Stowarzyszenie Techników Cukrowników Łódź, 28 czerwca 2016 r. Polisacharydy w procesie produkcji cukru dr inż. Aneta Antczak-Chrobot dr inż. Maciej Wojtczak
ESST PROJECT Characterisation and impact of polymers in sugar processing
Specjalistyczne Laboratorium Analityki Cukrowniczej Dr inż. Maciej Wojtczak, project Leader Dr inż. Aneta Antczak-Chrobot Dr inż. Agnieszka Papiewska Dr inż. Radosław Gruska Mgr inż. Paulina Bąk Dr inż. Ilona Błaszczyk Dr inż. Magdalena Molska 3 studenci: Agnieszka Janiszewska, Katarzyna Godos, Agata Klimczak, Michał Wojciechowski, Natalia Głowacka
WP 1. Formation of exo-polymers during degradation of frost damaged beets WP 1.1. Identification of exo-polimers formed during degradation WP 1.2. The kinetics of formation of exo-polymers - markers, substrates, microorganisms WP 2. The impact of exopolymers on processing 4 WP 2.1. The exo-polymers passage to raw juice during extraction of degraded beets WP 2.2. Influence on juice viscosity and calcium-sludge particles size distribution WP 2.3. Influence of juice puriffication process - filtration and sedimentation
5 Przerób buraków zdegradowanych
Zmiany w składzie chemicznym buraków zdegradowanych Glukoza Fruktoza Rafinoza Polisacharydy: dextran, levan 6 Sacharoza Wartość technologiczna
Extracellular Polymeric Substances Egzopolisacharydy są to makrocząsteczki zbudowane z monomerów, produkowanych przez szereg drobnoustrojów 7
Exopolisacharydy (Bacterial polysaccharides) (EPSs) Homopolisacharydy (HoPSs) Jeden typ monosacharydów Heteropolisacharydy (HePSs) Dwa lub więcej typów monosacharydów 8 (glównie D-glukoza lub D-fruktoza) ( glukoza, galaktoza, mannoza and ramnoza) (Madhuri and Prabhakar, 2014)
Lactic Acid Bacteria (LAB) Mezofilne i termofilne szczepy LAB syntetyzują zarówno homo jak i heteropolisacharydy. 9 Homopolisacharydy produkowane przez LAB obejmującej glukany (βglukany i α-glukany tj. dekstran, mutant, reuteran) i fruktany składającą się z cząsteczek fruktozy (lewan, inulina) Comparative genomics of the lactic acid bacteria PNAS; 2006,
(Tabibloghmany and Ehsandoost, 2014) Homopolisaccharides HoPS Fructosyltransferases Glucansucrases Fructans (β links) Glucans Inulin β-(1,2) linear or branched Levans β-(2,6) α-links β-links 10 Mutans α-(1,3) Dextrans α-(1,6) Reuterans α-(1,4)
EPSs Na właściwości fizyczne polisacharydów wpływa sekwencja monomerów, z których jest zbudowany łańcuch główny polisacharydu, jak również sieć utworzona przez łańcuchy boczne 11
Exopolisacharydy w procesie produkcji cukru obecność EPSs powoduje problemy podczas przerobu surowca o pogorszonej jakości ostatecznie prowadzi do spowolnienia procesu i zwiększenie kosztów produkcji 12
Dekstran n 13 (Abdel-Rahman et al., 2008; Eggleston G et all.,2009; Jiménez E. R.:, 2005, 2009)
Dextran formation (Eggleston i Huet 2012)
(Eggleston et al., 2009) Masa molowa dekstranu HMW dextran MMW dextran LMW dextran >1000 kda 100-1000 kda < 100 kda
Exopolisacharydy w procesie produkcji cukru - DEXTRAN Cząsteczka dekstranu Obecność dekstranu powoduje: 16 wzrost lepkości soków, spowolnienie procesu filtracji i crystalizacji wzrost strat cukru
Wpływu dekstranu na proces filtracji BLOKOWANIE FILTRÓW poprzez Zwiększenie lepkości soku Zmniejszenie wielkości cząstek węglanu wapniowego
Filter clogging 2 nd T 100 2 nd T 500
Eliminowanie negatywnego wpływu dekstranu Zapobieganie przed syntezą dekstranu Hydroliza dekstran dekstranazą Poprawa filtracyjności przez zastosowanie PCC
Zastosowanie dekstranazy (Eggleston et al. 2005, 2009; Khalikova et al. 2005)
DU/ml ph temperature,180,160,140,120,100,80,60,40,20,0 ph 4.0 ph 5.5 ph6.2 ph7.0 21 (Eggleston et al. 2005, 2009; Khalikova et al. 2005)
Dextran hydrolysis 45 40 35 30 25 20 15 10 5 0 DP 11-30 1 3 5 10 15 20 30 40 50 60 75 90 105 120 T 30C; ph 6.2 T 55C; ph 6.2 T 65C; ph 6.2 7 6 5 DP 30-50 4 3 2 1 0 1 3 5 10 15 20 30 40 50 60 75 90 105 120 T 30C; ph 6.2 T 55C; ph 6.2 T 65C; ph 6.2
Dextran hydrolyzis 45 DP 11-30 2-5 kda 40 35 30 25 20 15 10 5 0 1 ml dextranase (6000 DU/ml) per 1000 mg dextran In raw juice in DP 11-1 3 5 10 15 20 3-5 minutes30 40 1 3505 10 156020 7 DP 30-50 5-9 kda 6 5 4 3 2 1 0
PCC Kolejnym sposobem poprawy właściwości filtracyjnych osadów węglanu wapnia powstałych w obecności dekstranu jest dodatek podczas drugiej saturacji świeżo strąconego węglanu wapnia (PCC).
PCC PCC wytwarzany jest bezpośrednio z mleka wapiennego i zawiera drobne cząstki czystego węglanu wapnia. Dodanie PCC podczas drugiej saturacji powoduje szybszy wzrost kryształów węglanu wapnia w obecności dekstranu, co prowadzi do poprawy granulacji osadu.
PCC PCC może być również używany do jako środek poprawiający filtrację, wtedy dodawany jest do soku bezpośrednio przed filtracją. Takie stosowanie PCC wymaga aby kryształy węglanu wapnia w nim zawarte były duże, dobrze wykształcone i jednorodne.
Exopolysaccharides EPSs DEXTRAN
W celu prawidłowego postępowania z EPSs konieczna jest informacja o strukturze i składzie chemicznym polisacharydów produkowanych podczas degradacji buraka. Należy zastosować nowoczesne instrumentalne techniki analityczne w celu określenia rodzaju i struktury EPSs Należy znaleźć łatwą i szybką metodę monitorowania obecności (rodzaju/ilości) EPSs w procesie produkcji cukru
OZNACZENIE ZAWARTOŚCI DEKSTRANU W PROCESIE PRODUKCJI CUKRU
Oznaczenie zawartości dekstranu w procesie produkcji cukru 30 Metoda mgiełki alkoholowej (ICUMSA) Metoda Roberts`a (AOAC) Metoda polarymetryczna (DASA) Metody enzymatyczne Metody immunologiczne FT-IR (Mean and Near Infra Red Spectroscopy) HPLC/HPAEC
Metoda mgiełki alkoholowej (ICUMSA) wytrącenie dekstran alkoholem pomiar absorbancji powstałego zmętnienia stosunkowo prosta i precyzyjna nie dość specyficzna trudne w interpretacji wyników niewrażliwa na oznaczanie dekstranu o masie cząsteczkowej 31 (Mw) mniejszej niż 10 5 Brown & Inkerman, 1992; Aquino & Franco, 2009; ICUMSA Methods Book
Metoda Roberts`a (AOAC) wytrącanie oligo- i polisacharydów etanolem usunięcie sacharozy kolorymetryczne oznaczenie wyizolowanego z mieszaniny w postaci kompleksu miedziowego dekstranu procedura analityczna jest skomplikowana czasochłonna 32 konieczne całkowite usunięcie sacharozy niezależna od masy cząsteczkowej dekstranu Godshall et all, 2004
Metoda polarymetryczna (DASA) Mierzy zmianę skręcalności optycznej próbki przed i po enzymatycznej hydrolizie dekstranazą 33 (Sigelton et al 2002)
Metoda monoklonalnych przeciwciał pomiar zmętnienia wytworzonego na skutek specyficznej reakcji monoklonalnych przeciwciał z dekstranem wysoce specyficzna oznaczenie HMW dekstran nie wymaga specjalistycznego wyposażenia bardzo wysoki koszt analizy 34 (Xie Zhen-Ming et al., 2014, Mattiasson et al. 2010)
Metoda enzymatyczna wytrącanie polisacharydów alkoholem hydroliza dekstranazą enzymatyczne oznaczenie zawartości zhydrolizowanej glukozy oznaczenie dekstranu o różnych masach molowych efektywna 35 selektywna skomplikowana (Ahmad et al. 2006; Muangsiri and Kirsch 2006; Xie Zhen-Ming et al., 2014)
specific non-specific 36 Method Principle Specific Rapid Low cost Roberts copper method Precipitation & dissolution with alcohol *1 + resp. Cu(II) reagent, acid hydrolysis, colour reaction ASI Method Amylase, alcohol precipitation, enzyme *1 + (Audobon Sugar Institute) hydrolysis, colour reaction Modified alcohol haze Removal starch & protein, alcohol *1 +/ + method addition, turbidity measurement Midland SucroTest TM Antibody, turbidity measurement + *2 + immunological method DASA Optical activity Measure optical activity before and after + *3 +/ + polarimetric method treatment with dextranase ELISA, enzyme linked A sensitive antigen is used to recognise + + + *4 immunosorbent assay the antibody HPAEC of isomaltose & isomaltotriose Dextranase hydrolysis and HPAEC analysis of released oligosaccharides + +/ + *1 *2 *3 *4 May cross react with other polysaccharides; methods may have initially been developed for dextran determination in (raw) cane sugar Assay is less sensitive to dextran 40 kda and no detectable turbidity formed at 10 kda Might give erroneously high levels of dextran due to either partial dextran hydrolysis or poor filtration Method in early stage of development [3], not yet available on the market
POŚREDNIE METODY OZNACZANIA ZAWARTOŚCI DEKSTRANU 37
Produkcja dekstranu (Eggleston i Huet 2012)
Produkcja mannitolu Leuconostoc Lactobacillus 39 mannitol
Dextran, mannitol, lactic and acetic acids, mg/l log N Kinetyka przyrostu metabolitów oznaczanych w soku surowym poddanym w fermentacji spontanicznej w temp.30 C 10000 9000 Leuconostoc sp. mannitol 10 9 8000 8 7000 6000 5000 7 6 5 4000 lactic acid 4 3000 dextran 3 2000 2 40 1000 acetic acid 1 0 0 10 20 30 40 50 60 70 0 Fermentation time, h
Dextran, mg/l Korelacja pomiędzy zawartością mannit i dekstran Badania wykazują, że wzrost zawartości mannitol nie zawsze prowadzi do wzrostu zawartości dekstranu. 3500 3000 2500 2000 C Dextran = 0.354 C Mannitol + 68.294 R² = 0.9964 41 Mannitol powinien być traktowany bardziej jako wskaźnik aktywności mikrobiologicznej niż bezpośredni marker dekstranu. 1500 1000 500 0 0 2000 4000 6000 8000 10000 Mannitol, mg/l
Fabryczne metody oznaczania dekstranu można podzielić na trzy grupy: Metody, w których dekstran oznacza się bezpośrednio Metody, w których oznacza się produkty hydrolizy dekstranu (glukoza, izomaltoza itp.) Metody, w których oznacza się markery aktywności mikrobiologicznej (mannitol, kw. mlekowy, glukoza) 42
43 STRUKTURA I SKŁAD CHEMICZNY EPSS
Metody oznaczania struktury i składu chemicznego egzopolisacharydów HPLC HPAEC-PAD HPLC-DAD HPLC-IR GC 44 SEC Elektroforeza kapilarna
Metody oznaczania struktury i składu chemicznego egzopolisacharydów Jonizacja próbki połączoną z pomiarem jej masy w spektrometrze masowym (MALDI-TOF-MS) (ang. matrix assisted laser desorption and ionisation) Spektroskopia w podczerwieni (FT-IR) jądrowy rezonans magnetyczny (NMR) 45 skaningowa mikroskopia elektronowa (SEM) kalorymetria skaningowa (DSC)
aneta.antczak@p.lodz.pl Dziękuję za uwagę 46