diagnostyka laboratoryjna Journal of Laboratory Diagnostics 2009 Volume 45 Number 4 315-323 Praca poglądowa Review Article Ocena statusu HER2 w raku piersi Anna Kruczak, Magdalena Rozmus-Piętoń, Urszula Marchińska-Osika Zakład Patomorfologii Nowotworów, Centrum Onkologii Instytutu im. M. Skłodowskiej-Curie, Oddział w Krakowie Streszczenie Onkogen HER2 koduje receptor transbłonowy o aktywności kinazy tyrozynowej. Istnieje ścisły związek pomiędzy amplifikacją tego genu i nadekspresją jego receptora a rokowaniem u chorych na raka piersi oraz odpowiedzią na leczenie. Oznaczanie ekspresji receptora HER2 lub amplifikacji genu w komórkach nowotworowych należy aktualnie do standardów badań diagnostycznych u wszystkich chorych na raka piersi. Związane jest to z wprowadzeniem do leczenia humanizowanego przeciwciała blokującego ten receptor. Według zaleceń z St Gallen metodami służącymi do oznaczania statusu receptora HER2 jest badanie immunohistochemiczne i/lub badanie amplifikacji genu techniką FISH (fluorescencyjna hybrydyzacja in situ ). Badanie FISH jest zalecane każdorazowo w przypadku, gdy wynik oznaczania ekspresji białka jest niejednoznaczny. Laboratoria prowadzące opisane testy winny być poddawane regularnym, wewnętrznym i zewnętrznym, kontrolom jakości. Evaluation of HER2 status in breast cancer Summary HER2 oncogen encodes the transmembrane receptor of tyrosine kinase activity. There is a close link between the gene amplification and overexpression of its receptor and prognosis and response to treatment in patients with breast cancer. Estimation of HER2 expression or gene amplification in tumor cells currently belongs to the standard diagnostic procedures in all breast cancer patients. This is connected with introducing into treatment of humanized antibody blocking this receptor. According to the St. Gallen recommendations the main methods for the determination of HER2 status are immunohistochemical evaluation and/or study gene amplification using FISH technique (fluorescent hybridization in situ). FISH examination is recommended in each case if the outcome of the determination of protein expression is ambiguous. Laboratories conducting the tests described should be subject to regular, internal and external quality checks. Słowa kluczowe: HER2/neu, immunohistochemia, FISH, rak piersi Key words: HER2/neu, immunohistochemistry, FISH, breast cancer Rak piersi jest najczęstszym nowotworem złośliwym u kobiet, w 2004 r. zarejestrowano w Polsce ponad 12 000 nowych zachorowań, a pomimo znacznego postępu w metodach leczenia wskaźniki umieralności utrzymują się na wysokim poziomie (standaryzowany wsk. umieralności 14,5/100 000) [34]. U znacznego odsetka chorych poddanych w założeniu radykalnemu leczeniu dochodzi do rozsiewu zarówno drogą chłonną, jak i krwionośną. Z tego właśnie względu rak piersi klasyfikowany jest niekiedy jako choroba przewlekła. Znaczna heterogenność w obrazie klinicznym i immunohistochemicznym, a także odrębności w przebiegu klinicznym sprawiają, że wyróżnia się szereg jednostek morfologicznych raka piersi. Przez wiele lat w charakterystyce raka piersi uwzględniano dane dotyczące typu histologicznego nowotworu, stopnia zróżnicowania (ang. grading) i obecność receptorów hormonalnych (ER, PR). M.in. wymienione wskaźniki morfologiczne, a także szereg danych klinicznych dotyczących stadium zaawansowania choroby, liczby zajętych węzłów chłonnych, naciekania położonych wokół guza naczyń krwionośnych i limfatycznych stanowią zespół informacji o znaczeniu predykcyjnym, jak i prognostycznym. Odkrycie w roku 1984 przez Weinberga i wsp. receptora HER2, jak i wykazanie istotnych zależności pomiędzy nadekspresją tego receptora i rokowaniem chorych, a także wprowadzenie do leczenia adjuwantowego leku o nazwie Trastuzumab (Herceptyna zhumanizowane przeciwciało monoklonalne przeciwko HER2) sprawiło, że określenie statusu HER2 stało się integralną składową morfologicznej charakterystyki guzów [24, 27]. Obecnie z klinicznego punktu widzenia wyróżnić można cztery grupy raka piersi, tj. nowotwory z: a) ekspresją receptorów hormonalnych i brakiem nadekspresji HER2 (wysokie prawdopodobieństwo dobrej reakcji na 315
Ocena statusu HER2 w raku piersi leczenie hormonalne i ewentualnie chemioterapię), b) nadekspresją HER2 (wrażliwe na celowane leczenie z użyciem Trastuzumabu), c) z koekspresją receptorów hormonalnych i receptora HER2 (brak reakcji na leczenie wyłącznie hormonalne) d) brakiem receptorów rutynowo oznaczanych (ang. triplet negative breast cancer) w tej grupie stosuje się jedną z dostępnych chemioterapii systemowych [6, 24]. Zakłada się, że u chorych na raka piersi z nadekspresją HER2 właśnie zaburzenie onkogenu odpowiedzialnego za produkcję tego receptora błonowego, tj. amplifikacja genu HER2, leży u podstaw karcinogenezy. Gen HER2 (NEU, ERBB-2) jest zlokalizowany na chromosomie 17q21, a kodowana przez niego glikoproteina zbudowana z 1255 reszt aminokwasowych ma ciężar cząsteczkowy 185 kda i określana jest symbolem p185. HER2 należy do rodziny transbłonowych receptorów, zbudowanych z domeny wewnątrzkomórkowej, wykazującej aktywność kinazy tyrozynowej, przezbłonowej o własnościach lipofilnych oraz domeny zewnątrzkomórkowej odpowiedzialnej za wiązanie ligandu (extracellular domain ECD p105) [16, 32]. Do tej rodziny zalicza się cztery, w znacznym stopniu homologiczne receptory, tj. HER1 receptor naskórkowego czynnika wzrostu (EGFR), HER2 (ErbB-2), HER3 (ErbB-3) i HER4 (ErbB-4) [2]. W prawidłowych komórkach obecne są dwie kopie genu HER2 i efektem ich aktywności jest ok. 50000 cząsteczek białka na komórkę. Powielenie czyli amplifikacja genu HER2, prowadzi zazwyczaj do 10 100 krotnego zwiększenia liczby monomerów HER2 w komórce, czyli do nadekspresji receptora [15]. Zjawisko to obserwuje się w 15 25 % raków piersi [31]. W przypadku raków z nadekspresją HER2 liczba receptorów (ECD) na powierzchni komórki może wzrastać do ponad 2 milionów [12, 26, 28]. Receptory HER ulegają aktywacji przez związanie z odpowiednimi ligandami. Aktywacja receptora może zachodzić w dwojaki sposób: niezależny i zależny od liganda. Pierwszy jest wynikiem amplifikacji genu lub nadekspresji białka, co prowadzi do spontanicznej aktywacji homodimerów, a drugi ma miejsce wówczas, gdy utworzone heterodimery są stabilizowane przez połączenie z odpowiednim ligandem [2]. O ile receptor HER1 (EGFR) może wiązać się z kilkoma różnymi ligandami, między innymi z naskórkowym czynnikiem wzrostu (EGF), to receptory HER3 i HER4 zdolne są do swoistego wiązania wszystkich z ponad 15 izoform pokrewnego czynnika wzrostu, które określa się mianem heregulin (HGR s) [29]. Do chwili obecnej nie zostały natomiast poznane ligandy dla receptora HER2. Zakłada się, że może on ulegać aktywacji przez ligandy heterologiczne, tworząc heterodimery zarówno z receptorem HER1(EGFR), jak i HER3 i HER4 [13, 14, 26]. Heterodimeryzacja prowadzi do autofosforylacji tyrozyny obu receptorów tworzących heterodimer, co jest równoznaczne z inicjacją przenoszenia sygnału mitogennego. Heterodimery zawierające HER2 w porównaniu z innymi homo- lub heterodimerami cechują się szczególnie wysokim potencjałem przewodzenia sygnału. Może to tłumaczyć znaczącą rolę HER2 w tworzeniu fenotypu onkogennego [14]. Efektem takiej przedłużonej stymulacji jest pobudzanie głównych cytoplazmatycznych szlaków przekazywania sygnału: szlaku ras-raf-mapks (ang. mitogen activated protein kinases), kinaz Jun/SAPK (ang. stress activated protein kinases), szlaku kinaz JAK aktywujących ścieżkę STAT, oraz ścieżki fosfolipazy Cγ (PLC γ), wpływającej na proliferację, przeżycie, ruchliwość i przyleganie komórek [9, 25, 26, 29]. Stymulowanie sygnałów szlakiem kinazy fosfatydyloinozytolu PI3K przez zaktywowane receptory czynników wzrostu spełnia istotną rolę w regulowaniu przeżycia komórki i rozwoju właściwości antyapoptotycznych [25, 26, 30]. Po przeniesieniu sygnału do jądra komórki następuje aktywacja wybranych protoonkogenów (c-myc, c-myb, c-fos, c-jun), których produkty białkowe wiążą się z DNA komórki i biorą udział w stymulacji podziałów komórkowych [2]. W procesach tych szczególną rolę odgrywa heterodimer HER2/HER3, ponieważ jest on najsilniejszym mitogenem wśród heterodimerów rodziny receptorów HER [4]. Hereguliny, poza regulowaniem wzrostu komórek, partycypują w procesach kontroli innych zachowań komórek nowotworowych, takich jak przyleganie, inwazja i migracja, a także przypisywana jest im istotna rola w mechanizmach procesów angiogenezy i apoptozy [27, 30]. Uważa się że hereguliny biorą ponadto udział w regulacji ekspresji urokinazowego aktywatora plazminogenu (upa), który poprzez destrukcję macierzy zewnątrzkomórkowej może przyspieszać migrację i nasilać inwazyjność komórek, stąd ma szczególny udział w procesach przerzutowania [30]. Wartość rokownicza Zjawisko amplifikacji z jednoczesną nadekspresją receptora HER2 zostało stwierdzone w szeregu ludzkich nowotworów, a m.in. w raku piersi, jajnika, żołądka, ślinianek, nerki, trzustki, jelita grubego oraz niedrobnokomórkowym raku płuca [2, 18, 22]. Jako pierwsi informacje odnośnie wartości rokowniczej nadekspresji receptora HER2 w raku piersi przedstawili w roku 1987 Slamon i wsp. [12, 18]. Ich obserwacje znalazły następnie potwierdzenie w wynikach licznych badań. W większości z nich wykazano korelacje amplifikacji i/lub nadekspresji HER2 z innymi niekorzystnymi czynnikami rokowniczymi, takimi jak: stopień złośliwości histologicznej, aneuploidia DNA, typ histopatologiczny raka, brak receptorów estrogenowych i progesteronowych, wysoka aktywność proliferacyjna, mutacje TP53, amplifikacja topoizomerazy IIα, zajęcie węzłów chłonnych oraz zmiany w szeregu innych molekularnych biomarkerów inwazji i przerzutowania [12, 14, 15, 22, 27]. Wykazano, że amplifikacja genu HER2 ma związek ze zwiększoną ruchliwością komórek, inwazją, zwiększeniem ilości odległych przerzutów, nasileniem angiogenezy i zahamowaniem apoptozy [27]. Istotne znaczenie rokownicze HER2 przypisywane jest liczbie zamplifikowanych kopii genu [31]. Obecnie receptor HER2 jest jednym z najlepiej poznanych czynników prognostycznych. Nadekspresja receptora, jak 316
A. Kruczak, M. Rozmus-Piętoń, U. Marchińska-Osika i amplifikacja genu HER2 uznawane są za niekorzystne czynniki prognostyczne, zarówno u chorych z zajętymi węzłami chłonnymi (N+), jak i u chorych na raka piersi bez przerzutów do pachowych węzłów chłonnych (N-) [22, 32]. W grupie chorych z zajętymi węzłami chłonnymi wykazano ponadto istotny wpływ występowania nadekspresji receptora HER2 na długość przeżycia całkowitego [15, 31-33]. Stwierdzono związek między nadekspresją HER2 a miejscem występowania przerzutów odległych. U chorych z guzami z nadekspresją receptora HER2 częściej dochodziło do rozwoju przerzutów do płuc, mózgu aniżeli do kości [22]. Ross i wsp. [27] na podstawie 107 prac dotyczących badań nadekspresji receptora HER2 u łącznie 39730 chorych na raka piersi, dokonali metaanalizy jego wartości prognostycznej. W 95 (88%) z tych prac potwierdzono, w analizie jedno lub wieloczynnikowej, że nadekspresja receptora HER2 lub amplifikacja genu HER2 jest niekorzystnym czynnikiem prognostycznym. W 68 (73%) wykazano że nadekspresja białka lub amplifikacja genu, jest niezależnym od innych czynników, niekorzystnym czynnikiem prognostycznym. Dla przeżyć całkowitych (overall survival OS), ryzyko względne RR wynosiło 2,74 (zakres 1,39-6,39), mediana 2,33. Dla przeżyć bezobjawowych (disease free survival DFS), ryzyko względne RR wynosiło 2,04 (zakres 1,30-3,01), mediana 1,8 [27]. Znaczenie predykcyjne HER2 Nadekspresji receptora HER2 przypisywane jest jednak przede wszystkim znaczenie predykcyjne. Przeważa obecnie opinia, że nadekspresja/amplifikacja HER2 może wskazywać na niższe prawdopodobieństwo odpowiedzi na Tamoxifen, a lepszą odpowiedź na inhibitory aromatazy i wskazuje na celowość zastąpienia schematu CMF leczeniem taksanami lub antracyklinami [9, 18, 22, 26, 32]. Już od 2001 roku grupa ekspertów ds. wytycznych dotyczących wykorzystania markerów guza Amerykańskie Towarzystwo Onkologii Klinicznej (ASCO) i Kolegium Patologów Amerykańskich (CAP), zaleca rutynowe badanie HER2 w przypadkach nowo rozpoznanego i przerzutowego raka piersi [4, 12]. Nadekspresja HER2 jest obecnie uznanym, silnym markerem predykcyjnym dla oceny korzyści klinicznych, wynikających ze stosowania Trastuzumabu w chorobie przerzutowej i w warunkach leczenia uzupełniającego [26]. Trastuzumab humanizowane mysie przeciwciało monoklonalne stosowany w monoterapii lub dodawany do programu chemioterapii w przerzutowym raku piersi zwiększa odsetek dobrych odpowiedzi na leczenie, wydłuża czas do wystąpienia progresji, a nawet wydłuża czas przeżycia całkowitego chorych [9, 11, 12, 16, 23, 26]. Przeciwciało to, wiążąc się z zewnątrzkomórkową domeną receptora HER2, blokuje aktywność receptora [12]. W pięciu międzynarodowych, prospektywnych, randomizowanych badaniach klinicznych wykazano, że leczenie uzupełniające Trastuzumabem zmniejsza ryzyko nawrotu choroby i zgonu, odpowiednio o połowę i jedną trzecią u chorych we wczesnych stadiach raka piersi [16, 33]. Innym lekiem stosowanym u chorych z nadekspresją receptora HER2 jest Lapatinib, jest to inhibitor aktywności kinazy tyrozynowej receptora HER2 i HER1 [23, 28]. Powyższe dane wskazują, że wyniki badań HER2 wnoszą informacje przydatne podczas podejmowania decyzji terapeutycznych u chorych na raka piersi. Analizy retrospektywne sugerują, że korzyści osiągają jedynie chore na raka piersi z bardzo silną ekspresją receptora HER2, ocenianą na stopień (3+) metodą immunohistochemiczną i/lub amplifikacją genu HER2 w hybrydyzacji fluorescencyjnej in situ (FISH) [12, 33]. Dlatego też właściwa ocena stopnia nasilenia ekspresji białka, jak i prawidłowa ocena statusu genu HER2 ma podstawowe znaczenia dla prawidłowej selekcji chorych do leczenia. Typ histologiczny nowotworu a ekspresja HER2 Nadekspresja HER2 spotykana jest częściej w rakach o niskim stopniu zróżnicowania histologicznego: w rakach przewodowych G3, w rakach wewnątrzprzewodowych (DCIS) szczególnie cechujących się martwicą typu czopiastego, oraz w chorobie Pageta piersi [26, 27]. W zrazikowych rakach piersi w porównaniu z rakami przewodowymi HER2 spotyka się względnie rzadko, a jeśli jest obecna to ma związek z typem pleomorficznym nowotworu [22, 25, 27]. Rzadko również nadekspresja HER2 spotykana jest w raku śluzowym, rdzeniastym i cewkowym [27]. W licznych badaniach wykazano ponadto, że w 70-80% przypadków raka piersi status receptora HER nie zmienia się w przebiegu choroby, jest taki sam w guzie pierwotnym, jak i w ogniskach przerzutów [27]. Badania ekspresji HER2 Ekspresję HER2 można badać przy pomocy metod: immunohistochemicznych (IHC), testem ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay), a także metodą Western immunoblot. Natomiast metody: fluorescencyjna hybrydyzacja in situ (FISH), Southern blot, CISH (chromogenic in situ hybridization) i PCR służą do badania amplifikacji genu HER2. Określenia poziomu mrna HER2 dokonuje się przy pomocy hybrydyzacji Northern [15], natomiast w surowicy krwi można badać uwolnione białko stanowiące zewnątrzkomórkową domenę receptora (ECD, p105) [19, 26, 32]. Należy zaznaczyć że szereg z metod wykorzystywanych jest jedynie w badaniach naukowych [4]. W początkowym okresie ekspresję receptora HER2 badano przy pomocy metody Southern blot. Obecnie w praktyce do badania ekspresji receptora HER2 stosuje się metodę immunohistochemiczną, metodę FISH oraz CISH. Metody te mają tę przewagę nad innymi, że dają pełny obraz morfologiczny ekspresji receptora HER2 w tkance nowotworowej. Zarówno metoda immunohistochemiczna, metoda FISH oraz CISH uzyskały akceptację Amerykańskiej Agencji ds. Żywności i Leków (FDA) dla oznaczania nadekspresji/amplifikacji HER2 [12, 27]. Liczne badania potwierdzają wysoką zgodność (97-99%) pomiędzy 317
Ocena statusu HER2 w raku piersi badaniami CISH i FISH [27]. CISH może być metodą alternatywną do metody FISH do określania amplifikacji genu HER2 u chorych z guzami o niejednoznacznym statusie HER2 uzyskanym w metodzie IHC (2+) [1]. Metoda IHC Metoda immunohistochemiczna jest stosowana na szeroką skalę w laboratoriach patomorfologicznych. Wg zaleceń Polskiej Grupy Badawczej ds. HER2 jest to podstawowa metoda oceny stanu receptora HER2 [22]. Oznaczeń dokonuje się w materiale z bloczków parafinowych zawierających tkankę z guza, także na materiale z bloków komórkowych z biopsji aspiracyjnych cienkoigłowych (BAC), szczególnie w przypadkach przerzutowego raka piersi. Jednak wykorzystanie materiału z BAC ma pewne ograniczenie. Oceny dokonuje się analizując odczyn błonowy, a błony komórek raka pochodzących z aspiratów często ulegają uszkodzeniu [19]. Oznaczeń dokonuje się także w materiale z biopsji gruboigłowych, jednak w takich przypadkach interpretacja wyniku jest utrudniona ze względu na niespecyficzne wiązania przeciwciał na skutek uszkodzenia materiału tkankowego [4, 28]. Metoda immunohistochemiczna nie jest zasadniczo wystandaryzowana. Istotny wpływ na wyniki uzyskiwane tą metodą mają min. sposób i długość czasu utrwalania materiału tkankowego, stosowanie różnych przeciwciał, różnych systemów detekcyjnych, różnych rozcieńczeń, a także różnych metod odsłaniania antygenów. Optymalny czas utrwalania wynosi od 6-48 godzin, a optymalny utrwalacz to 4% roztwór buforowanej formaliny [4]. Standardowa grubość skrawków do barwień immunohistochemicznych powinna wynosić 3-5 µm. Jedną z możliwości standaryzacji IHC jest stałe używanie jednego testu. W przypadku raka piersi do oznaczania ekspresji receptora HER2 metodą immunohistochemiczną ASCO zaleca stosowanie zestawów Herceptest (DAKO, Carpinteria, CA) lub Pathway (Ventana Medical Systems, Tucson, AZ). Obydwa posiadają certyfikaty FDA [8, 15, 27, 28]. Przy pomocy Herceptestu określa się nasilenie barwienia błonowego za pomocą 4-stopniowej skali: brak zabarwienia, zabarwienie słabe (1+), umiarkowane (2+) i silne (3+). Test ten zawiera zestaw kontrolny, w odniesieniu do którego ocenia się uzyskany wynik [15]. W większości badań tylko przypadki z mocnym zabarwieniem błony komórkowej (3+) w metodzie IHC wykazują zgodność z amplifikacją genu HER2 stwierdzoną w metodzie FISH [12]. Należy pamiętać, że nadekspresji receptora nie zawsze może towarzyszyć amplifikacja genu. Ten fakt ma istotne implikacje kliniczne; tylko w przypadkach równoczesnego występowania nadekspresji białka i amplifikacji genu HER2, nadekspresja receptora HER2 odgrywa ważną rolę w progresji choroby nowotworowej [2]. W metodzie immunohistochemicznej o dodatnim wyniku badania świadczy barwienie IHC (3+) (silne, całkowite zabarwienie błony w ponad 30% komórek raka inwazyjnego), o wyniku ujemnym świadczy całkowite zabarwienie komórek guza co najwyżej w 10% komórek raka inwazyjnego, zabarwienie o charakterze nieciągłym lub całkowity brak zabarwienia. Zabarwienie o umiarkowanym natężeniu reakcji IHC określane jako (2+) traktowane jest jako niejednoznaczne. Ma miejsce wtedy, gdy stwierdza się słabe lub średnie całkowite zabarwienie w ponad 10% komórek raka naciekającego, lub silne całkowite wybarwienie błonowe w mniej lub w 30% komórek raka naciekającego [20] (ryc 1). W takich przypadkach ewentualna amplifikacja musi być potwierdzona badaniem FISH [12, 20, 21]. Do leczenia z zastosowaniem Trastuzumabu kwalifikuje się chore, u których stwierdzono nadekspresję w metodzie IHC (3+) lub chore sklasyfikowane jako (2+), u których stwierdzono metodą FISH amplifikację genu HER2 [22, 32]. Przeciętnie w około 20% guzów stwierdza się reakcję o silnym (3+) natężeniu, w około 15% guzów reakcję o umiarkowanym (2+) natężeniu i w około 15% reakcję o słabym (1+) natężeniu. Ocenę każdego preparatu powinno przeprowadzać dwóch niezależnych patologów. Ocena dotyczy jedynie raka naciekającego. Biologiczne znaczenie nadekspresji białka HER2 w komponencie wewnątrzprzewodowej raka nie zostało dotychczas udowodnione, dlatego wynik oceny statusu HER2 w raku in situ nie jest uwzględniany przy klasyfikacji chorych do leczenia. Należy ponadto unikać interpretacji wyników uzyskanych metodą IHC w przypadkach, w których zabarwieniu uległy prawidłowe przewody gruczołu piersiowego [4, 28]. Zgodność wyników uzyskiwanych przy pomocy metody IHC i FISH mieści się w szerokich granicach, od 70-90% [15, 26]. Jest ona znacząco wyższa i sięga 100% w odniesieniu do guzów z nadekspresją HER2, w IHC (3+) [26, 32]. Rozbieżność pomiędzy wynikami oceny statusu HER2 przy zastosowaniu obu tych metod, w przypadkach IHC (3+)/FISH- mogą być spowodowane zwiększoną ekspresją genu na poziomie transkrypcji, bez towarzyszącej amplifikacji [15]. Tylko średnio w około 20% guzów z wynikiem niejednoznacznym IHC (2+) stwierdza się amplifikację genu HER2 potwierdzoną metodą FISH [15, 28, 33]. Metoda FISH Przy pomocy metody IHC wykrywa się obecność wewnątrzkomórkowej domeny receptora, a technika FISH pozwala na bezpośrednią detekcję amplifikacji genu HER2 kodującego białko receptorowe [12]. Detekcji tej dokonuje się za pomocą swoistych oligonukleotydów, znakowanych fluorescencyjnie, komplementarnych w stosunku do poszukiwanego fragmentu DNA [15]. Ta metoda jest bardziej czuła i swoista w porównaniu do metody IHC. Nie istnieje tu ryzyko uzyskania wyniku fałszywie ujemnego, spowodowanego utratą białka receptorowego, na skutek złego utrwalenia w formalinie [15]. Oznaczeń ekspresji statusu genu HER2 metodą FISH dokonuje się podobnie jak w metodzie IHC na skrawkach tkankowych uzyskanych z bloczków parafinowych. Zalecane jest stosowanie 4% buforowanej formaliny. Inne utrwalacze mogą powodować degradację DNA i obecność dużego tła 318
A. Kruczak, M. Rozmus-Piętoń, U. Marchińska-Osika a) b) c) spowodowanego autofluorescencją w obrazie [12]. Poza materiałem tkankowym do badań metodą FISH może służyć także materiał cytologiczny z biopsji aspiracyjnych cienkoigłowych, utrwalony i zatopiony również w bloczkach parafinowych [12]. Standardowa grubość skrawków do badania FISH powinna wynosić 4-5 µm. Wyniki badania FISH są oceniane w mikroskopie fluorescencyjnym. Podbarwienie tkanki nowotworowej DAPI lub jodkiem propidyny (PI) pozwala na identyfikację jąder komórkowych, co w porównaniu z obrazem tkanki zabarwionej hematoksyliną i eozyną skrawków z tego samego bloku pozwala na identyfikację składowej naciekającej guza. [12]. Należy zauważyć, że DNA w porównaniu do białka receptora HER2 jest bardziej stabilne, dlatego efekt nieprawidłowych procedur stosowanych podczas przygotowywania tkanki do barwienia nie musi mieć tak niekorzystnego wpływu jak w przypadku barwienia immunohistochemicznego. Dlatego też stwierdza się większą zgodność wyników uzyskanych tą metodą w porównaniu z metodą IHC. Liczne retrospektywne badania kliniczne wykazały, że wyniki uzyskane metodą FISH mają silniejszą wartość predykcyjną, jeśli chodzi o korzyści odniesione w leczeniu Trastuzumabem [12, 28]. Podobne wyniki otrzymano przy zastosowaniu Lapatinibu w dużym badaniu klinicznym u chorych z przerzutowym rakiem piersi. Nie uzyskano natomiast korzyści w leczeniu Trastuzumabem u chorych, u których nie potwierdzono amplifikacji metodą FISH w przypadkach, w których immunohistochemicznie ekspresję białka HER2 oceniono jako silną (3+) [22]. Wydaje się więc, że FISH jest najlepszą metodą służącą do identyfikacji chorych z przerzutowym rakiem piersi, które odniosą korzyści z leczenia Herceptyną. [15, 28] W badaniu FISH stosowane są zatwierdzone przez FDA, trzy dostępne komercyjnie testy: test firmy Ventana Medical Systems, przy pomocy którego oznacza się liczbę kopii genu HER2, test PathVision firmy Vysis, w którym do badania amplifikacji genu HER2 stosuje się mieszaniny 2 sond komplementarnych odpowiednio do genu HER2 i centromeru chromosomu 17 oraz test PHarmDx firmy DAKO [26, 28]. Sondy związane są z fluorochromami, odpowiednio: rodaminą i fluoresceiną [11]. Efekt związania sond widoczny jest w mikroskopie fluorescencyjnym (ryc. 2). Interpretacja wyniku oparta jest na zliczeniu sygnałów z przynajmniej 20 komórek (optymalnie 60) pochodzących z dwóch różnych obszarów składowej naciekającej guza [12]. W każdej analizowanej komórce należy policzyć sygnały odpowiadające genowi HER2 i genowi centromeru chromosomu 17. Amplifikację opisuje wskaźnik R, który wyraża stosunek liczby sygnałów odpowiadających genowi HER2 do liczby sygnałów pochodzących z centromerowej sondy dla chromosomu 17 (HER2/CEP17). Rycina 1. Ekspresja receptora HER2 w naciekającym raku piersi (metoda IHC) a) reakcja o słabym (+) natężeniu; b) reakcja o umiarkowanym natężeniu (2+); c) reakcja o silnym natężeniu (3+) 319
Ocena statusu HER2 w raku piersi a) b) Wskaźnik R>2 oznacza amplifikację genu HER2 [20, 21] (ryc. 2). Prawidłowe komórki widoczne w preparacie, np. fibroblasty lub limfocyty, zawierają po dwie kopie genu HER2, co stanowi wewnętrzną kontrolę w barwieniu FISH [28]. Wyniki uzyskane tymi dwiema metodami wykazują wysoką korelację. Niezgodności mogą wystąpić jedynie w przypadkach z polisomią chromosomu 17, które oceniane są jako negatywne przy użyciu testu firmy Vysis (HER2/CEP17<2), a jako pozytywne w teście firmy Ventana, gdzie średnia liczba sygnałów pochodzących od chromosomu 17 jest większa od 4. Takich przypadków może być od 2% do ponad 30% [3, 27, 28, 33]. Są one rozpoznane jako fałszywie dodatnie w teście bez kontroli chromosomu 17. Jest to tzw. pseudoamplifikacja cechująca się obecnością wielu kopii genu HER2 przy wskaźniku R<2 [8, 11]. Tak więc użycie wewnętrznej kontroli jest konieczne, a stwierdzenie liczby kopii genu HER2 i sygnałów z centromeru chromosomu 17 jest najbardziej optymalnym i najlepszym biologicznym testem do selekcji chorych z amplifikacją genu HER2. Kliniczne znaczenie polisomii chromosomu 17 w kontekście terapii Trastuzumabem pozostaje nieznane i oczekuje na rezultaty badań klinicznych [3, 4]. Jakkolwiek nie ma jeszcze wyników z dużych prospektywnych badań klinicznych, to jednak stwierdzono pozytywną odpowiedź na leczenie Trastuzumabem u chorych z polisomią chromosomu 17, ale tylko takich, u których stwierdzono nadekspresję HER2 w teście IHC (3+) [27]. Kontrola jakości w badaniach HER2 Implikacje, jakie niosą ze sobą wyniki badań ekspresji HER2 w klinikach onkologicznych wymagają stosowania przez laboratoria wysoce wystandaryzowanych procedur oraz stosowania rygorystycznej kontroli jakości w celu uzyskiwania wiarygodnych wyników. W badaniu IHC powinny być stosowane skrawki kontrolne o znanym statusie HER2 lub preparaty z linii komórkowych [4]. Przykładowo linia komórkowa SK-BR-3 jest linią z nadekspresją HER2, linia MDA-175 cechuje się ekspresją HER2 o umiarkowanym natężeniu, a linie MDA231 i MCF-7 nie wykazują ekspresji HER2, są to kontrole negatywne [4]. Powinno się stosować okresową powtórną analizę skrawków przez drugiego obserwatora, zarówno w badaniu IHC jak i FISH, a wszystkie przypadki o granicznych wartościach w badaniu zarówno IHC, jak i FISH powinny być powtórnie przeanalizowane przez jednego lub dwóch innych badaczy. Powinno się też wzajemnie kontrolować wyniki uzyskiwane przez kilku badaczy w laboratorium [12]. Kontrola zewnętrzna polega na okresowym porównaniu wyników uzyskiwanych w różnych laboratoriach. Różne kraje stosują różne metody kontroli zewnętrznej. Głównie odbywa się to przez wysyłanie próbek do centralnego laboratorium, gdzie c) 320 Rycina 2. Metoda FISH. a) naciekający rak piersi brak amplifikacji; b) naciekający rak piersi obecna amplifikacja genu HER2; c) naciekający rak piersi polisomia chromosomu 17
A. Kruczak, M. Rozmus-Piętoń, U. Marchińska-Osika powtórnie powinna być przeprowadzona analiza IHC, a nadekspresja powinna być potwierdzona badaniem FISH. Zgodność pomiędzy IHC (3+) a FISH powinna wynosić powyżej 90%. Odsetek przypadków ocenionych w metodzie IHC na (2+), w których wykazano amplifikację genu HER2, nie powinien przekraczać natomiast 25% [4]. Regularnie przeprowadzany zewnętrzny audyt powinien wykazywać 15-25% HER2 pozytywnych wyników w populacji nieselekcjonowanych raków piersi. Znany jest związek ekspresji HER2 z wybranymi typami histologicznymi raka piersi, dlatego stwierdzenie nadekspresji HER2 w raku zrazikowym, śluzowym, cewkowym oraz brak reakcji w raku przewodowym naciekającym o niskim stopniu zróżnicowania histologicznego, przy jednoczesnym braku receptorów hormonalnych powinno skłonić oceniających patomorfologów do weryfikacji wyników [4]. Kontrola jakości w Polsce Wewnętrzna kontrola jakości preparatów IHC polega na ocenie każdego preparatu przez dwóch oceniających, a przy rozbieżnej ocenie przez trzech oceniających. Kontrola zewnętrzna polega na corocznym wysyłaniu określonej liczby bieżących preparatów do ośrodka centralnego (Centrum Onkologii Instytut im. M.C.Skłodowskiej w Warszawie) i poddaniu ich powtórnej ocenie. Odsetek zgodności wyników powinien przekraczać 90%. Wewnętrzna kontrola jakości preparatów FISH polega na ocenie każdego badania o niejednoznacznym wyniku przez dwóch bądź trzech oceniających. Zewnętrzna kontrola badań FISH polega na tym, że do poszczególnych ośrodków wysyłane są preparaty o znanym statusie genu HER2 i ocenie tych preparatów. Wskaźnik R powinien wykazywać ponad 90% zgodności. Trudności w interpretacji wyników IHC Oceny dokonuje się jedynie w komórkach z kompletną reakcją błonową, barwienie cytoplazmatyczne nie podlega ocenie, reakcja w prawidłowym nabłonku wyklucza preparat z oceny [28]. Trudności w ocenie sprawiają artefakty powstałe na skutek złego skrojenia skrawka lub tzw. artefakt brzeżny, który może być przyczyną wyniku fałszywie pozytywnego. Ocena reakcji jest subiektywna, jednak w ocenie pomagają preparaty kontrolne dołączane do każdego testu. Trudności w interpretacji wyników FISH Podbarwienie jąder komórkowych DAPI/PI pozwala na zaobserwowanie nieprawidłowości w badanym preparacie. Krojenie zbyt cienkich skrawków powoduje skrojenie jąder, a w rezultacie utratę DNA. Jądra, które mają średnicę mniejszą niż połowa przeciętnej średnicy jąder komórek nowotworowych nie powinny podlegać interpretacji. Sygnały powinny być widoczne przynajmniej w 75% komórek. Liczenia sygnałów dokonuje się jedynie w jądrach niezniszczonych o pełnych granicach. W przypadku guzów heterogennych zlicza się sygnały w komórkach pochodzących z różnych miejsc, a w szczególności miejsc o maksymalnej ekspresji. Ocena preparatów uzyskanych techniką FISH wymaga dużego doświadczenia w umiejętności odróżniania komórek nowotworowych od prawidłowych oraz komórek raka naciekającego i wewnątrzprzewodowego, a także umiejętności pomijania artefaktów [4, 15]. Wytyczne ASCO (American Society of Clinical Oncology) Podczas 11 Konferencji dotyczącej leczenia pierwotnego raka piersi w St Gallen w 2009 r. potwierdzono konieczność oznaczania statusu HER2 przy użyciu dwóch podstawowych metod: IHC i FISH, stosując kryteria przyjęte przez Amerykańskie Towarzystwo Onkologii Klinicznej (ASCO) i Kolegium Patologów Amerykańskich (CAP) [7]. Organizacje te zwołały grupę ekspertów, która opracowała zalecenia dla optymalnej sprawności badania HER2. Grupa ekspertów zaleca, aby stan HER2 ustalać we wszystkich przypadkach inwazyjnego raka piersi. Zalecono algorytm definiujący wartości dodatnie, niejednoznaczne i ujemne zarówno dla ekspresji białka HER2, jak i amplifikacji genu (ryc. 3). O wyniku dodatnim HER2 świadczy barwienie IHC (3+) (jednolite, intensywne zabarwienie błony w >30% komórek guza inwazyjnego), ponad 6 kopii genu HER2 na jądro we fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ (FISH) dla systemów bez wewnętrznej sondy kontrolnej, lub wskaźnik HR (stosunek liczby sygnałów HER2 do liczby sygnałów chromosomu 17; stosunek HER2/CEP17) wynoszący ponad 2,2. Na wynik ujemny wskazują: zabarwienie IHC 0 lub (1+), wynik HR mniej niż 4 kopie genu HER2 na jądro dla systemów bez wewnętrznej sondy kontrolnej lub wskaźnik FISH poniżej 1,8. Wyniki niejednoznaczne wymagają powtórzenia badania w celu ustalenia rozstrzygającego wyniku [33]. Wynikiem niejednoznacznym HER2 określa się albo punktację 2+ w IHC, albo wskaźnik FISH 1,8-2,2; bądź przeciętną liczbę kopii genu HER2 = 4-6 sygnałów na jądro dla systemów bez wewnętrznej sondy kontrolnej. Średnio stanowi to około 2% wszystkich przypadków raka sutka. Jeśli wskaźnik R wynosi od 1,8-2,2 należy policzyć sygnały w dodatkowych 20 komórkach, oraz dodatkowo w minimum 40 komórkach przez drugiego obserwatora, a jeśli wyniki uzyskane przez dwóch badaczy są rozbieżne należy powtórzyć test [28]. W badaniu powtórnym metodą FISH, gdy wskaźnik R wynosi 2,0 lub więcej, stwierdza się amplifikacje genu HER2 [20]. Gdzie badać próbki? Badanie ekspresji receptora HER2 powinno być wykonywane w ośrodkach stosujących wystandaryzowane metody badania ekspresji receptora HER2 i amplifikacji odpowiadającego mu genu. Zastrzeżenie to dotyczy przede wszystkim metody IHC. Dostępne przeciwciała nie są identyczne, tak że nasilenie odczynu w zależności od stosowanego przeciwciała może różnić się w stopniu wpływającym na ostateczny wynik badania ekspresji HER2. Z praktycznego punktu widzenia najistotniejsze jest stosowanie jednolitej metodyki w badaniach ekspresji HER2, zarówno w przygotowaniu 321
Ocena statusu HER2 w raku piersi Rycina 3. Algorytm dla oceny badania IHC i FISH wg Wolffa i wsp. preparatów, jak i w ich ocenie. Centralizacja umożliwia uzyskanie większej liczby preparatów do oceny, co pozwala na uzyskanie większego doświadczenia osoby oceniającej. Ocena w laboratoriach lokalnych może być dokładna o ile biorą one udział w programach nauczania, standaryzacji oraz wewnętrznych i zewnętrznych programach kontroli jakości. Ponadto laboratorium musi wykonywać minimalną roczną liczbę badań (jest to np. ponad 250 przypadków badania IHC i 100 badań FISH w Wielkiej Brytanii [4, 33]), a także musi ono brać stale udział w programach zapewnienia jakości. Metoda mikromacierzy Najnowsze badania ekspresji genów techniką mikromacierzy potwierdzają obecność co najmniej czterech podstawowych podtypów raka piersi o odmiennym profilu molekularnym, w tym dwóch z ekspresją genu HER2: podtyp z nadekspresją HER2 oraz podtyp luminalny B z koekspresją receptorów hormonalnych i receptora HER2 (ER+ i/lub PR+, HER2+) [6, 33]. Podsumowanie Wystandaryzowane procedury i stałe doskonalenie metod diagnostycznych mają kluczowe znaczenie dla właściwej oceny statusu genu HER2, a tym samym dla identyfikacji chorych na raka piersi do leczenia Trastuzumabem. Testem z wyboru służącym do oznaczania nadekspresji receptora HER2 jest badanie immunohistochemiczne. Powinno być ono wykonywane w laboratoriach, w których skrupulatnie przestrzegane są procedury wykonywania testów diagnostycznych, zwłaszcza na etapie tzw. odzyskiwania antygenów. Wszystkie przypadki o niejednoznacznym wyniku badania immunohistochemicznego winny być weryfikowane poprzez ocenę amplifikacji genu techniką FISH. Piśmiennictwo: 1. Arnould R, Denoux Y, MacGrogan G. Agreement between chromogenic in situ hybridization (CISH) and FISH in the determination of HER2 status in breast cancer. Br J Cancer 2003; 88: 1587-1591. 2. Bar J, Wąsikiewicz D. HER2/NEU- od badań podstawowych do implikacji klinicznych. Adv Clin Exp Med 2003; 12: 97-103. 3. Bempt IV, Loo PV, Drijkoningen M. Polysomy 17 in Breast Cancer: Clinicopathologic Significance and Impact on HER2 Testing. J Clin Oncol 2008; 26:4869-4874. 4. Bilous M, Dowsett M, Hanna W i wsp. Current Perspectives on HER2 Testing: A Review of National Testing Guidelines. Mod Pathol 2003; 16(2): 173-182. 5. Cheang MCU, Voduc D, Bajdik C i wsp. Basal-Like Brest Cancer Defined by Five Biomarkers Has Superior Prognostic Value 322
A. Kruczak, M. Rozmus-Piętoń, U. Marchińska-Osika than Triple-Negative Phenotype. Clin Cancer Res 2008; 14(5) 6. Cleator S, Heller W, Coombes RC. Triple-negative breast cancer: therapeutic options. Lancet Oncol 2007; 8: 235-244. 7. Goldrhirsch A, Ingle JN, Gelber RD. Thresholds for therapies: highlights of the St Gallen International Expert Consensus on the Primary Therapy of Early Breast Cancer 2009. An Oncol 2009; 20: 1319-1329. 8. Gown AM. Current issues in ER and HER2 testing by IHC in breast cancer. Mod Pathol 2008; 21: 8-15. 9. Harari PM, Allen GW, Bonner JA. Biologia interakcji: czynniki skierowane przeciwko receptorowi naskórkowego czynnika wzrostu. J Clin Oncol 2007; 25: 4057-4065. 10. Harris L, Fritsche H, Mennel R. American Society of Clinical Oncology 2007 Update of Recommendationa for the Use of Tumor Markers in Breast Cancer. J Clin Oncol 2007; 25: 5287-5312. 11. Hicks DG, Kulkarni SK. HER2+ Breast Cancer. Review of Biologic Relevance and Optimal Use of Diagnostic Tools. Am J Clin Pathol 200; 129: 263-273. 12. Hicks DG, Tubbs RR. Assessment of the HER status in breast cancer by fluorescence in situ hybridization: a technical review with interpretive guidelines. Human Pathol 2005; 36: 250-261. 13. Kozłowski W, Szacikowska E. Wielokierunkowe działanie Herceptyny w komórkach raka z nadekspresją receptora HER2 (białka p185). Współ Onkol 2001; 5: 254-259. 14. Krasińska L, Jassem J. Znaczenie rokownicze i predykcyjne HER2 w raku piersi. Współ Onkol 2002; 6: 279-287. 15. Krasińska L, Jassem J. Kliniczne znaczenie zaburzeń HER2 w raku piersi z uwzględnieniem metod ich oznaczania. Nowotwory 2003; 53: 68-73. 16. Leary AF, Hanna WM, van de Vijver MJ i wsp. Value and Limitations of Measuring HER-2 Extracellular Domain in the Serum of Breast Cancer Patiens. J Clin Oncol 2009; 27:1694-1705. 17. Livasy CA, Karaca G, Nanda R i wsp. Phenotypic evaluation of the basal-like subtype of invasive breast carcinoma. Modern Pathol 2006; 19: 264-271. 18. Lohrisch C, Piccart M. An Overview of HER2. Seminn Oncol 2001; 28: 3-11. 19. Olszewski WT, Krzakowski M. Rekomendacje Polskiej Grupy badawczej ds. HER2. Nowotwory 2004; 54: 500-505. 20. Olszewski WP. Patomorfologiczna selekcja chorych do terapii systemowej. Pol J Pathol 2009; 3 (suplement 1): 28-33. 21. Perez EA, Roche PC, Jenkins RB. HER2 Testing in Patients With Breast Cancer: Poor Correlation Between Weak Positivity by Immunohistochemistry and Gene Amplification by Fluorescence In Situ Hybridization. Mayo Clin Proc 2002; 77: 148-154. 22. Piekarski J. Białko c-erbb-2/her2/neu. Przegląd piśmiennictwa. Biuletyn Onkol 2006; 6: 24-33. 23. Prat A, Baselga J. The role of hormonal therapy in the management of hormonal-receptor-positive breast cancer with coexpression of HER2. Nature Clin Practice 2008; 531-542. 24. Reis-Filho JS, Tutt ANJ. Triple negative tumours: a critical re- view. Histopathology 2008; 52: 108-118. 25. Ross JS, Fletcher JA, Bloom KJ i wsp. Targeted Therapy in Breast Cancer. The HER2/neu Gene and Protein. Mol Cell Proteomics 2004; 3: 379-398. 26. Ross JS, Fletcher JA, Linette GP. The HER2/neuGene and Protein in Breast Cancer 2003: Biomarker and Target of Therapy. The Oncologist 2003; 8: 307-325. 27. Ross JS, Słodkowska EA, Symmans WF i wsp. The HER2 Receptor and Breast Cancer: Ten Years of Targeted Anti-HER2 Therapy and Personalized Medicine. The Oncologist 2009; 14: 320-368. 28. Sauter G, Lee J, Bartlett JMS i wsp. Guidelines for Human Epidermel Growth Factor Receptor 2 Testing: Biologic and Methodologic Considerations. J Clin Oncol 2009; 27: 1323-1333. 29. Szacikowska E, Kozłowski W. Heterodimer receptorów HER2/ HER3, autokrynne hereguliny i cyklooksygenaza 2 a działanie Herceptyny. Współ Onkol 2000; 4: 93-99. 30. Szacikowska E, Kozłowski W. Rola receptorów HER i heregulin w powstawaniu przerzutów raka piersi. Współ Onkol 2002; 6: 312-321. 31. Szydłowska-Pazera K, Płużańska A. Rola czynników molekularnych w ocenie wartości leczenia przedoperacyjnego raka piersi. Onkol Pol 2005; 8: 239-244. 32. Ułańska M. HER2 jako czynnik prognostyczny i predykcyjny u chorych z rakiem piersi. Ale czy tylko? Biuletyn Okol 2003; 3: 80-81. 33. Wolff AC, Hammond MEH, Schwartz JN i wsp. Wytyczne American Society of Clinical Oncology/College of American Pathologists dotyczące badania receptora 2 dla ludzkiego naskórkowego czynnika wzrostu (HER2) w raku piersi. Journal of Clinical Oncology 2007; 5. 34. Wojciechowska U, Didkowska J, Zatoński W. Nowotwory złośliwe w Polsce w 2006 roku. Warszawa 2008. Adres Autorów: Zakład Patomorfologii Nowotworów Centrum Onkologii Instytut im. Marii Skłodowskiej-Curie Oddział w Krakowie, ul. Garncarska 11, 31-115 Kraków (Praca wpłynęła do Redakcji: 2009-12-20) (Praca przekazana do opublikowania: 2010-01-12) 323