HIM. Przeznaczenie. COBAS AMPLICOR HIV-1 MONITOR Test, version 1.5 DO STOSOWANIA W DIAGNOSTYCE IN VITRO.

COBAS AMPLICOR HIV-1 MONITOR Test, version 1.5 HIM DO STOSOWANIA W DIAGNOSTYCE IN VITRO. Informacje dotyczące zamówienia COBAS AMPLICOR HIM 48 Tests P/N: 21118390 123 HIV-1 MONITOR Test, version 1.5 ART: 11 1839 0 US: 83369 Przeznaczenie COBAS AMPLICOR WB 500 Tests P/N: 20759899 123 Wash Buffer ART: 07 5989 9 US: 83314 COBAS AMPLICOR HIV-1 MONITOR Test, version 1.5 (v1.5) jest to test amplifikacji kwasu nukleinowego in vitro służący do oznaczenia ilościowego RNA ludzkiego wirusa niedoboru odporności typu 1 (Human Immunodeficiency Virus Type 1, HIV-1) w ludzkim osoczu za pomocą analizatora COBAS AMPLICOR. Test umożliwia oznaczenie ilościowe HIV-1 RNA w zakresie 50-750 000 kopii/ml, wykorzystując połączenie dwóch procedur przygotowania próbki, standardowej oraz ultraczułej. Test jest przeznaczony do zastosowania w postępowaniu klinicznym u pacjentów zakażonych HIV-1, z uwzględnieniem stanu klinicznego oraz innych wskaźników laboratoryjnych progresji choroby. Test może służyć do oceny rokowania w oparciu o pomiar początkowego poziomu HIV-1 RNA; może także służyć do monitorowania leczenia przeciwretrowirusowego w oparciu o pomiar zmian poziomu HIV-1 RNA w osoczu podczas trwania tego leczenia. Poziomy HIV-1 RNA, oznaczane za pomocą reakcji łańcuchowej polimerazy (Polymerase Chain Reaction, PCR), wykorzystano jako jeden z zastępczych wskaźników w przyspieszonym procesie weryfikacji prowadzonym przez FDA następujących leków: inhibitorów proteazy INVIRASE (metanosulfonian sakwinawiru), CRIXIVAN (sulfonian indinawiru), NORVIR (ritonawir) i FORTOVASE (sakwinawir); nienukleozydowych inhibitorów odwrotnej transkryptazy VIRAMUNE (newirapina), SUSTIVA (efavirenz) i ZIAGEN (abakawir); oraz inhibitorów odwrotnej transkryptazy EPIVIR (lamiwudyna). Test COBAS AMPLICOR HIV-1 MONITOR, v1.5, nie jest przeznaczony do stosowania jako test przesiewowy krwi lub produktów krwiopochodnych na obecność HIV-1. Nie jest również przeznaczony do stosowania jako test diagnostyczny potwierdzający obecność zakażenia HIV-1. P/N: 04497821 190 4/2008, Revision 7.0 COBAS AMPLICOR HIV-1 MONITOR Test, version 1.5 1/52

Podsumowanie i objaśnienie testu Ludzki wirus niedoboru odporności (HIV) jest czynnikiem etiologicznym zespołu nabytego niedoboru odporności (Acquired Immunodeficiency Syndrome, AIDS) 1-3. Zakażenie HIV może być przenoszone drogą kontaktu płciowego, narażenia na zakażoną krew lub produkty krwiopochodne albo z zakażonej matki na płód 4. W ciągu trzech do sześciu tygodni od narażenia na HIV, ogólnie u osób zakażony występuje krótki, ostry zespół charakteryzujący się objawami grypopodobnymi, któremu towarzyszy duża wiremia we krwi obwodowej 5-8. Później u większości zakażonych osób występuje swoista dla HIV odpowiedź immunologiczna oraz zmniejszenia wiremii w osoczu; ma to zazwyczaj miejsce od czterech do sześciu tygodniu od początku objawów 9,10. Po serokonwersji zakażone osoby wchodzą zazwyczaj w fazę o stabilnym przebiegu klinicznym, bezobjawową, która może trwać wiele lat 11-13. Okres bezobjawowy charakteryzuje się utrwaloną niewielką wiremią w osoczu 14 oraz stopniowym zanikaniem limfocytów T CD4 +, co prowadzi do ciężkiego niedoboru odporności, mnogich zakażeń oportunistycznych, nowotworów złośliwych i zgonu 15. Pomimo, że poziomy wiremii w fazie bezobjawowej zakażenia we krwi obwodowej są stosunkowo małe, to replikacja wirusa i jego usuwanie wydają się być procesem dynamicznym, w którym duża produkcja wirusa i zakażanie komórek CD4 + jest równoważone przez odpowiednio nasilone usuwanie wirusa, śmierć zakażonych komórek i uzupełnianie komórek CD4 +. Powoduje to, że poziomy wiremii i komórek CD4 + w osoczu są względnie stałe 16-18. Za pomocą pomiarów ilościowych wiremii HIV we krwi obwodowej wykazano, że większe poziomy wirusa mogą wiązać się ze zwiększonym ryzykiem progresji klinicznej choroby wywoływanej przez HIV. Ponadto wykazano, że zmniejszenie poziomów wirusa w osoczu może wiązać się ze zmniejszonym ryzykiem progresji klinicznej 19-21. Poziomy wirusa we krwi obwodowej można oznaczyć ilościowo mierząc antygen p24 HIV w surowicy, prowadząc ilościową hodowlę HIV z osocza lub bezpośrednio oceniając zawartość wirusowego RNA w osoczu za pomocą amplifikacji kwasu nukleinowego lub technologii amplifikacji sygnału 22-26. Antygen p24 jest głównym białkiem rdzeniowym wirusa HIV i znajduje się w surowicy w postaci wolnej lub związanej z przeciwciałem przeciwko p24. Wolny antygen p24 można mierzyć za pomocą dostępnych w handlu badań immunoenzymatycznych (EIA). Niemniej jednak przydatność antygenu p24 jako markera obciążenia organizmu wirusem jest ograniczona, ponieważ może być on wykryty tylko u 20% bezobjawowych pacjentów i 40-50% pacjentów z objawami. Postępowanie zmierzające do rozbicia kompleksów antygen-przeciwciało poprawia czułość badań mierzących poziom antygen p24, ale białko wirusa nadal nie jest wykrywane u większości bezobjawowych pacjentów 22. HIV w osoczu można hodować inokulując nim pobudzone komórki jednojądrowe krwi obwodowej (peripheral blood mononuclear cells, PBMC) pochodzące od zdrowych dawców. Oznaczenie ilościowe uzyskuje się inokulując PBMC za pomocą seryjnych rozcieńczeń próbki osocza. Hodowla ilościowa ma ograniczoną użyteczność w monitorowaniu poziomów wirusa u osób zakażonych, ponieważ jedynie niewielka frakcja cząstek wirusa jest zakaźna w warunkach in vitro. Zakaźny wirus jest często niewykrywalny u osób bez objawów 22. HIV RNA w osoczu można oznaczyć ilościowo za pomocą technologii amplifikacji kwasu nukleinowego, takich jak reakcja łańcuchowa polimerazy (PCR) 27-29. Test COBAS AMPLICOR HIV-1 MONITOR, v1.5, wykorzystuje technologię PCR w celu osiągnięcia maksymalnej czułości oraz dynamicznego zakresu ilościowego detekcji HIV-1 RNA w osoczu zawierającym dodatek antykoagulantów (EDTA lub ACD) 24. 2/52 COBAS AMPLICOR HIV-1 MONITOR Test, version 1.5 4/2008, Revision 7.0

HIV-1 MONITOR Zasady procedury Test COBAS AMPLICOR HIV-1 MONITOR, v1.5, opiera się na pięciu głównych procesach: przygotowanie próbki; odwrotna transkrypcja docelowego RNA w celu utworzenia komplementarnego DNA (cdna) 30 ; amplifikacja PCR 30 docelowego cdna z wykorzystaniem primerów swoistych dla HIV-1; hybrydyzacja zamplifikowanego produktu z sondami oligonukleotydowymi swoistymi dla celu (celów); oraz wykrycie związanych z sondami zamplifikowanych produktów za pomocą kolorymetrii. Test COBAS AMPLICOR HIV-1 MONITOR, v1.5, umożliwia równoczesne przeprowadzenie odwrotnej transkrypcji oraz amplifikacji PCR docelowego HIV-1 oraz HIV-1 Quantitation Standard RNA. Mieszanina główna (Master Mix) zawiera parę primerów swoistych zarówno dla HIV-1 RNA jak i dla HIV-1 Quantitation Standard RNA. Opracowano ją w celu zapewnienia równoważnego oznaczenia ilościowego podtypów HIV-1 grupy M. Nie ustalono charakterystyki działania testu dla próbek grupy O. Oznaczenie ilościowe HIV-1 wirusowego RNA przeprowadza się za pomocą HIV-1 Quantitation Standard. HIV-1 Quantitation Standard to niezakaźny transkrypt RNA zawierający identyczne miejsca wiązania odcinków primerowych z posiadanymi przez docelowy HIV-1 RNA, oraz charakterystyczne miejsce wiązania sondy, które umożliwia zróżnicowanie amplikonu Quantitation Standard od amplikonu HIV-1. HIV-1 Quantitation Standard wchodzi w skład każdej próbki; znana jest liczba jego kopii; razem z docelowym HIV-1 jest przeprowadzany przez proces przygotowania próbki, odwrotną transkrypcję, amplifikację PCR, hybrydyzację i detekcję, a także jest amplifikowany. Analizator COBAS AMPLICOR oblicza poziomy HIV-1 RNA w badanych próbkach, porównując sygnał HIV-1 z sygnałem Quantitation Standard dla każdej próbki. Quantitation Standard rekompensuje wpływ hamowania oraz kontroluje proces amplifikacji, aby umożliwić dokładne oznaczenie ilościowe HIV-1 RNA w każdej próbce. Przygotowanie próbki Test COBAS AMPLICOR HIV-1 MONITOR, v1.5, może być stosowany z dwiema procedurami przygotowania próbki, procedurą standardową oraz procedurą ultraczułą. W standardowej procedurze przygotowania próbki HIV-1 RNA izoluje się z bezpośrednio z osocza poprzez lizę cząsteczek wirusa przy użyciu czynnika chaotropowego, a następnie strącenie RNA z alkoholem. W ultraczułej procedurze przygotowania próbki cząsteczki wirusa HIV-1 w osoczu są w pierwszym etapie koncentrowane za pomocą wirówki o dużej prędkości, a następnie poddawane lizie przy użyciu czynnika chaotropowego, po której ma miejsce strącenie HIV-1 RNA z alkoholem. Znana liczba cząsteczek Quantitation Standard RNA jest wprowadzana do każdej próbki z odczynnikiem lizującym. HIV-1 Quantitation Standard przeprowadza się przez etapy przygotowania próbki, odwrotnej transkrypcji, amplifikacji i detekcji oraz wykorzystuje się do ilościowego oznaczenia HIV-1 RNA w badanej próbce. 4/2008, Revision 7.0 COBAS AMPLICOR HIV-1 MONITOR Test, version 1.5 3/52

Odwrotna transkrypcja i amplifikacja PCR Wybór sekwencji docelowej Wybór docelowej sekwencji RNA dla HIV-1 zależy od identyfikacji regionów w obrębie genomu HIV-1, które wykazują największy konserwatyzm sekwencji. Zgodnie z tym, właściwy wybór odcinków primerowych oraz sondy ma kluczowe znaczenie dla zdolności testu do detekcji genotypu HIV-1. Test COBAS AMPLICOR HIV-1 MONITOR, v1.5, wykorzystuje primery SK145 i SKCC1B w celu określenia sekwencji 155 nukleotydów w obrębie bardzo konserwatywnego regionu genu gag HIV-1 31. Region gag koduje antygeny charakterystyczne dla grupy oraz białka strukturalne rdzenia wirionu. Ogólnie geny gag HIV-1 posiadają około 1500 nukleotydów i znajdują się w przybliżeniu w pozycjach 789-2290 genomu HIV. Sekwencja nukleotydów odcinków primerowych została zoptymalizowana w taki sposób, aby zapewnić równoważną amplifikację podtypów grupy M HIV-1. Odwrotna transkrypcja Reakcje odwrotnej transkrypcji i amplifikacji PCR wykonywane są przy użyciu termostabilnego, rekombinowanego enzymu Thermus thermophilus polimeraza DNA (rtth pol). W obecności manganu i w odpowiednich warunkach układu buforowego, rtth pol wykazuje aktywność zarówno odwrotnej transkryptazy, jak i polimerazy DNA 30. Pozwala to na zachodzenie reakcji odwrotnej transkrypcji i amplifikacji PCR w tej samej mieszaninie reakcyjnej. Poddane obróbce próbki dodaje się do mieszaniny amplifikacyjnej w probówkach do amplifikacji (A-tubes), w których zachodzi zarówno odwrotna transkrypcja, jak i amplifikacja PCR. Primer inicjujący transkrypcję nici sensownej, określany jako primer antysensowny (SKCC1B) oraz primer inicjujący transkrypcję nici antysensownej, określany jako primer sensowny (SK145) są biotynylowane na końcach 5'. Mieszanina reakcyjna jest ogrzewana, aby umożliwić primerowi antysensownemu swoiste wtopienie do docelowego HIV-1 RNA oraz do HIV-1 Quantitation Standard RNA. W obecności Mn 2+ oraz nadmiaru trójfosforanów deoksynukleozydu (deoxynucleoside triphosphates, dntps), w tym trójfosforanów deoksyadenozyny, deoksyguanozyny, deoksycytydyny oraz deoksytymidyny, rtth pol wydłuża wtopiony primer, budując nić DNA (cdna) komplementarną do docelowego RNA. Amplifikacja odcinka docelowego Po odwrotnej transkrypcji docelowego HIV-1 RNA oraz HIV-1 Quantitation Standard RNA, mieszanina reakcyjna jest ogrzewana, aby doszło do denaturacji hybrydy RNA:cDNA oraz odsłonięcia docelowych sekwencji dla primera. Po ochłodzeniu mieszaniny i swoistym wtopieniu primera sensownego (SK145) z nicią cdna, rtth pol wydłuża primer syntetyzując drugą nić DNA. W ten sposób kończy się pierwszy cykl PCR. W jego wyniku powstała dwuniciowa kopia DNA regionu docelowego HIV-1 RNA oraz HIV-1 Quantitation Standard RNA. Mieszanina reakcyjna podgrzewana jest po raz kolejny, w celu rozdzielenia powstałego dwuniciowego DNA i odsłonięcia sekwencji docelowych dla primerów. W miarę stygnięcia mieszaniny, primery SK145 i SKCC1B przyłączają się do docelowego DNA. rtth pol w obecności Mn 2+ oraz nadmiaru dntps wydłuża przyłączone primery wzdłuż docelowych wzorców, w celu wytworzenia cząsteczki dwuniciowego DNA, zawierającej 155 par zasad, nazwanej amplikonem. Analizator COBAS AMPLICOR automatycznie powtarza powyższy proces przez określoną liczbę cykli, w każdym z nich skutecznie podwajając ilość DNA amplikonu. Amplifikacja zachodzi wyłącznie w regionie genomu HIV-1, który znajduje się pomiędzy dwoma primerami; cały genom HIV-1 nie jest amplifikowany. 4/52 COBAS AMPLICOR HIV-1 MONITOR Test, version 1.5 4/2008, Revision 7.0

HIV-1 MONITOR Amplifikacja wybiórcza Amplifikacja wybiórcza docelowego kwasu nukleinowego z próbki klinicznej zachodzi w teście COBAS AMPLICOR HIV-1, v1.5, dzięki zastosowaniu enzymu AmpErase (uracylo-n-glikozydaza) i trójfosforanu dezoksyurydyny (dutp). Enzym AmpErase rozpoznaje i katalizuje zniszczenie nici DNA zawierających dezoksyurydynę 32, nie wpływając na DNA zawierający dezoksytymidynę. W DNA występującym w naturze nie stwierdza się dezoksyurydyny, natomiast jest ona zawsze obecna w amplikonie, z uwagi na stosowanie trójfosforanu dezoksyurydyny jako jednego spośród trójfosforanów dezoksynukleozydu (dntps) w odczynniku Master Mix; dlatego też dezoksyurydynę zawiera wyłącznie amplikon. Dezoksyurydyna powoduje wrażliwość zanieczyszczającego amplikonu na rozkład przez enzym AmpErase przed amplifikacją docelowego DNA. Enzym AmpErase, zawarty w odczynniku Master Mix, katalizuje rozszczepienie DNA zawierającego dezoksyurydynę przy resztach dezoksyurydynowych na drodze otwarcia łańcucha w pozycji C1. Podczas ogrzewania w pierwszym cyklu termicznym w ph zasadowym odczynnika Master Mix, łańcuch amplikonu DNA pęka w pozycji dezoksyurydyny, w ten sposób wykluczając dalszą amplifikację DNA. Enzym AmpErase jest nieczynny w temperaturach powyżej 55 C, tj. w czasie trwania całego cyklu termicznego, dlatego też nie niszczy on amplikonu docelowego. Po amplifikacji każdy resztkowy enzym jest denaturowany poprzez dodanie roztworu denaturacyjnego. W ten sposób zapobiega się degradacji dowolnego amplikonu docelowego. Wykazano, że enzym AmpErase w teście COBAS AMPLICOR HIV-1 MONITOR, v1.5 inaktywuje co najmniej 10 3 kopii amplikonu HIV-1 zawierającego dezoksyurydynę w przeliczeniu na jedną reakcję PCR. Reakcja hybrydyzacji Reakcja detekcji Po amplifikacji PCR analizator COBAS AMPLICOR automatycznie dodaje roztwór denaturacyjny do probówek amplifikacyjnych (A-tubes) w celu chemicznej denaturacji amplikonu HIV-1 oraz HIV-1 Quantitation Standard i uzyskania jednoniciowego DNA. W celu uzyskania wyników ilościowych obejmujących duży zakres dynamiczny, analizator COBAS AMPLICOR seryjnie rozcieńcza zdenaturowany amplikon w naczyńkach używanych do detekcji (D-cups). Do każdego z czterech rozcieńczeń amplikonu HIV-1 lub do każdego z dwóch rozcieńczeń amplikonu HIV-1 Quantitation Standard dodaje się zawiesinę cząsteczek magnetycznych opłaszczonych sondą oligonukleotydową swoistą dla, odpowiednio, amplikonu HIV-1 (SK102) lub amplikonu HIV-1 Quantitation Standard (CP35). Amplikony znakowane biotyną ulegają hybrydyzacji ze swoistymi dla materiału docelowego sondami oligonukleotydowymi związanymi z cząsteczkami magnetycznymi. Każde oznaczenie ilościowe wymaga czterech niezależnych pomiarów absorbancji odczynników, wykorzystujących zawiesinę sondy HIV-1, oraz dwóch pomiarów absorbancji wykorzystujących zawiesinę sondy HIV-1 Quantitation Standard. Po reakcji hybrydyzacji analizator COBAS AMPLICOR przemywa cząsteczki magnetyczne w pojemnikach D-cup w celu usunięcia niezwiązanego materiału, a następnie dodaje kompleks awidyna-peroksydaza chrzanowa. Kompleks awidynaperoksydaza chrzanowa wiąże się ze znakowanymi biotyną amplikonami, które uległy hybrydyzacji ze swoistymi dla materiału docelowego sondami oligonukleotydowymi związanymi z cząsteczkami magnetycznymi. Analizator COBAS AMPLICOR usuwa niezwiązany koniugat przez wypłukanie cząsteczek magnetycznych, a następnie dodaje do każdego pojemnika D-cup roztwór substratu, zawierający nadtlenek wodoru i 3,3',5,5'-tetrametylobenzydynę (TMB). W obecności nadtlenku wodoru peroksydaza chrzanowa związana z cząsteczkami katalizuje utlenianie TMB tworząc barwny kompleks. Analizator COBAS AMPLICOR mierzy wartość absorbancji tego kompleksu przy długości fali 660 nm. 4/2008, Revision 7.0 COBAS AMPLICOR HIV-1 MONITOR Test, version 1.5 5/52

Oznaczenie ilościowe HIV-1 RNA Total HIV-1 A Total QS A Test COBAS AMPLICOR HIV-1 MONITOR, v1.5, ilościowo oznacza wirusowy RNA HIV-1, wykorzystując drugą sekwencję docelową (HIV-1 Quantitation Standard), którą w znanym stężeniu dodaje się do badanej próbki. HIV-1 Quantitation Standard to niezakaźna cząsteczka RNA składająca się z 233 transkrybowanych in vitro nukleotydów, której miejsca wiązania primera są identyczne ze znajdującymi się w docelowej sekwencji HIV-1. HIV-1 Quantitation Standard zawiera miejsca wiązania primerów SK145 i SKCC1B oraz wytwarza produkt amplifikacji o tej samej długości (155 zasad) i składzie zasad, jak docelowy HIV-1 RNA. Miejsce wiązania sondy amplikonu HIV-1 Quantitation Standard zostało zmodyfikowane w celu różnicowania amplikonu HIV-1 Quantitation Standard i amplikonu docelowego HIV-1. W liniowym zakresie testu, pochłanianie dla długości fali wynoszącej 660 nm (A 660 ) dla każdego pojemnika D-cup jest proporcjonalne do ilości amplikonów HIV-1 lub HIV-1 Quantitation Standard w pojemniku D-cup. Analizator COBAS AMPLICOR oblicza całkowita absorbancja HIV-1 i HIV-1 Quantitation Standard mnożąc pochłanianie pojemnika D-cup przez współczynnik rozcieńczenia amplikonu dla tego pojemnika, a następnie wybiera pojemnik o maksymalnym całkowitym pochłanianiu. Obliczona całkowita absorbancja jest proporcjonalna do ilości HIV-1 RNA lub HIV-1 Quantitation Standard RNA obecnej w każdej reakcji odwrotnej transkrypcji/amplifikacji PCR. Ilość HIV-1 RNA w każdej próbce oblicza się ze współczynnika całkowitego absorbancji HIV-1 i całkowitego absorbancji HIV-1 Quantitation Standard, oraz wprowadzonej liczby cząsteczek HIV-1 Quantitation Standard RNA, za pomocą następującego równania: [ ] AF x Input HIV-1 QS kopie/pcr x Sample Volume Factor = HIV-1 RNA kopie/ml gdzie: Total HIV-1 A = obliczona całkowita absorbancja dla amplikonu HIV-1 Total QS A = obliczona całkowita absorbancja dla amplikonu Quantitation Standard Input HIV-1 QS copies/pcr = liczba kopii Quantitation Standard w każdej reakcji; liczba ta jest swoista dla serii Sample Volume Factor = współczynnik konwersji jednostek: kopie/pcr do kopii/ml AF = współczynnik dostosowania do standaryzacji wyników testu COBAS AMPLICOR HIV-1 MONITOR v1.5 do wyników testu AMPLICOR HIV-1 MONITOR v1.5 (współczynnik dostosowania = 1,11) Sample Volume Factor = 40 (dla standardowej procedury przygotowania próbki) Sample Volume Factor = 4 (dla ultraczułej procedury przygotowania próbki) 6/52 COBAS AMPLICOR HIV-1 MONITOR Test, version 1.5 4/2008, Revision 7.0

HIV-1 MONITOR Odczynniki COBAS AMPLICOR HIM 48 testów P/N: 21118390 123 HIV-1 MONITOR Test, ART: 11 1839 0 version 1.5 US: 83369 Odczynniki do przygotowania próbki HIM PREP HIV-1 LYS (HIV-1 MONITOR odczynnik lizujący) Bufor Tris-HCl 68% tiocyjanian guanidyny 3% ditiotreitol < 1% glikogen Xn 68% (udział wagowy) tiocyjanian guanidyny + 4 x 9,0 ml Produkt szkodliwy HIV-1 QS, v1.5 4 x 0,1 ml (HIV-1 MONITOR standard oznaczania, wersja 1,5) < 0,001% niezakaźny, transkrybowany in vitro RNA (pochodzenia bakteryjnego) zawierający sekwencje wiążące primery HIV-1 oraz unikalny obszar wiążący sondę < 0,005% Poly ra RNA (syntetyczny) EDTA 0,05% azydek sodu HIV-1 DIL (HIV-1 MONITOR rozcieńczalnik próbki) Bufor Tris-HCl < 0,005% Poly ra RNA (syntetyczny) EDTA 0,05% azydek sodu 4 x 4,8 ml Odczynniki kontroli HIM CTL NHP 4 x 1,6 ml [Osocze ujemne (ludzkie)] Ludzkie osocze, niereaktywne w testach (licencjonowanych w USA przez FDA) dla przeciwciała przeciwko HCV, przeciwciała przeciwko HIV-1/2, antygenu p24 HIV oraz HBsAg; brak wykrycia HIV-1 RNA, HCV RNA lub HBV DNA za pomocą PCR w zmieszanych jednostkach od wielu dawców; brak wykrycia przeciwciała przeciwko rdzeniowi HBV w zmieszanych jednostkach od wielu dawców za pomocą testów licencjonowanych przez FDA. 0,1% Substancja konserwująca ProClin 300 HIV-1 ( ) C [HIV-1 ( ) Kontrola] < 0,005% Poly ra RNA (syntetyczny) EDTA 0,05% azydek sodu 4 x 0,05 ml 4/2008, Revision 7.0 COBAS AMPLICOR HIV-1 MONITOR Test, version 1.5 7/52

HIV-1 L(+)C 4 x 0,05 ml [HIV-1 MONITOR Low (+) Kontrola] < 0,001% niezakaźny, transkrybowany in vitro RNA (pochodzenia bakteryjnego) zawierający sekwencje HIV-1 < 0,005% Poly ra RNA (syntetyczny) EDTA 0,05% azydek sodu HIV-1 H(+)C 4 x 0,05 ml [HIV-1 MONITOR High (+) Kontrola] < 0,001% niezakaźny, transkrybowany in vitro RNA (pochodzenia bakteryjnego) zawierający sekwencje HIV-1 < 0,005% Poly ra RNA (syntetyczny) EDTA 0,05% azydek sodu Odczynniki do amplifikacji HIM AMP HIV-1 MMX, v1.5 4 x 0,7 ml (HIV-1 MONITOR Master Mix, wersja 1.5) Bufor bicynowy Glicerol < 0,01% rtth polimeraza DNA (rtth pol, bakteryjna) Octan potasu < 0,07% datp, dctp, dgtp, dutp, dttp < 0,001% primery SKCC1B i SK145, biotynylowane < 0,01% enzym AmpErase (uracylo-n-glikozylaza) (bakteryjna) 0,05% azydek sodu HIV-1 Mn 2+, v1.5 (HIV-1 MONITOR roztwór manganu, wersja 1.5) < 2% mangan Kwas octowy Barwnik amarantowy 0,05% azydek sodu 4 x 0,1 ml Odczynniki do swoistej reakcji detekcji HIM DK AD3 2 x 75 testów (Odczynnik do rozcieńczenia amplikonu) EDTA 0,8% wodorotlenek sodu Xi 0,8% (udział wagowy) wodorotlenek sodu + Produkt drażniący IM PS1, v1.5 2 x 100 testów (HIV-1 MONITOR zawiesina sondy 1, wersja 1.5) Bufor MES < 0,01% zawiesina Dynabeads (cząsteczkek paramagnetycznych) opłaszczonych oligonukleotydową sondą swoistą dla HIV-1 (SK102) 0,09% azydek sodu 8/52 COBAS AMPLICOR HIV-1 MONITOR Test, version 1.5 4/2008, Revision 7.0

HIV-1 MONITOR IM4, v1.5 (HIV-1 MONITOR zawiesina sondy 2, wersja 1.5) Bufor fosforanowy < 0,2% detergent 24,9% tiocyjanian sodu 2 x 100 testów IQ PS1, v1.5 1 x 100 testów (HIV-1 MONITOR zawiesina sondy 1 standardu oznaczania, wersja 1.5) Bufor MES < 0,01% zawiesina Dynabeads (cząsteczkek paramagnetycznych) opłaszczonych oligonukleotydową sondą swoistą dla HIV-1 Quantitation Standard (CP35) 0,09% azydek sodu IQ4, v1.5 (HIV-1 MONITOR zawiesina sondy 2 standardu oznaczania, wersja 1.5) Bufor fosforanowy < 0,2% detergent 24,9% tiocyjanian sodu 1 x 100 testów Odczynniki do nieswoistej reakcji detekcji DK DN4 1 x 100 testów (Roztwór denaturacyjny) 1,6% wodorotlenek sodu EDTA Błękit tymolowy Xi 1,6% (udział wagowy) wodorotlenek sodu + Produkt drażniący CN4 3 x 100 testów (Kompleks awidyna-peroksydaza chrzanowa) Bufor Tris-HCl < 0,001% koniugat awidyny i peroksydazy chrzanowej Albumina wołowa (ssacza) Emulsit 25 (Dai-ichi Kogyo Seiyaku Co., Ltd.) 0,1% fenol 1% Substancja konserwująca ProClin 150 SB3 (Substrat A) Roztwór soli kwasu cytrynowego 0,01% nadtlenek wodoru 0,1% Substancja konserwująca ProClin 150 5 x 75 testów 4/2008, Revision 7.0 COBAS AMPLICOR HIV-1 MONITOR Test, version 1.5 9/52

SB 5 x 5 ml (Substrat B) 0,1% 3,3',5,5'-tetrametylobenzydyna (TMB) 40% dimetyloformamid (DMF) T 40% (udział wagowy) dimetyloformamid (DMF) Produkt toksyczny R: 61-20/21-36 Może działać szkodliwie na dziecko w łonie matki. Działa szkodliwie przez drogi oddechowe i w kontakcie ze skórą. Działa drażniąco na oczy. S: 53-45 Unikać narażenia - przed użyciem zapoznać się z instrukcją. W przypadku awarii lub jeżeli źle się poczujesz, niezwłocznie zasięgnij porady lekarza - jeżeli to możliwe, pokaż etykietę. COBAS AMPLICOR WB 500 testów P/N: 20759899 123 Wash Buffer ART: 07 5989 9 COBAS AMPLICOR bufor płuczący US: 83314 WB (10X koncentrat płuczący) < 2% bufor fosforanowy < 9% chlorek sodu EDTA < 2% detergent 0,5% Substancja konserwująca ProClin 300 Ostrzeżenia i środki ostrożności 2 x 250 testów Do stosowania w diagnostyce in vitro. Test ten jest przeznaczony wyłącznie do stosowania z ludzkim osoczem pobranym do EDTA lub ACD (antykoagulanty). Wykazano, że heparyna hamuje PCR i nie wolno jej stosować w tej procedurze. Nie pipetować ustami. Nie jeść, nie pić oraz nie palić w laboratorium, w obszarach roboczych. Przy obchodzeniu się z próbkami i odczynnikami z zestawów stosować jednorazowe rękawice, fartuchy laboratoryjne oraz odpowiednią ochronę oczu. Dokładnie umyć ręce po obchodzeniu się z próbkami i odczynnikami testowymi. Przy pobieraniu poszczególnych dawek odczynników z butelek, unikać skażenia bakteryjnego odczynników lub ich zanieczyszczenia rybonukleazą. Zaleca się używanie jałowych jednorazowych pipet oraz końcówek pipet wolnych od RNazy. Nie mieszać odczynników pochodzących z różnych serii lub różnych butelek tej samej serii. Wyrzucić wszystkie nieużyte odczynniki, postępując zgodnie z przepisami krajowymi, federalnymi, stanowymi i lokalnymi. Nie używać zestawu po upływie daty przydatności. Regionalne biuro Roche na życzenie może dostarczyć informacje o bezpieczeństwie materiałów (Material Safety Data Sheets, MSDS). 10/52 COBAS AMPLICOR HIV-1 MONITOR Test, version 1.5 4/2008, Revision 7.0

HIV-1 MONITOR Praca w laboratorium musi zachodzić w sposób jednokierunkowy, z początkiem w obszarze przedamplifikacyjnym i z jednokierunkowym ruchem w stronę obszaru poamplifikacyjnego (amplifikacji/detekcji). Czynności wykonywane przed amplifikacją muszą rozpoczynać się od przygotowania odczynników, następnie zaś należy przygotowywać próbki. Materiały i urządzenia muszą być przypisane do każdej z czynności przedamplifikacyjnych i nie wolno ich używać do żadnych innych czynności lub przenosić pomiędzy obszarami. W każdym z obszarów należy używać rękawic; rękawice muszą być zmieniane przed opuszczeniem każdego z obszarów. Wyposażenie i materiały zastosowane do przygotowania odczynnika nie mogą być używane podczas czynności związanych z przygotowywaniem próbki lub pipetowaniem albo obróbką zamplifikowanego DNA lub innych źródeł docelowego DNA. Materiały i urządzenia używane w czynnościach po amplifikacji muszą pozostawać zawsze w obszarze poamplifikacyjnym. Uwaga Z próbkami należy obchodzić się tak, jak z materiałem zakaźnym, stosując laboratoryjne procedury bezpieczeństwa, takie jak określone w dokumencie Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories 33 oraz w CLSI Document M29-A3 34. Dokładnie oczyścić i odkazić wszystkie powierzchnie robocze świeżo przygotowanym roztworem 0,5% podchlorynu sodu w wodzie dejonizowanej lub destylowanej. Dostępny w handlu płynny domowy wybielacz zawiera zazwyczaj podchloryn sodu w stężeniu 5,25%. Rozcieńczenie domowego wybielacza w stosunku 1:10 przyniesie 0,5% roztwór podchlorynu sodu. UWAGA: Niniejszy zestaw zawiera składnik (NHP) otrzymany z ludzkiej krwi. Materiał źródłowy badano przy użyciu testów zatwierdzonych przez US FDA i stwierdzono, że jest on niereaktywny pod względem obecności przeciwciał przeciwko HCV, przeciwciał przeciwko HIV-1/2, antygenu HIV p24 oraz antygenu powierzchniowemu wirusa zapalenia wątroby typu B (HBsAg). Ponadto badano zmieszane jednostki od wielu dawców; nie wykryto HIV-1 RNA, HCV RNA i HBV DNA za pomocą PCR oraz nie wykryto przeciwciała przeciwko rdzeniowi HBV za pomocą licencjowanego przez FDA testu. Żadna ze znanych metod badania nie może zaoferować całkowitej pewności, że produkty otrzymane z ludzkiej krwi nie będą przenosić czynników zakaźnych. Dlatego też wszelkie materiały pochodzenia ludzkiego należy traktować jako potencjalnie zakaźne. Z NHP należy obchodzić się jak z materiałem zakaźnym, stosując bezpieczne procedury laboratoryjne takie jak procedury wymienione w dokumencie Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories 33 oraz w dokumencie CLSI M29-A3 34. Należy dokładnie czyścić i dezynfekować wszystkie powierzchnie robocze przy użyciu 0,5% roztworu podchlorynu sodu w wodzie dejonizowanej lub destylowanej. HIV-1 QS, v1.5; HIV-1 DIL; HIV-1 MMX, v1.5; HIV-1 Mn 2+, v1.5; HIV-1 ( ) C; HIV-1 L(+)C; HIV-1 H(+)C; IM PS1, v1.5 i IQ PS1, v1.5 zawierają azydek sodu. Azydek sodu może wchodzić w reakcje z instalacjami wodno-kanalizacyjnymi wykonanymi z ołowiu lub miedzi, tworząc silnie wybuchowe azydki metali. Usuwając roztwory zawierające azydek sodu do zlewów laboratoryjnych, należy spłukać rury dużą objętością wody, aby zapobiec nagromadzeniu azydków. Należy nosić okulary ochronne, fartuchy laboratoryjne oraz jednorazowe rękawiczki podczas obchodzenia się z HIV-1 LYS; HIV-1 MMX, v1.5; DN4; AD3; IM4, v1.5; IQ4, v1.5; CN4; SB3; SB i substratem roboczym (zmieszanymi odczynnikami SB3 i SB). Unikać kontaktu wymienionych materiałów ze skórą, oczami i błonami śluzowymi. Jeżeli dojdzie do kontaktu, natychmiast spłukać dużą objętością wody. Jeżeli nie zostaną podjęte odpowiednie środki, może dojść do oparzeń. W razie rozlania powyższych odczynników przed wytarciem plam należy rozcieńczyć je wodą. Unikać kontaktu skóry i błon śluzowych z SB lub substratem roboczym. Jeżeli dojdzie do kontaktu ze skórą, natychmiast spłukać dużą objętością wody. 4/2008, Revision 7.0 COBAS AMPLICOR HIV-1 MONITOR Test, version 1.5 11/52

Dimetyloformamid zawarty w SB i substracie roboczym może działać szkodliwe na płód w łonie matki; opisywano ponadto działania toksyczne po doustnym przyjęciu dużych dawek. Należy unikać kontaktu ze skórą, wdychania oparów oraz spożycia. Jeżeli dojdzie do kontaktu ze skórą, dokładnie spłukać za pomocą mydła i wody oraz natychmiast zwrócić się o pomoc medyczną. Nie wolno dopuścić, aby HIV-1 LYS, który zawiera tiocyjanian guanidyny, lub IM4, v1.5 i IQ4, v1.5, które zawierają tiocyjanian sodu, nawiązały kontakt z roztworem podchlorynu sodu (wybielaczem). Mieszaniny takie mogą spowodować powstanie silnie toksycznego gazu. Do przygotowywania próbek oraz kontroli należy używać probówek z zakręcanym korkiem, aby zapobiegać rozlaniu i możliwości skażenia krzyżowego próbek. Nie należy używać probówek z korkami zatrzaskowymi. Wymagania dotyczące przechowywania i użytkowania Nie zamrażać odczynników. Przechowywać HIV-1 LYS, HIV-1 QS, v1.5 oraz HIV-1 DIL w temperaturze 2-8 C. Nieotwarte odczynniki zachowują stabilność do podanej daty ważności. Po otwarciu nieużytą część należy wyrzucić. Podczas przechowywania HIV-1 LYS w temperaturze 2-8 C powstaje osad. Przed użyciem należy rozpuścić osad, ogrzewając HIV-1 LYS do 25-37 C. Ogrzewanie HIV-1 LYS kontynuować przez maksymalnie 30 minut, a następnie dokładnie wymieszać, aż kryształy ulegną rozpuszczeniu. Przed użyciem należy zbadać każdą butelkę HIV-1 LYS, obserwując ją na białym tle, poszukując śladu żółtego koloru lub cech wyciekania. Jeżeli stwierdzono jakikolwiek ślad żółtego koloru lub obecność wycieku, nie używać danej butelki do badania. Należy skontaktować się z lokalnym przedstawicielstwem firmy Roche w celu wymiany. Po otwarciu opakowania, pozostałe po badaniu odczynniki należy wyrzucić. Roboczy odczynnik lizujący (przygotowany poprzez dodanie HIV-1 QS, v1.5 do HIV-1 LYS) musi być przechowywany w temperaturze pokojowej i zużyty w ciągu 4 godzin od przygotowania. HIV-1 MMX, v1.5 i HIV-1 Mn 2+, v1.5 przechowywać w temperaturze 2-8 C. Odczynniki te zachowują stabilność do podanej daty przydatności. Po otwarciu opakowania pozostałe po badaniu odczynniki należy wyrzucić. Roboczy odczynnik Master Mix (przygotowany przez dodanie HIV-1 Mn 2+, v1.5 do HIV-1 MMX, v1.5) musi być przechowywany w temperaturze 2-8 C i jest stabilny przez 4 godziny w temperaturze 2-8 C. NHP, HIV-1 ( ) C, HIV-1 L(+)C i HIV-1 H(+)C przechowywać w temperaturze 2-8 C. Odczynniki te zachowują stabilność do podanej daty przydatności. Po otwarciu opakowania pozostałe po badaniu odczynniki należy wyrzucić. AD3 przechowywać w temperaturze 2-25 C. Po załadowaniu do analizatora COBAS AMPLICOR, AD3 jest stabilny przez 30 dni w temperaturze 2-8 C lub do upływu daty ważności. AD3 stosować można maksymalnie w ciągu 4 cykli pracy urządzenia (24 godziny/cykl), a pomiędzy poszczególnymi cyklami należy przechowywać go w temperaturze 2-8 C. IM PS1, v1.5 i IM4, v1.5 przechowywać w temperaturze 2-8 C. Odczynniki te są stabilne do oznaczonej daty przydatności. Po wymieszaniu IM PS1, v1.5 i IM4, v1.5, odczynnik roboczy jest stabilny przez 14 dni w temperaturze 2-8 C. Odczynnik roboczy może być stosowany przez maksymalnie 2 cykle pracy urządzenia (24 godziny/cykl), a pomiędzy cyklami musi być przechowywany w temperaturze 2-8 C. IQ PS1, v1.5 i IQ4, v1.5 przechowywać w temperaturze 2-8 C. Odczynniki te są stabilne do oznaczonej daty przydatności. Po wymieszaniu IQ PS1, v1.5 i IQ4, v1.5, odczynnik roboczy jest stabilny przez 30 dni w temperaturze 2-8 C. 12/52 COBAS AMPLICOR HIV-1 MONITOR Test, version 1.5 4/2008, Revision 7.0

HIV-1 MONITOR Dostarczane materiały Odczynnik roboczy może być stosowany przez maksymalnie 4 cykle pracy urządzenia (24 godziny/cykl), a pomiędzy cyklami musi być przechowywany w temperaturze 2-8 C. DN4 przechowywać w temperaturze 2-25 C. DN4 zachowuje stabilność do oznaczonej daty przydatności. Po otwarciu opakowania, DN4 jest stabilny przez 30 dni w temperaturze 2-8 C lub do upływu daty ważności. DN4 stosować można maksymalnie w ciągu 4 cykli pracy urządzenia (24 godziny/cykl), a pomiędzy poszczególnymi cyklami należy przechowywać go w temperaturze 2-8 C. CN4 przechowywać w temperaturze 2-8 C. CN4 zachowuje stabilność do oznaczonej daty przydatności. Po otwarciu opakowania, odczynnik CN4 jest trwały przez 30 dni w temperaturze 2-8 C lub do upływu daty ważności. CN4 stosować można maksymalnie w ciągu 4 cykli pracy urządzenia (24 godziny/cykl), a pomiędzy poszczególnymi cyklami należy przechowywać go w temperaturze 2-8 C. SB3 i SB przechowywać w temperaturze 2-8 C. Nieotwarte, odczynniki te są stabilne do oznaczonej daty ważności. Substrat roboczy musi być przygotowywany codziennie, poprzez wymieszanie SB3 z SB. W analizatorze COBAS AMPLICOR substrat roboczy jest stabilny przez 16 godzin. Ani SB3, SB ani substratu roboczego nie należy poddawać działaniu metali, środków utleniających lub bezpośredniego światła. WB przechowywać w temperaturze 2-30 C. WB zachowuje stabilność do podanej daty ważności. Zbadać WB przed rozcieńczeniem, i jeśli potrzeba, ogrzać do temperatury 30-37 C, aby rozpuścić ewentualny osad. Roboczy roztwór płuczący (1X), przygotowany poprzez rozcieńczenie WB 1:10 w wodzie destylowanej lub dejonizowanej, musi być przechowywany w temperaturze 2-25 C w zbiorniku buforu płuczącego COBAS AMPLICOR i zachowuje stabilność przez 2 tygodnie od daty przygotowania. Pomiędzy uruchomieniami urządzenia częściowo zużyte odczynniki detekcji należy przechowywać w temperaturze 2-8 C. Przed wprowadzeniem do analizatora COBAS AMPLICOR odczynników z otwartych opakowań lub odczynników roboczych, należy sprawdzić ich datę ważności. COBAS AMPLICOR HIM P/N: 21118390 123 HIV-1 MONITOR Test, ART: 11 1839 0 version 1.5 US: 83369 Odczynniki do przygotowania próbki HIV-1 LYS (HIV-1 MONITOR odczynnik lizujący) HIV-1 QS, v1.5 (HIV-1 MONITOR standard oznaczania, wersja 1,5) HIV-1 DIL (HIV-1 MONITOR rozcieńczalnik próbki) Odczynniki kontroli NHP [Osocze ujemne (ludzkie)] HIV-1 ( ) C [HIV-1 ( ) Kontrola] HIV-1 L(+)C [HIV-1 MONITOR Low (+) Kontrola] HIV-1 H(+)C [HIV-1 MONITOR High (+) Kontrola] HIM PREP HIM CTL 4/2008, Revision 7.0 COBAS AMPLICOR HIV-1 MONITOR Test, version 1.5 13/52

Odczynniki do amplifikacji HIM AMP HIV-1 MMX, v1.5 (HIV-1 MONITOR odczynnik Master Mix, wersja 1.5) HIV-1 Mn 2+, v1.5 (HIV-1 MONITOR roztwór manganu, wersja 1.5) Odczynniki do swoistej reakcji detekcji HIM DK AD3 (Odczynnik do rozcieńczenia amplikonu) IM PS1, v1.5 (HIV-1 zawiesina sondy 1, wersja 1.5) IM4, v1.5 (HIV-1 zawiesina sondy 2, wersja 1.5) IQ PS1, v1.5 (HIV-1 zawiesina sondy 1 standardu oznaczania, wersja 1.5) IQ4, v1.5 (HIV-1 zawiesina sondy 2 standardu oznaczania, wersja 1.5) Odczynniki do nieswoistej reakcji detekcji DK DN4 (Roztwór denaturacyjny) CN4 (Kompleks awidyna-peroksydaza chrzanowa) SB3 (Substrat A) SB (Substrat B) COBAS AMPLICOR WB P/N: 20759899 123 Wash Buffer ART: 07 5989 9 COBAS AMPLICOR bufor płuczący US: 83314 WB (10X koncentrat płuczący) Materiały wymagane, lecz niedostarczane Obszar obróbki przedamplifikacyjnej obszar przygotowywania odczynników Pierścień A-ring wyposażony w 12 probówek A-tubes COBAS AMPLICOR Uchwyt pierścienia A-ring do aparatu COBAS AMPLICOR Pipeta Eppendorf Multipette z pojemnikiem 1,25 ml Combitip (jałowa, pojedynczo pakowana) Pipetory (o pojemności 50 µl i 100 µl)* z końcówkami pozbawionymi RNazy z barierą dla aerozoli lub wyrzutnikiem Jednorazowe rękawiczki, bezpudrowe 14/52 COBAS AMPLICOR HIV-1 MONITOR Test, version 1.5 4/2008, Revision 7.0

HIV-1 MONITOR Przed amplifikacją obszar przygotowania próbki i kontroli Probówki z zakrętką o pojemności 2,0 ml, jałowe (Sarstedt 72.694.006 lub odpowiednik)** Probówki z zakrętką o pojemności 1,5 ml, jałowe (Sarstedt 72.692.105 lub odpowiednik)** Stojaki do próbówek (Sarstedt 93.1428 lub odpowiednik) 95% etanol, do stosowania w biologii molekularnej lub histologii (świeżo rozcieńczony do 70% za pomocą wody destylowanej lub dejonizowanej) Alkohol izopropylowy, o stopniu czystości odczynnika chemicznego Jałowe pipety transferowe o cienkich końcówkach, wolne od RNazy Jałowe, jednorazowe, polistyrenowe pipety serologiczne (5 ml, 10 ml i 25 ml) Pipetory (pojemność 12,5 µl, 25 µl, 50 µl, 100 µl, 200 µl, 400 µl, 500 µl, 600 µl, 800 µl i 1000 µl)* z końcówkami pozbawionymi RNazy z barierą dla aerozoli lub wyrzutnikiem Mikrowirówka (maks. RCF 16 000 x g, min. RCF 12 500 x g); Eppendorf 5415C, HERMLE Z230M lub odpowiednik Chłodzona ultrawirówka i nieruchomy wirnik kątowy (45 stopni, mieszczący co najmniej 24 probówki o pojemności 1,5 ml) z RCF 23 600 x g (Heraeus 17RS z wirnikiem HFA 22.1, Biofuge 28RS lub odpowiednik) Mieszadło wibracyjne Bezpudrowe rękawiczki jednorazowe Po amplifikacji obszar amplifikacji/detekcji Analizator i drukarka COBAS AMPLICOR Instrukcja obsługi analizatora COBAS AMPLICOR Opcjonalnie: Oprogramowanie AMPLILINK obejmujące: Stację danych z oprogramowaniem AMPLILINK, wyposażoną w drukarkę Instrukcję obsługi oprogramowania AMPLILINK serii 2.4, współpracującego z analizatorem COBAS AMPLICOR (w przypadku stosowania oprogramowania AMPLILINK w wersji 2.41) lub Podręcznik oprogramowania AMPLILINK serii 3.2 stosowanego z urządzeniem COBAS AmpliPrep, analizatorem COBAS TaqMan, analizatorem COBAS TaqMan 48 i analizatorem COBAS AMPLICOR (w przypadku stosowania oprogramowania AMPLILINK serii 3.2) Stojaki dla pojemników D-cups Woda destylowana lub dejonizowana Pipety serologiczne o pojemności 5 ml Mieszadło wibracyjne Niepudrowane rękawiczki jednorazowe * Pipetory powinny być dokładne z zakresie 3% objętości znamionowej. We wskazanych przypadkach używać należy pozbawionych RNazy końcówek do pipet z barierą dla aerozoli lub wyrzutnikiem w celu zapobieżenia skażeniu krzyżowemu między próbką i amplikonem. ** Do przygotowania próbek i kontroli należy bezwzględnie używać probówek zakręcanych, aby uniknąć rozpryśnięcia i możliwości krzyżowego skażenia próbek i kontroli. Nie stosować korków zatrzaskowych. 4/2008, Revision 7.0 COBAS AMPLICOR HIV-1 MONITOR Test, version 1.5 15/52

Pobieranie, transport i przechowywanie próbek Uwaga Pobieranie próbek Ze wszystkimi próbkami należy obchodzić się jak z materiałem zdolnym do przenoszenia czynników zakaźnych. Test COBAS AMPLICOR HIV-1 MONITOR, v1.5 przeznaczono do użycia tylko z próbkami osocza. Krew pobierać do jałowych probówek stosując jako antykoagulant EDTA (nakrętka lawendowa) lub ACD (nakrętka żółta). Próbki pobrane na heparynę nie nadają się do badania przy użyciu tego testu. Pełną krew przechowywać w 2-25 C nie dłużej niż 6 godzin. Zastosowanie próbek zabezpieczonych przed krzepnięciem za pomocą ACD przyniesie wyniki, które są o około 15% mniejsze niż wyniki uzyskane z próbek zabezpieczonych za pomocą EDTA. Wynika to z rozcieńczenia za pomocą 1,5 ml ACD znajdującego się w probówce. Na rysunku 1 przedstawiono wpływ antykoagulantów ACD i EDTA na wyniki oznaczania HIV-1 RNA w próbkach osocza. Rysunek 1 Porównanie antykoagulantów ACD i EDTA * Próbki z ACD Przeciętny wynik testu AMPLICOR HIV-1 MONITOR (HIV RNA kopie/ml osocze, n = 2) AMPLICOR HIV-1 MONITOR Wyniki dla próbek z EDTA i ACD Próbki z EDTA Przeciętny wynik testu AMPLICOR HIV-1 MONITOR (HIV RNA kopie/ml osocze, n = 2) * Dane przedstawione na rysunku 1 otrzymano za pomocą testu AMPLICOR HIV-1 MONITOR, po standardowej procedurze przygotowania próbki. Oddzielić osocze od pełnej krwi w ciągu 6 godzin od pobrania, odwirowując (800-1600 x g przez 20 minut) w temperaturze pokojowej. Osocze należy przenieść do jałowych probówek polipropylenowych. Transport próbek Przechowywanie próbek Transport pełnej krwi lub osocza musi przebiegać zgodnie z przepisami krajowymi, federalnymi, stanowymi lub lokalnymi, dotyczącymi transportowania czynników etiologicznych 35. Krew pełną należy transportować w temperaturze 2-25 C i obrabiać w przeciągu 6 godzin od pobrania. Osocze może być transportowane w 2-8 C lub zamrożone w temperaturze 20 C do 80 C. Próbki osocza mogą być przechowywane w temperaturze pokojowej przez 1 dzień lub w temperaturze 2-8 C przez 5 dni, albo zamrożone w temperaturze 20 C do 80 C. Zaleca się, aby próbki przechowywać w równych objętościach (600-700 µl) w jałowych polipropylenowych probówkach 2,0 ml z zakręcanymi korkami (takimi jak Sarstedt 72.694.006). Próbki osocza można zamrażać i rozmrażać najwyżej trzykrotnie. Rysunek 2 przedstawia dane z badań dotyczących zamrażania i rozmrażania. 16/52 COBAS AMPLICOR HIV-1 MONITOR Test, version 1.5 4/2008, Revision 7.0

HIV-1 MONITOR Instrukcja użytkowania Uwaga Uwaga Uwaga Uwaga Uwaga Rysunek 2 Przeciętne wyniki HIV-1 z trzech mieszanin osocza HIV-1 dodatniego po 2, 3 i 4 cyklach zamrożenia-rozmrożenia* HIV-1 RNA kopie/ml Znormalizowany do pierwszego rozmrożenia Liczba rozmrożeń * Dane przedstawione na rysunku 2 otrzymano za pomocą testu AMPLICOR HIV-1 MONITOR, po standardowej procedurze przygotowania próbki. Szczegółowe informacje na temat obsługi, drukowania wyników oraz interpretacji sygnałów i komentarzy przedstawiono w (1) Instrukcji obsługi analizatora COBAS AMPLICOR, (2) Instrukcji obsługi oprogramowania AMPLILINK w wersji 2.4, współpracującego z analizatorem COBAS AMPLICOR (w przypadku stosowania oprogramowania AMPLILINK serii 2.41) lub, w przypadku używania oprogramowania AMPLILINK serii 3.2 w Podręczniku oprogramowania AMPLILINK serii 3.2, stosowanego z urządzeniem COBAS AmpliPrep, analizatorem COBAS TaqMan, analizatorem COBAS TaqMan 48 i analizatorem COBAS AMPLICOR. Przed użyciem wszystkie odczynniki muszą osiągnąć temperaturę otoczenia. Potwierdzić wzrokowo obecność wystarczającej objętości każdego z odczynników przed przystąpieniem do procedury testowej. Próbki osocza przed użyciem muszą mieć temperaturę otoczenia. Tam, gdzie jest to wskazane, używać pipetorów z końcówkami z barierą aerozolową lub wyrzutnikiem. Dołożyć wszelkich starań, aby zapewnić wybiórczą amplifikację. Do przygotowywania próbek badanych oraz kontrolnych należy stosować probówki z zakręcanym korkiem, aby zapobiegać rozlaniu i potencjalnemu skażeniu krzyżowemu próbek. Nie stosować korków zatrzaskowych. Test COBAS AMPLICOR HIV-1 MONITOR, v1.5 można wykonywać tylko w trybie podstawowym (Basic). Wielkość przebiegu Każdy zestaw zawiera odczynniki wystarczające dla czterech przebiegów po 12 oznaczeń każdy, które wykonywać można oddzielnie lub w dwóch przebiegach po 24 oznaczeń. Maksymalna liczba próbek na przebieg wynosi 24 (21 próbek + 3 kontrole). Co najmniej jedno powtórzenie każdej AMPLICOR HIV-1 ( ) Kontroli, AMPLICOR HIV-1 MONITOR Low (+) Kontroli oraz AMPLICOR HIV-1 MONITOR High (+) Kontroli musi być włączone do każdego uruchomienia testu (zobacz rozdział Kontrola jakości). Odczynniki przygotowania próbki oraz amplifikacji próbki pakowane są do butelek jednokrotnego użytku, wystarczających do wykonania 12 testów. Aby zapewnić efektywne użycie odczynników, próbki i kontrole należy badać w seriach o liczebności będącej wielokrotnością liczby 12. 4/2008, Revision 7.0 COBAS AMPLICOR HIV-1 MONITOR Test, version 1.5 17/52

Uwaga Przebieg pracy Przygotowanie odczynników Test COBAS AMPLICOR HIV-1 MONITOR, v1.5 można wykonywać tylko w trybie podstawowym (Basic). Test COBAS AMPLICOR HIV-1 MONITOR, v1.5 można zakończyć w ciągu jednego lub dwóch dni. Aby przeprowadzić oznaczenie w ciągu jednego dnia roboczego należy kolejno wykonywać instrukcje w punktach Przygotowanie odczynników, przygotowanie próbek badanych i kontrolnych, oraz Odwrotna transkrypcja, amplifikacja i detekcja. Badanie można wykonywać przez 2 dni, przeprowadzając Przygotowanie próbek badanych i kontrolnych w 1 dniu, a następnie Przygotowanie odczynników i Odwrotną transkrypcję, amplifikację i detekcję w 2 dniu. W celu przeprowadzenia przygotowania próbek badanych i kontrolnych w 1 dniu, a odwrotnej transkrypcji, amplifikacji i detekcji w 2 dniu, należy wykonać albo Standardowe przygotowanie próbek badanych i kontrolnych (etapy A.1 do A.14) albo Ultraczułe przygotowanie próbek badanych i kontrolnych (etapy B.1 do B.19). Poddane obróbce próbki należy przechowywać w warunkach wskazanych w etapie A.14 lub B.19. W 2 dniu należy rozpocząć od Przygotowania odczynników, a następnie w temperaturze pokojowej rozmrozić poddane obróbce próbki badane i kontrolne, po czym przystąpić do Standardowego przygotowania próbek badanych i kontrolnych, etap A.15, lub Ultraczułego przygotowania próbek badanych i kontrolnych, etap B.20, oraz do Odwrotnej transkrypcji, amplifikacji i detekcji. Wykonywane w: Obszarze przedamplifikacyjnym obszarze przygotowania odczynników 1. Określ, jaka liczba pierścieni A-ring jest potrzebna do badania próbek od pacjentów i kontroli. Umieścić pierścień (pierścienie) A-ring w statywie (statywach). 2. Przygotować roboczy odczynnik Master Mix dodając 100 µl HIV-1 Mn 2+, v1.5 do jednej fiolki HIV-1 MMX, v1.5. Odmierzanie objętości Master Mix nie jest konieczne. Dodać 100 µl HIV-1 Mn 2+, v1.5 do całej fiolki HIV-1 MMX, v1.5. Zamknąć ponownie probówkę i wymieszać zawartość odwracając 10-15 razy. Nie mieszać roboczego odczynnika Master Mix na mieszadle wibracyjnym. Różowy barwnik znajdujący się w HIV-1 Mn 2+, v1.5 wykorzystuje się do wizualnego potwierdzenia, że HIV-1 Mn 2+, v1.5 został dodany do Master Mix. Pozostałą część HIV-1 Mn 2+, v1.5 należy wyrzucić. Roboczy odczynnik Master Mix musi być przechowywany w temperaturze 2-8 C i użyty w ciągu 4 godzin po przygotowaniu. 3. Dodać 50 µl roboczego odczynnika Master Mix do każdej z probówek A-tube, używając pipetora do powtarzalnego dozowania jednakowych objętości cieczy lub pipetora z końcówkami wyposażonymi w barierę dla aerozoli lub wyrzutnik. W tym czasie nie należy zamykać korków probówek A-tube. Niezużyty roboczy odczynnik Master Mix należy wyrzucić. 4. Umieścić pierścień (pierścienie) A-ring zawierający roboczy odczynnik Master Mix w zamykanej torebce foliowej i zamknąć szczelnie torebkę. Przenieść pierścień(nie) A-ring do obszaru przedamplifikacyjnego przygotowania próbek. Pierścień(nie) A-ring zawierające roboczy odczynnik Master Mix należy przechowywać w temperaturze 2-8 C w obszarze przedamplifikacyjnym przygotowania próbek, do czasu zakończenia przygotowywania próbek badanych i kontrolnych. Roboczy odczynnik Master Mix w probówkach A-tube zamkniętych szczelnie w plastykowym worku w temperaturze 2-8 C zachowuje stabilność przez 4 godziny. 18/52 COBAS AMPLICOR HIV-1 MONITOR Test, version 1.5 4/2008, Revision 7.0

HIV-1 MONITOR Przygotowanie próbek badanych i kontroli Uwaga Uwaga Uwaga Standardowe przygotowanie próbek badanych i kontrolnych Uwaga Wykonywane w: Obszarze przedamplifikacyjnym przygotowania próbki Aby wykonać amplifikację uprzednio przygotowanych próbek i kontroli, należy najpierw wykonać kroki opisane w części Przygotowanie odczynników. W temperaturze pokojowej należy rozmrozić poddane obróbce próbki badane i kontrolne, a następnie wykonać Standardowe przygotowanie próbek badanych i kontrolnych, etap A.15 lub Ultraczułe przygotowanie próbek badanych i kontrolnych, etap B.20. W HIV-1 LYS podczas przechowywania w temperaturze 2-8 C tworzy się osad. Przed użyciem ogrzać do temperatury 25-37 C i dokładnie wymieszać, aby doprowadzić do rozpuszczenia osadu. Przed użyciem należy zbadać każdą butelkę HIV-1 LYS, obserwując ją na białym tle, poszukując śladu żółtego koloru lub cech wyciekania. Jeżeli stwierdzono jakikolwiek ślad żółtego koloru lub obecność wycieku, nie używać danej butelki do badania. Należy skontaktować się z lokalnym przedstawicielstwem firmy Roche w celu wymiany. A.1. A.2. A.3. Przygotować 70% etanol. Dla 12 testów, wymieszać 11,0 ml 95% etanolu i 4,0 ml wody dejonizowanej lub destylowanej. Oznaczyć jedną probówkę o pojemności 2,0 ml z zakręcanym korkiem dla każdej próbki pochodzącej od pacjenta oraz dodatkowo oznaczyć trzy probówki jako HIV-1 ( ) C, HIV-1 L(+)C i HIV-1 H(+)C. Przygotować standardowy roboczy odczynnik lizujący. Mieszać HIV-1 QS, v1.5 za pomocą mieszadła wibracyjnego przez co najmniej 10 sekund przed użyciem. Dla każdej serii składającej się maksymalnie z 12 próbek badanych i kontrolnych, dodać 100 µl HIV-1 QS, v1.5 do jednej butelki HIV-1 LYS i dokładnie wymieszać. Mierzenie objętości HIV-1 LYS nie jest konieczne. Różowy barwnik znajdujący się w HIV-1 QS, v1.5 wykorzystuje się do wizualnego potwierdzenia, że HIV-1 QS, v1.5 został dodany do HIV-1 LYS. Pozostałą część HIV-1 QS, v1.5 należy wyrzucić. W temperaturze pokojowej roboczy odczynnik lizujący jest stabilny przez 4 godziny. W razie używania zamrożonych próbek, należy je rozmrozić w temperaturze pokojowej i mieszać na mieszadle wibracyjnym przez 3 do 5 sekund. Odwirować krótko probówkę z próbką, aby pobrać próbkę z dna probówki. Zachować ostrożność, aby uniknąć skażenia rękawic przy obchodzeniu się z próbkami. A.4. A.5. Dodać 600 µl standardowego roboczego odczynnika lizującego do każdej oznaczonej probówki; następnie zamknąć probówki. Sprawdzić, czy roboczy odczynnik lizujący jest różowy, aby potwierdzić, że HIV-1 QS, v1.5 został dodany do HIV-1 LYS. Przygotować próbki kontrolne w następujący sposób: Mieszać na mieszadle wibracyjnym NHP, HIV-1 ( ) C, HIV-1 L(+)C i HIV-1 H(+)C przez 3-5 sekund. Dodać 200 µl NHP do każdej spośród trzech probówek kontrolnych. Zamknąć probówki i mieszać na mieszadle wibracyjnym przez co najmniej 3-5 sekund. Dodać 50 µl HIV-1 ( ) C do probówki opisanej HIV-1 ( ) C zawierającej standardowy roboczy odczynnik lizujący oraz NHP. Zamknąć probówkę i mieszać na mieszadle wibracyjnym przez 3-5 sekund. Dodać 50 µl HIV-1 L(+)C do probówki opisanej HIV-1 L(+)C zawierającej standardowy roboczy odczynnik lizujący oraz NHP. Zamknąć probówkę i mieszać na mieszadle wibracyjnym przez 3-5 sekund. 4/2008, Revision 7.0 COBAS AMPLICOR HIV-1 MONITOR Test, version 1.5 19/52