Ekspresja genów heterogenicznych w drożdżach Pichia pastoris
Ekspresja genów heterogenicznych w drożdżach Pichia pastoris Drożdże Pichia pastoris należą do drożdży metanolotroficznych tj. zdolnych do wykorzystywania metanolu jako jedynego źródła węgla
Ekspresja genów heterogenicznych w drożdżach Pichia pastoris Pierwszą reakcją na drodze asymilacji metanolu przez drożdże Pichia pastoris jest reakcja utleniania metanolu do formaldehydu i H 2 O 2 katalizowana przez enzymy oksydazę alkoholową 1 (AOX1) i oksydazę alkoholową 2 (AOX2) CH 3 OH HCOH + H 2 O 2 AOX1 (szybka utylizacja metanolu) AOX2 (wolna utylizacja metanolu) Białko AOX1 może stanowić aż do 30% wszystkich białek komórkowych Pichia pastoris podczas wzrostu tych drożdży na pożywce zawierającej metanol.
Pichia pastoris Ze względu na podobieństwo do S. cerevisiae istnieje możliwość zastosowania opracowanych protokołów W przeciwieństwie do większości komercyjnych systemów ekspresji genów w drożdżach Saccharomyces cerevisiae, systemy ekspresji genów w Pichia pastoris opierają się na integracji DNA wektora plazmidowego z DNA genomowym tych drożdży, uzyskane szczepy rekombinantowe Pichia pastoris są znacznie bardziej stabilne niż szczepy rekombinantowe Saccharomyces cerevisiae Obecność promotora genu alkoholowej oksydazy 5% mrna w komórce
Pichia pastoris ekspresja genów W konstrukcji systemów ekspresyjnych Pichia pastoris można wykorzystać elementy konstrukcyjne wykorzystywane w konstrukcji wektorów ekspresyjnych z Saccharomyces cerevisiae np. gen URA3 wykorzystywany jako marker selekcyjny w auksotroficznych szczepach drożdży Saccharomyces cerevisiae niezdolnych do produkcji uracylu może być użyty w tej samej roli w układach ekspresyjnych dla analogicznych szczepów drożdży Pichia pastoris
Pichia pastoris ekspresja genów Gen/marker selekcyjny wektora plazmidowego z Saccharomyces cerevisiae Szczep auksotrofowy Pichia pastoris HIS4 His - LEU2 Leu - ARG4 Arg - TRP1 Trp - URA3 Ura -
Pichia pastoris Możliwość prowadzenia hodowli do wysokiego OD (10 gr/litr 1 gr/litr) Poziom ekspresji genów heterogenicznych jest z reguły od 10- do 100- razy wyższy niż w drożdżach Saccharomyces cerevisiae Tanie pożywki zabezpieczone przed kontaminacją (obecność metanolu, niskie ph) Brak konieczności dodawania witamin
Pichia pastoris Możliwość sekrecji produkowanych białek do pożywki Niewielka ilość białek gospodarza Prosty skład pożywek Modyfikacje posttranslacyjne Mostki disiarczkowe O- glikozylacja (b. rzadko w S. cerevisiae) N-glikozylacja Odcinanie sekwencji sygnalnej do transportu na zewnątrz (pre-pro)
Pichia pastoris - wady Tworzenie nowych szczepów P. pastoris trudniejsze niż E. coli 10 µg DNA na transformację Brak możliwości przechowywania komóek kompetentnych Wolne tempo wzrostu (po transformacji 2-3 dni) Powolna ekspresja białek (do 1 tygodnia) Niewielka ilość domen fuzyjnych komercyjnie dostępnych
Pichia pastoris - klonowanie Wiele dostępnych wektorów, ale tylko kilka z nich ma następujące cechy: Ori E. coli Kaseta selekcyjna dla E. coli Kaseta selekcyjna dla P. pastoris Możliwość multikopijnej integracji Silny indukowalny promotor (AOX1) MCS w ramce odczytu z sekwencją sygnalną
ppic9k ppiczα
Wektory ekspresyjne Pichia pastoris Plazmidy wahadłowe Zawierają bakteryjne ori replikacji np. ori pbr322 (ppic3.5) lub ori puc (ppicz A,B,C)
Wektory ekspresyjne Pichia pastoris Plazmidy wahadłowe Zawierają geny oporności na ampicylinę, (markery selekcyjne w E. coli) albo gen oporności na antybiotyk zeocynę (uniwersalny marker selekcyjny w E. coli i Pichia pastoris)
Wektory ekspresyjne serii ppic i phil Pichia pastoris W wektorach plazmidowych serii phil i ppic ekspresja genów heterogenicznych odbywa się spod silnego promotora P AOX1 genu AOX1 kodującego oksydazę alkoholową metanolu AOX1
Wektory ekspresyjne serii ppic i phil Pichia pastoris Ekspresja spod promotora P AOX1 jest regulowana przez obecność glukozy, glicerolu i metanolu w pożywce glukoza (represja) konieczność odwirowania hodowli (m.in. z bioreaktorów np. 200 l) glicerol (represja, ale łatwiejsza indukcja) metanol (indukcja)
Wektory ekspresyjne serii ppic i phil Pichia pastoris W wektorach plazmidowych serii phil i ppic ekspresja genów heterogenicznych jest hamowana przez terminator genu AOX1: 3 AOX1(TT)
Wektory ekspresyjne serii ppic i phil Pichia pastoris W wektorach plazmidowych serii phil i wektorach ppic3.5k oraz ppic9k rolę eukariotycznego markera selekcyjnego pełni gen kodujący dehydrogenazę histydynylową HIS4 W wektorach ppicz A(B,C) oraz ppiczalfa A(B,C,E) stosowany jest uniwersalny marker selekcyjny: gen kodujący oporność na antybiotyk zeocynę
Wektory ekspresyjne serii ppic i phil Pichia pastoris Ekspresja genu oporności na zeocynę zachodzi w komórkach: E. coli spod promotora P EM7 Pichia pastoris spod promotora P TEF1 (ten promotor działa we wszystkich drożdżach)
Expression of beta-galactosidase form ppicz
Szczepy Pichia pastoris Z wektorami plazmidowymi serii phil, ppic są najczęściej wykorzystywane dwa szczepy Pichia pastoris tj.: Pichia pastoris GS115 Pichia pastoris KM71 Oba szczepy są mutantami auksotrofowymi His - niezdolnymi do syntezy endogennej histydyny na skutek mutacji w genie HIS4 kodującym dehydrogenazę histydynylową
Szczep Pichia pastoris GS115 Szczep Pichia pastoris GS115 opisywany jest jako mutant fenotypowy His -, Mut + Szczepy Pichia pastoris Mut + są to szczepy, które posiadają taką samą zdolność do wykorzystywania metanolu jako źródło węgla jak dzikie szczepy Pichia pastoris (Methanol utilization plus strain) Szczepy te posiadają dzikie kopie genów AOX1 i AOX2 kodujących obie wersje oksydazy alkoholowej Pichia pastoris
Szczep Pichia pastoris KM71 Szczep Pichia pastoris KM71 opisywany jest jako mutant fenotypowy His -, Mut S, Arg + Szczepy Pichia pastoris Mut S są to szczepy, które ze względu na dezaktywację genu AOX1 rosną znacznie wolniej niż szczepy dzikie na pożywce zawierającej metanol jako jedyne źródło węgla tzw: (Methanol utilization slow strain) Szczep KM71 powstał poprzez insercję genu AOX1, w celu przerwania jego ciągłości, genu liazy argininobursztynianowej ARG4 (aox1::arg4), która nadała szczepowi wyjściowemu KM71 o fenotypie His -, Mut +, Arg - fenotyp His -, Mut S, Arg +
Integracja DNA wektora z DNA genomowym Niezależnie od tego czy jako szczep gospodarza dla rekombinantowego wektora np. ppic3.5k użyjemy szczepu GS115 czy też KM71 integracja DNA tego plazmidu z DNA genomowym tych szczepów Pichia pastoris może zajść na drodze rekombinacji homologicznej w obrębie: 1. genu AOX1 szczepu GS115 lub genu aox1:arg4 szczepu KM71 2. defektywnego genu his4 3. w obu powyższych przypadkach może również dojść do wielokrotnej rekombinacji homologicznej więcej niż jednej kopii DNA plazmidu z DNA genomowym gospodarza
Integracja DNA plazmidowego w obrębie genu AOX1 szczepu GS115 i genu aox1: ARG4 szczepu KM71 Selekcja rekombinantów odbywa się na płytkach ze złożem nie zawierającym histydyny
Wielokrotna rekombinacja homologiczna DNA plazmidowego z DNA genomowym szczepów Pichia pastoris Rekombinacja wielokrotna może zachodzić w przypadku od 1-10% komórek rekombinantowych szczepów Pichia pastoris uzyskanych po transformacji DNA plazmidu rekombinantowego
Integracja plazmidowego DNA z genomem Pichia pastoris poprzez podwójny crossing over W przypadku szczepu Pichia pastoris GS117 prowadzi to do utraty przez ten szczep cechy fenotypowej Mut + na Mut s (ułatwiona selekcja rekombinantów)
Integracja DNA wektora z DNA genomowym UWAGA!!! Ze względu na transformację Pichia pastoris zlinearyzowanym DNA plazmidu rekombinantowego dominuje integracja z DNA genomowym poprzez podwójny crossing over
Ekspresja wewnątrzkomórkowa i zewnątrzkomórkowa w komórkach Pichia pastoris Wektory plazmidowe używane do ekspresji genów heterologicznych w Pichia pastoris możemy podzielić na dwie grupy: Wektory kierujące eksprymowane białko do cytoplazmy Wektory kierujące eksprymowane białko do pożywki
Ekspresja wewnątrzkomórkowa i zewnątrzkomórkowa w komórkach Pichia pastoris W celu transportu białek z komórek Pichia pastoris do pożywki należy je wyposażyć w specyficzną sekwencję sygnalną na N-końcu, w tym celu można użyć: - sekwencję sygnalną białka obecną w natywnej sekwencji nukleotydowej genu je kodującego - sekwencję sygnalną rozpoznawaną przez Pichia pastoris np. sekwencja -faktora z Saccharomyces cerevisiae Kierowanie eksprymowanego w Pichia pastoris białka do pożywki ułatwia proces oczyszczania białka rekombinowanego - Pichia pastoris produkuje niewiele białek zewnątrzkomórkowo
Wektory ekspresyjne Pichia pastoris serii pgap Do wektorów tej serii należą wektory plazmidowe pgap A, B, i C oraz pgapα A,B i C Wektory te różnią się od wektorów serii phil i serii ppic wykorzystaniem silnego konstytutywnego promotora P GAP Pichia pastoris do ekspresji genów heterogenicznych oraz integracją z DNA genomowym Pichia pastoris w loci GAP
Wektory ekspresyjne Pichia pastoris serii pgap P GAP promotor P GAP promotor w komórkach Pichia pastoris jest odpowiedzialny za ekspresję genu kodującego dehydrogenazę aldehydu-3- fosfoglicerolu
Integracja DNA plazmidowego wektorów serii pgap z DNA genomowym Pichia pastoris
Możliwa jest także wielokrotna integracja
Szczepy Pichia pastoris Z wektorami plazmidowymi serii pgap najczęściej wykorzystywane są dwa szczepy Pichia pastoris GS115 Pichia pastoris KM71
Szczepy Pichia pastoris Ze względu na obecność uniwersalnego markera selekcyjnego w wektorach plazmidowych serii pgap (genu oporności na antybiotyk zeocynę) istnieje możliwość jego stosowania do ekspresji w dzikich szczepach Pichia pastoris tj.: Pichia pastoris X-33 Z pozostałych serii plazmidów tylko wektory ppicz A,B,C i ppicz A,B,C,E mogą wykorzystać ten szczep jako gospodarza
Uwagi Produkcję białek rekombinowanych w Pichia pastoris powinno prowadzić się w odpowiednich bioreaktorach (pełne wykorzystanie potencjału ekspresyjnego P. pastoris) Glikozylacja białek posiadających w swej sekwencji motyw Asn-X-Ser/Thr, może prowadzić do utraty aktywności enzymatycznej lub właściwości strukturalnej (epitopy antygenowe) eksprymowanego białka heterogenicznego w Pichia pastoris
Pichia pastoris ekspresja genów Możliwość uzyskania dużej biomasy (100-200 g z litra hodowli)
P. pastoris ekspresja w kolbach Jedna kolonia do 50 ml pożywki minimalnej z glicerolem (24-48 h) Przenieść komórki do 200 ml (24-48h, OD=10) Przenieść komórki do 1 litra pożywki z metanolem (0,5%) Po pierwszym dniu od indukcji dodawać 0,5% metanolu na kolejne 1-2 dni
Hansenula polymorpha
Hansenula polymorpha http://www.artes-biotechnology.com/expres/hansenula/hansenula01.jsp
Hansenula polymorpha Stabilność szczepów Multikopijnosć wektorów (do 120 na komórkę) Możliwość koekspresji trzech różnych genów Dosępne wektory nbez genów kodujących oporność na antybiotyki Promotor FMD glicerol jest induktorem Promotor MOX metanol jest induktorem
Inne systemy - Artes Arxula adeninivorans Aspergillus sojae Sordaria macrospora