Dlaczego mikrodysekcja laserowa? Agnieszka Łoboda Zakład Biotechnologii Medycznej Wydział Biochemii, Biofizyki i Biotechnologii UJ, Kraków
Mikrodysekcja laserowa szybka metoda izolacji komórek z preparatów zamroŝonych lub skrawków tkanek utrwalonych formaliną i zatopionych w parafinie metoda szczególnie przeznaczona do wycinania małej liczby komórek ( dokładna, nie powodująca zanieczyszczeń) system umoŝliwia separację i transport Ŝywych komórek duŝe zastosowanie w przypadku tkanek roślinnych
RóŜnorodność materiału u uŝytego u do mikrodysekcji laserowej i moŝliwe zastosowania Kultury komórkowe Komórki macierzyste Chromosomy Biologia komórki Badania roślin Diagnostyka Kontrast fazowy Histochemia Fluorescencja
Na naszym Wydziale Leica LMD7000 - najnowszy model
Przygotowanie preparatów w do mikrodysekcji Preparaty mroŝeniowe Tkanki MUSZĄ być zamroŝone szybko po pobraniu w celu ograniczenia ewentualnej degradacji RNA czy białek. Po cięciu na kriostacie na specjalne szkiełka, NIE NALEśY wysuszać tkanek Preparaty parafinowe NaleŜy uŝywaćświeŝo przygotowanych rozpuszczalników/barwników w bardzo małej ilości kilka kropel bezpośrednio na tkankę Preparaty muszą być w pełni odwodnione (sekwencja etanoli i ksylenu)
Następne kroki po wycięciu izolacja RNA najlepiej uŝywać specjalnych zestawów, np. RNeasy Micro Kit, RNeasy Plus Micro Kit (Qiagen), Izolacja do 45 µg całkowitego RNA z komórek i tkanek z uŝyciem kolumn eliminujących genomowe DNA - wykorzystanie specjalnych kolumn pozwala na wyeliminowanie kroku trawienia DNazą - bardzo wydajne usunięcie genomowego DNA - uzyskuje się powtarzalne wyniki - test szybki
Sprawdzenie jakości RNA Bioanalyzer 2100 AgilentTechnologies analiza 10-12 próbek w 30-40 minut RIN RNA Integrity Number <0-10> RIN = 10 RIN = 5 RIN = 3 Fluorescence Fluorescence Fluorescence 45 40 35 30 25 20 15 10 5 0 9 8 7 6 5 4 3 2 1 3.5 0 3.0 2.5 2.0 1.5 1.0 0.5 0.0 18S 18S 19 24 29 34 39 44 49 54 59 64 69 28S 28S Time (seconds)
AmpliSpeed RT-PCR z jednej komórki 48 moŝliwych reakcji jedna komórka jedna reakcja 1 µl mieszaniny reakcyjnej 1 dołek AmpliSpeed Beckman Coulter
RóŜne moŝliwości barwień Hematoksylina/eozyna Fiolet krezylu OranŜ akrydyny
Mikrodysekcja laserowa - przykłady Przed wycięciem Podczas wycinania Po wycięciu Fragment w wieczku eppendorfa skrawki mroŝeniowe barwienie hematoksyliną
Mikrodysekcja laserowa - przykłady Po wycięciu Fragment w wieczku eppendorfa skrawki mroŝeniowe barwienie hematoksyliną
Mikrodysekcja laserowa - przykłady Przed wycięciem Podczas wycinania Po wycięciu 1 2 3 Fragmenty w wieczku eppendorfa 1 2 4 5 3 4 5 skrawki mroŝeniowe barwienie hematoksyliną
Mikrodysekcja laserowa - przykłady Przed wycięciem Podczas wycinania Niektóre obiekty w wieczku eppendorfa skrawki mroŝeniowe barwienie hematoksyliną
Mikrodysekcja laserowa - przykłady Przed wycięciem Podczas wycinania Po wycięciu Przed wycięciem Podczas wycinania skrawki parafinowe barwienie hematoksyliną
Mikrodysekcja laserowa - przykłady Przed wycięciem Podczas wycinania Obiekty w wieczku eppendorfa skrawki parafinowe barwienie hematoksyliną
Mikrodysekcja laserowa - przykłady Przed wycięciem Podczas wycinania Obiekty w wieczku eppendorfa skrawki mroŝeniowe barwienie hematoksyliną
Mikrodysekcja laserowa Ŝywych komórek hodowla wyizolowanych komórek brak zmian w tempie wzrostu komórek/morfologii Przed wycięciem Po wycięciu hodowla 2 dni 6 dni 10 dni Proliferacja wyizolowanych komórek
Korzyści MembraneRings Mikrodysekcja prowadzona w całkowicie sterylnych warunkach Pozwala wycinać zarówno pojedyncze komórki jak i większe skupiska/kolonie komórek Wilgotność w komorze zbudowanej z dwóch pierścieni chroni przed szybkim wysychaniem komórek
Mikrodysekcja laserowa Ŝywych komórek Komórki NIH3T3 hodowane w tzw. membrane rings przed wycięciem podczas wycięcia po wycięciu komórki po wycięciu w nowej szalce
Podsumowanie Mikrodysekcja laserowa jest nowoczesną techniką separacji komórek/tkanek Więcej na częś ęści praktycznej Podziękowania Krzysztof Szade, Zakład Biotechnologii Medycznej, WBBB, UJ Bartosz Pilecki, Zakład Biotechnologii Medycznej, WBBB, UJ