Uniwersytet Medyczny w Łodzi Wydział Farmaceutyczny Oddział Medycyny Laboratoryjnej PRACA MAGISTERSKA Dominika Grondalska Praca magisterska wykonana w Zakładzie Biochemii Farmaceutycznej Katedry Chemii Farmaceutycznej i Biochemii Uniwersytetu Medycznego w Łodzi. Kierownik pracy magisterskiej Prof. nadzw. dr hab. Barbara Kostka Łódź 2008 1
TEMAT PRACY Wsp Współczesna diagnostyka zaburzeń układu hemostazy w chorobach cywilizacyjnych. Current diagnostics of haemostatic system disorders in civilization diseases. 2
Rozdziały y pracy: 1. Diagnostyka laboratoryjna wczoraj i dziś, 2. Choroby cywilizacyjne, 3. Hemostaza, 4. Współczesna diagnostyka układu hemostazy. 3
www.inspiria.pl/labs_common_200 70314_laborato... I DIAGNOSTYKA LABORATORYJNA WCZORAJ I DZIŚ www.gronkowiec.pl/skazenia.htm commons.wikimedia.org/wiki/image:laboratorium.jpg 4
DIAGNOSTYKALABORATORYJNA WCZORAJ I DZIŚ Początki diagnostyki, Ustawa o diagnostach z dn.27.vi.2001 (fragment), Rozwój diagnostyki. 5
Początki diagnostyki Do końca lat 60-tych diagnostyka laboratoryjna była kopciuszkiem wśród nauk medycznych. Dopiero wtedy, zauwaŝona i doceniona, zaczęła swój wspaniały marsz ku nowoczesności. 1. W 1962 roku powołano do Ŝycia Sekcję Analityki Lekarskiej Polskiego Towarzystwa Lekarskiego. 2. W 1964 przekształciła się ona w Polskie Towarzystwo Diagnostyki Laboratoryjnej. Nowa instytucja postawiła sobie za cel promowanie nowinek z dziedziny diagnostyki laboratoryjnej, organizowanie szkoleń dla diagnostów oraz organizację laboratoriów w Polsce. www.ptdl.pl/ 6
Ustawa o diagnostyce i diagnostach Diagnostyką laboratoryjną są czynności, które obejmują: Badania laboratoryjne, mające na celu określanie właściwości fizycznych, chemicznych i biologicznych oraz składu płynów ustrojowych, wydzielin, wydalin i tkanek pobranych do celów profilaktycznych, diagnostycznych, leczniczych lub sanitarno epidemiologicznych. Mikrobiologiczne badania laboratoryjne płynów ustrojowych, wydzielin, wydalin i tkanek pobranych do celów profilaktycznych, diagnostycznych, leczniczych lub sanitarno epidemiologicznych. Działania zmierzające do ustalenia zgodności tkankowej Za wykonywanie czynności diagnostyki laboratoryjnej uwaŝa się takŝe działalność naukowo dydaktyczną i polegającą na kierowaniu laboratorium, prowadzoną w dziedzinie diagnostyki laboratoryjnej przez osobę wpisaną na listę diagnostów laboratoryjnych. (z dnia 27 lipca 2001 r.) 7
Rozwój j diagnostyki Ostatnie ćwierć wieku przyniosło ze sobą istotne zmiany w medycynie, a co za tym idzie równieŝ w diagnostyce. Badania wykonywane są w laboratoriach, gdzie przeprowadzają je osoby o bardzo wysokich kwalifikacjach, przechodzące regularne szkolenia. Diagności stają się partnerami lekarzy w diagnozowaniu poszczególnych przypadków. Zajmują się nie tylko wykonaniem badania, ale równieŝ słuŝą pomocą we właściwej interpretacji wyniku, są stroną w dyskusji co do sposobu dalszej terapii i ewentualnych kolejnych badań. Znacznej poprawie w ostatnich latach uległo takŝe wyposaŝenie laboratoriów. Wzrósł poziom automatyzacji aparatury pomiarowej, a takŝe świadomość, Ŝe jej prawidłowe działanie wymaga, mimo wysokich kosztów, systematycznej konserwacji i przeglądów. 8
Diagnosta laboratoryjny to obecnie bardzo odpowiedzialny i waŝny zawód d z przyszłości cią. Nie ma medyka bez analityka - ta myśl l potwierdza ten fakt i wskazuje, jak istotna jest dziś i będzie b w przyszłości współpraca praca lekarza i diagnosty laboratoryjnego. http://www.gczdim.katowice.pl/tresc.php?id=49 9
http://www.gim.staszic.waw.pl/eko/index.php?dzial=kdcotojest http://images.google.pl/imgres?imgurl=http://www.geektoys.pl/foto/1185.jpg&imgrefurl=http://www.geektoys.pl/view.php%3 Fid%3D1185&h=215&w=250&sz=14&hl=pl&start=10&um=1&tbnid=A2JOcrooqhZcLM:&tbnh=95&tbnw=111&prev=/im ages%3fq%3dpalenie%26um%3d1%26hl%3dpl%26rls%3dcom.microsoft:pl 10 II CHOROBY CYWILIZACYJNE http://forum.gazeta.pl/forum/72,2.html?f=211&w=78678056&v=2&s=0
CHOROBY CYWILIZACYJNE Cytat o ziemi i człowieku, Narodziny chorób cywilizacyjnych, Definicja choroby cywilizacyjnej, Przykłady chorób cywilizacyjnych, Ogólne informacje o hemostazie w chorobach cywilizacyjnych. 11
Cytat o ziemi i człowieku... A wreszcie rzekł Bóg : << Uczyńmy człowieka na Nasz obraz, podobnego Nam. Niech panuje nad rybami morskimi, nad ptactwem powietrznym, nad bydłem, nad ziemią, nad wszystkimi zwierzętami pełzającymi po ziemi >> Stworzył więc Bóg człowieka na swój obraz, na obraz BoŜy go stworzył: stworzył męŝczyznę i niewiastę. Po czym Bóg im błogosławił, mówiąc do nich: << Bądźcie płodni i rozmnaŝajcie się, abyście zaludnili ziemię i uczynili ją sobie poddaną, abyście panowali nad rybami morskimi, nad ptactwem powietrznym i nad wszystkimi zwierzętami pełzającymi po ziemi >> www.biblia.poznan.pl/ps/biblia.htm (Ks.1, Rdz.1, 26-31 ) 12
Narodziny chorób b cywilizacyjnych Pierwszy człowiek biorąc ziemię we władanie otrzymał jak podaje Biblia polecenie uczynienia jej sobie poddanej. Analizując zmiany, jakie zaszły na naszej planecie w ciągu wieków trudno nie odnieść wraŝenia, Ŝe otrzymane kompetencje człowiek przekroczył wielokrotnie, nie bacząc na skutki swojego postępowania. Coraz większe uprzemysłowienie, urbanizacja, degradacja środowiska oraz szczególny tryb Ŝycia mieszkańców wielkich aglomeracji wywołały jeszcze inne negatywne skutki dla Ŝycia i zdrowia człowieka. To choroby cywilizacyjne koszmar naszych czasów. 13
CHOROBY CYWILIZACYJNE (definicja) Choroby cywilizacyjne to schorzenia związane z ujemnymi skutkami Ŝycia w warunkach wysoko rozwiniętej cywilizacji (sytuacjach stresowych, napięciu nerwowym, małej ruchliwości mięśniowej, oddziaływaniu skaŝeńśrodowiska i hałasu, nieracjonalnym odŝywianiu). Nowy leksykon PWN. Wyd. PWN Warszawa, 1998 14
Choroby cywilizacyjne: Choroby układu krąŝenia: - choroba niedokrwienna serca (zawał serca) - nadciśnienie tętnicze - miaŝdŝyca, Choroby nowotworowe, Cukrzyca, Otyłość, Choroby układu oddechowego (astma). 15
Do chorób b cywilizacyjnych zaliczamy równieŝ: Zespół metaboliczny, Lekomanię (narkomanię), Zaburzenia psychiczne (stres), Chorobę wrzodową. 16
http://www.wampiriada.pl/index.php?action=krew III HEMOSTAZA www.zdrowie.med..pl/aspiryna/aspiryna_4.html 17
HEMOSTAZA Zarys historyczny hemostazy, Definicja hemostazy, Budowa i zaburzenia układu hemostazy, Rodzaj i mechanizm zaburzeń hemostazy w wybranych chorobach cywilizacyjnych. 18
Zarys historyczny hemostazy Medycyna naleŝy do tych nauk, które rozwijają się bardzo dynamicznie, a jej obecny stan to połączenie doświadczeń przeszłości i osiągnięć współczesnej myśli naukowej. Początki medycyny sięgają czasów najdawniejszych, a szybki postęp i kolejne osiągnięcia przyczyniały się do wzrostu zainteresowania tą nauką, rozwoju coraz to nowych kierunków w medycynie. Mając na uwadze temat pisanej przeze mnie pracy, chciałabym skupić się na zagadnieniach koagulologicznych, związanych z układem hemostazy. Przedmiotem tej dziedziny medycyny jest krew. www.edukator.pl/indekx.php?page=2034 19
Zarys historyczny hemostazy www.theglasgowstory.com/image.php?inum=tgsd0002 5 Andrew Buchanan (1798-1882) - prowadził badania nad fibryną, we współpracy z Aleksandrem Schmidtem opisał proces powstawania fibyny. Rudolf Virchow (1821-1902)- prowadził badania nad fibryną, wskazał na jej znaczenie w procesie krzepnięcia krwi, wprowadził do nauki terminy Embolia (zator) i Tromboza (zakrzepica) www.geocities.com/ufreytag/page17.html 20
Zarys historyczny hemostazy Dr med. Maksymilian Rosenmann (1889-1960) - pionier badań naukowych nad krzepliwością krwi (układem fibrynolitycznym osocza). Opracował metodę preparatyki trombolizyny oraz poczynił pierwsze próby zastosowania enzymów fibrynolitycznych, Jego prace naukowe pozwoliły na wysnucie pierwszej fizjologicznej teorii fibrynolizy. Jednak największym sukcesem dr Rosenmanna było odkrycie adsorpcji enzymu fibrynolitycznego osocza na skrzepie. Trafnie określił znaczenie trombolizyny jako substancji zmniejszającej krzepliwość krwi Prof. Karol Buluk (1916-1990) autor proteolitycznej teorii krzepnięcia, jako pierwszy wyizolował krioprecypitat z osocza krwi (stosowany w leczeniu hemofilii i ch. Von Villebrandta), odkrywca XIII czynnika krzepnięcia w płytkach. 21
Hemostaza Całokszta okształt t procesów, których celem jest utrzymanie krwi oraz jej swobodnego przepływu w łoŝysku naczyniowym w warunkach fizjologicznych, jak i w przypadku uszkodzenia ściany naczynia. 22
Budowa układu hemostazy Płytki krwi, Ściana naczyń krwionośnych ( śródbłonek naczyniowy), Układ krzepnięcia, Układ fibrynolizy. Płytki krwi www.gembro.com 1. Warstwa tk. Łącznej 2. Warstwa tk. Mięśniowej 3. Warstwa śródbłonka Przekrój przez ścianę naczynia 23
Schemat kaskady krzepnięcia LEGENDA Kłyszejko-Stefanowicz L:. Ćwiczenia z biochemii. Wyd. PWN Warszawa, 1999, 625 24
Aktywatory i inhibitory procesu fibrynolizy LEGENDA PK prekalikreina HMWK wysokocząsteczkowy kininogen t-pa tkankowy aktywator plazminogenu u-pa urokinazowy aktywator plazminogenu PAI inhibitor aktywatora plazminogenu PDF produkty degradacji fibrynogenu i fibryny TAFI inhibitor fibrynolizy aktywowany przez trombinę. Radziwon P., Kłoczko J., Kiss B.: Współczesna teoria aktywacji i kontroli krzepnięcia krwi. Przew. Lek., 2004; 11: 50-56 25
Mechanizmy ograniczające ce tworzenie zakrzepów w (pozwalają na zachowanie płynności krwi): Ściana naczyń krwionośnych ( śródbłonek wydziela substancje przeciwzakrzepowe), Układ fibrynolityczny ( enzym plazmina trawi fibrynę i fibrynogen), Inhibitory osoczowe układu krzepnięcia (antytrombina,heparyna), Białko C (degradujące i inaktywujące aktywne czynniki VIII i V). plazmina heparyna antytrombina 26
Skrzepy włókna fibryny RBC www.astrographics.com www.colorado.edu 27
IV NOWOCZESNE METODY DIAGNOSTYCZNE UKŁADU HEMOSTAZY (opis obejmuje tylko wybrane przykłady) 28
Cytometria przepływowa Budowa i zasada działania ania cytometru przepływowego Cytometria przepływowa to metoda pomiaru pojedynczych komórek lub cząsteczek przepływających przez aparat w strumieniu cieczy. 29
Zastosowanie cytometrii umoŝliwia: precyzyjne określenie liczby płytek krwi, ekspresji receptorów płytkowych oraz zmiany kształtu płytek, badanie fizjologii, aktywacji i reaktywności płytek oraz ich oddziaływania z leukocytami i komórkami śródbłonka, określenie liczby retikulocytów (flow cytometric reticulocyte count), określenie liczby płytek retikulocytarnych w badanych próbkach na podstawie obecności mrna resztkowego, zastosowanie substancji wiąŝących jony wapniowe pozwala na oznaczenie jego stęŝenia wewnątrz płytki, dzięki tej metodzie moŝliwe jest równieŝ oznaczenie frakcji zuŝytych płytek i agregatów płytkowych z jednoczesnym określeniem, czy zbudowane są one jedynie z płytek czy zawierają równieŝ domieszkę krwinek białych. 30
Cytometria przepływowa Zalety: DuŜa szybkość pomiaru, MoŜliwość oceny wielu parametrów jednocześnie, Badanie wykonywane we krwi pełnej (minimalna manipulacja w próbce), Mała objętość próbki potrzebna do wykonania badania, Wysoka czułość i specyficzność pomiaru, Wysoka dokładność i minimalizacja rozrzutu wyników. Wady: Wysokie koszty badania oraz samej aparatury, Mała dostępność aparatury. 31
PCR (Polymerase Chain Reaction) RT-PCR (Real-time PCR) PCR-SSP (reakcja łańcuchowej polimerazy z primerami swoistymi dla alleli) 32
Zasada metody: RT-PCR ( reakcja łańcuchowej polimerazy w czasie rzeczywistym) www.takarabiousa.com/html/pcr_rtpcr_intro.html 1. W metodzie tej dochodzi do powielenia określonych fragmentów DNA dzięki zastosowaniu starterów i sond oligonukleotydowych (np. TagMan), wyznakowanych fluorochromem. 2. Obserwacja procesu namnaŝania moŝliwa jest dzięki połączeniu termocyklera z urządzeniem słuŝącym do pomiaru fluorescencji. 3. Odczyt fluorescencji podczas kolejnych cyklów pozwala na określenie pierwotnej ilości DNA, uŝytego do reakcji oraz monitorowanie przyrostu produktu reakcji jeszcze podczas jej trwania. Zastosowanie: ocena ekspresji glikoprotein płytkowych 33
PCR-SSP (reakcja łańcuchowej polimerazy z primerami swoistymi dla alleli) Zasada metody: 1. Metoda ta polega na jak najdokładniejszym dobraniu starterów oligonukleotydowych, komplementarnych do sekwencji badanych alleli, co pozwala na ich maksymalne wykorzystanie. www.unesp.br/prope/projtecn/saude/saude49b.htm 2. W odpowiednio dobranych warunkach reakcji primery dokonują amplifikacji określonej sekwencji. 3. Produkt reakcji wyodrębniony zostaje dzięki zastosowaniu elektroforezy na Ŝelach agarozowych. 4. Jego uwidocznienie umoŝliwia zastosowanie odpowiednich barwników. 5. MoŜliwe jest równieŝ wykorzystanie techniki stosowanej w RT-PCR w celu określenia ilości produktu poprzez pomiar natęŝenia sygnału świetlnego, związanego z badanym fragmentem fluorochromu. Elektroforeza na Ŝelach agarozowych. Typowanie antygenów HPA-1,-2,-3,-4,-5 przy pomocy PCR-SSP Zastosowanie: genotypowanie antygenów płytkowych HPA (Human Platelet Antigens) na glikoproteinach płytkowych 34
Metody biologii molekularnej pozwalają równieŝ na określenie: polimorfizmów, jakie występują w genie protrombiny, inhibitorze tkankowego aktywatora plazminogenu typu 1, w genach kodujących łańcuchy polipeptydowe fibrynogenu, polimorfizmów związanych z budową GP błonowych płytek. Parametry te, do niedawna praktycznie niedostępne dla diagnostyki, stały się obecnie kolejnym badaniem, wykonywanym w wielu laboratoriach. 35
Metoda CAT (automatycznego skalibrowanego trombogramu) Zasada metody: 1. Metoda polega na dodaniu do ubogopłytkowego osocza syntetycznego substratu fluorogennego, oddziałującego z trombiną. 2. Ulega on hydrolizie pod wpływam trombiny w ściśle określonym miejscu, w wyniku czego uwolniony zostaje fragment mający zdolność emitowania fluorescencji. 3. Nasilenie fluorescencji jest zaleŝne od aktywności trombiny zawartej w badanej próbce. Pol. Arch. Med.. Wewn. 2007; 117 (7) 4. Odczytu dokonuje się przy uŝyciu spektrofluorymetru. 5. Połączenie urządzenia ze specjalistycznym oprogramowaniem komputerowym umoŝliwia szybkie uzyskanie wyniku. Zastosowanie Bezpośrednie oznaczanie generacji trombiny. 36
Immunodiagnostyka (ELISA, RIA) Sandwich ELISA Metoda ta umoŝliwia wykrycie obecności swoistych antygenów na powierzchni badanych komórek lub tkanek. 1. W pierwszym etapie stosuje się przeciwciała pierwotne, wiąŝące badany antygen. 2. Następnie dodaje się biotynylowane, swoiste przeciwciało wtórne, przyłączające się do kompleksu antygenprzeciwciało pierwotne. 3. W ostatnim etapie dodawany jest kompleks awidynabiotynylowany enzym, reagujący z przeciwciałem wtórnym i substrat dla stosowanego enzymu. 4. Wynikiem reakcji jest powstanie barwnego produktu w miejscu występowania poszukiwanego antygenu. Jest on widoczny pod mikroskopem, w miejscu przyłączenia przeciwciała do badanej tkanki http://thefutureothings.com/articles/37/biopen-senses-biothreats.html Zastosowanie ELISA i RIA słuŝą do określenia stęŝenia kompleksów trombina-antytrombina III (TAT), fragmentów 1+2 protrombiny (1+2), trombomoduliny (TM), jak równieŝ oznaczania stęŝenia TFPI, kompleksu plazmina-α 2 antyplazmina oraz TF, βtg i aktywności czynnika vwf. RIA Wykrycie kompleksu antygen-przeciwciało zachodzi poprzez pomiar promieniowania izotopów promieniotwórczych, które związane są z jedną ze składowych reakcji. 37
Immunoturbidymetria Zasada pomiaru opiera się na reakcji antygen-przeciwciało, zachodzącej w fazie płynnej, w wyniku czego dochodzi do utworzenia kompleksów, których obecność prowadzi do zmiany właściwości optycznych badanego roztworu. Światło, przechodząc przez taki ośrodek, ulega w większym stopniu pochłonięciu i rozproszeniu. Immohistochemia Metoda ta umoŝliwia wykrycie obecności swoistych antygenów na powierzchni badanych komórek lub tkanek. 1. W pierwszym etapie stosuje się przeciwciała pierwotne, wiąŝące badany antygen. 2. Następnie dodaje się biotynylowane, swoiste przeciwciało wtórne, przyłączające się do kompleksu antygenprzeciwciało pierwotne. 3. W ostatnim etapie dodawany jest kompleks awidynabiotynylowany enzym, reagujący z przeciwciałem wtórnym i substrat dla stosowanego enzymu. 4. Wynikiem reakcji jest powstanie barwnego produktu w miejscu występowania poszukiwanego antygenu. Jest on widoczny pod mikroskopem, w miejscu przyłączenia przeciwciała do badanej tkanki. 38 Sierko E., Sawicki Z., Hempel D., Sulkowski S., Zimnoch L., Wojutkiewicz M.Z.: Ocena ekspresji in loco czynników układu krzepnięcia krwi w raku piersi. Onkol. Pol., 2006; 9(3): 69-74
PFA-100 (platelet function analyzer) Zasada metody opiera się na pomiarze tzw. czasu zamknięcia (okluzji) otworu w membranie przez powstający czop płytkowy. 1. Metoda ta umoŝliwia badanie płytek w warunkach in vitro, po wcześniejszej symulacji uszkodzenia naczynia. 2. System PFA-100 pozwala na stwierdzenie zaburzeń w funkcjonowaniu płytek krwi. 3. Membrana pokryta jest kolagenem, co imituje powierzchnię naczynia, sprzyja adhezji płytek i stanowi bodziec do ich aktywacji. Na jej powierzchni znajduje się równieŝ adrenalina lub ADP, które dodatkowo pobudzają aktywację płytek. 4. Wynik oznaczenia przedstawiany jest jako czas, który minął od momentu kontaktu krwi z membraną do chwili zamknięcia otworu przez skrzep płytkowy. Jest to tzw. czas zamknięcia (CT, Closure Time), podawany jest przez aparat w sekundach. Kwas acetylosalicylowy Zastosowanie wykrywanie dysfunkcji płytek krwi wywołanych przez czynniki wewnątrzpłytkowe, chorobę von Willebranda, monitorowanie działania leków przeciwpłytkowych (antagoniści GP IIb/ IIIa), wykrywanie oporności na ASA oraz kontrola jego terapii. 39
KaŜdy otrzymany wynik niezaleŝnie od metody stosowanej w jego oznaczeniu, naleŝy y analizować w porównaniu z wywiadem z pacjentem, historią jego choroby, jego aktualnym stanem klinicznym oraz innymi badaniami diagnostycznymi. 40