ĆWICZENIE OZNACZANIE AKTYWNOŚCI LIPAZY TRZUSTKOWEJ I JEJ ZALEŻNOŚCI OD STĘŻENIA ENZYMU ORAZ ŻÓŁCI JAKO MODULATORA REAKCJI ENZYMATYCZNEJ. INHIBICJA KOMPETYCYJNA DEHYDROGENAZY BURSZTYNIANOWEJ. 1. Oznaczanie aktywności lipazy trzustkowej i jej zależności od stężenia enzymu oraz żółci jako modulatora reakcji enzymatycznej. Zasada metody: Aktywność lipazy określa się na podstawie ilości uwolnionych kwasów tłuszczowych z tłuszczów roślinnych, w czasie działania enzymu w optymalnych warunkach. Ilość uwolnionych kwasów tłuszczowych oznacza się poprzez miareczkowanie mianowanym roztworem NaOH wobec fenoloftaleiny jako wskaźnika. Część analityczna Przygotowanie substratu Odmierzyć 25 ml oleju do kolbki stożkowej. Dodać 1 ml 0,01M NaOH i sporządzić emulsję przez wytrząsanie. Wolne kwasy tłuszczowe zawarte w oleju tworzą w obecności NaOH mydła, które obniżają napięcie powierzchniowe, a nieznaczny nadmiar NaOH zapewnia słabo alkaliczny odczyn, optymalny dla aktywności lipazy. Oznaczenie aktywności enzymu Przygotować dwa szeregi próbówek i oznaczyć je odpowiednio cyframi: trzy pierwsze próbówki w rzędzie jako 0 (próby kontrolne) a kolejne cyframi od 1 do 5. Następnie do próbówek odmierzyć roztwory odczynników w ilościach podanych w tabelach poniżej. Szereg I. Inkubacja bez aktywatorów Próbówka nr 0 0 0 1 2 3 4 5 Substrat 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 NaCl 2,0 2,0 2,0 2,5 2,0 1,5 1,0 0,5 Szereg II. Inkubacja z aktywatorami Próbówka nr 0 0 0 1 2 3 4 5 Substrat 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 NaCl 1,5 1,5 1,5 2,0 1,5 1,0 0,5 - Żółć 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 W doświadczeniu wykorzystujemy lipazę trzustkową ekstrahowaną ze zliofilizowanego proszku tkankowego trzustki. Lipazę zinaktywowaną otrzymujemy poprzez denaturację cieplną enzymu
aktywnego. Do obydwu szeregów próbówek dodawać lipazę w 30 sekundowych odstępach w ilościach przedstawionych w tabeli poniżej. Szereg I Szereg II Próbówka nr 0 0 0 1 2 3 4 5 Enzym aktywny Enzym zinaktywowany Enzym aktywny Enzym zinaktywowany - - - 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5 1,0 1,0 1,0 - - - - - - - - 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5 1,0 1,0 1,0 - - - - - Wymieszać zawartość próbówek i wstawić do łaźni wodnej o temp. 37 C. Zanotować czas rozpoczęcia inkubacji, Próby należy inkubować przez 30 min. w łaźni wodnej, po czym do każdej z nich należy dodać w odstępach 30 sekund po 2 ml 96% etanolu w celu zatrzymania reakcji enzymatycznej. Kolejność dodawania etanolu do próbówek musi być identyczna jak w przypadku dodawania enzymów. Etanol denaturuje białko oraz ułatwia przejście hydrofobowych produktów reakcji enzymatycznej do fazy wodnej, a tym samym umożliwia ich odmiareczkowanie za pomocą wodnego roztworu NaOH. Przenieść próbówki z łaźni wodnej na stół laboratoryjny i dodać do każdej z nich po 4 krople fenoloftaleiny. Przenieść zawartość próbówek do kolbek stożkowych, a następnie miareczkować 0,01M NaOH do wystąpienia i utrzymania się przez 30 sek. purpurowego zabarwienia. Zanotować objętość wodorotlenku zużytą do zobojętniania poszczególnych próbówek. Uwaga: W czasie miareczkowania wstrząsać intensywnie zawartość kolby, gdyż miareczkowany jest układ dwufazowy!!! Obliczenia i wnioski Od każdej objętości NaOH zużytej do odmiareczkowania próby z aktywnym enzymem odejmij objętość NaOH zużytą do odmiareczkowania odpowiednich prób kontrolnych (średnią z trzech prób), jest ona wykładnikiem kwasowości mieszaniny reakcyjnej niezależnej od aktywności enzymu. Sporządzić wykres zależności aktywności lipazy wyrażonej w ml NaOH zużytego na zobojętnienie wolnych kwasów tłuszczowych powstałych w wyniku hydrolizy od jej stężenia wyrażonego w ml dodanego roztworu enzymu. Opisać wnioski wyciągnięte z doświadczenia. 2. Oznaczanie aktywności dehydrogenazy bursztynianowej za pomocą K 3 [Fe(CN) 6 ] oraz hamowanie jej aktywności w obecności inhibitorów. Zasada metody: Dehydrogenaza bursztynianowa jest flawoproteiną ściśle związaną z wewnętrzną błoną mitochondrialną. Uczestniczy w transporcie protonów i elektronów w łańcuchu oddechowym. W warunkach fizjologicznych utlenia bursztynian do fumaranu, a akceptorem protonów jest ubichinon. W oznaczeniach aktywności enzymatycznej dehydrogenazy bursztynianowej in vitro stosowane są sztuczne akceptory elektronów takie jak heksacyjanożelazian (III) potasu K 3 [Fe(CN) 6 ]. Reakcję redukcji heksacyjanożelazianu (III) potasu przedstawia reakcja: K 3 [Fe(CN) 6 ] + e K 4 [Fe(CN) 6 ] żółty bezbarwny Obserwując zmianę barwy w trakcie przebiegu reakcji, można wnioskować o kierunku przebiegu reakcji oksydacyjno-redukcyjnej w badanym roztworze.
Reakcje redukcji heksacyjanożelazianu (III) potasu hamuje malonian, będący odwracalnym inhibitorem kompetycyjnym dehydrogenazy bursztynianowej oraz HgCl 2. Część analityczna Przygotowanie homogenatu Odważyć 10 g wątroby i rozdrobnić. Wprowadzić do cylindra homogenizatora pokrojoną tkankę oraz 50 ml buforu fosforanowego ph=6. Homogenizować przez 5 minut, a następnie przesączyć przez podwójną warstwę gazy. Przygotowanie próbówek z mieszaninami inkubacyjnymi, inkubacja wstępna Przygotować mieszaniny inkubacyjne na podstawie zamieszczonej tabeli. Próbę kontrolną bez substratu będzie stanowiła mieszanina inkubacyjna w próbówce nr 1. Natomiast w próbówce nr 2 będzie się znajdować próba kontrolna bez aktywnego enzymu, w tym celu należy dodać do niej 2 ml 10% kwasu trichlorooctowego, który poprzez denaturację białka spowoduje zanik aktywności enzymu. Wszystkie mieszaniny inkubacyjne należy ogrzewać na łaźni wodnej w temperaturze 37 C przez 5 minut w celu preinkubacji. Numer próbówki 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 0,1 M bufor fosforanowy ph=6,0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0,05 M bursztynian sodowy 0 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 2,0 2,0 2,0 2,0 0,1 0,1 2,0 2,0 0,05 M malonian sodowy 0 0 0 0 0,1 0,1 0,1 0,1 0 0 0 0 0 0 0,01 M HgCl 2 0,5%K 3 [Fe(CN) 6 ] Woda destylowana Inkubacja właściwa 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0,1 0,1 0,1 0,1 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 3,0 2,9 2,9 2,9 2,8 2,8 0,9 0,9 1,0 1,0 2,8 2,8 0,9 0,9 Do każdej próbówki dodać 0,5 ml homogenatu wątroby, wymieszać i inkubować przez 30 minut w łaźni wodnej o temperaturze 37 C. Reakcję przerwać poprzez dodanie do każdej próbówki (za wyjątkiem próbówki nr 2) 2 ml 10% kwasu trichlorooctowego, a następnie odwirowywać przez 10 minut. W otrzymanym nadsączu oznaczyć absorbancję przy długości fali 420 nm względem wody. Obliczenia i wnioski Obliczyć i wpisać do tabeli stężenia substratu (bursztynianu) i inhibitorów (malonianu, HgCl 2 ) w poszczególnych próbówkach. Opisać w których próbówkach obserwowano zmiany zabarwienia i wyjaśnić przyczynę zjawisk obserwowanych w każdej z próbówek. Literatura 1. Biochemia Harpera - Robert Murray 2. Ćwiczenia z biochemii - Leokadia Kłyszejko-Stefanowicz 3. Biochemia. Ćwiczenia praktyczne dla studentów wydziału farmaceutycznego - Lidia Włodek Proszę przynieść na ćwiczenia papier milimetrowy SPRAWOZDANIE
1. Oznaczanie aktywności lipazy trzustkowej i jej zależności od stężenia enzymu oraz żółci jako modulatora reakcji enzymatycznej. A. OBSERWACJE DOTYCZĄCE WYZNACZENIA PUNKTU KOŃCOWEGO MIARECZKOWANIA. TYP METODY. B. OBJĘTOŚCI NaOH WYZNACZONE PODCZAS MIARECZKOWANIA Szereg I Szereg II Nr próbki V NaOH Nr próbki V NaOH 0 0 0 0 0 0 1 1 2 2 3 3 4 4 5 5 C. OBLICZENIE V NaOH RÓWNOWAŻNEJ ILOŚCI UWOLNIONYCH WOLNYCH KWASÓW TŁUSZCZOWYCH Szereg I Szereg II Nr próbki V NaOH Nr próbki V NaOH
1 1 2 2 3 3 4 4 5 5 D. WYKONANIE WYKRESU Sporządzenie na papierze milimetrowym wykresu zależności aktywności lipazy wyrażonej w ml NaOH zużytego na zobojętnienie wolnych kwasów tłuszczowych powstałych w wyniku hydrolizy (y) od jej stężenia wyrażonego w ml dodanego roztworu enzymu (x). szereg I X szereg II E. WNIOSKI 2. Oznaczanie aktywności dehydrogenazy bursztynianowej za pomocą K 3 [Fe(CN) 6 ] oraz hamowanie jej aktywności w obecności inhibitorów. A. OBLICZENIE STĘŻEŃ MOLOWYCH BURSZTYNIANU, MALONIANU I HgCl 2 W POSZCZEGÓLNYCH PRÓBACH BADANYCH B. WYNIKI POMIARU ABSORBANCJI I OBSERWACJE Numer próbówki C bursztynianu [mol/dm 3 ] C inhibitora [mol/dm 3 ] A Zajście reakcji [-, +, ++, +++]
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 C. WNIOSKI