiają się w krwiobiegu (np. fosfataza zasadowa w przypadku zastoju żółci). Ryc. 2. Subkomórkowa lokalizacja enzymów o znaczeniu diagnostycznym.

3 Tabela II. Najważniejsze enzymy o znaczeniu klinicznym ENZYM GŁÓWNE ŹRÓDŁO DIAGNOSTYKA Aldolsaza Mięsnie szkieletowe, serce Choroby mięsni Amylaza Ślinianki, jajniki, trzustka Choroby trzustki ALT Wątroba, mięśnie szkieletowe, serce Choroby miąższu wątroby AST Cholinesteraza Dehydrogenaza mleczanowa Gammaglutamylotransferaza Wątroba, mięśnie szkieletowe, serce, nerki, erytrocyty Wątroba Erytrocyty, serce, wątroba, mięśnie Wątroba, nerki Choroby miąższu wątroby, mięśni, zawał serca Choroby miąższu wątroby, zatrucie pestycydami, grzybami Niedokrwistości hemolityczne, późny marker zawału serca Choroby dróg żółciowych, alkoholizm Fosfataza kwaśna Prostata, erytrocyty Rak prostaty Fosfataza zasadowa Kinaza kreatynowa Wątroba nerki, kości, nabłonek jelita Mięśnie szkieletowe, serce, mózg, mięśnie gładkie Choroby miąższu wątroby i dróg żółciowych Zawał serca, choroby mięśni METODY BADANIA AKTYWNOŚCI ENZYMATYCZNEJ Współczesne techniki badania aktywności enzymów oparte są głównie na metodach kinetycznych, które umożliwiają badanie przebiegu katalizowanej reakcji na podstawie śledzenia zmian absorbancji w czasie. Np.: test optyczny Warburga - przebieg utleniania lub redukcji koenzymów (NAD/NADH2, NADP/NADPH2), który stosuje się do oznaczania aktywności LDH, ALT/AST, CK i GLDH (Ryc. 3). Drugą grupą metod są badania zmian absorbancji związanych z hydrolizą substratu, służące do oznaczania aktywności amylazy fosfatazy kwaśnej i zasadowej, cholinesterazy, lipazy i γ-glutamylotransferazy. Aktywność enzymów wyraża się w jednostkach enzymatycznych: Jednostką enzymatyczną (U) jest ilość enzymu, która katalizuje przekształcenie 1 µmola substratu w ciągu jednej minuty, w warunkach optymalnych dla danego enzymu. Katal jest przyjętą w układzie SI jednostką aktywności enzymu, zdefiniowaną jako aktywność katalityczna, która zwiększa szybkość reakcji w specyficznym układzie o jeden mol na sekundę. Katal jest zbyt duży dla większości zastosowań i jest zazwyczaj wyrażany w mikrokatalach, nanokatalach i pikokatalach. 1 kat = 1 mol/s = 60 mol/min = 60x10 6 μmol/min = 6x10 7 U 1U = 1 μmol/min = 1/60 μmol/s = 1/60 μkat = 16.67x10-9 kat

4 Ryc. 3. Test optyczny Warburga. Zmiany absorbancji mierzy się przy długościach fali 334/340/365 nm. 1. Dehydrogenaza mleczanowa (LDH, E.C. 1.1.1.27) Dehydrogenaza mleczanowa jest enzymem z klasy oksydoreduktaz, występuje w cytoplazmie wszystkich komórek. LDH katalizuje odwracalne przejście pirogronianu w mleczan: ph 7,4 7,8 pirogronian + NADH + H + mleczan + NAD - ph 8,8 9,8 Oprócz mleczanu LDH przekształca również pokrewne hydroksy- i ketokwasy, np. kwas 2- hydroksymasłowy. Ciężar cząsteczkowy LDH 134 000. Cząsteczka LDH jest tetramerem złożonym z 2 typów podjednostek (łańcuchów polipeptydowych), których synteza kontrolowana jest przez osobne geny. Locus dla podjednostki H (H heart) znajduje się na 11 chromosomie, a dla podjednostki M (M muscle) na 12. Kombinacja tych podjednostek daje 5 możliwości budowy tetrameru (izoenzymu), o zróżnicowanej lokalizacji tkankowej (Ryc. 4.). LDH1 = HHHH; LDH2 = HHHM; LDH3 = HHMM; LDH4 = HMMM; LDH5 = MMMM. W alkalicznym ph najszybciej do anody wędruje LDH1, najwolniej LDH5.

5 Ryc.4 Opisano przypadki całkowitego niedoboru podjednostki H lub M, dziedziczone jako cechy autosomalne recesywne. U homozygot z niedoborem podjednostek M zachowana jest prawidłowa aktywność LDH w osoczu, a analiza izoenzymów wykazuje obecność tylko LDH1. U homozygot z niedoborem podjednostek H obserwuje się obniżoną aktywność LDH w osoczu, zależną od obecności wyłącznie izoenzymu LDH5. U homozygot bardzo rzadko występuje obniżona aktywność LDH w osoczu, a rozpoznanie opiera się na wyznaczeniu proporcji LDH1/LDH3. Aktywność LDH jest hamowana przez metale ciężkie (reakcja z grupami tiolowymi, odwracalna po dodaniu cysteiny lub zredukowanego glutationu). Mleczan i pirogronian w nadmiarze hamują aktywność enzymu; wrażliwość podjednostki H na nadmiar substratu jest większa. Aktywność LDH w tkankach przewyższa kilkaset razy aktywność obserwowaną w osoczu i niewielkie uszkodzenie tkanki powoduje znaczący wzrost aktywności enzymu w osoczu. Oznaczanie aktywności dehydrogenazy kwasu mlekowego metodą kinetyczną z pirogronianem Pomiary aktywności dehydrogenazy kwasu mlekowego obecnie dokonywane za pomocą reakcji sprowadzających się do śledzenia przebiegu testu optycznego Warburga. Zasada tego testu oparta została na obserwacji, że NADH, koenzym enzymów przenoszących wodór, silnie pochłania światło o długości fali 300-370 nm, natomiast jego postać utleniona, NAD, nie wykazuje w tym zakresie fali żadnej absorpcji. Można więc na podstawie pomiarów absorbancji w odpowiednim paśmie (334, 340 lub 366 nm) oznaczać bezpośrednio przebieg utleniania lub redukcji w tej reakcji. Test optyczny Warburga stał się podstawą kinetycznego pomiaru przebiegu reakcji katalizowanych przez enzymy przenoszące proton (tzw. test optyczny prosty) oraz w połączeniu z reakcjami wskaźnikowymi i pomocniczymi - przez inne enzymy, np. transferazy, kinazy i niekiedy hydrolazy. Czas reakcji (inkubacji) został skrócony do kilku minut a jej przebieg kontrolowany w postaci odczytu absorbancji co 1 minutę.

Zasada metody Dehydrogenaza mleczanowa katalizuje reakcję przeniesienia protonu na ketokwas, kwas pirogronowy, z utworzeniem hydroksykwasu, kwasu mlekowego. Obserwowany spadek absorbancji przy dł. fali 340/365 nm spowodowany jest utlenieniem koenzymu NADH do NAD. Materiał badany: Surowica bez śladów hemolizy, osocze poheparynowe. Odczynniki: Zestaw odczynnikowy do stosowania w laboratoriach diagnostycznych. Obliczanie wyników: Wyliczyć średni spadek absorbancji na minutę ( A/min.): 6 (A1 A2) + (A2 A3) + (A3 A4) A/min = 3 Otrzymaną wartość A/min należy następnie podstawić do wzoru: A/min VK x x 10 6 mol. min.-1 l -1 = aktywność LDH [IU/l] x d VA gdzie: A/min - średnia zmiana absorbancji/min.; VK - objętość końcowa próby VA - objętość badanego materiału; d - grubość warstwy (droga światła w kuwecie); - molowy współczynnik absorpcji NADH, przy dł. fali 365 nm 3300 przy dł. fali 340 nm 6300 Uwaga: Jeżeli średni spadek absorbancji na minutę przekracza 0,05, to badaną surowicę należy rozcieńczyć solą fizjologiczną w stosunku 1:5 lub 1:10 i powtórzyć analizę. Interpretacja wyników: U noworodków obserwuje się 3-4-krotnie wyższe wartości aktywności LDH, niż u osób dorosłych. Umiarkowany wzrost aktywności występuje w wirusowym zapaleniu wątroby, w nowotworach złośliwych i w chorobach mięsni szkieletowych. Znaczny wzrost aktywności LDH pojawia się w zawale mięśnia sercowego, zawale nerki, niewydolności krążenia ze wstrząsem hemodynamicznym i w niektórych chorobach hematologicznych. Przebieg niektórych chorób jest związany ze zmianami dystrybucji izoenzymów. Np. u pacjentów z postępującą dystrofią mięśniową, rodzaje i aktywności izoenzymów LDH, kinazy fosfokreatynowej i aldolazy porównywalne są ze stanem obserwowanym w mięśniach szkieletowych płodu, co tłumaczone jest niezdolnością tkanki do prawidłowego różnicowania się. Izoenzymy w tkance regenerującej się również przypominają dystrybucję u płodu, co z kolei tłumaczy się jako rozluźnienie lub modyfikację układów kontrolnych w szybko dzielących się

7 komórkach, np. w ostrym zapaleniu wielomięśniowym. Powtórne pojawienie się u dorosłego składu izoenzymów, charakterystycznego dla tkanki płodowej, jest również cechą złośliwych transformacji tkanek. W złośliwych guzach (prostaty, szyjki macicy, piersi, mózgu, żołądka, jelita grubego, odbytu, oskrzeli i węzłów chłonnych) obserwuje się na ogół przesunięcie równowagi izoenzymów w kierunku wariantów katodowych, tzn. LDH4 i 5, czemu towarzyszy obniżka postaci LDH1 i 2. Odzwierciedla to dystrybucję izoenzymów LDH znajdowaną w tkankach płodowych. Zmiany tego samego typu stwierdza się również w prawidłowych tkankach sąsiadujących z nowotworem. Przeciwnie, w łagodnych guzach obserwuje się większą ilość anodowych izoenzymów LDH. 2. Aminotransferaza alaninowa (ALT, E.C. 2.6.1.2 ) i aminotransferaza asparaginianowa (AST, E.C. 2.6.1.1) Aminotransferazy (popularnie nazywane transaminazami) katalizują reakcje przeniesienia grup aminowych z aminokwasów na 2-oksyglutaran ( -ketoglutaran) lub inny związek pochodzący z przemiany węglowodanowej. Kwas -ketoglutarowy za pośrednictwem kwasu glutaminowego jest jednym z kluczowych elementów przemiany białkowej i usuwania amoniaku z ustroju. Koenzymem aminotransferaz jest fosforan pirydoksalu Zasada metody: Kinetyczne oznaczanie aminotransferaz opiera się na teście optycznym Warburga, jest to test z reakcją wskaźnikową: ALT L-alanina + -ketoglutaran kwas L-glutaminowy + pirogronian LDH Pirogronian + NADH + H + mleczan + NAD + AST L-asparaginian+ -ketoglutaran kwas L-glutaminowy + szczawiooctan MDH Szczawiooctan + NADH + H + jabłczan + NAD + Materiał badany: Surowica, osocze wersenianowe lup heparynowe. Hemoliza (stężenie hemoglobiny do 100 mg/100 ml) nie przeszkadza tylko w oznaczaniu aktywności ALT. Odczynniki do metody enzymatycznej: Zestawy odczynnikowe do stosowania w laboratoriach diagnostycznych.

Interpretacja wyników STAN Ostre wirusowe zapalenie wątroby, zatrucia Przewlekłe wirusowe zapalenie wątroby - zaostrzenie choroby Marskość Cholestaza - zablokowanie dróg wyprowadzających żółć kamieniem Cholestaza - ucisk przez guz STOSUNEK AST/ALT AST = ALT AST>ALT AST>ALT AST< ALT AST = ALT UWAGI 8 W ostrym okresie aktywności mogą sięgać 50-100x ponad górną granicę normy. W okresie zdrowienia ALT>AST Poziom aktywności zależy od nasilenia choroby, może sięgać 10x ponad górną granicę normy. AST może sięgać 4x ponad górną granicę normy, w końcowym okresie choroby aktywności obniżają się - nawet do poziomu normy Poziom aktywności zależy od nałożonej infekcji i ewentualnie martwicy Często aktywności w normie pomimo silnej żółtaczki 3. Kinaza kreatynowa (CK, E.C. 2.7.3.2.) W obecności jonów Ca i Mg katalizuje zwrotnie tworzenie ATP z ADP i kreatyny oraz fosforylację kreatyny w obecności ATP. Największą zawartość tego enzymu stwierdza się w mięśniach szkieletowych, następnie w mózgu, mięśniu sercowym, odbytnicy, żołądku, pęcherzyku żółciowym, śladowe ilości w wątrobie. CK jest dimerem składającym się z podjednostek wywodzących się z mięśni (muscle, M) i mózgu (brain, B); zidentyfikowano trzy izoenzymy: MM, MB i BB. Izoenzymy występują w mitochondriach lub cytozolu właściwych komórek. U ludzi zdrowych 95% aktywności CK w surowicy stanowi izoenzym CK-MM, resztę (ok. 5%) CK-MB; izoenzym CK-BB nie występuje w krążeniu w stanie zdrowia. Podwyższenie aktywności CK w surowicy obserwuje się w chorobach mięśni szkieletowych, zwłaszcza w dystrofiach mięśniowych, po urazach tkanki mięśniowej, w zapaleniu na tle zakaźnym mięśnia sercowego u dzieci, w miopatiach i w nagminnym porażeniu dziecięcym. Badanie całkowitej aktywności CK jak i izoenzymu CKMB jest wykonywane głównie w diagnostyce zawału mięśnia sercowego, znaczny wzrost obydwu parametrów obserwuje się we wczesnych godzinach (2-6 h) od powstania zawału. Selektywne badanie aktywności CKMB polega na zablokowaniu przeciwciałem monoklonalnym udziału w reakcji podjednostki M. Mierzone zmiany absorbancji zależą od aktywności podjednostki B, po wyliczeniu wyniku badania dla CKMB ocenia się procentowy udział tego izoenzymu w całkowitej aktywności CK i przyjmuje się, że o zawale świadczy aktywność CKMB przekraczająca 6% CK. Obecnie w diagnostyce zawału serca stosuje się immunochemiczne badanie stężenia białka enzymatycznego CKMB (CKMBmass), które jest czulsze niż klasyczna analiza enzymologiczna i może przyspieszyć rozpoznanie choroby. Wzrost całkowitej aktywności CK na skutek przenikania izoenzymu CKBB przez uszkodzoną barierę krew-mózg można zaobserwować po urazach i w procesach chorobowych centralnego układu nerwowego.

Zasada metody: Kinetyczne oznaczanie kinazy kreatynowej opiera się na teście optycznym Warburga, jest to test z reakcją pomocniczą i wskaźnikową: 9 CK fosforan kreatyny + ADP kreatyna + ATP HEKSOKINAZA glukoza + ATP glukozo-6-fosforan + ADP DEHYDROGENAZA GLUKOZO-6-FOSFORANU glukozo-6-fosforan+nadp glukono-6-fosforan + NADPH Materiał badany: Surowica, osocze wersenianowe lup heparynowe. Odczynniki do metody enzymatycznej: Zestawy odczynnikowe do stosowania w laboratoriach diagnostycznych. Ryc. 5. Narządowa lokalizacja najczęściej oznaczanych enzymów. 4. Fosfataza zasadowa (ALP, E.C. 3.1.3.1.) Enzym ten hydrolizuje szereg zróżnicowanych substratów naturalnych i syntetycznych. Osobnicy z wrodzonym brakiem aktywności ALP wydalają z moczem duże ilości fosforanu etanoloaminy, co sugeruje, że związek ten (lub fosfatydyloetanoloamina) może być rzeczywistym substratem tego enzymu. ALP występuje we wszystkich tkankach organizmu i

10 związana jest z błonami komórkowymi. Wysoką aktywność ALT obserwuje się w nabłonku jelitowym, cewkach nerkowych, osteoblastach, wątrobie i łożysku. Znane izoenzymy ALP wykazują optimum ph ok. 10 w warunkach in vitro. Funkcją fizjologiczną ALP jest udział w transporcie lipidów w jelicie oraz w procesach kalcyfikacji kości. W warunkach prawidłowych w osoczu występują izoenzymy pochodzące z wątroby i kości a ich aktywność zmienia się z wiekiem (najwyższa ok. 15 r.ż., najniższa pomiędzy 30-40 r. ż., od 50 r. ż stopniowy wzrost). U osób z grupą krwi B lub O, tzw. wydzielaczy substancji grupowych krwi do płynów ustrojowych, w osoczu znajduje się niewielka ilość izoenzymu jelitowego. Aktywatorami ALP są kationy dwuwartościowe (Mg, Co i Mn), a cynk jest składnikiem konstytucyjnym. Wszystkie izoenzymy ALP hamowane są przez fosforany, szczawiany, borany i cyjanki. Oznaczenie aktywności fosfatazy zasadowej metodą kinetyczną z p-nitrofenylofosforanem Zasada metody Fosfataza zasadowa hydrolizuje substrat, p-nitrofenylofosforan, do p-nitrofenolu i anionu fosforanowego: FOSFATAZA ZASADOWA p-nitrofenylofosforan + H2O p-nitrofenol + fosforan Przyrost stężenia wolnego p-nitrofenolu w środowisku zasadowym mierzony jest wzrostem absorbancji przy dł. fali 405 nm. Materiał badany Surowica bez śladów hemolizy, osocze heparynowe. Odczynniki Zestaw odczynnikowy do stosowania w laboratoriach diagnostycznych. Obliczanie wyników Wyliczyć średni przyrost absorbancji na 1 minutę: A4 A1 A/min. = 3 Molowy współczynnik absorpcji dla p-nitrofenolu =18700 (405 nm) Interpretacja wyników Podwyższoną aktywność fosfatazy zasadowej stwierdza się najczęściej w śródwątrobowej i pozawątrobowej niedrożności przewodów żółciowych, marskości wątroby, zapaleniach wątroby, niedrożności jelit, w zapaleniu otrzewnej, w nadczynności przytarczyc, nowotworach kości, szpiczaku mnogim, w ostatnim trymestrze ciąży. Obniżenie aktywności: w niedoczynności tarczycy i zatruciu wit. D.

11 ENZYMY JAKO ODCZYNNIKI W BIOCHEMII KLINICZNEJ Szereg istotnych z diagnostycznego punktu widzenia metabolitów oznaczano posługując się metodami opartymi na reakcjach kolorymetrycznych, które nie wykazywały pełnej specyficzności i dawały często wyniki zafałszowane obecnością leków czy składników diety. Obecnie w powszechnym użyciu są metody wykorzystujące enzymy charakterystyczne dla szlaków przemian. Analiza ilościowa możliwa jest dzięki sprzężeniu z testem optycznym Warburga lub z układami generującymi barwę (reakcja Trindera). W tej reakcji czynnikiem interferującym jest kwas askorbinowy (>5 mg/dl), ponieważ zużywa aktywność peroksydazy w reakcji z nadtlenkiem wodoru (Ryc. 6.). Ryc. 6. Udział kwasu askorbinowego w reakcji Trindera. 1/ Oznaczanie kwasu moczowego metodą z urykazą Kwas moczowy + 2H2O + O2 [URYKAZA] alantoina + H2O2 2H2O2 + 4-aminoantypiryna + fenol [PEROKSYDAZA] chinonoimina + 4H2O 2/ Oznaczanie mocznika metodą z ureazą Mocznik + H2O [UREAZA] 2 NH4 + + CO2 2 NH4 + + NADH + H + + 2-oksoglutaran [GLDH] glutaminian + NAD +

12 3/ Oznaczanie cholesterolu metodą z esterazą i oksydazą cholesterolu Estry cholesterolu + H2O [ESTERAZA CHOLESTEROLU] cholesterol + kwasy tłuszczowe Cholesterol + H2O + O2 [OKSYDAZA CHOLESTEROLU] cholest-4-en-3-on + H2O2 2 H2O2 + 4-aminoantypiryna + fenol [PEROKSYDAZA] chinonoimina + 4H2O 4/ Oznaczanie triglicerydów metodą z oksydazą glicero-3-fosforanu Triglicerydy [LIPAZA] glicerol + wolne kwasy tłuszczowe Glicerol + ATP [KINAZA GLICEROLU] glicero-3-fosforan Glicero-3-fosforan + O2 [OKSYDAZA GLICERO-3-FOSFORANU] fosforan dihydroksyacetonu + H2O2 H2O2 + 4-chlorofenol + 4-aminoantypiryna [PEROKSYDAZA] chinonoimina + 4H2O 5/ Oznaczanie glukozy metodą z oksydazą glukozy Glukoza [OKSYDAZA GLUKOZY] kwas glukonowy + H2O2 H2O2 + 4-chlorofenol + 4-aminoantypiryna [PEROKSYDAZA] chinonoimina + 4H2O