MED. DOŚW. MIKROBIOL., 2012, 64: 239-244 Replikacja wirusa HCV w linii komórkowej Huh 7.5 HCV replication in Huh 7.5 cell line Marcin Komorowski, Agnieszka Kołakowska, Paulina Godzik, Kazimierz Madaliński Pracownia Immunopatologii Zakażeń Hepatotropowych Zakładu Wirusologii Narodowego Instytutu Zdrowia Publicznego Państwowego Zakładu Higieny w Warszawie Zakażenie wirusem zapalenia wątroby C (HCV) stanowi globalny problem zdrowotny. Prowadzone są intensywne badania nad stworzeniem komórkowego modelu replikacji wirusa. Opracowany konstrukt HCV o genotypie 2a (JFH1 Japanese Fulminant Hepatitis) badano in vitro początkowo w linii komórkowej Huh 7. Ze względu na niską infekcyjność JFH1 w stosunku do linii Huh 7 zastąpiono ją linią komórkową Huh 7.5. Celem bieżącej pracy było zbadanie dynamiki zmian ilości wirusowego RNA w hodowli Huh 7.5. Słowa kluczowe: wirus zapalenia wątroby C, linia komórkowa Huh - 7.5, replikacja wirusowa ABSTRACT Introduction. Infection with hepatitis C virus is a serious worldwide health problem. Since its discovery in 1989, the development of a cell culture system for HCV has been a major goal for scientists worldwide. In 2005 the first tissue culture that led to the production of HCV particles (2a genotype) has been created. The aim of the study was to determine viral RNA level in an infectious HCV cell culture system. Methods. Huh-7.5 cell line was infected with the JFH1 (Japanese Fulminant Hepatitis) RNA by lipofection. The level of HCV RNA was measured in supernatant of the cell culture by Real-Time PCR method. Results. HCV RNA was detected in the supernatant of Huh-7.5 cell line infected with the use of JFH1 RNA and lipofectamin. The maximal level of HCV RNA (3.69x10 9 copies/ml) was detected 96h after transfection. After about 30 days of transfection, HCV RNA was on the stable level (10 7 10 8 ). Conclusions. Huh-7.5 cell line infected with HCV form a robust cell culture model of HCV infection. HCV replicates on high levels in Huh-7.5, which is the crucial event for the investigation of new antivirals in in vitro model. Key words: hepatitis C virus, Huh 7.5 cell line, viral replication
240 M. Komorowski i inni Nr 3 WSTĘP Wirus zapalenia wątroby C (HCV) stanowi poważny problem zdrowotny. Według danych Światowej Organizacji Zdrowia na świecie jest do 170 mln osób zakażonych HCV (9). U ponad 80% z nich dochodzi do zakażenia przewlekłego, które może prowadzić do włóknienia, marskości wątroby, a nawet raka wątrobowo-komórkowego (7). Dotychczas nie udało się opracować szczepionki przeciwko HCV, a obowiązujący standard leczenia przeciwwirusowego nie daje satysfakcjonujących rezultatów. Obecnie prowadzi się badania nad potencjalnymi lekami przeciwko HCV. Podstawowymi komórkami gospodarza, w których dochodzi do replikacji HCV są hepatocyty. Wirus dostaje się do wnętrza komórki poprzez ph zależną endocytozę, poprzedzoną połączeniem wirusowej glikoproteiny E2 z komórkowym receptorem CD81. Uwolnione w ten sposób wirusowe RNA służy jako mrna w procesie translacji poliproteiny. Następnie poliproteina przetwarzana jest przez komórkowe i wirusowe białka, w wyniku czego powstaje 10 białek wirusa. Wśród nich można wyróżnić białka strukturalne: białko rdzenia, dwie glikoproteiny (E1 i E2), p7 oraz białka niestrukturalne: NS2, NS3, NS4A, NS4B, NS5A i NS5B. Białka niestrukturalne odpowiadają za translację oraz replikację wirusowego RNA. Replikacja HCV rozpoczyna się od syntezy komplementarnej ujemnej nici RNA, która służy jako matryca do produkcji wielu dodatnich nici genomowego RNA. Niekompletne są dane na temat składania wirusa i uwalniania cząstek wirusowych z komórki. Sugeruje się, iż wirus opuszcza komórkę poprzez konstytutywny szlak wydzielniczy. Od roku 1989, w którym zidentyfikowano HCV, prowadzone są intensywne badania nad stworzeniem komórkowego modelu replikacji wirusa. Badania nad replikacją wirusa HCV z wykorzystaniem konstruktów zawierających pełnogenomowe cdna były prowadzone przez wielu badaczy, jednak nie dawały wystarczająco dobrych rezultatów (5,10). Replikacja HCV zachodziła na bardzo niskim poziomie i nie udało się zaadoptować hodowli komórkowej tak, aby otrzymać jej wysoki poziom (4). Dopiero w 2005 roku pojawiło się pierwsze doniesienie o stworzeniu systemu replikacyjnego HCV in vitro. Do stworzenia konstruktu HCV wykorzystano RNA wirusa o genotypie 2a (JFH1 Japanese Fulminant Hepatitis), wyizolowane od japońskiego pacjenta z piorunującym zapaleniem wątroby. Przepisany na cdna materiał genetyczny wirusa wklonowano w plazmid, a następnie przeprowadzono transkrypcję in vitro. Otrzymany produkt wprowadzono do linii komórkowej Huh 7 (hepatoma cell line). Po 24 godzinach wykryto pełnogonomowe RNA wirusa w komórkach, zaś po 72 - białko rdzeniowe oraz białka niestrukturalne wirusa. Cząstki wirusowe wykryto w supernatancie znad hodowli metodą mikroskopii elektronowej. Były one zakaźne zarówno w stosunku do niezakażonej linii Huh 7, jak i szympansów (8). Ograniczeniem opisanego systemu był niski poziom infekcyjności JFH1 w stosunku do linii Huh 7. Wyższą infekcyjność osiągnięto w linii Huh 7.5 (2). System JFH1 stanowi dotychczas jedyny system replikacji wirusa HCV, w którym produkowane są infekcyjne cząstki wirusowe. Pomimo wielu prób nie udało się stworzyć systemu replikacji opartego na materiale genetycznym genotypu 1. Naukowcom udało się jedynie skonstruować subgenomowe replikony HCV genotypu 1, które nie kodują białek strukturalnych wirusa, a zatem nie są zdolne do produkcji cząstek wirusowych (1,3,6). Zarówno system replikacji wirusa HCV oparty na JFH1, jak i subgenomowe replikony są powszechnie wykorzystywane w badaniach nad nowymi potencjalnymi związkami przeciwwirusowymi.
Nr 3 Replikacja wirusa HCV 241 Celem pracy było otrzymanie stabilnego komórkowego modelu replikacji HCV in vitro oraz zbadanie dynamiki zmian ilości wirusowego RNA w hodowli Huh 7.5. MATERIAŁ I METODY Konstrukt HCV oraz transkrypcja. Otrzymano plazmid pjfh1 zawierający sekwencję HCV cdna pod kontrolą promotora T7 (dzięki uprzejmości dr Takaji Wakita, Toray Industries and Tokyo Metropolitan Organization for Medical Research). Plazmid został zlinearyzowany na końcu 3 HCV cdna przy pomocy enzymu restrykcyjnego XbaI. Oczyszczone DNA posłużyło jako matryca w transkrypcji in vitro (TranscriptAid T7 High Yield Transcription Kit, Fermentas). Hodowla komórkowa. Linię komórkową Huh 7.5 otrzymano dzięki uprzejmości dr Małgorzaty Rychłowskiej z Gdańskiego Uniwersytetu Medycznego. Zarówno niezakażoną, jak i transfekowaną HCV hodowlę komórkową prowadzono w podłożu DMEM uzupełnionym 10% FCS oraz antybiotykami w 37 C i 5% CO 2. Komórki pasażowano 2 razy w tygodniu w stosunku 1:6. Transfekcja HCV RNA. Otrzymane w wyniku transkrypcji in vitro RNA JFH1 wprowadzono do komórek Huh 7.5 metodą lipofekcji (Lipofectamin 2000, Invitrogen). Na jedną dobę przed planowanym eksperymentem zakładano hodowlę Huh 7.5 w probówkach ze skosem o pojemności 2ml. Każda probówka zawierała 4x10 5 komórek zawieszonych w 2 ml medium hodowlanego DMEM uzupełnionym 10% FCS bez antybiotyków. Do lipofekcji podłoże wzrostowe zastępowano podłożem OPTI MEM, a następnie dodawano mieszaninę RNA z lipofektyną (LIPO) oraz mieszaniny kontrolne (RNA:LIPO) w proporcjach podanych w podpisie pod ryciną 1. Tak założone hodowle inkubowano w cieplarce z dostępem CO 2 w temp. 37 C przez kolejną dobę. Po tym czasie zmieniono OPTI MEM na podłoże wzrostowe DMEM. Oznaczanie HCV RNA w hodowli komórkowej. Obecność RNA wirusa oznaczono w supernatancie znad hodowli jakościową oraz ilościową metodą łańcuchowej reakcji polimerazy (PCR). Badaniu poddano 21 supernatantów, gromadzonych systematycznie podczas kolejnych pasaży prowadzonej hodowli. Pierwsze oznaczenie wykonano po 24 godzinach od lipofekcji metodą Nested PCR, w celu potwierdzenia efektywności zakażenia hodowli. Badanie kolejnych supernatantów metodą Real Time PCR (HCV Real TM Quant, Sacace Biotechnologies) pozwoliło ocenić dynamikę zmian ilości HCV RNA w zakażonej linii komórkowej. WYNIKI W wyniku przeprowadzonej transfekcji linii komórkowej Huh 7.5 przy zastosowaniu transkryptu JFH1 oraz lipofektyny otrzymano hodowlę Huh 7.5 zakażoną genotypem 2a wirusa HCV. Wirusowe RNA w supernatancie hodowli wykryto wyłącznie w próbkach, do zakażenia których użyto JFH1 oraz lipofektyny. Obraz elektroforetycznego rozdziału produktów PCR uzyskanych z supernatantów znad hodowli Huh 7.5 24 godziny po przeprowadzonej lipofekcji prezentuje rycina 1.
242 M. Komorowski i inni Nr 3 Ryc. 1 Elektroforegram obrazujący rozdział produktów reakcji PCR wykonanej z użyciem supernatanó z nad hodowli Huh_7.5 24h po przeprowadzonej lipofekcji. Ścieżka K- - kontrola negatywna PCR; Ścieżka K+ - kontrola pozytywna PCR; Ścieżki oznaczone symbolami od 2A do 4D - produkty PCR uzyskane dla różnych wariantów lipofekcji: 2A-1µg RNA + 0µl LIPO; 1A-0µg RNA + 0µl LIPO; 3A-2.5µg RNA + 0µl LIPO; 4A-5µg RNA + 0µl LIPO; 1B-0µg RNA + 2µl LIPO; 2B-1µg RNA + 2 µl LIPO; 1C-0µg RNA + 5µl LIPO; 2C-1µg RNA + 5µl LIPO; 3C-2.5µg RNA + 5µl LIPO; 4C-5µg RNA + 5µl LIPO; 1D-0µg RNA + 10µl LIPO; 2D-1µg RNA + 10µl LIPO; 3D-2.5µg RNA + 10µl LIPO; 4D-5µg RNA + 10µl LIPO Badanie dynamiki zmian ilości wirusowego RNA zaplanowano dla dwóch wariantów zakażonej hodowli Huh 7.5: 3D 2.5µg RNA + 10µl LIPO oraz 4D 5µg RNA + 10µl LIPO. W związku z zanikiem replikacji wirusa HCV w wariancie 3D podczas kolejnych pasaży, dalsze analizy przeprowadzono dla wariantu 4D linii komórkowej Huh 7.5. Hodowlę prowadzono przez okres 3 miesięcy (21 pasaży) według warunków opisanych w materiałach i metodach. Najwięcej wirusowego RNA (3.69x10 9 kopii/ml) wykryto w 96 godzin po przeprowadzonej transfekcji (przed pierwszym pasażem). W kolejnych pasażach ilość RNA spadała, uzyskując najniższą wartość przed siódmym pasażem (2.14x10 5 ). Przez kolejne 4 pasaże ilość RNA wzrastała, a następnie utrzymywała się na stałym poziomie (10 7 10 8 ) aż do końca prowadzenia hodowli. Wyniki reakcji Real-Time PCR przedstawia rycina 2. Hodowlę zakończono na 21 pasażu ze względu na rozpoczynającą się degenerację komórek. Hodowlę Huh 7.5 zakażoną HCV umieszczono w banku hodowli komórkowych Zakładu Wirusologii NIZP PZH. Obecność materiału genetycznego wirusa wykryto w linii komórkowej Huh 7.5 prowadzonej po rozmrożeniu. Ilość materiału genetycznego wirusa określono na 10 7 kopii RNA/ml. Ryc. 2 Dynamika zmian ilości wirusowego RNA w trakcie prowadzenia hodowli (21 pasaży).
Nr 3 Replikacja wirusa HCV 243 DYSKUSJA Przeprowadzone badania pozwoliły uzyskać stabilny model komórkowy hodowli wirusa HCV w linii Huh 7.5, w którym wirus ulega replikacji. Wyboru hodowli komórkowej dokonano w oparciu o dostępne dane literaturowe. Linię tę uzyskano poprzez traktowanie interferonem linii Huh 7. Stworzenie Huh 7.5 dało możliwość prowadzenia badań z użyciem pełnogenomowego replikonu HCV. Linia ta była bardziej podatna na zakażenie JFH1 niż Huh 7, co zwiększyło jej przydatność jako modelu replikacji wirusa in vitro (2). W obecnym badaniu linię komórkową Huh 7.5 transfekowano wirusem JFH1 przy użyciu lipofektyny. Uzyskane wyniki potwierdziły konieczność jej zastosowania. W próbkach, w których podjęto próbę zakażenia samym wirusowym RNA, nie wykryto obecności materiału genetycznego HCV w badanym supernatancie. Użycie lipofektyny oraz wirusowego RNA dało pozytywny rezultat transfekcji, niezależnie od ilości obu składników. Istotne jest natomiast zastosowanie odpowiedniej proporcji transkryptu JFH1 do lipofektyny. Według danych literaturowych właściwy stosunek RNA:LIPO wynosi 1:2, co potwierdzają bieżące badania (11). Zakażoną genotypem 2a HCV hodowlę Huh 7.5 prowadzono przez okres 3 miesięcy. Tak długi czas utrzymania niezdegenerowanej linii komórkowej niewątpliwie stanowi zaletę przedstawionego modelu badawczego. Stwarza on możliwość prowadzenia czasochłonnych eksperymentów in vitro. Dodatkowym atutem, mającym wpływ na osiągnięcie powtarzalnych wyników, jest wysoki i stały poziom materiału genetycznego HCV, utrzymujący się w hodowli. Wspomniane cechy modelu badawczego zaobserwowano w bieżącym badaniu. Stworzony w oparciu o linię Huh 7.5 model badawczy może stać się dobrym narzędziem służącym testowaniu potencjalnych leków przeciwko HCV, które mogą wpływać bezpośrednio na jego replikację. Zaobserwowany w badaniach Wakita i wsp. oraz potwierdzony w bieżącym doświadczeniu, powtarzalny schemat dynamiki zmian ilości RNA HCV w hodowli daje możliwość uzyskania porównywalnych warunków badania inhibitorów wirusa in vitro (8). WNIOSKI Linia Huh 7.5 zakażona wirusem HCV stanowi stabilny model komórkowy, w którym wirus ulega replikacji. Zbadany model komórkowy hodowli HCV charakteryzuje się określoną dynamiką zmian ilości materiału genetycznego wirusa. Opisany model komórkowy może stanowić podstawę badań nad potencjalnymi lekami hamującymi replikację HCV. Podziękowanie: Praca została wykonana w ramach realizacji grantu MNiSW NN405 132539 (2010 2013) Acknowledgement: This study was supported by grant NN405 132539 from the Ministry of Science and Higher Education (2010 2013)
244 M. Komorowski i inni Nr 3 PIŚMIENNICTWO 1. Blight K, Kolykhalov A, Rice C. Efficient initiation of HCV RNA replication in cell culture. Science 2000; 290: 1972 4 2. Blight K, McKeating J, Rice C. Highly permissive cell lines for subgenomic and genomic hepatitis C virus RNA replication. J Virol 2002; 76: 13001 14 3. Blight KJ, McKeating JA, Marcotrigiano J i inni. Efficient replication of hepatitis C virus genotype 1a RNAs in cell culture. J Virol 2003; 77: 3181 90 4. Godzik P. System replikacji wirusa zapalenia wątroby typu C (HCV) in vitro. Post Mikrobiol 2009; 48: 207 12 5. Kolykhalov A, Agapov E, Blight K i inni. Transmission of hepatitis C by intrahepatic inoculation with transcribed RNA. Science 1997; 277: 570 4 6. Lohmann V, Korner F, Koch JO i inni. Replication of subgenomic hepatitis C virus RNAs in a hepatoma cell line. Science 1999; 285: 110-3 7. Saito I, Miyamura T, Ohbayashi A i inni. Hepatitis C virus infection is associated with the development of hepatocellular carcinoma. Proc Natl Acad Sci USA 1990; 87: 6547 9 8. Wakita T, Pietschmann T, Kato T i inni. Production of infectious hepatitis C virus in tissue culture from a cloned viral genome. Nat Med 2005; 11: 791 6 9. WHO. Hepatitis C global prevalence (update). Wkly Epidemiol Rec 2000; 75: 18 9 10. Yanagi M, Purcell R, Emerson S i inni. Transcripts from a single full-length cdna clone of hepatitis C virus are infectious when directly transfected into the liver of a chimpanzee. Proc Natl Acad Sci USA 1997; 94: 8738 43 11. Zhong J, Gastaminza P, Cheng G i inni. Robust hepatitis C virus infection in vitro. Proc Natl Acad Sci USA 2005; 102: 9294-9 Otrzymano: 11 IX 2012 r. Adres Autora: 00-791 Warszawa, ul. Chocimska 24, Pracownia Immunopatologii Zakażeń Hepatotropowych Zakładu Wirusologii NIZP-PZH w Warszawie