Agnieszka Kołakowska, Paulina Godzik, Kazimierz Madaliński. Zakład Wirusologii Narodowego Instytutu Zdrowia Publicznego Państwowego Zakładu Higieny

Transkrypt

1 MED. DOŚW. MIKROBIOL., 2013, 65: Metody badania potencjalnych inhibitorów wirusa zapalenia wątroby typu C w linii komórkowej Huh-7.5 Methods of testing potential inhibitors of hepatitis C in Huh-7.5 cell line Agnieszka Kołakowska, Paulina Godzik, Kazimierz Madaliński Zakład Wirusologii Narodowego Instytutu Zdrowia Publicznego Państwowego Zakładu Higieny Zgodnie z szacunkami Światowej Organizacji Zdrowia z powodu chorób wątroby wywołanych wirusem HCV umiera rocznie osób. Dotychczas nie udało się stworzyć skutecznej szczepionki przeciwko wirusowi HCV, a dostępne obecnie terapie nie dają 100% pewności wyleczenia. Dlatego od wielu lat na całym świecie prowadzone są intensywne badania nad poszukiwaniem nowych leków o bezpośrednim działaniu przeciwwirusowym. Celem pracy było opracowanie metodyki badania aktywności oraz cytotoksyczności potencjalnych inhibitorów helikazy HCV w systemie produkującym wirusowe cząstki potomne. Słowa kluczowe: wirus zapalenia wątroby C, inhibitory replikacji HCV, linia komórkowa Huh 7.5 ABSTRACT Introduction: According to WHO reports, there are million persons chronically infected with hepatitis C virus on a global scale. There is no effective vaccine against HCV, and the current standard of chronic hepatitis C therapy has limited efficiency and undesirable side effects. Current studies are focused on searching for a new therapeutic agents, which are specifically targeted against the virus. The aim of the study was to develop a methodology for testing the activity and cytotoxicity of potential helicase inhibitors (derivatives of anthracycline antibiotics) in Huh-7.5 cell line infected with HCV. Methods: The Huh-7.5 cell line was infected with the JFH1 (Japanese Fulminant Hepatitis) RNA by lipofection. The cytotoxicity of anthracycline antibiotics was measured by Cell Proliferation Kit II (XTT), after 1, 2, 3, 4 and 24 hours after incubation with tetrazolium salt XTT. The activity of anthracycline antibiotics was examined by Real-Time PCR method. Results: The study allowed to optimize the conditions of cytotoxicity and activity studies of anthracycline antibiotics.

2 276 A. Kołakowska, P. Godzik, K. Madaliński Nr 4 Conclusions: Huh-7.5 cell line infected with HCV is a robust cell culture model for screening new antivirals against HCV. Key words: hepatitis C virus, inhibitors of HCV replication, Huh 7.5 cell line WSTĘP Zgodnie z szacunkami Światowej Organizacji Zdrowia zakażenie wirusem zapalenia wątroby typu C (HCV) dotyczy mln osób na całym świecie. Rocznie z powodu chorób wątroby wywołanych wirusem zapalenia wątroby typu C umiera osób (19). U około 60-80% dochodzi do zakażenia przewlekłego, które zwykle w początkowym okresie przechodzi bezobjawowo lub skąpo-objawowo (11). Natomiast, w dłuższej perspektywie, choroba prowadzi do poważnych następstw, takich jak: włóknienie i marskość wątroby oraz rak wątrobowo-komórkowy. Dodatkowo zakażenie HCV może prowadzić również do licznych pozawątrobowych objawów oraz chorób. Zjawiskiem najczęściej wiązanym z zakażeniem HCV jest krioglobulinemia, której objawem klinicznym jest rozpowszechnione zapalenie naczyń prowadzące do zapalenia kłębuszków nerkowych i polineuropatii (8). Udział zakażenia HCV zaobserwowano również w takich chorobach, jak: zapalenie tarczycy, liszaj płaski, porfiria późna skórna, samoistna trombocytopenia i pierwotny zespół Sjögrena (5, 7, 12, 10, 15). Wirus HCV został zidentyfikowany w 1989 roku i zaklasyfikowany do rodziny Flaviviridae (4). Jego materiał genetyczny występuje pod postacią pojedynczej nici RNA o dodatniej polarności. RNA zawiera pojedynczą otwartą ramkę odczytu (ang. Open Reading Frame, ORF) kodującą poliproteinę, z której na skutek kotranslacyjnego oraz potranslacyjnego działania komórkowych i wirusowych proteaz powstają 4 białka strukturalne oraz 6 białek niestrukturalnych. Genom wirusa, poza konserwatywnymi regionami UTR, różni się pomiędzy poszczególnymi izolatami wirusa. Na podstawie tych rozbieżności można wyróżnić 6 głównych genotypów oraz liczne podtypy wirusa. Zróżnicowanie to wpływa na szereg cech wirusa. Genotyp 1 jest najbardziej rozpowszechniony, częściej prowadzi do poważnych uszkodzeń wątroby oraz nowotworów, jak również pacjenci zakażeni tym genotypem gorzej odpowiadają na leczenie niż zakażeni genotypami 2 i 3. Ze względu na dużą zmienność HCV, nie udało się jak dotąd wytworzyć skutecznej szczepionki przeciwko wirusowemu zapaleniu wątroby typu C (wzw C). Do niedawna standardem w leczeniu wirusowego zapalenia wątroby typu C była terapia dwulekowa (pegylowany interferon alfa oraz rybawiryna). Skuteczność tej terapii jest niezadowalająca i w przypadku najbardziej rozpowszechnionego genotypu 1 wynosi około 42 54% (9,16). Dlatego od wielu lat na całym świecie prowadzone są intensywne badania nad poszukiwaniem nowych leków o bezpośrednim działaniu przeciwwirusowym. W wyniku tych prac w 2011 roku Amerykańska Agencja ds. Żywności i Leków (ang. Food and Drug Administration, FDA) zatwierdziła możliwość stosowania inhibitorów proteazy wirusa HCV: boceprewiru i telaprewiru w terapii skojarzonej z interferonem i rybawiryną u dorosłych pacjentów z przewlekłym zapaleniem wątroby typu C wywołanym przez genotyp 1. Stosowanie trójlekowej terapii w znaczny sposób zwiększyło trwałą odpowiedź wirusologiczną

3 Nr 4 Aktywność inhibitorów helikazy HCV 277 (ang. Sustained Virological Response, SVR) (1). W Polsce telaprewir oraz boceprewir stosowane są od maja 2013 roku w ramach programów lekowych. Pomimo znacznego zwiększenia skuteczności terapii trójlekowej z zastosowaniem telaprewiru i boceprwewiru, wciąż istnieje potrzeba poszukiwania nowych leków o bezpośrednim działaniu antywirusowym. Obecnie stosowana terapia trójlekowa nadal daje około 75% wyleczalności. Jednocześnie część pacjentów nie może ukończyć leczenia z powodu niepożądanych skutków prowadzonej terapii. Niewątpliwą trudność w badaniu nowych substancji o działaniu inhibicyjnym w stosunku do wirusa HCV stanowi brak zwierzęcego modelu badawczego. Jedynymi zwierzętami, u których dochodzi do zakażenia są szympansy. Ze względów etycznych oraz finansowych nie jest możliwe prowadzenie na szeroką skalę badań nad nowymi lekami u tej grupy zwierząt. W celu prowadzenia badań nad patogenezą zakażeń wirusem HCV wytworzono transgeniczne myszy posiadające chimeryczne wątroby zbudowane z ludzkich i mysich hepatocytów (17). Model ten pozwolił na uzyskanie stabilnej replikacji wirusa HCV, natomiast nie dał możliwości badania związków o potencjalnym działaniu antywirusowym, ponieważ pozbawiony był prawidłowo funkcjonującego układu odpornościowego. Pod koniec lat 90-tych XX wieku przeprowadzono pierwsze próby utworzenia hodowli wirusa HCV. Trudność polegała na tym, iż RNA wirusa izolowane bezpośrednio od osób zakażonych nie było infekcyjne w stosunku do hodowli komórkowych. Przełomowym wydarzeniem było utworzenie przez Lohmanna i wsp. subgenomowych replikonów HCV (JFH1 Japanese Fulminant Hepatitis), które replikowały się w linii komórkowej Huh 7 (hepatoma cell line) (14). Replikon ten pozbawiony był RNA kodującego białka strukturalne, dlatego system nie dawał możliwości tworzenia cząstek wirusowych. W 2005 roku opublikowano pierwszą pracę na temat utworzenia systemu replikacji HCV in vitro, w którym powstawały zakaźne cząstki wirusowe (18). Obecnie powszechnie wykorzystuje się systemy hodowli in vitro oparte na subgenomowych replikonach do badania nowych potencjalnych związków przeciwwirusowych. Celem prezentowanej pracy było opracowanie metodyki badania aktywności oraz cytotoksyczności potencjalnych inhibitorów (pochodnych antybiotyków antracyklinowych) HCV w systemie produkującym wirusowe cząstki potomne. MATERIAŁ I METODY Hodowla komórkowa. Oznaczenie aktywności inhibicyjnej pochodnej antybiotyku antracyklinowego oraz badanie jej cytotoksyczności przeprowadzono w linii komórkowej Huh 7.5, otrzymanej dzięki uprzejmości Pracowni Biologii Molekularnej Wirusów Gdańskiego Uniwersytetu Medycznego. Hodowlę prowadzono w podłożu wzrostowym DMEM wzbogaconym 10% FCS, mieszaniną aminokwasów oraz antybiotyków i inkubowano w cieplarce z dostępem dwutlenku węgla (37 C; 5% CO 2 ). Transfekcja linii komórkowej Huh 7.5. W celu badania aktywności inhibicyjnej pochodnej antracyklinowej przeprowadzono transfekcję RNA wirusa HCV do linii komórkowej Huh 7.5 z zastosowaniem związków lipidowych (Lipofectamin 2000, Invitrogen). HCV RNA użyte do lipofekcji powstało w wyniku linearyzacji plazmidu pjfh1 (otrzymany dzięki uprzejmości Toray Industries and Tokyo Metropolitan Organization for Medical Research) przy pomocy enzymu restrykcyjnego XbaI, oczyszczenia otrzymane-

4 278 A. Kołakowska, P. Godzik, K. Madaliński Nr 4 go DNA oraz jego transkrypcji in vitro (TranscriptAid T7 High Yield Transcription Kit, Fermentas). Otrzymany transkrypt RNA wraz z lipofektaminą (mieszanina transfekcyjna w proporcji 2:1) wprowadzono do komórek Huh 7.5, wykorzystując zjawisko tworzenia między kwasami nukleinowymi a związkami lipidowymi lipopleksów oraz ich ułatwionej endocytozy. Proces lipofekcji przeprowadzono w 24 godzinnej hodowli komórkowej o gęstości wyjściowej 4x10 4 kom/dołek, założonej na płytce 96-dołkowej. Do lipofekcji zastosowano podłoże bez antybiotyków OPTI MEM. Po 18 godzinach inkubacji w 37 C i środowisku 5% CO 2 podłoże OPTI MEM wymieniono na podłoże wzrostowe DMEM. Badany związek. Zbadano aktywność pochodnej antybiotyku antracyklinowego (otrzymanej dzięki uprzejmości prof. Ireny Oszczapowicz oraz dr Małgorzaty Łukawskiej z Instytutu Biotechnologii i Antybiotyków), dla której stwierdzono wcześniej w fluorometrycznym teście aktywności helikazy (2,3) wysoką aktywność przeciwko helikazie RNA wirusa HCV (białku NS3). Badanie cytotoksyczności związków. Oznaczenie cytotoksyczności pochodnej antracyklinowej wykonano w niezakażonej linii komórkowej Huh 7.5 z użyciem kolorymetrycznego testu Cell Proliferation Kit II (Roche). Zastosowany test badania cytotoksyczności polega na spektofotometrycznym odczycie barwnej reakcji redukcji soli tetrazoliowych XTT w formazan pod wpływem działania komórkowej dehydrogenazy mitochondrialnej. Na 1 dobę przed rozpoczęciem doświadczenia założono hodowlę komórkową w 96-dołkowej płytce z inokulum zawierającego 4x10 5 kom/ml, rozpipetowując po 100µl wyjściowej zawiesiny komórek na dołek. Po 24h do hodowli dodano po 100µl/dołek uprzednio przygotowanego roztworu badanej substancji, tak aby uzyskać końcowy zakres stężeń nM. Każdy roztwór naniesiono na płytkę hodowlaną w trzech powtórzeniach. Jako kontrolę zastosowano niezakażoną hodowlę komórkową Huh 7.5, do której nie dodano badanej substancji. Cytotoksyczność zbadano w trzeciej dobie od dodania pochodnej antracyklinowej do hodowli komórkowej, w obecności soli tetrazoliowych XTT. W celu optymalizacji warunków eksperymentu, odczyt cytotoksyczności przeprowadzono po1-, 2-, 3-, 4- i 24- godzinnej inkubacji z XTT. Zastosowanie testu XTT pozwoliło na oznaczenie toksyczności związków na podstawie oceny aktywności metabolizmu mitochondrialnego przetrwałych komórek linii Huh 7.5. Wynik otrzymano poprzez pomiar absorbancji (λ nm), której wartość była proporcjonalna do ilości żywych i sprawnych metabolicznie komórek. Badanie aktywności związku. Oznaczanie aktywności pochodnej antracyklinowej przeprowadzono na podstawie zmian ilości RNA wirusa w zakażonej hodowli Huh 7.5 metodą Real-Time PCR (HCV Real-TM Quant, Sacace Biotechnologies). W celu opracowania optymalnej metody oznaczenia aktywności związków, badaną substancję w końcowym zakresie stężeń nM dodawano do zakażonej hodowli zaraz po lipofekcji, 4 godziny oraz 24 godziny po przeprowadzonej lipofekcji, a HCV RNA oznaczano po trzech dobach od dodania związku. RNA wirusa izolowano z supernatantu oraz komórek Huh 7.5 poddanych wcześniej 3 cyklom zamrażania i rozmrażania. Jako kontrolę zastosowano zakażoną hodowlę Huh 7.5, do której nie dodano związku hamującego replikację wirusa HCV. WYNIKI Badanie cytotoksyczności przeprowadzono metodą kolorymetryczną w niezakażonej hodowli Huh 7.5, aby uniknąć oddziaływania wirusa na metabolizm komórek. Zgodnie

5 Nr 4 Aktywność inhibitorów helikazy HCV 279 z zaleceniami producenta testu XTT Cell Proliferation Assay Kit oraz wcześniejszymi doświadczeniami zdobytymi w Zakładzie Wirusologii NIZP PZH, przeprowadzono badanie cytotoksyczności dokonując pomiarów po 1, 2, 3, 4 oraz 24 godzinach od dodania XTT do hodowli (tabela I). Po analizie wyników za najbardziej optymalny czas inkubacji z solami tetrazoliowymi, uznano przedział między drugą a czwartą godziną po dodaniu XTT. W przypadku 24 godzin od dodania XTT do hodowli, wartości absorbancji przekroczyły skalę odczytu. Tabela I. Średnia wartość absorbancji w teście cytotoksyczności, w zależności od czasu inkubacji. Stężenie badanego związku Czas inkubacji 1 godzina 2 godziny 3 godziny 4 godziny 24 godziny Średnia absorbancji x x x x x 40 nm 0,86 1,57 1,83 2,02 out 80 nm 0,82 1,48 1,92 2,54 out 160 nm 0,80 1,54 1,97 2,06 out 400 nm 0,78 1,40 1,82 2,11 out 1000 nm 0,61 1,06 1,42 1,52 out 2000 nm 0,44 0,75 0,98 1,10 2, nm 0,14 0,19 0,22 0,27 2,88 Kontrola 1,02 1,67 1,91 2,05 out Out wartość poza skalą odczytu Badanie aktywności związku wykonano w hodowli Huh 7.5 zakażonej genotypem 2a wirusa HCV. Zakażoną linię komórkową uzyskano poprzez jej transfekcję z zastosowaniem transkryptu JFH1 oraz lipofektyny (13). Lipofekcję prowadzono w linii komórkowej, założonej na 96-dołkowej płytce z zawiesiny komórkowej zawierającej 4x10 5 kom/ml. Wartość inokulum wyznaczono doświadczalnie, tak aby uzyskać 80% pokrycie powierzchni dołka monowarstwą komórek po 24 godzinach prowadzenia hodowli komórkowej. Lipofekcję wykonywano każdorazowo przed dodaniem badanych substancji do hodowli. W celu optymalizacji metody badania aktywności związków, badaną substancję dodawano do zakażonej hodowli zaraz po lipofekcji, 4 godziny oraz 24 godziny po przeprowadzonej lipofekcji. Efektem dodania związku tuż po lipofekcji oraz 4 godziny po zakażeniu wirusem HCV była całkowita degradacja komórek, co wykluczyło dalsze badania. W przypadku dodania związków po 24 h nie zaobserwowano zmian degeneracyjnych w obrębie komórek. Badanie aktywności związków przeprowadzono z wykorzystaniem techniki PCR w czasie rzeczywistym. Początkowo nasilenie replikacji, mierzone ilością kopii RNA, oceniono w supernatantach zebranych znad hodowli, do której dodano badanego związku. Następnie dla porównania, oznaczenie wykonano w pełnej hodowli (w supernatantach i komórkach). Badając obecność materiału genetycznego wirusa w supernatantach w połączeniu z komórkami uzyskano kilkukrotnie wyższą wartość RNA niż w samych supernatantach. Wyniki pomiarów przedstawia tabela II.

6 280 A. Kołakowska, P. Godzik, K. Madaliński Nr 4 Tabela II. Liczba kopii HCV RNA uzyskana w wyniku reakcji Real Time PCR, przeprowadzonej w 4 dobie inkubacji z potencjalnym inhibitorem HCV. Liczba kopii HCV w 1 ml mieszaniny reakcyjnej (kopie/ml) Lp. Numer próbki Pełna hodowla Supernatant (supernatant i komórki) 1 Kontrola 0 nm 5,42 x ,74 x Kontrola 0 nm 1,11 x ,80 x Kontrola 0 nm 3,22 x ,88 x nm 1,07 x ,05 x nm 2,23 x ,49 x nm 7,27 x ,59 x nm 5,65 x ,96 x nm 7,52 x ,83 x nm 2,84 x ,19 x nm 3,10 x ,32 x nm 1,82 x ,72 x nm 1,05 x ,59 x nm 3,39 x ,91 x nm 2,84 x ,44 x nm 5,15 x ,07 x nm 1,79 x ,60 x nm 1,26 x ,46 x nm 2,54 x ,14 x nm 1,09 x ,57 x nm 1,14 x ,68 x nm 1,05 x ,83 x DYSKUSJA Jedne z pierwszych metod badania cytotoksyczności wymagały zastosowania materiałów radioaktywnych oraz kosztownej aparatury, a procedury ich wykonania były skomplikowane i długotrwałe. W latach 80-tych XX wieku po raz pierwszy wykorzystano testy kolorymetryczne w badaniach cytotoksyczności in vitro. Zastosowane w metodzie sole tetrazoliowe, będące akceptorami elektronów, są przekształcane do barwnych związków formazanowych przez żywe komórki. Obecnie dostępne są sole tetrazoliowe pierwszej (MTT) i drugiej (XTT) generacji. W celu ustalenia optymalnej metody badania cytotoksyczności potencjalnych inhibitorów wirusa HCV w hodowli Huh 7.5 wybrano test kolorymetryczny XTT, w którym sole tetrazoliowe redukowane są do rozpuszczalnych w środowisku wodnym związków formazanowych. W teście MTT formazany wytrącają się w postaci kryształów, co utrudnia procedurę badania (6). Zasada działania testu kolorymetrycznego opiera się na wprost proporcjonalnej zależności pomiędzy ilością żywych komórek, a ich aktywnością metaboliczną. Dodana do hodowli komórkowej żółta sól tetrazoliowa redukowana jest przez dehydrogenazę mitochondrialną żywych komórek do pomarańczowego formazanu. Natężenie zabarwienia mierzone spek-

7 Nr 4 Aktywność inhibitorów helikazy HCV 281 trofotometrycznie koreluje z ilością wytworzonego formazanu, co oznacza, że im większa ilość żywych komórek, tym wyższa wartość absorbancji. Zastosowanie testu do badania cytotoksyczności w konkretnej linii komórkowej należy poprzedzić doświadczeniem wstępnym, w celu optymalizacji warunków eksperymentu. Poszczególne linie komórkowe różnią się aktywnością metabolizmu komórkowego, a co za tym idzie aktywnością dehydrogenazy mitochondrialnej. Należy w sposób doświadczalny ustalić wpływ czasu inkubacji na intensywność redukcji soli XTT. Zgodnie z instrukcją producenta testu odczyt należy wykonać po 4-24 godzinach od dodania XTT. W celu optymalizacji badania cytotoksyczności w linii Huh-7.5 dokonano pomiaru absorbancji po 1, 2, 3, 4 i 24 godzinach. Po godzinnej inkubacji uzyskano niską wartość absorbancji dla kontroli, co może świadczyć o niedostatecznym czasie inkubacji hodowli z solami tetrazoliowymi. Zadowalające wyniki uzyskano po 2-, 3- i 4-godzinnej inkubacji. W tych przypadkach zaobserwowano spadek absorbancji skorelowany ze wzrostem stężenia badanego związku, jak również uzyskano zbliżone wartości dla trójkowych powtórzeń. Pomiar wartości absorbancji po 24-godzinnej inkubacji dla kontroli i stężeń w zakresie nM był niemożliwy ze względu na uzyskanie wyników poza skalą odczytu. XTT był metabolizowany aż 24 godziny przez żywe komórki, a wysokie wartości absorbancji były spowodowane kumulacją związków formazanowych. W celu opracowania odpowiedniej metodyki oznaczenia aktywności pochodnych antracyklinowych metodą lipofekcji, przygotowano hodowlę Huh 7.5 zakażoną wirusem HCV. Transfekcję wykonywano każdorazowo przed dodaniem badanych substancji do hodowli, ponieważ próby bankowania zakażonej linii Huh 7.5 prowadziły do degradacji komórek. Optymalizacja badania polegała na doświadczalnym ustaleniu odpowiedniego czasu dodania potencjalnego inhibitora do hodowli zakażonej HCV. W tym celu badaną substancję dodawano do zakażonej hodowli zaraz po lipofekcji, 4 godziny oraz 24 godziny po przeprowadzonej lipofekcji. Tylko w przypadku dodania związku po 24 h nie zaobserwowano degradacji komórek. Dodanie pochodnej antybiotyku antracyklinowego w czasie lipofekcji oraz 4 godziny po niej prowadziło do śmierci komórek, prawdopodobnie na skutek nadmiernego osłabienia błon komórkowych, poprzez jednoczesne działanie lipofektyny i antybiotyku. W zakażonej HCV hodowli Huh 7.5 potomne wiriony są częściowo wydzielane do supernatantu, część z nich natomiast pozostaje w komórkach. Wykonano ilościowe badanie HCV RNA metodą Real Time PCR w podłożu znad hodowli. Następnie dla porównania, oznaczenie powtórzono w pełnej hodowli (w supernatancie i komórkach). Wykazano, że ilość RNA izolowana z supernatantów jest znacząco niższa od ilości w pełnej hodowli. Dodatkowo zaobserwowano różnice w ilości RNA w supernatantach w kolejnych powtórzeniach, co może wynikać z nierównomiernego uwalniania wirusa do podłoża. Natomiast w przypadku badania w pełnej hodowli uzyskano powtarzalność wyników. Ten wariant uznano za najbardziej efektywny w badaniu aktywności związków przeciwwirusowych. Podsumowując, przeprowadzenie badań in vitro w kierunku aktywności oraz cytotoksyczności związków przeciwwirusowych wymaga optymalizacji warunków eksperymentu. WNIOSKI 1. Badanie cytotoksyczności wymaga przeprowadzenia wstępnych doświadczeń, umożliwiających opracowanie optymalnych warunków eksperymentu.

8 282 A. Kołakowska, P. Godzik, K. Madaliński Nr 4 2. W przypadku linii komórkowej Huh 7.5 odpowiedni czas inkubacji z solami tetrazoliowymi (XTT) w badaniu cytotoksyczności to 2-4 godziny. 3. Dodanie pochodnej antybiotyku antracyklinowego do hodowli Huh 7.5 w czasie lipofekcji, jak również 4 godziny po zakażeniu wirusem HCV powoduje degradację komórek. 4. Badanie aktywności związków skierowanych przeciwko wirusowi HCV in vitro, metodą Real-Time PCR należy wykonywać w pełnej hodowli (komórki i supernatant). Podziękowanie: Praca została wykonana w ramach realizacji grantu MNiSW NN ( ) Acknowledgement: This study was supported by grant NN from the Ministry of Science and Higher Education ( ) PIŚMIENNICTWO 1. Buckman B, Kossen K, Nicholas J i inni. NS3 protease non-covalent inhibitors. W: Hepatitis C. Antiviral drug discovery and development. Red. Tan S-L, He Y. Norfolk (UK): Caister Academic Press; 2011, Boguszewska-Chachulska AM, Krawczyk M, Stankiewicz A i inni. Directfluorometric measurement of hepatitis C virus helicase activity. FEBS Letters 2004; 567(2-3): Boguszewska-Chachulska AM, Krawczyk M, Najda A i inni. Searching for a new anti-hcv therapy: Synthesis and properties of tropolone derivatives Biochem.Biophys. Res. Commun. 341, Choo QL, Kuo G, Weiner AJ i inni. Isolation of a cdna clone derived from a blood-borne non-a, non-b viral hepatitis genome. Science 1989; 244: Clifford BD, Donahue D, Smith L i inni. High prevalence of serological markers of autoimmunity in patients with chronic hepatitis C. Hepatology 1995; 21: Dzitko K, Dudzińska D, Grzybowski M i inni. Ocena przydatności testów kolorymetrycznych MTT i XTT do badań prowadzonych in vitro na tachyzoitach Toxoplasmagondii. Wiadomości Paratytologiczne 2010; 56: Fargion S, Piperno A, Cappellini MD i inni. Hepatitis C virus and porphyria cutaneatarda: evidence of a strong association. Hepatology 1992; 16: Ferri C, Sebastiani M, Giuggioli D i inni. Mixed cryoglobulinemia: demographic, clinical, and serologic features and survival in 231 patients. Semin Arthritis Rheum. 2004; 33: Fried MW, Shiffman ML, Reddy KR i inni. Peginterferon alfa-2a plus ribavirin for chronic hepatitis C virus infection. N Engl J Med. 2002; 347: Hadziyannis S. Nonhepatic manifestations and combined diseases in HCV infection. Digest Dis Sci 41, No. 12 (1996 suppl): Halota W, Flisiak R, Boroń-Kaczmarska A i inni. Standardy leczenia wirusowych zapaleń wątroby typu C Rekomendacje Polskiej Grupy ekspertów HCV Przegl Epidemiol 2012; 66: Jabłońska J, Ząbek J, Madaliński K, Godzik P. Pozawątrobowe objawy zakażenia wirusem zapalenia wątroby typu C. Reumatologia 2009; 47: Komorowski M, Godzik P, Kołakowska A i inni. Replikacja wirusa HCV w linii komórkowej Huh-7.5. Med. Dośw. Mikrobiol. 2012; 64: Lohmann V, Korner F, Koch JO i inni. Replication of subgenomic hepatitis C virus RNAs in a hepatoma cell line. Science 1999; 285: Madaliński K, Godzik P, Zimmermann-Górska I i inni. Anty-HCV oraz HCV-RNA u chorych z pierwotnym zespołem Sjögrena. Przegl Epidemiol 2009; 63:

9 Nr 4 Aktywność inhibitorów helikazy HCV Manns M, McHutchison J, Gordon S i inni. Peginterferon alfa-2b plus ribavirin compared with interferon alfa-2b plus ribavirin for initial treatment of chronic hepatitis C: a randomised trial. The Lancet 2001; 358: Mercer D, Schiller D, Elliott J i inni. Hepatitis C virus replication in mice with chimeric human livers. Nat Med 2001; 7: Wakita T, Pietschmann T, Kato T i inni. Production of infectious hepatitis C virus in tissue culture from cloned viral genome. Nat Med 2005; 11: WHO. Hepatitis C. Wkly. Epidemiol. Rec 2011; 86: Otrzymano: 31 X 2013 r. Adres Autora: Warszawa, ul. Chocimska 24, Zakład Wirusologii Narodowego Instytutu Zdrowia Publicznego Państwowego Zakładu Higieny w Warszawie

10