Chromatografia Chromatografia kolumnowa Chromatografia po co? Zastosowanie: oczyszczanie wydzielanie Chromatogram czarnego atramentu analiza jakościowa analiza ilościowa Optymalizacja eluentu Optimum 0.2 < R F < 0.5
Chromatografia kolumnowa Chromatografia kolumnowa jest bardzo dobrą i wydajną techniką słuŝącą do wydzielania i oczyszczania produktów naturalnych i syntetycznych. Mechanizm rozdziału jest identyczny z mechanizmem rozdziału w chromatografii cienkowarstwowej. dzięki istnieniu róŝnic w sile oddziaływań międzycząsteczkowych dla róŝnych związków pomiędzy składnikami mieszaniny, a fazą ruchomą oraz składnikami mieszaniny a fazą stacjonarną. W roli fazy stacjonarnej moŝna uŝywać rozmaitych adsorbentów. najczęściej w chemii organicznej stosowanym jest silikaŝel (bardzo silnie polarny) Związki polarne (b) adsorbują się silniej na polarnych cząsteczkach silikaŝelu, dlatego są wymywane z kolumny później niŝ składniki mniej polarne (a), które poruszają się szybciej przy zastosowaniu rozpuszczalnika mniej polarnego. Chromatografia kolumnowa co i jak? Przygotowanie kolumny Załadowanie kolumny Rozwijanie kolumny Zbieranie frakcji Analiza frakcji
Przygotowanie kolumny Kolumna powinna być ustawiona pionowo!!! silikaŝel korek z waty Pakowanie kolumny przygotowanie zawiesiny adsorbentu w eluencie do eluentu wsypuje się adsorbent zamieszać zawiesinę i zanim opadnie na dno, przelać do kolumny odczekać chwilę, do ubicia się adsorbentu w kolumnie otwarcie kranu, aŝ do momentu gdy wysokość eluentu nad adsorbentem wyniesie ok. 5 mm nie moŝna dopuścić do obniŝenia się poziomu rozpuszczalnika poniŝej poziomu adsorbentu!!! zamknąć kran Wpływ wielkości cząstek adsorbentu i szybkości przepływu na wysokość półki teoretycznej Źródło: Skoog, Holler, and Nieman, Principles of Instrumental Analysis, 5 th edition, Saunders College Publishing.
Aplikacja próbki do kolumny Przed aplikacją próbki wskazane jest, aby na warstwę adsorbentu nasypać piasku (2-5 mm) Próbka powinna być rozpuszczona w jak najmniejszej ilości eluentu OstroŜnie wprowadza się ją na warstwę adsorbentu, tak aby nie spowodować mieszania się z adsorbentem Następnie naleŝy ostroŝnie dodać eluent, tak aby nie dopuścić do zmieszania się z rozdzielaną próbką Rozwijanie kolumny i zbieranie frakcji OstroŜnie otworzyć kran Następuje rozdział substancji na warstwie adsorbentu NaleŜy starać się utrzymywać stałą wysokość rozpuszczalnika nad fazą stacjonarną Od dołu kolumny naleŝy odbierać kolejne frakcje w z góry ustalonych ilościach Objętość frakcji dobiera się empirycznie Proces prowadzi się do czasu, aŝ wszystkie analizowane związki opuszczą kolumnę Rozwijanie kolumny i zbieranie frakcji zmiana zlewki, gdy pojawi się Ŝółty kolor W celu szybkiego uzyskania niebieskiego związku, naleŝy uŝyć rozpuszczalnika bardziej polarnego.
Rozdział związków bezbarwnych Bardzo często rozdzielane (oczyszczane) związki są bezbarwne. zbiera się frakcje o niewielkiej objętości objętość frakcji dobiera się w zaleŝności od wielkości (długość, średnica) kolumny typowa wielkość frakcji wynosi 1 10 cm 3 kaŝdą z frakcji analizuje się wykonując oznaczenie metodą TLC łączy się frakcje zawierające tę samą substancję Analiza frakcji Analizę frakcji wykonuje się najczęściej stosując metodą TLC Po wykonaniu analiz łączy się frakcje zawierające ten sam związek, a następnie usuwa rozpuszczalnik W końcowym etapie otrzymuje się oczyszczone związki Inne waŝne zasady nie powinno się dopuszczać do wyschnięcia kolumny, kolumny nie naleŝy poddawać udarom mechanicznym, nie powinno się w sposób gwałtowny obniŝać ciśnienia eluentu, naleŝy przestrzegać zaleceń producenta co do warunków pracy kolumny,
Chromatografia kolumnowa Flash zasada działania identyczna jak tradycyjnej chromatografii kolumnowej budowa kolumny zbliŝona do tradycyjnej stosuje się niewielkie nadciśnienie szybszy rozdział substancji Chromatografia kolumnowa Flash Budowa kolumny Aplikacji próbki Rozwijanie kolumny Zbieranie frakcji Analiza TLC Połączenie frakcji Chromatografia kolumnowa Flash Średnica kolumny Obj. eluentu a Ilość próbki (typowa) [mg] Obj. frakcji [mm] [ml] R F > 0.2 R F > 0.2 [ml] 10 100 100 40 5 20 200 400 160 10 30 400 900 360 20 40 600 1600 600 30 50 1000 2500 1000 50 a Typowa objętość eluentu potrzebna do pakowania kolumny i elucji