(12) TŁUMACZENIE PATENTU EUROPEJSKIEGO (19) PL (11) PL/EP (96) Data i numer zgłoszenia patentu europejskiego:

Transkrypt

1 RZECZPOSPOLITA POLSKA (12) TŁUMACZENIE PATENTU EUROPEJSKIEGO (19) PL (11) PL/EP (96) Data i numer zgłoszenia patentu europejskiego: (13) (1) T3 Int.Cl. C12N 1/00 (06.01) Urząd Patentowy Rzeczypospolitej Polskiej (97) O udzieleniu patentu europejskiego ogłoszono: Europejski Biuletyn Patentowy 11/03 EP B1 (4) Tytuł wynalazku: Zmutowane promotory AOX1 (30) Pierwszeństwo: AT 3040 (43) Zgłoszenie ogłoszono: w Europejskim Biuletynie Patentowym nr /2 (4) O złożeniu tłumaczenia patentu ogłoszono: Wiadomości Urzędu Patentowego 11/06 (73) Uprawniony z patentu: Technische Universität Graz, Graz, AT VTU Holding GmbH, Grambach, AT (72) Twórca(y) wynalazku: PL/EP T3 FRANZ HARTNER, Kufstein, AT ANTON GLIEDER, Gleisdorf, AT (74) Pełnomocnik: rzecz. pat. Urszula Bartnik POLSERVICE KANCELARIA RZECZNIKÓW PATENTOWYCH SP. Z O.O. ul. Bluszczańska Warszawa Uwaga: W ciągu dziewięciu miesięcy od publikacji informacji o udzieleniu patentu europejskiego, każda osoba może wnieść do Europejskiego Urzędu Patentowego sprzeciw dotyczący udzielonego patentu europejskiego. Sprzeciw wnosi się w formie uzasadnionego na piśmie oświadczenia. Uważa się go za wniesiony dopiero z chwilą wniesienia opłaty za sprzeciw (Art. 99 (1) Konwencji o udzielaniu patentów europejskich).

2 2 EP B1 Opis patentowy [0001] Przedmiotem wynalazku są zmutowane promotory AOX1 z Pichia pastoris. [0002] S. cerevisiae dominowały (i ciągle dominują) w zastosowaniach naukowych i biotechnologicznych jako modelowy organizm eukariotyczny i układ produkcyjny. W ubiegłym wieku ogromne zainteresowanie wzbudził inny organizm drożdżowy, drożdże amitotyczne, Schizosaccharomyces pombe. Dzięki właściwości reprodukcji jedynie przez podział, S. pombe zwróciły dużą uwagę jako organizm modelowy i do dzisiaj, na równi z S. cerevisiae, jest to najintensywniej badany gatunek drożdży pod względem genetyki molekularnej i 1 biologii. Spośród ponad 700 różnych znanych dotychczas gatunków drożdży, tylko te dwa wspomniane powyżej mogą zapewnić interesujący, określony zestaw cech cennych dla zastosowań technologicznych i naukowych. Od lat 1970-tych lub 80-tych, coraz więcej gatunków drożdży o wyróżniających właściwościach badano do celów biotechnologii i naukowych. Te, tak zwane drożdże niekonwencjonalne (NCY) albo drożdże nie należące do Saccharomyces (w tym przypadku termin Saccharomyces obejmuje drożdże Schizosaccharomyces pombe) były badane 2 dla kilku przyczyn: mają one albo znaczenie medyczne, jak Candida albicans albo użyteczność technologiczną,

3 3 jak Yarrowia lipolytica i Kluyveromyces lactis, które mają zdolność wzrostu na określonych substratach (np. na n-alkanach, laktozie). Dla przykładu, najbardziej rozpowszechniony ludzki patogen, C. albicans intensywnie badano aby wykryć naturę czynników wirulencji zaangażowanych w patogenezie i przez to stał się on modelowym organizmem dla drożdży chorobotwórczych. Inną dobrze ustaloną grupą NCY są metylotroficzne drożdże Pichia pastoris i Hansenula polymorpha (Pichia angusta), które wykazują wyższość nad S. cerevisiae pod względem wytwarzania rekombinantowego białka i badań biogenezy peroksysomu. Są to tylko najbardziej prominentni przedstawiciele drożdży niekonwencjonalnych, ciągle budzący 1 zainteresowanie albo technologiczne albo naukowe. Dotychczas szereg innych gatunków stało się również przedmiotem szczególnego zainteresowania i ta grupa będzie szybko rosła w następnych latach. [0003] Cukry, najbardziej rozpowszechniona klasa cząsteczek w przyrodzie, są wykorzystywane przez wszystkie znane drożdże. Jakkolwiek występują ogromne różnice międzygatunkowe pod względem akceptacji konkretnego substratu (patrz tabela 1), to konwersja glukozo-6-fosforanu albo fruktozo-6-fosforanu do 2 pirogronianu jest wspólna w ich metabolizmie. W każdym razie, aparat enzymatyczny uczestniczący w szlaku glikolitycznym znacznie się różni w różnych drożdżach.

4 4 Podczas, gdy w S. cerevisiae poznano i scharakteryzowano większość enzymów, przynajmniej częściowo, to w przypadku NCY opisano jedynie kilka enzymów. W niektórych drożdżach, w pewnych funkcjach potrzebnych w glikolizie pośredniczy szereg genów/enzymów, zwłaszcza tych, które pełnią dodatkową rolę w kontrolowaniu lub regulowaniu metabolizmu i/lub znajdujących się w punkcie rozgałęzienia, takich jak glukokinaza/heksokinaza, fosfofruktokinaza i dehydrogenaza gliceraldehydo-3-fosforanowa. Normalnie, te izoenzymy są regulowane w różny sposób, co wskazuje na zróżnicowane funkcje w zmieniających się warunkach środowiska. Pewne geny kodujące enzymy glikolityczne są konstytutywne i dają silną ekspresję, np. w S. 1 cerevisiae, gen dla PGK1 (kinazy fosfoglicerynianowej) albo w P. pastoris, gen GAP (dla dehydrogenazy gliceraldehydo-3-fosforanowej), podczas gdy inne enzymy są ściśle regulowane, tak jak w S. cerevisiae, gen ENO1 (dla enolazy). Tabela 1: Wybrane drożdże o znaczeniu biotechnologicznym i odnośne handlowe substraty inne niż glukoza i fruktoza Drożdże Metabolism energetyczny S. cerevisiae Fenotyp Crabtreepozytywny Wybrane substraty Sacharoza, maltoza, rafinoza, etanol

5 S. pombe Fenotyp Crabtreepozytywny Zygosaccharomyces Fenotyp Crabtree- ballii pozytywny Yarrowia Fenotyp Crabtreenegatywny lipolytica Pichia stipitis Fenotyp Crabtreenegatywny Pichia pastoris Fenotyp Crabtreenegatywny Hansenula Fenotyp Crabtreenegatywny polymorpha Schwanninomyces Fenotyp Crabtreenegatywny occidentalis Kluyveromyces Fenotyp Crabtreenegatywny lactis Sacharoza, maltoza, rafinoza Kwas octowy, etanol, glicerol n-alkany, kwasy tłuszczowe, etanol Ksyloza Metanol, glicerol Metanol, glicerol Skrobia, n-alkany, ksyloza, sacharoza, rafinoza, trehaloza, laktoza, etanol Laktoza, sacharoza, maltoza, rafinoza, etanol, glicerol, ksylitol, mleczan [0004] Losy pirogronianu w metabolizmie różnią się znacznie w różnych gatunkach drożdży i w warunkach hodowli. W S. cerevisiae i w innych tak zwanych drożdżach Crabtree-pozytywnych, oddychanie jest hamowane przez glukozę i pokrewne cukry. Prowadzi to transformacji pirogronianu przez dekarboksylazę

6 6 pirogronianową do etanolu i CO 2, nawet wobec dużych ilości tlenu w procesie znanym jako fermentacja. W drożdżach Crabtree-negatywnych, do których należy większość NCY, transformacja pirogronianu do etanolu pojawia się tylko w warunkach anaerobowych. W warunkach aerobowych, pirogronian jest utleniany do CO 2 w cyklu dehydrogenazy pirogronianowej i kwasów trikarboksylowych (TCA). Cykl TCA ma bardzo ważne znaczenie dla metabolizmu komórki z tego powodu, że jest to jedyna droga utleniania cukrów do CO 2. Utlenianie do CO 2 powoduje wytwarzanie NADH, który jest zużywany do wytwarzania energii. Poza tym, półprodukty cyklu TCA są głównymi źródłami metabolitów do celów biosyntezy. Z powodu usuwania półproduktów, cykl TCA 1 musi być uzupełniany aby mógł przebiegać. Głównymi reakcjami anaplerotycznymi w drożdżach są: cykl karboksylazy pirogronianowej i cykl glioksylanowy. Ten pierwszy cykl jest głównym szlakiem przy wzroście na amoniaku jako jedynym źródle azotu, natomiast drugi jest potrzebny do wzrostu na źródłach węgla zawierających mniej niż 3 atomy węgla. W odróżnieniu od tego wybitnego zainteresowania, nic nie wiadomo o genach lub enzymach uczestniczących w cyklu TCA w drożdżach NCY. NADH generowany w reakcjach 2 katabolicznych, bądź w cytosolu bądź w mitochondriach, musi ulec re-utlenieniu do NAD + aby reakcje mogły przebiegać. W drożdżach Crabtree-negatywnych (np. w

7 7 Pichia pastoris), w warunkach aerobowych, NADH jest re-utleniany głównie w łańcuchu oddechowym. Sytuacja jest znacząco różna w drożdżach Crabtree-pozytywnych, takich jak S.cerevisiae, w których współistnieją oddychanie i fermentacja. Przy wzroście na glukozie w warunkach aerobowych, oddychanie jest pod represją glukozy i pojawia się fermentacja. W tych warunkach, NAD + regeneruje się przez tworzenie etanolu (NADH wytwarzany przez glikolizę) albo glicerolu. Oddychanie w drożdżach różni się od schematu tego szlaku u zwierząt, co jest opisane w każdym podręczniku biochemii. Po pierwsze, pewne drożdże, takie jak S. cerevisiae i Kluyveromyces lactis, nie mają kompleksu I łańcucha oddechowego. W tych drożdżach, generowanie 1 NAD + odbywa się bez pompowania protonów przez wewnętrzną błonę mitochondrialną za pośrednictwem zewnętrznej i wewnętrznej dehydrogenazy NADH. Drugą ważną różnicą, występującą w drożdżach Crabtreenegatywnych, grzybach i roślinach jest alternatywny szlak oddechowy występujący równolegle do kompleksu III i IV w łańcuchu cytochromowym. W tym alternatywnym oddychaniu pośredniczy tak zwana alternatywna oksydaza, która przenosi elektrony bezpośrednio z puli ubichinonu na tlen bez pompowania protonów poprzez wewnętrzną 2 błonę mitochondrialną. [000] Dla celów biosyntezy, NADPH jest wytwarzany w części utleniającej szlaku pentozo-fosforanowego (PPP).

8 8 Innymi bardzo ważnymi metabolitami dostarczanymi w tym szlaku są rybozo--fosforan i erytrozo-4-fosforan, potrzebne odpowiednio do syntezy kwasów nukleinowych i ko-faktorów nukleotydowych oraz do syntezy aromatycznych aminokwasów. Ciągle jeszcze istnieje wiele luk w informacji o genach i odpowiadających im enzymach uczestniczących w PPP w drożdżach niekonwencjonalnych. Kilka enzymów wyizolowano z Candida utilis, S. pombe i K. lactis. Charakteryzacja pod względem składu i kinetyki ujawniła szereg różnic pomiędzy tymi enzymami. Z powodu braku informacji, nie można było ocenić ich wpływu na PPP w tych drożdżach, ale wykazano np., że mutanty izomerazy fosfoglukozy w K. lactis, w których nie występuje glikoliza, mają 1 zdolność wzrostu na pożywkach z glukozą, w odróżnieniu od S. cerevisiae. Ta obserwacja wskazuje, że pojemność szlaku pentozo-fosforanu w K. lactis jest wystarczająca do wzrostu na glukozie jako źródle węgla. W drożdżach metylotroficznych, można dodatkowo znaleźć transketolazę (syntazę dihydroksyacetonową). Ten enzym jest zlokalizowany w peroksyzomach i nadaje zdolność asymilacji formaldehydu do metabolizmu komórki przez kondensację z ksylulozo--fosforanem, z wytworzeniem dihydroksyacetonu i gliceraldehydo-3-fosforanu. 2 [0006] Drożdże, jako jednokomórkowe organizmy eukariotyczne dostarczają atrakcyjnych układów ekspresyjnych do produkcji białek rekombinantowych.

9 9 Łączą one zalety bakterii, takie jak dobrze opracowane techniki manipulacji genetycznej, proste, bezpieczne a zatem tanie (w dużej skali) techniki hodowli, z główną zaletą eukariotycznych układów ekspresyjnych, to znaczy, eukariotycznym przetwarzaniem białka. Ze względu na wyżej wspomniane zalety, S. cerevisiae zdominowały tę dziedzinę od wielu lat, co pozwoliło na wytwarzanie ogromnej liczby białek (np. insuliny, HBsAg, HSA) w tym organizmie. S. cerevisiae wykazują pewne ograniczenia z powodu hiperglikozylacji, zatrzymywania wydzielonych białek w przestrzeni periplazmatycznej, niestabilności plazmidu i niskich wydajności produktu. W celu pokonania ograniczeń tego pojedynczego organizmu, opracowano niewielki zbiór 1 drożdży niekonwencjonalnych jako gospodarzy dla ekspresji genu heterologicznego. Między innymi, stosowano K. lactis, Y.lipolytica i drożdże metylotroficzne Candida boidinii, H. polymorpha i P. pastoris, lecz tylko dwa ostatnie gatunki wzbudziły znaczące zainteresowanie gospodarcze. Schizosaccharomyces pombe wykazują pewne cechy bardzo bliskie wyższym organizmom eukariotycznym, co sprawia, że te drożdże stają się bardzo atrakcyjnym gospodarzem dla produkcji heterologicznego białka: (1) mechanizm 2 inicjacji transkrypcji jest bardziej podobny do tego, jaki występuje w wyższych organizmach eukariotycznych, (2) niektóre promotory ssacze funkcjonują w S. pombe,

10 (3) zdolność splicingu RNA, uwydatniająca się w podobieństwie składników spliceosomu do tych występujących u ssaków, (4) rozpoznawalny sygnał zachowania ssaczej siateczki śródcytoplazmatycznej KDEL, () występowanie reszt galaktozowych w glikoproteinach i (6) pewne inne modyfikacje posttranslacyjne, takie jak acetylacja i izoprenylacja białek przebiegają w sposób bardziej podobny do komórek ssaków niż do komórek drożdży. Niektóre z wyżej wymienionych właściwości mogą zwiększyć znaczenie S.pombe w wytwarzaniu białek rekombinantowych w bliskiej przyszłości pod względem produkcji autentycznych białek heterologicznych i ich wysokowydajnych zastosowań, takich jak strukturalna i 1 funkcyjna genomika. [0007] Wszystkie mikroorganizmy posiadają mechanizmy pozwalające dostosowywać ich metabolizm do optymalnego wykorzystania składników pokarmowych w środowisku. Szybka i ścisła adaptacja do tych przymusowych warunków jest głównym czynnikiem regulującym wzrost i inne parametry fizjologiczne wszystkich organizmów. Dla drożdży, tak jak i dla większości mikroorganizmów, glukoza jest preferowanym źródłem węgla i energii. Nie jest zatem dziwne, że glukoza, najpowszechniej 2 występujący w naturze monosacharyd, jest głównym przekaźnikiem dla komórek, wpływającym na wzrost i rozwój tych organizmów poprzez regulowanie ekspresji

11 11 genu, głównie ale nie wyłącznie, na poziomie kontroli transkrypcji. Genomowa analiza transkrypcji ujawniła, że znaczna ilość genów jest regulowana przez zdeterminowany środowiskiem poziom glukozy. Glukozą indukowane są geny o znanej metabolicznej funkcji w utylizacji glukozy, takie jak przenośniki glukozy o niskim powinowactwie i geny dla enzymów glikolitycznych a także geny kodujące białka rybosomalne. Z drugiej strony, glukoza tłumi duży zbiór genów, w tym geny biorące udział w utylizacji alternatywnych źródeł węgla, glukoneogenezie, cyklu glioksylanowym, funkcjach peroksyzosomów i oddychaniu. Represja oddychania (efekt Crabtree) pojawia się tylko w kilku gatunkach drożdży (w drożdżach fermentacyjnych, Crabtree-pozytywnych), 1 takich jak Saccharomyces cerevisiae, natomiast u większości gatunków drożdży glukoza nie wywiera represji na oddychanie (fenotyp Crabtree-negatywny). Chociaż w ostatnich dwudziestu latach zgromadzono szeroką wiedzę o aparacie represji glukozy, głównie w oparciu o drożdże Saccharomyces cerevisiae, to jej rzeczywisty mechanizm, zwłaszcza partie upstream wrażliwości i sygnalizacji glukozy, nie jest w pełni poznany. Nie mniej jednak, dla lepszego zrozumienia niniejszej pracy, poniżej opisano pokrótce kilka 2 głównych czynników w katabolicznej represji węgla, opisanych dla S. cerevisiae.

12 12 [0008] Gen SNF1 koduje kinazę białkową Ser/Thr, którą można znaleźć w kompleksach o wysokiej masie cząsteczkowej w komórkach drożdży. Jest on regulowany przez zmiany konformacyjne w obrębie kompleksu powodowane fosforylacją w podjednostce regulacyjnej Snf1p. Dotychczas wykryto, że trzy kinazy upstream (Pak1p, Elm1p i Tos3p) fosforylują, a więc aktywują Sbf1p. Jego aktywność jest bezwzględnie wymagana do derepresji wielu różnych genów hamowanych przez glukozę. Nie jest więc dziwne, że Snf1p albo jego homologi są powszechnie konserwatywne u eukariotów. [0009] Białko palca cynkowego, Mig1p ma zdolność wiązania się z regionami promotora wielu różnych genów będących pod represją glukozy. Najprawdopodobniej, 1 działa ono przez rekrutację głównego kompleksu represora, Ssn6(Cyc8)-Tup1p. Funkcję Mig1p kontroluje kinaza białkowa Snf1, chociaż nie ma wyraźnego dowodu na bezpośrednią fosforylację. Mig1p jest zlokalizowane w jądrze, w jego formie nie-fosforylowanej. Pozbawienie glukozy powoduje fosforylację Mig1p i następną jego translokację do cytoplazmy. Jeśli do komórek doda się glukozę, wówczas Mig1p szybko wraca do jądra i działa represyjnie na transkrypcję. [00] Adr1p również należy do rodziny białek palca 2 cynkowego i okazało się, że jest ono pozytywnym efektorem białek peroksysomalnych i genu ADH2, kodującego dehydrogenazę alkoholową II znajdującą się

13 13 pod represją glukozy. Ekspresja ADR1 jest regulowana w dół przez glukozę, za pośrednictwem zależnej od cyklicznego AMP (camp) kinazy białkowej przy wysokich poziomach camp. Główny efekt regulatorowy pojawia się na poziomie translacji mrna, jednak obserwowano również efekty regulacyjne w stosunku do transkrypcji oraz stabilności mrna, zależnie od analizowanego szczepu S. cerevisiae. [0011] W przypadku dużej ilości genów, łącznie z wieloma genami zaangażowanymi w metabolizmie oddechowym, transkrypcja jest aktywowana na nie dających fermentacji źródłach węgla przez kompleks Hap2/3/4/. Dla kilku genów zaangażowanych w proces oddychania, takich jak CYC1 (kodujący izo-1-cytochrom 1 c) i COX6 (dla podjednostki VI oksydazy cytochromu c) ustalono, że do derepresji po wzroście na glukozie potrzebna jest Snf1. Transkrypcja HAP4 jest tłumiona w obecności glukozy, chociaż nie wykazano bezpośredniego zaangażowania ani Hap4p ani Snf1p w derepresji. [0012] Gcr1p jest białkiem głównego aktywatora transkrypcji genów glikolitycznych (np. enolazy, gliceraldehydo-3-fosfatazy, dehydrogenazy). Gcr1p, razem z ogólnym czynnikiem transkrypcji Rap1p, jest głównym produktem ekspresji genu glikolitycznego w 2 odniesieniu do koordynacji transkrypcji i jest absolutnie niezbędne do ekspresji na wysokim poziomie. Wzorce ekspresji genomowej S. cerevisiae typu dzikiego

14 14 i mutantu gcr1 rosnące na różnych źródłach węgla ujawniły 3 otwarte ramki odczytu (ORF), w tym genów glikolizy jako Gcr1p-zależnych. [0013] Niniejszy opis niektórych czynników transkrypcji i szlaku Snf1p i Mig1p powinien dostarczyć krótkiego przeglądu niektórych uczestników w sieci represji glukozy. Należy zauważyć, że w represji glukozy uczestniczy więcej cykli regulacyjnych niż szlak Snf1p. Chociaż szeroką wiedzę na temat wrażliwości na glukozę i sygnalizacji glukozy uzyskano już lat temu, ciągle jeszcze główne pytania pozostają bez odpowiedzi: jaka jest natura sygnalizacji glukozy i w jaki sposób znane szlaki sygnalizacji są regulowane i integrowane. [0014] Ograniczona ilość gatunków drożdży ma zdolność 1 wzrostu na metanolu jako jedynym źródle węgla i energii. Należą one do jednego z czterech rodzajów: Pichia, Hansenula, Candida i Torulopsis i mają wspólny ogólny szlak utylizacji metanolu, którego ekspresja przebiega po derepresji lub indukcji metanolem (patrz ). Ponieważ początkowe reakcje tego szlaku przebiegają w kompartmentach w peroksysomach, te organelle są również indukowane. Ze względu na silną indukcję peroksysomów, drożdże Candida boidinii, Pichia methanolica, Pichia pastoris i Hansenula polymorpha 2 były często stosowane w biologii komórki do badań biogenezy i funkcji peroksysomów.

15 1 [001] Jak wspomniano powyżej, drożdże metylotroficzne mają wspólny szlak utylizacji metanolu. Pierwszym etapem jest utlenianie metanolu do formaldehydu i nadtlenku wodoru, katalizowane przez oksydazy alkoholowe (AOX, EC ). Toksyczny H 2 O 2 jest unieszkodliwiany do tlenu i wody przez działanie katalazy. Obydwa enzymy są odseparowywane w peroksysomach. Formaldehyd jest albo utleniany w dwóch kolejnych reakcjach z udziałem dehydrogenazy albo asymilowany w metabolizmie komórki przez kondensację z ksylulozo--fosforanem (XuP). Formaldehyd jest utleniany do mrówczanu i następnie do dwutlenku węgla przez glutationo (GSH)-zależną dehydrogenazę formaldehydową i dehydrogenazę mrówczanową, obydwie 1 zlokalizowane w cytosolu. NADH, generowany w obydwu tych reakcjach jest zużywany do produkcji energii do wzrostu na metanolu. Reakcja kondensacji ma miejsce w peroksysomach i jest katalizowana przez wyżej wspomnianą transketolazę, syntazę dihydroacetonową. Powstałe C3-związki, dihydroksyaceton (DHA) i gliceraldehydo-3-fosforan (GAP) są dalej metabolizowane w cytosolu. Po fosforylacji DHA powstaje fruktozo-1,6- bisfosforan (FBP) w katalizowanej aldolazą reakcji fosforanu dihydroksyacetonu (DHAP) i GAP. FBP ulega 2 przekształceniu do fruktozo-6-fosforanu przez fosfatazę a ksylulozo--fosforan (XuP) jest regenerowany w szlaku pentozo-fosforanu. Jedna trzecia powstałego GAP

16 16 wchodzi do szlaku glukoneogenezy, do syntezy składników komórkowych. [0016] Kluczowe enzymy szlaku utylizacji metanolu, oksydaza alkoholowa i dehydrogenaza mrówczanowa, są wytwarzane w bardzo dużych ilościach po indukcji metanolem. Oksydaza alkoholowa może stanowić ponad 30% ogólnego rozpuszczalnego białka, syntaza dihydroksyacetonu i dehydrogenaza mrówczanowa mogą stanowić do %. Peroksysomy, które również ulegają pobudzeniu, mogą stanowić około 80% objętości komórki. Opracowano sekwencje promotorowe kilku genów utylizacji metanolu do wytwarzania rekombinantowego białka. Między innymi, te silne i indukcyjne promotory są główną przyczyną szerokiego stosowania Pichia pastoris i 1 Hansenula polymorpha jako gospodarzy do produkcji białka. [0017] W H. polymorpha i C. boidinii, jeden gen koduje oksydazę alkoholową: MOX (oksydazę metanolową, H. polymorpha) i AOD1 (oksydazę alkoholową, C. boidinii). Dwa geny wykryto w dwóch gatunkach Pichia, P. pastoris (AOX1 i AOX2) i P. methanolica (AUG1 i AUG2, gen utylizujący alkohol albo MOD1 i MOD2), przy czym Aox1p i Aug1p to główne oksydazy alkoholowe. Porównanie regionów kodujących ujawniło 73-8% podobieństwo na 2 poziomie sekwencji aminokwasowych pomiędzy tymi drożdżami metylomorficznymi [1]. Homologia pomiędzy ORF (otwartymi ramkami odczytu) dla AOX1 i AOX2 z P.

17 17 pastoris wynosi odpowiednio 92% i 97% na poziomach sekwencji nukleotydowych i aminokwasowych [2,3]. Oksydaza alkoholowa jest oktameryczną flawoproteiną zawierającą jeden związany nie-kowalencyjnie FAD bądź jego modyfikowany analog (mfad) na podjednostkę. Translacja AOX ma miejsce na wolnych rybosomach, po niej następuje post-translacyjny import do peroksysomów. Przemieszczenie do peroksysomów jest kierowane przez sekwencję PTS1 (sygnał kierujący peroksysomu, typ 1) na jej zewnętrznym C-końcu. Oligomery Aox tworzą się tylko po imporcie do matrycy peroksysomu. [0018] W C. boidinii i w P. pastoris nie można znaleźć oligomerów Aox w cytosolu, w odróżnieniu do syntazy 1 dihydroksyacetonowej, która w cytosolu tworzy dimer przed jej przemieszczeniem do matrycy peroksysomu. Nie tylko sekwencja promotora oksydazy alkoholowej 1 z Pichia pastoris ale również sam enzym ma znaczenie biotechnologiczne dzięki szerokiemu zakresowi substratów (nienasycone i nasycone alkohole pierwszorzędowe o łańcuchu krótkim do umiarkowanej długości) i wysokiej stabilności w różnych warunkach reakcji. Regulacja wszystkich genów dla oksydazy alkoholowej występuje na poziomie transkrypcji i 2 najprawdopodobniej na etapie początku transkrypcji. Chociaż AOX1 i AOX2 są regulowane podobnie (mrna jest niewykrywalny przy wzroście na glicerolu ani glukozie,

18 18 jest wykrywalny w fazie głodu źródła węgla i wysokie ilości występują podczas wzrostu na metanolu), to ich regiony -flankujące nie wykazują znaczącej homologii [2,4]. [0019] Każde locus AOX wykazuje domniemane miejsce wiązania polimerazy RNA (TATAAA; Goldberg-Hogness albo kasetę TATA) w pozycji -43 względem pierwszego miejsca początku transkrypcji. Obydwie sekwencje liderowe mrna AOX z P. pastoris są wyjątkowo bogate w reszty A i niezwykle długie jak u drożdży (11 nukleotydów (nt) dla AOX1 i 160 nt dla AOX2). Regiony początku translacji wokół kodonu startu ATG (sekwencja Kozak; AOX1: CGAAACG ATG GCT, AOX2: GAGAAAA ATG GCC) są zgodne z opisanymi uprzednio sekwencjami konsensusowymi dla S. 1 cerevisiae i wyższych eukariotów. Fizjologiczna rola drugiego genu oksydazy alkoholowej w P. pastoris i P. methanolica jest wciąż niejasna. Rozerwanie AOX1 albo AUG1 powoduje ciężkie defekty wzrostu w tych szczepach (tak zwany fenotyp (Mut s ) wolnej utylizacji metanolu) podczas gdy szczepy aox2 i aug2 wykazują szybkość wzrostu porównywalną ze szczepem typu dzikiego. W P. methanolica wykryto dziewięć wielokrotnych form oksydazy alkoholowej reprezentujących losową oligomeryzację produktów dwóch genów, Aug1p i Aug2p. 2 AUG 1 i AUG2 są regulowane w różny sposób: przy głodzie węgla i niskim stężeniu metanolu można wykryć tylko Aug1p a przy wzrastającym stężeniu metanolu wzrasta

19 19 stosunek Aug2p do Aug1p. Przesunięcie w kierunku oktamerów z podwyższoną zawartością Aug2p jest wynikiem wzrostu ekspresji genu AUG2, regulowanej na poziomie transkrypcji. Wartości Km dla metanolu tych dwóch homooktamerów Aug1p i Aug2p wynoszą odpowiednio około 0,6 i,6 mm. W połączeniu z odkryciem, że rozerwanie genu AUG1 powoduje defekt wzrostu przy niskich stężeniach metanolu [], wyniki te sugerują, że AUG2 jest zaletą dla P.methanolica podczas wzrostu przy wysokich stężeniach metanolu. W Pichia pastoris nie analizowano bardziej szczegółowo ani roli genu AOX2 ani nie znaleziono korzystnych warunków dla posiadanego drugiego genu oksydazy alkoholowej. Jako, że warunki laboratoryjne odzwierciedlają tylko małą frakcję 1 warunków, w jakich żyją mikroorganizmy w stanie naturalnym, w naturze powinny występować warunki, w których gen AOX2 ma określone selektywne znaczenie dla P. pastoris. [00] Ekspresja AOD1 w C. boidinii i MOX w H. polymorpha znajduje się pod ścisłą represją podczas wzrostu na glukozie lub etanolu jako jedynym źródle węgla, derepresja tego genu następuje przy wzroście na glicerolu a silna indukcja - na metanolu. Ekspresja tych dwóch enzymów jest również w stanie represji jeśli 2 glukoza i metanol są zawarte w pożywce. Jeśli jest obecny glicerol, wówczas metanol może indukować ekspresję genu. Derepresja transkrypcji AOD1 i MOX

20 następuje również podczas głodu węgla a represja pojawia się jeśli w pożywce występuje etanol [6-9]. Za represję metabolizmu utylizacji metanolu przez etanol albo glukozę są odpowiedzialne dwa różne mechanizmy regulacyjne [,11]. W Pichia pastoris sytuacja jest zupełnie inna: AOX1 podlega represji jeśli w pożywce jest glukoza, etanol albo glicerol (w stężeniach nie ograniczających wzrostu). Derepresja przy głodzie węglowym i indukcja przez metanol są podobne do AOD1 i MOX. Źródłami węgla, przy których ekspresja AOX1 podlega derepresji są np. sorbitol, mannitol, trehaloza i alanina [12]. [0021] Przy przestawieniu z metanolu na represyjne źródło węgla, takie jak glukoza lub etanol, peroksysomy 1 ulegają degradacji w ciągu godzin podczas adaptacji do nowego źródła węgla. Degradacja proteolityczna w wakuolach drożdży podlega znowu dwóm różnym mechanizmom podczas adaptacji do glukozy lub etanolu, zwanymi odpowiednio mikro- i makroautofagią. [0022] Jak wspomniano powyżej, drożdże metylotroficzne Pichia pastoris i Hansenula polymorpha są szeroko stosowane przy produkcji białek rekombinantowych. Dotychczas w P. pastoris wytwarza się ponad 00 białek. Ich rozwój dokonał się dzięki kilku właściwościom, 2 które sprawiły, że stały się one bardziej korzystne niż inni rekombinantowi gospodarze ekspresyjni: 1) posiadają one wspólną dla drożdży ogólną zaletę w

21 21 odniesieniu do manipulacji genetycznych i technologii hodowli (na skalę laboratoryjną i przemysłową); 2) zdolność wzrostu do wyjątkowo wysokich gęstości komórek; i 3) wysoką wydajność produkcji rekombinantowego białka (wydzielanego lub wewnątrzkomórkowego). Do celów produkcji rekombinantowego białka opracowano silne promotory indukcyjne dla genów kodujących szlak reakcji utylizacji metanolu. Najszerzej stosowane są regiony promotora genów oksydazy alkoholowej AOX1 i MOX, odpowiednio z P. pastoris i H. polymorpha. Również inne regiony promotora genów szlaku utylizacji metanolu stosowano do intensyfikacji produkcji rekombinantowego białka: promotory FMD (dehydrogenazy mrówczanowej) i 1 DAS1 (syntazy dihydroksyacetonowej) w H.polymorpha i C. boidinii i promotor FLD1 (dehydrogenazy formaldehydowej) w P. pastoris. Ten ostatni może być indukowany metyloaminą jako jedynym źródłem azotu z glukozą jako źródłem węgla. Dostępne są również promotory do konstytucyjnej ekspresji obcych genów: element promotora GAP (dehydrogenazy gliceraldehydo-3- fosforanowej) w P. pastoris i promotor PMA1 (kodujący H + -ATP-azę błony plazmatycznej) z H. polymorpha. Opracowano szereg auksotroficznych kombinacji szczep 2 gospodarza/gen markerowy dla P. pastoris (np. HIS4) i H. polymorpha (np. LEU2 i URA3). Dostępne są również dominujące markery selekcyjne (np. Zeocin, gen

22 22 oporności G418). Integracji genu do drożdży metylotroficznych dokonuje się głównie (jeśli nie wyłącznie) przez integrację homologiczną. Wektory niosące region ARS (autonomicznie replikującej się sekwencji) są również dostępne ale są one zwykle całkiem nistabilne jeśli wystąpi ciśnienie selekcji, co sprawia, że mają one ograniczone zastosowanie technologiczne. W P. pastoris, obcy gen integruje się specyficznie co do miejsca, albo w locus AOX1 albo w locus HIS4. Innymi możliwymi miejscami integracji są np. locus GAP (dla ekspresji GAP) albo dowolne inne loci markera selekcyjnego (np. ADE1, URA3, ARG4 i LEU2). W H. polymorpha, kasety ekspresyjne są losowo zintegrowane w układzie głowa do ogona, co prowadzi do 1 stabilnych mitotycznie integrantów w dużej ilości kopii (nawet do 0). Duża ilość kopii nie zawsze przekłada się jednak na wysoki poziom ekspresji. Dodatkowymi czynnikami o dużym znaczeniu są: struktura kasety integracyjnej, rodzaj i struktura białka, które ma być wytwarzane i miejsce integracji. Szczególnie struktura 2 kasety ekspresyjnej ma duży wpływ na efekt dawki genu. Dalszy opis, jak optymalizować kasetę ekspresyjną i dawkę genu znajduje się w pozycjach [13 i 14]. Drożdże metylotroficzne należą do grupy drożdży Crabtreenegatywnych, a zatem, przy wzroście w warunkach aerobowych produkcja etanolu pojawia się jedynie na bardzo niskim poziomie. Dzięki temu, można prowadzić

23 23 wzrost tych drożdży do bardzo wysokich gęstości komórek w hodowlach w fermentorach, uzyskując wysokie wydajności produktu. Kierowaną promotorem AOX1 produkcję białka można dalej zwiększyć 3--krotnie jeśli stężenie metanolu w bioreaktorze znajduje się w zakresach ograniczających wzrost. Fakt, że P. pastoris wydziela w standardowych warunkach jedynie niewielkie ilości białek endogennych sprawia, że każde wydzielane do środowiska białko rekombinantowe staje się najliczniej występującym białkiem w pożywce. Sekrecja może służyć jako zasadniczy pierwszy etap w następującym po niej procesie oczyszczania. Do sekrecji białka, w P. pastoris i H. polymorpha szeroko stosuje się sekwencję prepro-liderową MFα1 (czynnik dopasowania 1 α) z S. cerevisiae i sekwencje pochodzące z kwaśnej fosfatazy (PHO1). W niektórych przypadkach, wystarczającą sekrecję osiąga się dla białek roślinnych, grzybowych i ssaczych, niosących swe własne naturalne sygnały sekrecji. Jak wspomniano powyżej, drożdże mają zdolność prowadzenia modyfikacji posttranslacyjnych, takich jak tworzenie mostków dwusiarczkowych, przetwarzanie sekwencji sygnalnych (np. sekwencji prepro-liderowej MFα1), podłączania reszty lipidowej i N- i O-glikozylacji. Podczas gdy 2 komórki ssaków wytwarzają wysoce złożone, związane poprzez azot lub tlen, struktury oligosacharydowe złożone z wielu różnych cukrów (np. N-

24 24 acetyloglukozaminy, galaktozy i kwasu sialowego) to większość drożdży wytwarza struktury o wysokiej zawartości mannozy, w których brakuje niektórych jednostek cukrowych, takich jak galaktoza lub kwas sialowy. Te nie-ssacze struktury mogą stwarzać poważne problemy w zastosowaniach leczniczych, głównie z powodu ich wysokiej potencjalnej immunogenności. W H. polymorpha i P. pastoris, w odróżnieniu od S. cerevisiae, hipermannozylacja jest mniej powszechna i w przyłączonych poprzez azot oligosacharydach nie są wbudowane wysoce immunogenne końcowe α-1,3-związane reszty mannozy. Dla przezwyciężenia problemów immunogenności (i niektórych innych, takich jak słaba stabilność w układzie krążenia) czyni się wysiłki w 1 kierunku humanizowania pochodzących z drożdży struktur oligosacharydowych, i jak donosi ostatnie piśmiennictwo, zwłaszcza w P. pastoris. Dotychczas, znakomita większość badań naukowych i procesów przemysłowych bazowała na dobrze znanych drożdżach S. cerevisiae. Dzięki wzrastającej wiedzy o drożdżach niekonwencjonalnych i w świetle oczywistych korzyści pod względem fermentacji w dużej skali i glikozylacji, H. polymorpha i P. pastoris stały się szybko drożdżami z wyboru. Na szczególną uwagę zasługuje fakt, że kilka 2 procesów produkcyjnych zostało wdrożonych w przemyśle. [0023] W WO 02/08160 ujawniono identyfikację regionów promotora AOX1, które mogą być użyte do konstruowania

25 2 zmutowanych promotorów AOX1. Ujawnione tam wycięte regiony sekwencji promotora AOX1 są bardzo długie, co powoduje, że obserwuje się efekt skumulowany a nie pojedyncze efekty oddzielnych regulatorowych sekwencji tego promotora. Takie podejście nie pozwala jednak na opracowanie silnie wzmocnionych promotorów. Szczególnie przy konstruowaniu nowych promotorów posiadających cechy wzmocnione drogą delecji albo duplikacji części oryginalnego promotora, potrzebna jest wiedza o dokładnym obszarze tej sekwencji regulatorowej. [0024] Celem niniejszego wynalazku jest dostarczenie ulepszonego promotora AOX1 o wzmocnionych właściwościach, w celu ułatwienia procesów dalszego przetwarzania w produkcji białka, w celu zwiększenia 1 wydajności w odniesieniu do czasu i przestrzeni i ułatwienia poprawy jakości produktu. [002] Innym celem jest dostarczenie silnego promotora AOX1 w wektorze albo w szczepie gospodarza, który to promotor uczestniczy częściowo albo całkowicie w represji glukozy. Korzystne jest posiadanie promotora, który napędza silną ekspresję w obecności wysokich stężeń glukozy. [0026] Dalszym celem niniejszego wynalazku jest dostarczenie promotora AOX1, który umożliwia produkcję 2 białka z użyciem zmniejszonej ilości metanolu albo bez metanolu. Takie promotory mogłyby mieć silny wpływ na

26 26 przemysłowe procesy produkcyjne. Ze względu na wymogi bezpieczeństwa, w fabrykach stosujących metanol jako czynnik indukujący, wymagana jest szczególna aparatura. To eliminuje stosowanie P. pastoris w wielu mniej wyspecjalizowanych zakładach produkcyjnych. Poza tym, stabilność białka w obecności metanolu może zaburzać indukcję ekspresji białka przez metanol. Nie ma to tak krytycznego znaczenia przy produkcji pospolitych białek przemysłowych ale staje się dużym problemem w przypadku np. wydzielanych do podłoża białek stosowanych w lecznictwie. [0027] Konstruowanie takich promotorów wymaga wiedzy o szczególnych częściach promotora AOX1 z P. pastoris typu dzikiego (np. o elementach regulacyjnych, 1 miejscach wiązania czynnika transkrypcji), które po zmutowaniu w jakiś sposób wywierają wpływ na zachowanie się ekspresji. Z tego względu, celem wynalazku jest zidentyfikowanie tych części i dzięki temu dostarczenie środków do tworzenia promotorów AOX1 o ulepszonych cechach. [0028] Tak więc, przedmiotem wynalazku jest zmutowany promotor oksydazy alkoholowej 1 (AOX1) z P. pastoris z promotora AOX1 P. pastoris typu dzikiego (SEQ ID Nr. 1) zdefiniowany w zastrzeżeniach. Ten zmutowany promotor 2 może ponadto zawierać co najmniej jedną mutację wybraną z grupy obejmującej:

27 27 a) miejsce wiązania czynnika transkrypcji (TFBS), b) nukleotydy 170 do 191 (-784 do -763), nukleotydy 192 do 213 (-762 do -741), nukleotydy 192 do 2 (-762 do - 744), nukleotydy 7 do 9 (-747 do -74), nukleotydy 214 do 23 (-740 do -719), nukleotydy 304 do 30 (-60 do -604), nukleotydy 364 do 393 (-90 do -61), nukleotydy 434 do 08 (- do -446), nukleotydy 09 do 1 (-44 do -403), nukleotydy 2 do 60 (-402 do - 394), nukleotydy 8 do 617 (-369 do -337), nukleotydy 621 do 660 (-333 do -294), nukleotydy 62 do 683 (-329 do -271), nukleotydy 736 do 741 (-218 do -213), nukleotydy 737 do 738 (-217 do -216), nukleotydy 726 do 7 (-228 do -199), nukleotydy 784 do 800 (-170 do - 14) albo nukleotydy 823 do 861 (-131 do -93) z 1 sekwencji SEQ ID Nr 1 oraz ich kombinacje. Liczby ujemne w nawiasach użyte w opisie odzwierciedlają odpowiednie pozycje promotora względem kodonu początku translacji (czyli ATG). Przykładowo, A z ATG w sekwencji kwasu nukleinowego zawierającej N x GACTATGN y odpowiada pozycji +1, natomiast T przed A z ATG odpowiada pozycji -1. [0029] Zgodnie z wynalazkiem, zmutowany promotor AOX1 zawiera conajnmiej jedną mutację w obrębie miejsca wiązania czynnika transkrypcji i/lub jedną z 2 wymienionych powyżej sekwencji kwasu nukleinowego. Okazało się, że szczególnie te regiony promotora AOX1 nadają się do modyfikacji tego promotora w celu zmiany

28 28 jego właściwości. Można również oczywiście wprowadzić kombinację mutacji wyszczególnionych powyżej dla wzmocnienia cech charakterystycznych promotora AOX1 (np. dwie mutacje TFBS wybrane z a), jedną mutację TFBS wybraną z a) i jedną mutację wybraną z b), jedną mutację wybraną z a) i dwie mutacje wybrane z b)). Przykładowo, mutację TFBS można połączyć z mutacją w obrębie nukleotydów 737 do 738 (-217 do -216) i/lub nukleotydów 7 do 9 (-747 do -74) z sekwencji SEQ ID Nr 1. Ekspresję białka pod kontrolą promotora AOX1 w Pichia pastoris indukuje się generalnie przez dodanie do pożywki metanolu i hamuje obecnością glukozy w pożywce. W celu wzmocnienia lub osłabienia wpływu tych dodatków do pożywki na ekspresję białka, korzystnie 1 dokonuje się mutacji promotora w podanych powyżej regionach tego promotora. Skuteczność zmutowanych promotorów AOX1 w wytwarzaniu danego białka waha się zależnie od ilości (np. kopii) wektora zintegrowanego w chromosomie gospodarza. Okazało się, że zwłaszcza szczepy niosące wiele kopii (szczepy wielokopiowe) wykazują wzmocnione działanie promotora. Oporność na antybiotyk szczepów Pichia zależy od ilości kaset oporności na antybiotyk (wektory wprowadzone do gospodarza zawierają korzystnie kasetę oporności na 2 antybiotyk, co umożliwia wzrost gospodarza na/w pożywce zawierającej antybiotyk jako marker selekcyjny) zintegrowanych w chromosomie danego gospodarza, a więc,

29 29 można wytwarzać szczepy wielokopiowe przez stosowanie wzrastających stężeń antybiotyku (w zakresie od µg/ml do mg/ml, korzystnie od 0 µg/ml do 00 µg/ml; zależnie od użytego antybiotyku; dla przykładu, genetycynę w stężeniu 0,1 do mg/ml, korzystnie 0,2 do mg/ml, szczególnie 0,2 do 4 mg/ml, zeocynę w stężeniu do 000 µg/ml, korzystnie 0 do 3000 µg/ml, szczególnie 0 do 00 µg/ml) na płytkach z agarem selekcyjnym w celu zwiększenia ciśnienia selekcji (np. [14]; Scorer C. A. i wsp., (1994) Bio/Technology 12: ). Okazało się jednak, że wzrost komórek niosących wielokrotność kaset oporności na antybiotyk jest nie tylko zależny od stężenia antybiotyku ale również zależny od czasu. Tak więc, szczepy 1 wielokopiowe mają zdolność wzrostu do wielkości wykrywalnej kolonii na podłożu zawierającym to samo stężenie antybiotyku w krótszym okresie czasu niż szczepy jednokopiowe. Takie zachowanie daje możliwość specjaliście wykrycia i wyizolowania szczepów wielokopiowych zanim szczepy jednokopiowe zaczną rosnąć. Przykładowo, szczep niosący jedną pojedynczą kopię kasety oporności na antybiotyk rośnie na płytce agarowej do wielkości wykrywalnej kolonii w czasie 72 godzin, podczas gdy ten sam szczep niosący więcej niż 2 jedną kopię tej kasety rośnie do tych samych rozmiarów w czasie 24 do 48 godzin.

30 30 [0030] Szczególnie szczepy wielokopiowe niosące promotor AOX1 z mutacjami w obrębie nukleotydów 694 do 723 (-260 do -231) i w obrębie nukleotydów 737 do 738 (-217 do -216) wykazały nieoczekiwanie zwiększone szybkości ekspresji. [0031] W celu zwiększenia wydajności ekspresji białka w danym gospodarzu w obecności metanolu, korzystnie mutuje się nukleotydy 170 do 23 (-784 do -719) w promotorze AOX1 (SEQ ID Nr 1). Mutacja w tym regionie zwiększa ekspresję białka do 1 130% w porównaniu z promotorem AOX1 typu dzikiego, pod warunkiem, że plazmid niosący ten zmutowany promotor AOX1 jest tylko raz zintegrowany w chromosomie/genomie gospodarza (mutant jednokopiowy). Jednakże, mutacje w obrębie 1 wszystkich innych wymienionych powyżej regionów zmniejszają albo nie mają wpływu na skuteczność metanolu w indukowaniu ekspresji białka. Odwrotnie, mutacje w regionach promotora w promotorze AOX1 typu dzikiego (jak podano powyżej) prowadzą zależnie od danej mutacji do zwiększonej lub zmniejszonej ekspresji białka w warunkach derepresji (np. patrz tabela 13, przykład 1). [0032] Jednakże rekombinantowe szczepy niosące więcej niż jedną kopię zmutowanych promotorów AOX1 są to 2 szczepy wykazujące zwiększoną aktywność w warunkach derepresji i indukcji metanolem (szczepy wielokopiowe, np. patrz fig. 7, przykład 2). Konkretnie, szczepy

31 31 wielokopiowe niosące mutacje w obrębie nukleotydów 694 i 723 z SEQ ID Nr. 1 (d6), w obrębie nukleotydów 694 i 723 (-260 i -231) z SEQ ID Nr. 1 (d6), w obrębie nukleotydów 694 i 723 (-260 i -231) i w obrębie nukleotydów 304 i 30 (-60 i -604) z z SEQ ID Nr. 1 (d2d6), w obrębie TFBS, zwłaszcza w Rap1, Gcr1, QA1F, Hsf_1, Adr1, Hsf_2, Mat1MC, abaa i Hap234, wykazują zwiększoną ekspresję w warunkach derepresji i/lub w warunkach indukcji metanolowej, w porównaniu z ekspresją białek pod kontrolą promotora AOX1 typu dzikiego. W warunkach derepresji, niektóre spośród tych szczepów wielokopiowych wykazują ekspresję białka na poziomie około -krotnie wyższym w porównaniu z ekspresjami pod kontrolą promotora typu dzikiego. W 1 obecności metanolu jako induktora, wydajność ekspresji ponad -krotnie wzrasta, jeśli stosuje się promotor według wynalazku. Tak więc, te mutacje, zwłaszcza jeśli występują w gospodarzu w formie wielu kopii, stosuje się korzystnie do ekspresji białek. Kombinacja dwóch albo większej ilości wyżej wymienionych mutacji może dalej zwiększyć siłę promotora (patrz fig. 7, przykład 2). [0033] Miejsca wiązania czynnika transkrypcji można identyfikować doświadczalnie (np. techniką innej 2 szybkości migracji w żelu (EMSA) albo techniką odbicia stopy) bądź przez porównanie sekwencji ze znanymi

32 32 miejscami wiązania czynnika transkrypcji (np. metodą analizy komputerowej [1]). [0034] Znajomość regionów promotora, które wpływają na siłę i charakterystykę tego promotora można spożytkować do projektowania promotorów o wyróżniających się właściwościach (wysoka ekspresja białka w warunkach derepresji i/lub wysoka ekspresja białka w obecności metanolu). Poza tym, właściwości te można wzmocnić albo zmienić jeśli te zmutowane promotory zintegruje się raz lub więcej razy w genomie gospodarza (patrz przykłady 1 do 3). [003] W niektórych przypadkach trzeba jednak obniżyć aktywność promotora zamiast jej zwiększania. Szczególnie, wymaga się, aby koekspresja białek 1 regulatorowych, takich jak kinazy, fosforylazy i białka pomocnicze, takie jak chaperony, izomerazy dwusiarczków białkowych, izomerazy cis-trans, foldazy, izomerazy dwusiarczków białkowych i proteazy, była w wielu przypadkach niska w porównaniu z głównym produktem, który może być wytwarzany przez komórkę pod promotorem typu dzikiego albo pod promotorem wzmocnionym zgodnie z niniejszym wynalazkiem. Szczególnie okazuje się korzystna połączona ekspresja dwóch różnych produktów (np. białka pomocniczego i głównego produktu) pod 2 kontrolą odpowiednio promotora AOX1 o zwiększonej aktywności i promotora AOX1 o zmniejszonej aktywności (w porównaniu z aktywnością typu dzikiego), ponieważ

33 33 szybkość ekspresji głównego i drugorzędowego produktu różnią się nawet bardziej niż w przypadku użycia promotorów AOX1 typu dzikiego. Zredukowaną ekspresję można korzystnie osiągnąć przez delecję miejsc wiążących aktywatora, takich jak HSF albo HAP albo przez insercję miejsc wiążących represora do promotora AOX1 typu dzikiego. Tak więc, zastosowanie promotora AOX1 o obniżonej aktywności zapobiega przeciążeniu maszynerii ekspresji białka w komórce, którego konsekwencją mogłoby być zmniejszenie wydajności głównego produktu. Dla przykładu, Bessette P.H. i wsp. (PNAS USA (1999) 96: ) wykazał, że ekspresję aktywnego polipeptydu można znacznie zwiększyć przez koekspresję tioredoksyny. 1 [0036] W korzystnym rozwiązaniu, promotor zawiera dalszą mutację w obrębie nukleotydów 694 do 723 (-260 do -231) i/lub nukleotydów 729 do 763 (-22 do -191) w sekwencji SEQ ID Nr. 1. [0037] Mutacja dotykająca tych zakresów nukleotydów w kombinacji z mutacją opisaną powyżej daje jeszcze bardziej wzmocnioną aktywność promotora. Na przykład, podwójna mutacja w obrębie nukleotydów 694 do 723 (-260 do -231) i nukleotydów 737 do 738 (-217 do -216) w sekwencji SEQ ID Nr. 1 prowadzi do uzyskania promotora 2 wykazującego wyższe poziomy ekspresji w warunkach derepresji a także, w warunkach indukcji, w porównaniu do poziomów ekspresji w tych samych warunkach dla

34 34 promotora typu dzikiego. Efekt tej podwójnej mutacji można wzmocnić, jeśli kwas nukleinowy stanowiący ten promotor wprowadzi się do komórki w ilości większej niż jedna kopia (otrzymując klon wielokopiowy). [0038] Mutacją jest korzystnie delecja, substytucja, insercja, inwersja i/lub multiplikacja. [0039] W celu modyfikacji cech promotora AOX1 typu dzikiego z Pichia pastoris, możliwych jest kilka typów mutacji. Obszary promotora zawierające wyżej wspomniane regiony (miejsca wiązania czynnika transkrypcji, TFBS, nukleotydy 170 do 23 (-784 do -719), 170 do 191 (-784 do -763), 192 do 213 (-762 do -741), 192 do 2 (-762 do -744), 7 do 9 (-747 do -74), 214 do 23 (-740 do -719), 304 do 30 (-60 do -604), 364 do 393 (-90 1 do -61), 434 do 08 (- do -446), 09 do 1 (-44 do -403), 2 do 60 (-402 do -394), 8 do 617 (-369 do -337), 621 do 660 (-333 do -294), 62 do 683 (-329 do 271), 694 do 723 (-260 do -231), 729 do 763 (-22 do -191), 736 do 741 (-218 do -213), 737 do 738 (-217 do - 216), 726 do 7 (-228 do -199), 784 do 800 (-170 do - 14) albo 823 do 861 (-131 do -93) z sekwencji SEQ ID Nr. 1) mogą być częściowo lub całkowicie usunięte przez delecję, częściowo lub całkowicie podstawione innymi nukleotydami lub sekwencjami kwasu nukleinowego, 2 rozerwane przez insercję pojedynczych nukleotydów albo sekwencji kwasów nukleinowych, częściowo lub całkowicie inwertowane albo zwielokrotnione. Wszystkie te mutacje

35 3 prowadzą do zmiany w aktywności promotora, gdyż cechy strukturalne i/lub miejsca rozpoznania/wiązania dla np. czynników transkrypcji zostały naruszone przez te mutacje. Zmiany te mogą jednak prowadzić do zwiększonej lub zmniejszonej aktywności promotora w porównaniu z promotorem typu dzikiego. [0040] Ze stanu techniki dobrze wiadomo, że zwielokrotnienie/podwojenie specyficznych obszarów kwasu nukleinowego może zwiększać aktywność promotora. Ta regulacja ekspresji genu w wielu promotorach eukariotycznych, zwłaszcza w promotorach drożdżowych, wywołuje wiele interakcji pomiędzy czynnikami transkrypcji związanymi w obrębie promotora. Do funkcjonowania nawet najmniejszych elementów cis-acting 1 może być wymaganych wiele miejsc. W komórkach drożdży, sekwencje upstream aktywatora (UAS) są konieczne do transkrypcji. One działają w każdej orientacji i przy zmiennej odległości od kasety TATA i miejsca początku transkrypcji ale w odróżnieniu od wzmacniaczy w wyższych organizmach eukariotycznych, one muszą się znajdować w górę od tych podstawowych elementów. UAS są celem dla kilku aktywatorów transkrypcji. [0041] Większość zjawisk represji w komórkach drożdży jest wynikiem inaktywacji bądź braku czynników 2 transkrypcji. Można jednak zidentyfikować również pewne negatywne miejsca regulatorowe (sekwencje represji upstream (URS).

36 36 [0042] W oparciu o analizę delecji promotora AOX2 z P. pastoris wykryto trzy regiony regulatorowe, w tym dwa regiony działające negatywnie (URS1 i URS2) i jedną domenę działającą pozytywnie (UAS)[3]. Dla promotora MOX z H. polymorpha również opisano dwie sekwencje aktywujące upstream (UAS1 i UAS2) i jedno miejsce wiązania represora (URS1) [8]. Korespondujące sekwencje można było również zidentyfikować na promotorach AOX1 (nukleotydy 8 do 614 (-369 do -340) i 72 do 76 (- 229 do -198), wykazując podobieństwa do UAS w AOX2 [3], jak również nukleotydy 622 do 66 (-332 do -298) [8]. Multiplikacja (2, 3, 4,, 6 lub 7 razy UAS) tych obszarów kwasu nukleinowego może dać promotor o zwiększonej sile, prowadząc do jeszcze silniejszej 1 ekspresji białka. Tak więc, konstruowanie promotorów zawierających zwielokrotnione UAS, korzystnie z udziałem wyżej wymienionych regionów sekwencji podobnych do UAS z AOX2 i MOX albo innych wielokrotnych obszarów sekwencji (np. wymienionych powyżej zakresów sekwencji kwasu nukleinowego) jest również objęte przedmiotem wynalazku i jest uznane za rozwiązanie korzystne. Sekwencja aktywująca stanowi na ogół kilkuset par zasad promotora. Przykładowo, najsilniej aktywujące sekwencje stanowią od około 0 do 400 par 2 zasad promotora, który jest wzmocniony. Dalej w górę, promotor zwykle zawiera dalsze wzmacniacze i miejsca wiązania czynnika transkrypcji.

37 37 [0043] Standardowymi sposobami znanymi specjalistom z tej dziedziny (opisanymi np. Molecular Cloning: A Laboratory manual (trzecie wydanie), J. Sambrook i D. Russell, 01, Cold Spring Harbor Laboratory Press) można wprowadzić co najmniej jedną mutację promotora AOX1. [0044] Według korzystnego rozwiązania niniejszego wynalazku, miejsce wiązania czynnika transkrypcji (TFBS) jest wybrane z grupy obejmującej Hap1, Hsf, Hap234, abaa, Stre, Rap1, Adr1, Mat1MC, Gcr1 i QA-1F. [004] Zmutowanie chociażby jednego z tych TFBS daje zmutowane promotory o różnych charakterystykach (patrz przykład 2). [0046] Korzystnie, miejsce wiązania czynnika 1 transkrypcji (TFBS) Hap1 obejmuje nukleotydy 4 (-900) do 8 (-896) z sekwencji SEQ ID Nr.1, Hsf obejmuje nukleotydy 142 (-812) do 149 (-80) i 17 (-437) do 24 (-430) z sekwencji SEQ ID Nr.1, Hap234 obejmuje nukleotydy 196 (-78) do 0 (-74), 6 (-748) do 2 (-744) i 668 (-286) do 672 (-282) z sekwencji SEQ ID Nr.1, abaa obejmuje nukleotydy 219 (-73) do 224 (-730) z sekwencji SEQ ID Nr.1, Stre obejmuje nukleotydy 281 (-673) do 28 (-669) z sekwencji SEQ ID Nr.1, Rap1 obejmuje nukleotydy 33 (-619) do 339 (-61) z 2 sekwencji SEQ ID Nr.1, Adr1 obejmuje nukleotydy 371 (- 83) do 377 (-77) z sekwencji SEQ ID Nr.1, Mat1MC

38 38 obejmuje nukleotydy 683 (-271) do 687 (-267) z sekwencji SEQ ID Nr.1, Gcr1 obejmuje nukleotydy 702 (- 22) do 706 (-248) z sekwencji SEQ ID Nr.1 i QA-1F obejmuje nukleotydy 747 (-7) do 761 (-193) z sekwencji SEQ ID Nr.1. [0047] Te TFBS można zidentyfikować eksperymentalnie albo przez porównanie ze znanymi TFBS z innych promotorów (np. z promotorami eukariotów) z pomocą programów komputerowych (patrz przykład 1). [0048] Zestawienie wpływu zmutowanych promotorów AOX1 na ekspresję białek, peptydów lub funkcyjnych kwasów nukleinowych jest podane w tabeli 2 (w porównaniu z aktywnością dla typu dzikiego). Tabela 2: Wpływ mutantów promotora AOX1 typu dzikiego 1 na ekspresję białek, peptydów lub funkcyjnych kwasów nukleinowych Mutacja Klon jednokopiowy Klon wielokopiowy Warunki Warunki Warunki Warunki derepresji 1 indukowania derepresji 1 indukowa- metanolem 1 nia metanolem 1 ΔHap1 + ΔHsf_ Δ1 + +