ELEKTROFOREZA BIAŁEK W ŻELU POLIAKRYLAMIDOWYM W WARUNKACH DENATURUJĄCYCH WPROWADZENIE Elektroforeza od ponad 60 lat pozostaje najczęściej stosowaną metodą izolacji makrocząstek w układach biologicznych oraz stanowi cenne narzędzie dostarczające informacji na temat masy cząsteczkowej, modyfikacji struktury, ładunku, czystości preparatu. Metoda ta wykorzystuje zjawisko wymuszonego ruchu cząstek obdarzonych ładunkiem, nałożonych na żel, w polu elektrycznym. Odległość jaką są one w stanie pokonać zależy od wielkości porów układu rozdzielającego, masy cząsteczkowej rozdzielanych substancji i wypadkowego ładunku. Elektroforeza w warunkach denaturujących SDS-PAGE (ang. sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis) jest najbardziej rozpowszechnioną techniką rozdziału białek i kwasów nukleinowych. Dodecylosiarczan sodu jest detergentem anionowym, który wiąże się z białkami i niszczy ich naturalną strukturę trójwymiarową, zmieniając je w sztywne cząsteczki o kształcie pałeczek. Ponadto nadaje białkom silny ładunek ujemny niezależnie od ich składu aminokwasowego. Białka poddane elektroforezie w obecności SDS poruszają się z szybkością zależną jedynie od ich rozmiarów. W 1959 jako nośnik do elektroforezy został wprowadzony poliakrylamid. Zel poliakrylamidowy ma szereg zalet: jest łatwy i szybki w przygotowaniu, obojętny chemiczny, bezbarwny, wytrzymały mechanicznie i termicznie oraz pozbawiony ładunków elektrycznych. Powstaje wskutek polimeryzacji akrylamidu i N,N -bisakrylamidu, a wielkość sieci oczek zależy od proporcji między tymi substratami. Polimeryzacja rozpoczyna się po dodaniu nadsiarczanu amonu w obecności katalizatora, którym jest N,N,N,N -tetrametylo-etylenodiamina (TEMED) lub β- dimetyloaminopropionitryl (DMAP). W wyniku rozpadu nadsiarczanu amonu w obecności katalizatora powstają wolne rodniki tlenowe inicjujące powstawanie rodników akryl amidowych. Początkowo w elektroforezie SDS-PAGE zakładano jednorodne warunki rozdziału. Metodę tę wkrótce zastąpiono przez układ złożony z dwóch faz: zagęszczającej i rozdzielającej. Fazy te różnią się między sobą stężeniem akrylamidu oraz ph. W
zagęszczającym następuje koncentracja białka w wąskim pasie startowym, co sprawia, że wszystkie białka rozpoczynają rozdział od tego samego punktu. Zastosowanie białek wzorcowych pozwala na sporządzenie krzywej zależności ruchliwości elektroforetycznej od logarytmu masy cząsteczkowej, na podstawie której można wyznaczyć eksperymentalnie masy cząsteczkowe badanych białek. Ze względu na brak barwy większości białek w świetle widzialnym niezbędne jest ich wybarwianie pozwalające na dalszą analizę jakościową i ilościową. Stosuje się wiele technik barwienia, z których najczęściej stosowane są błękit CBB (Coomassie Brillant Blue) lub sole srebra. W środowisku kwaśnym cząsteczki barwnika CBB wiążą się do grup aminowych łańcucha polipeptydowego poprzez oddziaływania hydrofobowe. Detekcja z wykorzystaniem soli srebra opiera się na precypitacji srebra na powierzchni żelu w postaci ciemnobrunatnych plamek na jasnym tle. Metodę tę stosuje się często w proteomice ze względu na wysoką czułość. WYKONANIE A. Przygotowanie żelu poliakrylamidowego i rozdział białek Przygotować aparat do elektroforezy starannie odtłuszczając alkoholem etylowym wszystkie uszczelki i szyby. Zmontować zestaw według instrukcji. Przygotować 12% żel rozdzielający. W tym celu do zlewki wprowadzić kolejno: 20,4 ml wody destylowanej, 15 ml buforu 1,5 M Tris-HCl z 0,4% SDS o ph 8,8, 24 ml 30% akrylamid/bisakrylamidu, 0,6 ml 10% SDS, 60 µl TEMED, 0,3 ml 10% APS. Uwaga! Wprowadzenie APS uruchamia proces polimeryzacji. Tak przygotowana mieszaninę ostrożnie, aby uniknąć pojawienia się bąbelków powietrza, wlać pomiędzy szyby. Na powierzchnię żelu nawarstwić alkohol izopropylowy i pozostawić do całkowitej polimeryzacji (około 45 minut). Pod koniec polimeryzacji przygotować 7% żel zagęszczający o składzie: 12,44 ml wody destylowanej, 2,51 ml buforu 0,5 M Tris-HCl z 0,4% SDS o ph 6,8, 4,81 ml 30% akrylamid/bisakrylamidu, 200 µl 10% SDS, 25 µl TEMED, 100 µl 10% APS. Na osuszoną po zlaniu alkoholu izopropylowego powierzchnię żelu rozdzielającego wlać
przygotowany roztwór żelu zagęszczającego. Po wylaniu żelu zagęszczającego umieścić w nim grzebień i pozostawić na około 30 minut do pełnej polimeryzacji. W trakcie polimeryzacji przygotować próby białkowe. W tym celu pobrać 100 µl buforu S (o składzie: 62,5 mm buforu Tris-HCl o ph 6,8, 2% SDS, 10% glicerol, 5% 2-merkaptoetanol, 0,05% błękitu bromofenylowego) i odpowiednią ilość badanej próbki (o stężeniu białka 1-2 mg/ml) lub prób zawierających markery masy molekularnej o znanej wielkości. Mieszaninę inkubować w temperaturze 96 C przez 10 minut, w celu usunięcia wiązań siarczkowych ze struktury białka. Po inkubacji próbki dobrze wymieszać. Umocować spolimeryzowane żele w aparacie do elektroforezy, delikatnie wyciągnąć grzebienie spomiędzy płytek, a następnie zalać kieszonki buforem elektrodowym o ph 8,3 (o składzie: 0,025 M Tris-HCl, 0,192 M glicyny, 0,1% SDS) oraz napełnić tym buforem komory aparatu. Nałożyć próbki i standardy do wcześniej zalanych buforem elektrodowym kieszonek. Komorę podłączyć do zasilacza i prowadzić rozdział elektroforetyczny w temperaturze 4 C przy napięciu 60 V dopóki próba znajduje się w żelu zagęszczającym, a następnie przy napięciu 120 do momentu, gdy marker migracji białek osiągnie odległość 1 cm od końca żelu rozdzielającego. Po zakończeniu elektroforezy rozmontować zestaw i pozostawić żel do wybarwienia. B. Wywoływanie białek w żelu poliakrylamidowym metodą z Coomassie Brillant Blue Żel zanurzyć w roztworze A (130 ml wody destylowanej, 30 ml etanolu i 20 ml kwasu octowego) i wytrząsać w temperaturze 37 C przez 2 godziny. Następnie żel przenieść do roztworu B (130 ml wody destylowanej, 50 ml etanolu, 20 ml kwasu octowego, 0,04 gcoomassie Brillant Blue R-250) i wytrząsać w temperaturze 37 C przez 20-30 minut. Po inkubacji w roztworze barwnika żel przenieść do roztworu C (160 ml wody destylowanej, 20 ml etanolu i 20 ml kwasu octowego) i wytrząsać w temperaturze 37 C aż do odbarwienia.
C. Wywoływanie białek w żelu poliakrylamidowym metodą srebrową Uwaga! Wszystkie etapy barwienia przeprowadzać z energicznym wytrząsaniem. Żel utrwalić przez 1 godzinę w 200 ml roztworu 1 (o składzie: 50% metanol, 12% kwas octowy, 0,5 ml/l formaldehyd, woda), a następnie przemyć 50% alkoholem etylowym 3-krotnie po 20 minut. Przenieść żel do 200 ml roztworu 2 (roztwór 0,2g/l Na 2 S 2 O 3 x 5H 2 O) na 1 minutę, a następnie przemyć 3-krotnie wodą po 20 sekund. Przenieść żel do 200 ml roztworu 3 (o składzie: 2 g/l AgNO 3, 0,75 ml/l formaldehyd, woda) i pozostawić na 20 minut. Następnie żel przemyć 3-krotnie wodą po 20 sekund. Przenieść żel do 200 ml roztworu 4 (o składzie: 60 g/l Na 2 CO 3, 0,5 ml/l formaldehyd, 4 mg/l Na 2 S 2 O 3 x 5H 2 O, woda) i pozostawić maksymalnie do 10 minut (powinny pojawić się brązowe prążki). Następnie żel przemyć wodą. Przenieść żel w celu zatrzymania reakcji do 200 ml roztworu 5 (o składzie: 50% metanol, 12% kwas octowy, woda) na 10 minut. Następnie przenieść żel do 50% roztworu metanolu, w którym żel może być przechowywany. LITERATURA Bradford M.M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal. Biochem. 72, 248-258 (1976). Doonan S. Białka i peptydy. Wydawnictwa naukowe PWN, Warszawa 2008. Gniot-Szulżycka J., Leźnicki A., Komoszyński M., Wojczuk B. Materiały do ćwiczeń z biochemii. Białka. Metody ilościowego oznaczania, rozdziału i oczyszczania. Uniwersytet Mikołaja Kopernika w Toruniu, Toruń 2005. Kraj A., Drabik A., Silberring J. Proteomika i metabolomika. Wydawnictwa Uniwersytety Warszawskiego, Warszawa 2010. Laemmli U.K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature 227, 680-685 (1970)
OPRACOWANIE I DOKUMENTACJA WYNIKÓW Na podstawie ruchliwości elektroforetycznej białek wzorcowych sporządzić krzywą kalibracyjną zależności ruchliwości względnej białek (iloraz drogi przebytej przez białko do drogi pokonanej przez czoło barwnika) od logarytmu ich masy cząsteczkowej. Na podstawie krzywej kalibracyjnej określić masę molekularną 1,2-dioksgenazy katecholowej rozdzielonej na żelu. Wykonać zdjęcie otrzymanego żelu z dołączonym opisem. Zaproponować modyfikacje protokołu oczyszczania 1,2-dioksygenazy katecholowej szczepu KB2, jeśli na obrazie SDS-PAGE występuje kilka prążków, zamiast oczekiwanego jednego.