(12) TŁUMACZENIE PATENTU EUROPEJSKIEGO (19) PL (11) PL/EP (96) Data i numer zgłoszenia patentu europejskiego:

RZECZPOSPOLITA POLSKA (12) TŁUMACZENIE PATENTU EUROPEJSKIEGO (19) PL (11) PL/EP 1631313 (96) Data i numer zgłoszenia patentu europejskiego: 04.06.2004 04754321.0 (13) (51) T3 Int.Cl. A61K 39/395 (2006.01) Urząd Patentowy Rzeczypospolitej Polskiej (97) O udzieleniu patentu europejskiego ogłoszono: 11.03.2015 Europejski Biuletyn Patentowy 2015/11 EP 1631313 B1 (54) Tytuł wynalazku: Terapia skojarzona zaburzeń z komórek B (30) Pierwszeństwo: 05.06.2003 US 476481 P 05.06.2003 US 476414 P 06.06.2003 US 476531 P (43) Zgłoszenie ogłoszono: 08.03.2006 w Europejskim Biuletynie Patentowym nr 2006/10 (45) O złożeniu tłumaczenia patentu ogłoszono: 31.08.2015 Wiadomości Urzędu Patentowego 2015/08 (73) Uprawniony z patentu: Genentech, Inc., South San Francisco, US (72) Twórca(y) wynalazku: PL/EP 1631313 T3 ANDREW CHAN, Menlo Park, US QIAN GONG, Foster City, US FLAVIUS MARTIN, Hayward, US (74) Pełnomocnik: rzecz. pat. Dorota Rzążewska JWP RZECZNICY PATENTOWI DOROTA RZĄŻEWSKA SP. J. ul. Żelazna 28/30 Sienna Center 00-833 Warszawa Uwaga: W ciągu dziewięciu miesięcy od publikacji informacji o udzieleniu patentu europejskiego, każda osoba może wnieść do Europejskiego Urzędu Patentowego sprzeciw dotyczący udzielonego patentu europejskiego. Sprzeciw wnosi się w formie uzasadnionego na piśmie oświadczenia. Uważa się go za wniesiony dopiero z chwilą wniesienia opłaty za sprzeciw (Art. 99 (1) Konwencji o udzielaniu patentów europejskich).

22591/15/ZWA/DR EP 1 631 313 Opis DZIEDZINA WYNALAZKU Terapia skojarzona zaburzeń z komórek B [0001] Wynalazek dotyczy nowych terapii skojarzonych do leczenia nowotworów złośliwych z komórek B oraz zaburzeń autoimmunologicznych. TŁO WYNALAZKU [0002] Limfocyty stanowią jedną z wielu populacji białych krwinek; specyficznie rozpoznają i reagują na obcy antygen. Trzy główne klasy limfocytów stanowią limfocyty B (komórki B), limfocyty T (komórki T), komórki naturalnych zabójców (NK). Limfocyty B są komórkami odpowiedzialnymi za produkcję przeciwciała i zapewniają odporność humoralną. Komórki B dojrzewają w szpiku kostnym i opuszczają szpik eksprymując przeciwciało wiążące antygen na powierzchni komórek. Gdy naiwne komórki B pierwszy raz stykają się z antygenem, do którego przeciwciało związane z błoną jest specyficzne, komórki zaczynają się szybko dzielić, a ich komórki potomne różnicują się do komórek pamięci B i komórek efektorowych, zwanych komórkami plazmatycznymi. Komórki pamięci B mają dłuższy okres życia i w dalszym ciągu eksprymują przeciwciało związane z błoną z taką samą specyficznością, jak oryginalna komórka macierzysta. Komórki plazmatyczne nie wytwarzają przeciwciała związanego z błoną, lecz wytwarzają wydzielaną postać przeciwciała. Wydzielane przeciwciała są głównymi cząsteczkami efektorowymi w odporności humoralnej. [0003] Antygen CD20 (zwany również antygenem różnicowania ograniczonym do ludzkich limfocytów B, Bp35) jest hydrofobowym białkiem transbłonowym o masie cząsteczkowej około 35 kda umieszczonym w limfocytach pre-b i dojrzałych B (Valentine i wsp. J. Biol. Chem. 264(19):11282-11287 (1989); i Einfeld i wsp. EMBO J. 7(3):711-717 (1988)). Antygen ten również ulega ekspresji w ponad 90% chłoniaków nieziarniczych (NHL) z komórek B (Anderson i wsp. Blood 63(6):1424-1433 (1984)), lecz nie występuje na krwiotwórczych komórkach macierzystych, komórkach pro-b, normalnych komórkach plazmatycznych ani innych normalnych tkankach (Tedder i wsp. J. Immunol. 135(2):973-979 (1985)). Uważa się, że CD20 reguluje wczesne etap(-y) w procesie aktywacji inicjacji cyklu komórkowego i różnicowania (Tedder i wsp., supra) i ewentualnie działa jak kanał wapniowy (Tedder i wsp. J. Cell. Biochem. 14D:195 (1990)). [0004] Biorąc pod uwagę ekspresję CD20 w chłoniakach z komórek B, antygen ten jest użytecznym celem terapeutycznym w leczeniu takich chłoniaków. Obecnie jest ponad 300,000 osób w Stanach Zjednoczonych z NHL z komórek B i diagnozuje się ponad 56.000 nowych przypadków każdego roku. Na przykład, przeciwciało rytuksymab (RITUXAN ), które jest zmodyfikowanym technikami inżynierii genetycznej chimerycznym mysim/ludzkim przeciwciałem monoklonalnym skierowanym przeciwko ludzkiemu antygenowi CD20 (dostępne w handlu z firmy Genentech, Inc., South San Francisco, California, U.S.), służy do leczenia pacjentów z nawracającym lub opornym, CD20 dodatnim, chłoniakiem nieziarniczym z komórek B o niskim stopniu złośliwości lub grudkowym. Rytuksymab jest

2- przeciwciałem zwanym jako C2B8 w Patencie Nr US 5,736,137 wydanym 7 kwietnia 1998 (Anderson i wsp.). Badania in vitro mechanizmu działania pokazały, że RITUXAN wiąże ludzki dopełniacz i lizuje linię komórek limfoidalnych B poprzez cytotoksyczność zależną od dopełniacza (CDC) (Reff i wsp. Blood 83(2):435-445 (1994)). Dodatkowo, ma on znaczącą aktywność w testach dla zależnej od przeciwciał cytotoksyczności komórkowej (ADCC). Badania przedkliniczne in vivo pokazały, że RITUXAN powoduje deplecję komórek B z krwi obwodowej, węzłów chłonnych i szpiku kostnego od małp cynomolgus, prawdopodobnie poprzez dopełniacz i procesy zależne od komórek (Reff i wsp. Blood 83(2):435-445 (1994)). Inne przeciwciała anty-cd20 wskazane do leczenia NHL obejmują mysie przeciwciało Zevalin, które jest połączone z radioizotopem, Itrem-90 (IDEC Pharmaceuticals, San Diego, CA), Bexxar, który jest innym pełnym mysim przeciwciałem skoniugowanym do I-131 (Corixa, WA). [0005] BLyS (znany również jako BAFF, TALL-1, THANK, TNFSF13B lub ztnf4) jest członkiem nadrodziny ligandów TNF1, który jest niezbędny do przeżycia i dojrzewania komórek B. Nadekspresja BLyS w transgenicznych myszach prowadzi do przerostu komórek B i rozwoju ciężkiej choroby autoimmunologicznej (Mackay, i wsp. (1999) J. Exp. Med. 190, 1697-1710; Gross, i wsp. (2000) Nature 404, 995-999; Khare, i wsp. (2000) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 97,3370-33752-4). Poziomy BLyS są podwyższone u pacjentów ludzkich z różnymi chorobami autoimmunologicznymi takimi, jak układowy toczeń rumieniowaty, reumatoidalne zapalenie stawów, i zespół Sjögrena (Cheema, G. S, i wsp., (2001) Arthritis Rheum. 44, 1313-1319; Groom, J., et al, (2002) J. Clin. Invest. 109,59-68; Zhang, J., i wsp., (2001) J. Immunol. 166, 6-10). Ponadto, poziomy BLyS korelują ze stopniem nasilenia choroby, co sugeruje, że BLyS może odgrywać bezpośrednią rolę w patogenezie tych chorób. BLyS działa na komórki B poprzez wiązanie się z trzema członkami nadrodziny receptorów TNF, TACI, BCMA i BR3 (znany również jako BAFF-R) (Gross, i wsp., supra; 8. Thompson, J. S., i wsp., (2001) Science 293, 2108-2111; Yan, M., i wsp., (2001) Curr. Biol. 11, 1547-1552; Yan, M., i wsp., (2000) Nat. Immunol. 1, 37-41; Schiemann, B., i wsp., (2001) Science 293, 2111-2114). Z trzech z nich, tylko BR3 jest specyficzny dla BLyS; dwaj pozostali również wiążą pokrewny członek rodziny TNF, APRIL. Porównanie fenotypów myszy zmutowanych lub z nokautem BLyS i receptora wskazuje, że przekazywanie sygnału przez BR3 pośredniczy w funkcjach przeżycia komórek B BLyS (Thompson, i wsp., supra; Yan, (2002), supra; Schiemann, supra). W przeciwieństwie do tego, TACI wydaje się działać jako receptor hamujący (Yan, M., (2001) Nat. Immunol. 2, 638-643), natomiast rola BCMA nie jest jasna (Schiemann, supra). [0006] BR3 jest białkiem transbłonowym typu III o 184 resztach, ulegającym ekspresji na powierzchni komórek B (Thompson, i wsp., supra; Yan, (2002), supra). Region wewnątrzkomórkowy nie ma żadnego podobieństwa sekwencji do znanych domen strukturalnych lub motywów oddziaływania białko-białko. Niemniej jednak, sygnalizacja wywołana BLyS przez BR3 powoduje przetwarzanie czynnika transkrypcyjnego NF-B2/p100 do p52 (Claudio, E, i wsp., (2002) Nat. Immunol. 3, 958-965; Kayagaki, N., i wsp., (2002) Immunity 10,515-524). Domena zewnątrzkomórkowa (ECD) BR3 jest również rozbieżna. Członkowie rodziny TNFR zazwyczaj charakteryzują się obecnością wielu domen bogatych

3- w cysteinę (CRD) w ich regionie zewnątrzkomórkowym; każdy CRD składa się typowo z ~40 reszt stabilizowanych przez sześć cystein w trzech wiązaniach disiarczkowych. Konwencjonalni członkowie tej rodziny dokonują kontaktów z ligandem przez dwa CRD oddziałujące z dwoma różnymi obszarami na powierzchni ligandu (przegląd w Bodmer, J.-L., i wsp., (2002) Trends Biochem. Sci. 27, 19-26). Jednakże ECD BR3 zawiera jedynie cztery reszt cysteinowe, zdolne do utworzenia co najwyżej częściowego CRD, co nasuwa pytanie, jak tak mały receptor nadaje wysokie powinowactwo wiązania ligandu. [0007] Wcześniej wykazano, że domena wiążąca BLyS BR3 znajduje się w regionie rdzeniowym 26-resztowym (Kayagaki, i wsp., supra). Sześć reszt BR3, gdy zorganizowane w strukturze peptydu typu spinki do włosów β (bhpbr3), było wystarczających do nadania wiązania BLyS i zablokowania sygnalizacji za pośrednictwem BR3. Inni opisali polipeptydy, które rzekomo oddziaływały z BLyS (np. WO 02/24909, WO 03/035846, WO 02/16312, WO02/02641). STRESZCZENIE WYNALAZKU [0008] Wynalazek zapewnia sposób powodowania deplecji komórek B z mieszanej populacji komórek według zastrzeżenia 1. Sposób ten jest użyteczny np. w komercyjnym teście in vitro skutecznej i selektywnej deplecji komórek B z mieszanej populacji komórek, przez kontaktowanie komórek B z antagonistą BLyS i przeciwciałem anty-cd20. Inny przykład wykonania powyższego sposobu deplecji komórek B jest specyficzną deplecją określonych podzbiorów komórek B takich, jak komórki B z ośrodków rozmnażania i komórki B ze strefy brzeżnej. Ujawnione tu komórki B z ośrodków rozmnażania mogą być w śledzionie i kępkach Peyera. Ujawniony jest tu sposób deplecji wszystkich podzbiorów komórek B in vitro lub in vivo przez kontaktowanie komórek B z antagonistą BLyS oraz przeciwciałem wiążącym CD20. [0009] Wynalazek zapewnia również sposób deplecji wszystkich populacji komórek B w śledzionie poprzez podawanie ssakowi antagonisty BLyS i przeciwciała anty-cd20 w ilościach skutecznych do deplecji wszystkich populacji komórek B. W konkretnym przykładzie wykonania, sposób ten jest skuteczny w deplecji komórki B ze strefy brzeżnej i z ośrodków rozmnażania w śledzionie, węźle chłonnym i kępkach Peyera. [0010] Ujawniony jest tu sposób leczenia neoplazji lub nowotworu złośliwego z komórek B cechujących się komórkami B z ekspresją CD20, obejmujący podawanie pacjentowi cierpiącemu na neoplazję lub nowotwór złośliwy, terapeutycznie skuteczną ilość przeciwciała wiążącego CD20 i antagonisty BLyS. Przeciwciało wiążące CD20 i antagonistę BLyS można podawać jednocześnie. Przeciwciało wiążące CD20 i antagonistę BLyS można podawać sekwencyjnie. Antagonistę BLyS można podawać przed przeciwciałem wiążącym CD20. Neoplazją z komórek B może być chłoniak nieziarniczy (NHL), NHL z małych limfocytów (SL), chłoniak Hodgkina - LP guzkowy (LPHD), chłoniaki grudkowe (FCC) (ang. follicular center cell (FCC) lymphomas), ostra białaczka limfoblastyczna (ALL), przewlekła białaczka limfocytowa (CLL) i białaczka włochatokomórkowa. W tym sposobie leczenia, podaje się

4- BR3-Fc i Rituxan w dawkach ujawnionych w rozdziale Dawkowanie. Antagonistę BLyS oraz przeciwciało wiążące CD20 można podawać w połączeniu z chemioterapią. [0011] Ujawniony jest tu sposób łagodzenia zaburzeń autoimmunologicznych regulowanych komórkami obejmujący podawanie pacjentowi cierpiącemu na to zaburzenie, terapeutycznie skutecznej ilości przeciwciała wiążącego CD20 i antagonisty BLyS. Zaburzenie autoimmunologiczne może być wybrane z grupy obejmującej reumatoidalne zapalenie stawów, młodzieńcze reumatoidalne zapalenie stawów, układowy toczeń rumieniowaty (SLE), chorobę Wegenera, zapalną chorobę jelit, idiopatyczną plamicę małopłytkową (ITP), zakrzepową plamicę małopłytkową (TTP), autoimmunologiczną trombocytopenię, stwardnienie rozsiane, łuszczycę, nefropatię IgA, polineuropatie IgM, myasthenia gravis, zapalenie naczyń, cukrzycę, zespół Reynauda, zespół Sjorgena i zapalenie kłębuszków nerkowych. Przy czym chorobą autoimmunologiczną jest reumatoidalne zapalenie stawów lub układowy toczeń rumieniowaty, antagonistę BLyS oraz przeciwciało wiążące CD20 można podawać w połączeniu z terapią przy użyciu leku wybranego z niesteroidowych leków przeciwzapalnych (NSAID), glukokortykoidu, prednizonu i leku modyfikującego przebieg choroby (DMARD). [0012] W każdym z tych sposobów leczenia lub łagodzenia zaburzenia, gdzie przeciwciało wiążące CD20 i antagonistę BLyS podaje się pacjentowi, przeciwciało wiążące CD20 i antagonistę BLyS można podawać jednocześnie lub sekwencyjnie. Antagonistę BLyS można podawać przed przeciwciałem wiążącym CD20. [0013] Ujawniono tu również kompozycję zawierającą przeciwciało wiążące CD20 oraz antagonistę BLyS. [0014] Ujawniony jest tu wyrób produkcyjny zawierający przeciwciało wiążące CD20, antagonistę BLyS i etykietę, przy czym etykieta wskazuje, że kompozycja jest przeznaczona do leczenia neoplazji z komórek lub zaburzenia autoimmunologicznego regulowanego komórkami B. [0015] Przeciwciało anty-cd20 może obejmować przeciwciało chimeryczne i humanizowane. Specyficzne przykłady wykonania przeciwciała anty-cd20 to rytuksymab (RITUXAN ), m2h7 (mysie 2H7), hu2h7 (humanizowane 2H7) i wszystkie jego warianty funkcjonalne, hu2h7.v16 (v oznacza wersję), v31, v96, v114, v115, mające sekwencje aminokwasowe. Nienaruszone hu2h7.v16 ma sekwencję dojrzałego łańcucha L SEQ ID NO. 15 i łańcucha H SEQ ID NO. 16. [0016] Antagonista BLyS, może być immunoadhezyną. W szczególnych przykłady wykonania, immunoadhezyna wybrana z grupy składającej się z immunoadhezyny BR3 zawierającej zewnątrzkomórkową domenę BR3, immunoadhezyny TACI zawierającej zewnątrzkomórkową domenę TACI i immunoadhezyny BCMA zawierającej zewnątrzkomórkową domenę BCMA. W innych przykładach wykonania, antagonista BLyS jest przeciwciałem anty-blys, w szczególności, przeciwciałem anty-blys, które wiąże BLyS w regionie BLyS zawierającym reszty 162-275. W innym przykładzie wykonania, antagonista BLyS jest przeciwciałem anty-br3, w tym takim, które wiąże BR3 w regionie

5- zawierającym reszty 23-38 ludzkiego BR3. Pozycje aminokwasowe ludzkiego BR3, o których mowa w zastrzeżeniach są według numeracji sekwencji w ramach ludzkiego BR3 lub alternatywnego ludzkiego BR3 ujawnionego tu pod definicją BR3. [0017] W specyficznych przykładach wykonania antagonista BLyS jest wybrany z grupy składającej się z 17-merowego polipeptydu o sekwencji ECFDLLVRAWVPCSVLK (SEQ ID NO 5), ECFDLLVRHWVPCGLLR (SEQ ID NO 6), ECFDLLVRRWVPCEMLG (SEQ ID NO 7), ECFDLLVRSWVPCHMLR (SEQ ID NO 8), lub ECFDLLVRHWVACGLLR (SEQ ID NO 9) oraz postaci PEGylowanych tych 17merów; polipeptydu o sekwencji immunoadhezyny hbr3-fc o sekwencji [0018] W dowolnym z powyższych sposobów według wynalazku, w jednym przykładzie wykonania, antagonista BLyS i przeciwciało anty-cd20 działają synergistycznie aby spowodować deplecję komórek B. KRÓTKI OPIS FIGUR [0019] Figury 1A-1B pokazują sekwencję polinukleotydową kodującą sekwencję natywną ludzkiego TACI (SEQ ID NO:_) i jego sekwencję aminokwasową (SEQ ID NO:_). Figura 2 przedstawia sekwencję polinukleotydową kodującą natywną sekwencję ludzkiego BCMA (SEQ ID NO:_) i jego sekwencję aminokwasową (SEQ ID NO: ). Figura 3 przedstawia sekwencję polinukleotydową kodującą natywną sekwencję ludzkiego BLyS (SEQ ID NO: ) i jego sekwencję aminokwasową (SEQ ID NO: _). Figury 4A-4B pokazują sekwencję polinukleotydową kodującą sekwencję natywną ludzkiego APRIL (SEQ ID NO: ) i jego domniemaną sekwencję aminokwasową (SEQ ID NO: ). Figura 5A przedstawia sekwencję polinukleotydową (kodony start i stop są podkreślone) kodującą natywne sekwencje ludzkich TACI (SEQ ID NO:_) oraz Figura 5B przedstawia jego sekwencję aminokwasową (SEQ ID NO: ).

6- Figura 6A przedstawia sekwencję polinukleotydową (kodony start i stop są podkreślone) kodującą natywną sekwencję ludzkiego BR3 (SEQ ID NO: ), oraz Figura 6B przedstawia jego sekwencję aminokwasową (SEQ ID NO:_); Figura 6C przedstawia sekwencję polinukleotydową (kodony start i stop są podkreślone) kodującą mysie BR3 (SEQ ID NO:_), oraz Figura 9A przedstawia jego sekwencję aminokwasową (SEQ ID NO: ). Figury 7A-7B pokazują przykładowe sposoby obliczania % identyczności sekwencji aminokwasowej sekwencji aminokwasowej oznaczonej jako Białko Porównawcze do sekwencji aminokwasowej oznaczonej PRO. Dla celów niniejszego opisu, sekwencją PRO mogą być sekwencje TACI, BCMA, TALL-1, APRIL, TACI lub BR3, określane tu tak także na Figurach. Figura 8 pokazuje dopasowanie dwóch sekwencji aminokwasowych dla receptora TACI, określanego jako htaci (265) (SEQ ID NO: ), uważanego za wariant składania, oraz htaci, określanego tu tak także na Figurach 1A-1B (SEQ ID NO: ). Figura 9 przedstawia dopasowanie sekwencji ludzkiego (SEQ ID NO: ) i mysiego BR3 (SEQ ID NO: ) z identycznymi aminokwasami oznaczonymi literą i konserwatywnymi aminokwasami oznaczonymi znakiem plus poniżej. Figura 10 przedstawia sekwencję aminokwasową ludzkiego CD20 pokazującą przewidywane transbłonowe (w ramce) i zewnątrzkomórkowe (podkreślone) regiony. Potencjalnymi Domenami są 1-63: Cytoplazmatyczna; 64-84: Transbłonowa; 85-105: Transbłonowa; 106-120: Cytoplazmatyczna; 121-141: Transbłonowa; 142-188: Zewnątrzkomórkowa; 189-209: Transbłonowa; 210-297: Cytoplazmatyczna; 81-167: wiązanie Disiarczkowe. Figura 11 przedstawia sekwencję nukleotydową ludzkiego CD20. FIG. 12 jest dopasowaniem sekwencji porównującym sekwencje aminokwasowe domeny zmiennej łańcucha lekkiego (V L ) mysiego 2H7 (SEQ ID NO._), humanizowanego 2H7 wariantu v16 (SEQ ID NO._) i ludzkiego łańcucha lekkiego kappa podgrupy I (SEQ ID NO._). CDR dla VL 2H7 i hu2h7.v16 są następujące: CDR1 (SEQ ID NO._), CDR2 (SEQ ID NO._ ) i CDR3 (SEQ ID NO._ ). FIG. 13 jest dopasowaniem sekwencji, które porównuje sekwencje V H mysiego 2H7 (SEQ ID NO. _ ), humanizowanego 2H7 wariantu v16 (SEQ ID NO. _ ) i ludzkiej konsensusowej sekwencji łańcucha ciężkiego podgrupa III (SEQ ID NO. _ ). CDR dla V H 2H7 i hu2h7.v16 są następujące: CDR1 (SEQ ID NO._), CDR2 (SEQ ID NO._ ), i CDR3 (SEQ ID NO._). Na FIG. 12 i Fig. 13, CDR1, CDR2 i CDR3 w każdym łańcuchu są zamknięte w nawiasach, oflankowane przez regiony zrębowe, FR1-FR4, jak wskazano. Gwiazdki w dwóch rzędach wskazują pozycje sekwencji, które różnią się pomiędzy dwoma sekwencjami. Numeracja reszt jest zgodna z Kabat i wsp., Sequences of

7- Immunological Interest. 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991), z insercjami pokazanymi jako a, b, c, d i e. Figura 14 pokazuje ekspresję transgenu ludzkiego CD20 w mysich komórkach B220 + (komórki B) myszy Tg+ hcd20 BAC. Figura 15 przedstawia ekspresję ludzkiego CD20 podczas dojrzewania komórek B u myszy hcd20 BAC Tg. Na Figurach 15-19, czerwona linia pokazuje kontrolę negatywną, barwienie komórek z miotów transgen ujemnych (Tg-) za pomocą mab anty-hcd20. Zielona linia pokazuje barwienie dla ludzkiego CD20 u myszy Tg+. Myszy Tg+ odnosi się do transgenicznych myszy HC20 BAC. Figura 16 przedstawia wykresy FACS ukazujące ekspresję ludzkiego CD20 w komórkach B z różnych etapów dojrzewania/różnicowania komórek (dojrzałe, pre-b i niedojrzałe B, pro-b i progenitorowe B) w szpiku kostnym myszy Tg+. Figura 17 przedstawia wykresy FACS ukazujące ekspresję ludzkiego CD20 w komórkach B śledziony myszy Tg+. Komórki bramkowano na B220+ w celu otrzymania komórek B. IgM i CD21 pozwalają na rozgraniczenie na różne podzestawy komórek B T2/grudkowych, strefy brzeżnej i T1. Figura 18 przedstawia wykresy FACS ukazujące ekspresję ludzkiego CD20 w węzłach chłonnych krezki myszy (LN) Tg+. Figura 19 przedstawia wykresy FACS ukazujące ekspresję ludzkiego CD20 w kępkach Peyera myszy Tg+. Komórki bramkowano dla B220+. Marker CD38 odróżnia dojrzałe od komórek B z ośrodków rozmnażania. Figura 20 przedstawia badania dotyczące wpływu mab anty-hcd20 u myszy Tg+ z ludzkim CD20. Myszom wstrzyknięto 1.0mg [równoważne 50mg/kg] przeciwciała anty-cd20 w dniu 0 (czarna strzałka powyżej linii poziomej) i komórki analizowano w dniach wskazanych przez czerwone strzałki poniżej linii poziomej. Analizy FACS przeprowadzono na krwi obwodowej, śledzionie, węźle limfatycznym, szpiku kostnym i kępkach Peyera. Monitorowano poziomy surowicy mab anty-hcd20. Figura 21 przedstawia wykresy FACS pokazujące deplecję komórek B krwi obwodowej za pomocą mab anty-hcd20. Lewy panel pokazuje kontrolę IgG, tj. zwierzęta leczone niespecyficznym, dopasowanych do izotypu przeciwciałem. Figura 22 przedstawia wykresy FACS pokazujące deplecję dojrzałych komórek B LN obwodowych za pomocą mab anty-hcd20 w prawym panelu. Lewy panel pokazuje kontrolę IgG, tj. zwierzęta leczone niespecyficznym, dopasowanych do izotypu przeciwciałem. CD21 + CD23 + bramkuje dla wszystkich komórek B. Figura 23 przedstawia wykresy FACS pokazujące deplecję komórek B T2 śledziony, ale nie komórek B ze strefy brzeżnej za pomocą mab anty-hcd20. Figura 24 przedstawia wykresy FACS pokazujące deplecję krążących dojrzałych komórek B, ale nie komórek niedojrzałych/pre-b lub pro-b, za pomocą mab anty-

8- hcd20. Czerwony oznacza myszy leczone IgG, natomiast zielony oznacza myszy leczone mab anty-hcd20 z ekspresją hcd20. Myszy leczone IgG (czerwony) zachowały dojrzałe komórki B z ekspresją hcd20, natomiast mab anty-hcd20 powodowało deplecję komórek mających hcd20. Ekspresję ludzkiego CD20 monitorowano do wykrywania zarówno niezwiązanego i Ab-związanego CD20. Figura 25 przedstawia wykresy FACS potwierdzające odporność kępki Peyera komórki B z ośrodków rozmnażania na mab anty-hcd20. Lewy panel przedstawia komórki od myszy leczonych kontrolą IgG. Prawy panel przedstawia komórki od myszy Tg+ leczonych mab anty-cd20. Figura 26 przedstawia wykresy FACS pokazujące deplecję i regenerację komórek B we krwi obwodowej po leczeniu myszy Tg+ mab anty-hcd20. Panele w górnym rzędzie pokazują barwienie komórki z myszy leczonych kontrolnym mab. Myszom podawano przeciwciało w dniu 1. Z czasem, prekursorowe komórki B, które nie eksprymują hcd20, rozwijają się w dojrzałe komórki B CD20+ (patrz barwienie w tygodniu 6 i 14). Figura 27 przedstawia wykresy FACS pokazujące, że odporność komórek B śledziony z ośrodków rozmnażania na krótkoterminowe (pojedyncze wstrzyknięcie) leczenie mab anty-cd20. W dniu 8 po immunizacji czerwonymi krwinkami krwi owcy do wywołania tworzenia ośrodków rozmnażania, jedną grupę myszy leczono mab m2h7 do ludzkiego CD20. Zestaw kontrolnych myszy poddano działaniu przeciwciała kontrolnego izotypu migg2a. Komórki śledziony od tych myszy analizowano w dniu 12. Barwienie PNA (aglutynina orzeszków ziemnych) dla ośrodków rozmnażania. Brak deplecji komórek B z ośrodków rozmnażania wykryto traktowaniem anty-cd20. Figura 28 przedstawia wykresy FACS pokazujące, że komórki B ze strefy brzeżnej (MZ) i B1, które nie uległy deplecji, nadają ochronę na antygeny T-niezależne. Na 3 panelach po prawej, komórki śledziony barwiono dla polisacharydu streptococcusfosfatydylocholina (antygen TI). CD138 jest markerem dla komórek plazmatycznych. Figura 29 pokazuje efekty biologiczne skojarzenia antagonisty BLyS, BR3-Fc i mab anty-cd20, m2h7, leczenia w modelu zwierzęcym opisanym w Przykładzie 4. Analizę FACS przeprowadzono na komórkach B śledziony, krwi, węzłów chłonnych (bramkowanych na CD21 + CD23 + ). Terapia skojarzona wyraźnie wytwarzała efekt synergistyczny w deplecji komórek B, a zwłaszcza komórek B ze strefy brzeżnej, T2 i pęcherzykowych w śledzionie. Figura 30 wykazuje synergistyczne efekty na deplecję komórek B w skojarzeniu z mab anty-hcd20 i BR3-Fc u myszy Tg+ z ludzkim CD20, jak opisano w Przykładzie 4. Myszy leczono kontrolną IgG 2a, BAFFR/BR3-Fc (100 µg/mysz IP dziennie przez 12 dni), mab anty-hcd20 (100 µg/mysz IP w dniu 9) albo skojarzeniem BAFFR/BR3-Fc i mab anty-hcd20 (takie samo dawkowanie jak dla pojedynczych grup terapeutycznych). Splenocyty B220 + izolowano w dniu 13 i wybarwiono dla CD21 i CD23. N=5 myszy/grupę.

9- Figura 31 pokazuje oznaczanie ilościowe deplecji całkowitych komórek B śledziony B220+ (wszystkie podzestawy MZ + FO + T1 + T2), komórek B ze strefy brzeżnej (MZ) i pęcherzykowych komórek B (FO) od myszy Tg+ hcd20 jak opisano w Przykładzie 4 i Fig. 30 z tym wyjątkiem, że myszy leczono pojedynczymi dawkami 0.1 mg kontrolnej IgG 2a, BAFF/BR3-Fc lub mab anti-hcd20. Splenocyty poddano analizie w dniu 4. N=5 myszy/grupę. Figura 32A-C przedstawia sekwencję aminokwasową 17merów wybranych z bibliotek fagowych pod kątem wiązania BLyS z wysokim powinowactwem. SZCZEGÓŁOWY OPIS KORZYSTNYCH PRZYKŁADÓW WYKONANIA [0020] Choć leczenie mab anty-cd20 powoduje deplecję pewnych podzbiorów komórek B, to uprzednio zaobserwowaliśmy, że komórki B ze strefy brzeżnej, komórki B z ośrodków rozmnażania i komórki plazmatyczne zostają zachowane. W przeciwieństwie do tego, blokada sygnałów przeżycia komórek B za pomocą BR3-Fc również powoduje deplecję komórek B lub moduluje liczbę komórek B, ale w innej skali. Uważa się, że BR3 wpływa na przeżycie wszystkich komórek B. Na podstawie opisanych tutaj doświadczeń stwierdzono, że podawanie skojarzenia przeciwciała anty-cd20 z antagonistą BLyS daje zaskakująco synergistyczne wyniki w odniesieniu do deplecji komórek B in vivo. Skojarzenie przeciwciała anty-cd20 i terapii skierowanych przeciwko szlakowi BLyS zapewnia nowy sposób leczenia chorób, w których pośredniczą komórki B, w tym nowotwory złośliwe z komórek B i zaburzenia immunologiczne regulowane komórkami B. Skojarzenie terapii przeciwciała anty- CD20 z antagonistą BLyS może zaoferować skuteczne i mniej toksyczne alternatywy dla istniejących sposobów leczenia niektórych chorób, np. przewlekłej białaczki limfocytowej (CLL) i chłoniaka z małych limfocytów (SLL). [0021] Choroba autoimmunologiczna oznacza tu chorobę niezłośliwą lub zaburzenie wynikające z i skierowane przeciwko (własnym) antygenom i/lub tkankom danej osoby. [0022] W stosowanym tu kontekście, deplecja komórek B odnosi się do zmniejszenia poziomu komórek B u zwierzęcia lub człowieka po leczeniu przeciwciałem lub lekiem, w stosunku do poziomu przed leczeniem. Poziomy komórek B można mierzyć za pomocą znanych testów takich, jak przez uzyskanie kompletnej morfologii krwi, przez analizę FACS znanych markerów barwienia komórek B i za pomocą sposobów takich, jak opisanych w Przykładach Doświadczalnych. Deplecja komórek B może być częściowa lub całkowita. W jednym przykładzie wykonania, deplecja komórek B z ekspresją CD20 wynosi co najmniej 25%. U pacjentów otrzymujących lek powodujący deplecję komórek B, deplecja komórek B jest powodowana ogólnie przez okres, w którym lek jest w obiegu w organizmie pacjenta i czas wymagany do regeneracji komórek B. [0023] Antygen CD20 jest nie-glikozylowanym transbłonowym fosfobiałkiem o masie cząsteczkowej około 35 kd, które znajduje się na powierzchni ponad 90% komórek B krwi obwodowej lub narządów limfoidalnych. CD20 ulega ekspresji w trakcie wczesnego rozwoju komórek pre-b i pozostaje aż do różnicowania w komórki plazmatycznej; nie występuje na ludzkich komórkach macierzystych, limfoidalnych komórkach progenitorowych i normalnych

10- komórkach plazmatycznych. CD20 występuje na prawidłowych komórkach B, a także złośliwych komórkach B. Inne nazwy dla CD20 w literaturze obejmują antygen różnicowania ograniczony do limfocytów B i Bp35. Antygen CD20 jest opisany w, na przykład, Clark i Ledbetter, Adv. Can. Res. 52:81-149 (1989) i Valentine i wsp. J. Biol. Chem. 264(19):11282-11287 (1989). [0024] Przeciwciało wiążące CD20 i przeciwciało anty-cd20 są tu stosowane wymiennie i obejmują wszystkie przeciwciała, które wiążą CD20 z wystarczającym powinowactwem tak, że przeciwciało jest użyteczne jako środek terapeutyczny w celowaniu komórki eksprymującej antygen i znacząco nie reaguje krzyżowo z innymi białkami takimi, jak z białkiem kontroli ujemnej w testach opisanych niżej. Rozważane są również bispecyficzne przeciwciała, w których jedno ramię przeciwciała wiąże CD20. Objęte także tą definicją przeciwciała wiążącego CD20 są funkcjonalne fragmenty powyższych przeciwciał. Przeciwciało wiążące CD20 zwiąże CD20 z Kd < 10nM. W korzystnych przykładach wykonania, wiązanie jest przy Kd < 7.5nM, bardziej korzystnie < 5nM, jeszcze bardziej korzystnie przy między 1-5nM, najbardziej korzystnie, <1nM. [0025] Przykłady przeciwciał, które wiążą antygen CD20 obejmują: C2B8 który nazywa się teraz Rytuksymab ( RITUXAN ) (Patent Nr US 5,736,137); znakowane itrem-[90] mysie przeciwciało 2B8 oznaczone Y2B8 lub Tiuksetan Ibrytumomabu ZEVALIN (Patent Nr US 5,736,137); mysia IgG2a B1, zwana również Tositumomab, (Beckman Coulter) ewentualnie znakowany 131 I z wytworzeniem przeciwciała 131I-B1 (jod I131 tositumomab, BEXXAR ) (Patent Nr US 5,595,721); mysie przeciwciało monoklonalne 1F5 (Press i wsp. Blood 69(2):584-591 (1987) i jego warianty, w tym typu framework patched lub humanizowane 1F5 (WO03/002607, Leung, S.); depozyt ATCC HB-96450); mysie 2H7 i chimeryczne przeciwciało 2H7 (Patent Nr US 5,677,180); humanizowane 2H7; humax-cd20 (Genmab, Dania); AME-133 (Applied Molecular Evolution); przeciwciało A20 lub jego warianty takie, jak chimeryczne lub humanizowane przeciwciało A20 (odpowiednio ca20, ha20) (US 2003/0219433, Immunomedics); i przeciwciała monoklonalne L27, G28-2, 93-1B3, B-C1 lub NU-B2 dostępne z International Leukocyte Typing Workshop (Valentine i wsp., In: Leukocyte Typing III (McMichael, Ed., p. 440, Oxford University Press (1987)). [0026] Określenia rytuksymab lub RITUXAN w niniejszym dokumencie odnoszą się do zmodyfikowanego metodami inżynierii genetycznej chimerycznego mysiego/ludzkiego przeciwciała monoklonalnego skierowanego przeciw antygenowi CD20 i oznaczonego C2B8 w Patencie Nr US 5,736,137, w tym jego fragmentów, które zachowują zdolność do wiązania CD20. [0027] W konkretnym przykładzie wykonania, przeciwciała anty-cd20 wiążą CD20 ludzi i naczelnych. W szczególnych przykłady wykonania, przeciwciała, które wiążą się z CD20, są humanizowane lub chimeryczne. Przeciwciała wiążące CD20 do rytuksymabu (RITUXAN ), m2h7 (mysie 2H7), hu2h7 (humanizowane 2H7) i wszystkich jego wariantów funkcjonalnych, w tym, bez ograniczania, hu2h7.v16 (v oznacza wersję), v31, v73, v75, jak również wariantów z niedoborem fukozy. Sekwencje niektórych wariantów

11- przeciwciał hu2h7 są zamieszczone poniżej, z sekwencjami sekwencją N-końcową pogrubioną, która jest sekwencją liderową usuwaną w dojrzałym polipeptydzie: łańcuch L hu2h7.v16 [232 aa] (SEQ ID NO. 3) łańcuch H hu2h7.v16 [471 aa] (SEQ ID NO. 4) łańcuch H hu2h7.v31 [471 aa] SEQ ID NO. 11: [0028] Łańcuch L v31 jest taki sam, jak powyżej v16, tj. SEQ ID NO. 3. [0029] Wyłącznie dla celów niniejszych, humanizowane 2H7v.16 odnosi się do nienaruszonego przeciwciała albo fragmentu przeciwciała zawierającego sekwencję zmienną łańcucha lekkiego: sekwencję zmienną ciężkiego: [0030] Gdy przeciwciało humanizowane 2H7v.16 jest nienaruszonym przeciwciałem, korzystnie zawiera sekwencję aminokwasową łańcucha lekkiego v16: sekwencję aminokwasową łańcucha ciężkiego v16

12- [0031] Region V wszystkich innych wariantów na podstawie wersji 16 będzie miał sekwencje aminokwasowe v16 z wyjątkiem pozycji substytucji aminokwasowych, które są wskazane w poniższej tabeli. O ile nie zaznaczono inaczej, warianty 2H7 będą miały ten sam łańcuch L jak ten dla v16. Wersja 2H7 Zmiany łańcucha ciężkiego (V H ) Zmiany lekkiego (V L ) łańcucha Zmiany Fc 31 - - S298A, E333A, K334A (SEQ ID NO. 17) 96 D56A, N100A S92A (SEQ ID NO. 18) 114 D56A, N100A M32L, S92A (SEQ ID NO. 19) 115 D56A, N100A M32L, S92A (SEQ ID NO. 21) S298A, E333A, K334A (SEQ IDNO. 20) S298A, E333A, K334A, E356D, M358L (SEQ ID NO. 22) [0032] Wariantem poprzedniego humanizowanego mab 2H7 jest 2H7v.31 mający taką samą sekwencję łańcucha L jak SEQ ID NO: 15 powyżej, z łańcuchem H o sekwencji aminokwasowej: [0033] Mysie przeciwciało anty-ludzkie CD20, m2h7, ma sekwencję VH: [0034] i sekwencję VL: [0035] O ile nie wskazano, ujawnione w niniejszym dokumencie sekwencje z humanizowanego 2H7v.16 i jego wariantów są dla dojrzałego polipeptydu, tj. bez sekwencji liderowej. [0036] Patenty i publikacje patentowe dotyczące CD20 obejmują Patenty US Nry 5,776,456, 5,736,137, 5,843,439, 6,399,061, i 6,682,734, oraz zgłosz. patentowe US nry US 2002/0197255A1, US 2003/0021781A1, US 2003/0082172 A1, US 2003/0095963 A1, US 2003/0147885 A1 (Anderson i wsp.); Patent Nr US 6,455,043B i WO00/09160 (Grillo-Lopez, A.); WO00/27428 (Grillo-Lopez i White); WO00/27433 (Grillo-Lopez i Leonard); WO00/44788 (Braslawsky i wsp.); WO01/10462 (Rastetter, W.); WO01/10461 (Rastetter i White); WO01/10460 (White i Grillo-Lopez); US2001/0018041A1, US2003/0180292A1, WO01/34194 (Hanna i Hariharan); Zgłosz. US nr US2002/0006404 i WO02/04021 (Hanna i

13- Hariharan); Zgłosz. US nr US2002/0012665 A1 i WO01/74388 (Hanna, N.); Zgłosz. US nr US 2002/0058029 A1 (Hanna, N.); Zgłosz. US nr US 2003/0103971 A1 (Hariharan i Hanna); Zgłosz. US nr US2002/0009444A1, i WO01/80884 (Grillo-Lopez, A.); WO01/97858 (White, C.); Zgłosz. US nr US2002/0128488A1 i WO02/34790 (Reff, M.);WO02/060955 (Braslawsky i wsp.);wo2/096948 (Braslawsky i wsp.);wo02/079255 (Reff i Davies); Patent Nr US 6,171,586B1, i WO98/56418 (Lam i wsp.); WO98/58964 (Raju, S.); WO99/22764 (Raju, S.);WO99/51642, Patent Nr US 6,194,551B1, Patent Nr US 6,242,195B1, Patent Nr US 6,528,624B1 i Patent Nr US 6,538,124 (Idusogie i wsp.); WO00/42072 (Presta, L.); WO00/67796 (Curd i wsp.); WO01/03734 (Grillo-Lopez i wsp.); Zgłosz. US nr US 2002/0004587A1 i WO01/77342 (Miller i Presta); Zgłosz. US nr US2002/0197256 (Grewal, I.); Zgłosz. US nr US 2003/0157108 A1 (Presta, L.); Patenty US Nry 6,565,827B1, 6,090,365B1, 6,287,537B1, 6,015,542,5,843,398, i 5,595,721, (Kaminski i wsp.); Patenty US Nry 5,500,362, 5,677,180, 5,721,108, 6,120,767, 6,652,852B1 (Robinson i wsp.); US Pat No. 6,410,391B1 (Raubitschek i wsp.); Patent Nr US 6,224,866B i WO00/20864 (Barbera- Guillem, E.); WO01/13945 (Barbera-Guillem, E.); WO00/67795 (Goldenberg); Zgłosz. Pat. US Nr US 2003/0133930 A1 i WO00/74718 (Goldenberg i Hansen); WO00/76542 (Golay i wsp.);wo01/72333 (Wolin i Rosenblatt); Patent Nr US 6,368,596B 1 (Ghetie i wsp.); Patent Nr US 6,306,393 i Zgłosz. US nr US2002/0041847 A1, (Goldenberg, D.); Zgłosz. US nr US2003/0026801A1 (Weiner i Hartmann); WO02/102312 (Engleman, E.); US Patent Application No. 2003/0068664 (Albitar i wsp.); WO03/002607 (Leung, S.); WO 03/049694, US2002/0009427A1, i US 2003/0185796 A1 (Wolin i wsp.) ; WO03/061694 (Sing i Siegall); US 2003/0219818 A1 (Bohen i wsp.); US 2003/0219433 A1 i WO 03/068821 (Hansen i wsp.); US2003/0219818A1 (Bohen i wsp.); US2002/0136719A1 (Shenoy i wsp.); WO2004/032828 (Wahl i wsp.),. Patrz także, Patent Nr US 5,849,898 i Zgłosz EP nr 330,191 (Seed i wsp.); Patent Nr US 4,861,579 i EP332,865A2 (Meyer i Weiss); USP 4,861,579 (Meyer i wsp.); WO95/03770 (Bhat i wsp.); US 2003/0219433 A1 (Hansen i wsp.). [0037] Przeciwciała CD20 mogą być nagim przeciwciałem lub skoniugowanym ze związkiem cytotoksycznym takim, jak radioizotop lub toksyna. Takie przeciwciała obejmują przeciwciało Zevalin, które jest połączone z radioizotopem, Itrem-90 (IDEC Pharmaceuticals, San Diego, CA) i Bexxar, które jest skoniugowane z I-131 (Corixa, WA). Humanizowane 2H7 warianty obejmują te, które mają substytucje aminokwasowe w FR i warianty o dojrzałym powinowactwie ze zmianami w szczepionych CDR. Podstawione aminokwasy w CDR i FR nie są ograniczone do tych obecnych w przeciwciele dawcy lub akceptora. W innych przykładach wykonania, przeciwciała anty-cd20 według wynalazku ponadto obejmują zmiany w resztach aminokwasowych w regionie Fc, które prowadzą do zwiększonej funkcji efektorowej, w tym zwiększonej funkcji CDC i/lub ADCC i zabijania komórek B (określanego tu także jako deplecja komórek B). W szczególności, zidentyfikowane zostały trzy mutacje dla poprawy aktywności CDC i ADCC: S298A/E333A/K334A (określane tu także jako potrójny mutant lub wariant Ala; numeracja w regionie Fc według numeracji EU; Kabat i wsp., supra), jak zostało to opisane (Idusogie i wsp., supra (2001); Shields i wsp., supra).

14- [0038] Inne przeciwciała anty-cd20 według wynalazku obejmują te o konkretnych zmianach, które poprawiają stabilność. W jednym przykładzie wykonania, chimeryczne przeciwciało anty-cd20 ma mysie regiony V i ludzki region C. Jednym takim chimerycznym przeciwciałem anty-cd20 jest Rituxan (Rituximab ; Genentech, Inc.). Rytuksymab i hu2h7 może pośredniczyć w lizie komórek B zarówno przez cytotoksyczność zależną od dopełniacza (CDC) i zależną od przeciwciał cytotoksyczność komórkową (ADCC). Warianty przeciwciała ze zmienionym regionem Fc sekwencji aminokwasowych oraz zwiększoną lub zmniejszoną zdolnością wiązania Clq są opisane w Patencie Nr US 6,194,551B1 i WO99/51642. Patrz także, Idusogie i wsp. J. Immunol. 164: 4178-4184 (2000). [0039] WO00/42072 (Presta) opisuje warianty polipeptydowe ze zwiększonym lub obniżonym wiązaniem do FcR: Patrz także, Shields i wsp. J. Biol. Chem. 9(2): 6591-6604 (2001). [0040] Miejsce N-glikozylacji w IgG jest przy Asn297 w domenie CH2. Objęte tu są wiążące CD20 humanizowane przeciwciała o regionie afc, przy czym około 80-100% (a korzystnie około 90-99%) przeciwciała w kompozycji składa się z dojrzałej struktury węglowodanowej rdzenia, która nie ma fukozy przyłączonej do regionu Fc glikoproteiny. Przeciwciała te wykazują poprawę w wiązaniu do FcγRIIIA(F158), który nie jest tak skuteczny w oddziaływaniu z ludzką IgG jak FcγRIIIA (V158). [0041] Termin przeciwciało jest używany w najszerszym znaczeniu i w szczególności obejmuje, na przykład, przeciwciała monoklonalne, przeciwciała poliklonalne, przeciwciała o poliepitopowej specyficzności, przeciwciała jednołańcuchowe i ich fragmenty przeciwciał. Zgodnie z niektórymi przykładami wykonania, polipeptyd jest w fuzji ze zrębem przeciwciała, na przykład, regionem zmiennym CDR lub w taki sposób, że przeciwciało może wiązać i hamować wiązanie się BLyS do BR3 lub sygnalizację BLyS. Przeciwciała zawierające polipeptyd według niniejszego wynalazku mogą być chimeryczne, humanizowane lub ludzkie. Przeciwciała zawierające polipeptyd mogą być fragmentem przeciwciała. Takie przeciwciała i sposoby ich wytwarzania są opisane bardziej szczegółowo poniżej. Alternatywnie, przeciwciała według niniejszego wynalazku można wytwarzać przez immunizację zwierzęcia polipeptydem. W związku z tym rozważane jest tu przeciwciało skierowane przeciwko ujawnionemu polipeptydowi. [0042] Termin przeciwciało monoklonalne w znaczeniu stosowanym w niniejszym dokumencie odnosi się do przeciwciała otrzymanego z populacji zasadniczo homogennych przeciwciał, to znaczy indywidualne przeciwciała stanowiące populację są identyczne, z wyjątkiem możliwych naturalnie występujących mutacji, które mogą występować w niewielkich ilościach. Przeciwciała monoklonalne są wysoce specyficzne, skierowane przeciw pojedynczym miejscom antygenowym. Ponadto, w przeciwieństwie do konwencjonalnych (poliklonalnych) preparatów przeciwciał, które zazwyczaj obejmują różne przeciwciała skierowane przeciwko różnym determinantom (epitopom), każde przeciwciało monoklonalne jest skierowane przeciwko pojedynczej determinancie na antygenie. W uzupełnieniu do ich specyficzności, przeciwciała monoklonalne są korzystne, ponieważ są syntetyzowane przez hodowlę hybrydom, niezanieczyszczone innymi immunoglobulinami.

15- Modyfikator monoklonalne wskazuje na charakter przeciwciała, jako uzyskanego z zasadniczo homogenicznej populacji przeciwciał i nie należy go interpretować jako wymogu produkcji przeciwciała jakimkolwiek określonym sposobem. Na przykład, przeciwciała monoklonalne do stosowania zgodnie z niniejszym wynalazkiem mogą być wykonane za pomocą metody hybrydoma, opisanej po raz pierwszy przez Kohler i wsp., Nature, 256:495 (1975), lub mogą być wytworzone metodami rekombinacji DNA (patrz, np. Patent US Nr 4,816,567). Przeciwciała monoklonalne mogą być także izolowane z bibliotek przeciwciał fagowych z użyciem technik opisanych w przykładowo Clackson i wsp., Nature, 352:624-628 (1991) i Marks i wsp., J. Mol. Biol., 222:581-597 (1991). [0043] W niniejszym opisie, monoklonalne przeciwciała obejmują szczególnie chimeryczne przeciwciała (immunoglobuliny), w których część łańcucha ciężkiego i/lub lekkiego jest identyczna z lub homologiczna do odpowiadających im sekwencji w przeciwciałach pochodzących od określonego gatunku lub należących do określonej klasy lub podklasy przeciwciał, natomiast pozostała część łańcucha(-ów) jest identyczna z lub homologiczna do odpowiadających im sekwencji w przeciwciałach pochodzących od innego gatunku lub należących do innej klasy lub podklasy przeciwciał, jak również fragmenty takich przeciwciał, o ile wykazują one pożądaną aktywność biologiczną (Patent US Nr 4,816,567; Morrison i wsp., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:6851-6855 (1984)). Sposoby wytwarzania chimerycznych przeciwciał są znane w stanie techniki. [0044] Humanizowane postacie przeciwciał gatunków innych niż ludzkie (na przykład mysich) to chimeryczne immunoglobuliny, łańcuchy immunoglobulin lub ich fragmenty (jak Fv, Fab, Fab', F(ab')2 lub inne wiążące antygen subsekwencje przeciwciał), które zawierają minimalną sekwencję pochodzącą z immunoglobuliny innej niż ludzkiej. W większości przypadków, humanizowane przeciwciała są ludzkimi immunoglobulinami (przeciwciało biorcy), w których reszty z regionu determinującego komplementarność (CDR) biorcy są zastąpione przez reszty z CDR gatunku innego niż człowiek (przeciwciało dawcy) takiego, jak mysz, szczur lub królik, mających pożądaną specyficzność, powinowactwo i pojemność. W niektórych przypadkach, reszty regionu zrębowego (FR) Fv ludzkiej immunoglobuliny są zastąpione przez odpowiadające reszty niepochodzące od człowieka. Co więcej, humanizowane przeciwciała mogą zawierać reszty, które nie występują ani w przeciwciele biorcy ani w importowanych CDR lub sekwencjach zrębowych. Zmiany te mają na celu dalsze udoskonalenia i zmaksymalizowania wydajności przeciwciała. Na ogół, humanizowane przeciwciało będzie zawierać zasadniczo wszystkie z co najmniej jednej, a zazwyczaj dwóch domen zmiennych, w których wszystkie lub zasadniczo wszystkie hiperzmienne pętle odpowiadają tym z nie-ludzkiej immunoglobuliny oraz wszystkie lub zasadniczo wszystkie regiony FR są tymi o sekwencji immunoglobuliny ludzkiej, chociaż regiony FR mogą zawierać jedną lub większą liczbę substytucji aminokwasowych, które poprawiają powinowactwo wiązania. Liczba tych substytucji aminokwasowych w FR wynosi zwykle nie więcej niż 6 w łańcuchu H, i w łańcuchu L, nie więcej niż 3. Humanizowane przeciwciało optymalnie będzie również zawierać co najmniej część regionu stałego immunoglobuliny (Fc), zazwyczaj tego z ludzkiej immunoglobuliny. W celu uzyskania dalszych informacji, patrz Jones i wsp., Nature, 321:522-525 (1986); Reichmann i wsp.,

16- Nature, 332:323-329 (1988); i Presta, Curr. Op. Struct. Biol., 2:593-596 (1992). Humanizowane przeciwciała obejmują przeciwciało PREMATIZED, przy czym region wiążący antygen przeciwciała pochodzi z przeciwciała wytworzonego przez, np. immunizację makaków antygenem. Sposoby wytwarzania humanizowanych przeciwciał są znane w tej dziedzinie. [0045] Ludzkie przeciwciała mogą być także wytwarzane przy użyciu różnych technik znanych w dziedzinie, w tym bibliotek fagowych. Hoogenboom i Winter, J. Mol. Biol., 227:381 (1991); Marks i wsp., J. Mol. Biol., 222:581 (1991). Techniki Cole i wsp. i Boerner i wsp. są także dostępne dla przygotowania przeciwciał monoklonalnych. Cole i wsp., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, p. 77 (1985); Boerner i wsp., J. Immunol., 147(1):86-95 (1991). [0046] Funkcjonalne fragmenty przeciwciał wiążących CD20 według wynalazku są to fragmenty, które zachowują wiązanie z CD20 z zasadniczo takim samym powinowactwem jak nienaruszona pełna cząsteczka łańcuchowa, z której one pochodzą i są w stanie powodować deplecję komórek B, co mierzono in vitro lub in vivo, jak to opisano w niniejszym dokumencie. Funkcje efektorowe przeciwciała odnoszą się do tych aktywności biologicznych, które można przypisać regionowi Fc (region Fc o sekwencji natywnej lub region Fc o wariantowej sekwencji aminokwasowej) przeciwciała i różnią się w zależności od izotypu przeciwciała. Przykłady funkcji efektorowych przeciwciał obejmują: wiązanie Clq oraz cytotoksyczność zależną od dopełniacza; wiązanie receptora Fc; zależną od przeciwciał cytotoksyczność komórkową (ADCC); fagocytozę; regulację w dół receptorów na powierzchni komórek (np. receptor komórek B); i aktywację komórek B. [0047] Cytotoksyczność komórkowa zależna od przeciwciał lub ADCC odnosi się do postaci cytotoksyczności, w której wydzielane Ig związane z receptorami Fc (FcR), obecnych na niektórych komórkach cytotoksycznych (np naturalnych zabójców (NK), neutrofili i makrofagów) pozwalają tym cytotoksycznym komórkom efektorowym na specyficzne wiązanie się do komórki docelowej niosącej antygen, a następnie zabijanie komórki docelowej za pomocą cytotoksyn. Przeciwciała uzbrajają komórki cytotoksyczne i są absolutnie konieczne dla takiego zabijania. Komórki pierwotne pośredniczące w ADCC, komórki NK, eksprymują tylko FcγRIII, podczas gdy monocyty eksprymują FcγRI, FcγRII i FcγRIII. Ekspresja FcR na komórkach hematopoetycznych jest podsumowana w Tabeli 3 na stronie 464 w Ravetch i Kinet, Annu. Rev. Immunol 9:457-92 (1991). W celu oszacowania aktywności ADCC cząsteczki będącej przedmiotem zainteresowania, można przeprowadzić oznaczenie ADCC in vitro takie, jak opisane w Patencie Nr US 5,500,362 lub 5,821,337. Użyteczne komórki efektorowe do takich oznaczeń obejmują komórki jednojądrzaste krwi obwodowej (PBMC) i komórki naturalnych zabójców (NK). Alternatywnie, lub dodatkowo, aktywność ADCC cząsteczki będącej przedmiotem zainteresowania można oceniać in vivo, na przykład w modelu zwierzęcym takim, jak ujawnionym w Clynes i wsp. PNAS (USA) 95:652-656 (1998).

17- [0048] Cytotoksyczność zależna od dopełniacza lub CDC odnosi się do lizy komórki docelowej w obecności dopełniacza. Aktywacja klasycznego szlaku dopełniacza jest inicjowana poprzez związanie pierwszego komponentu układu dopełniacza (Clq) do przeciwciał (w stosownych przypadkach podklasy), które są związane do swojego pokrewnego antygenu. W celu oceny aktywacji dopełniacza przeprowadzić test CDC, np. jak opisany w Gazzano-Santoro i wsp., J. Immunol. Methods 202:163 (1996). [0049] Wyizolowane przeciwciało to takie, które zostało zidentyfikowane i oddzielone i/lub odzyskane z komponentu jego naturalnego środowiska. Zanieczyszczającymi składnikami jego naturalnego otoczenia są materiały, które zakłócałyby prowadzenie zastosowań diagnostycznych lub terapeutycznych dla przeciwciała, i mogą obejmować enzymy, hormony i inne białkowe lub niebiałkowe substancje rozpuszczone. W korzystnych przykładach wykonania, przeciwciało będzie oczyszczane (1) do ponad 95% wagowych przeciwciała, jak określono metodą Lowry'ego, a najbardziej korzystnie więcej niż 99% wagowych, (2) do stopnia wystarczającego do otrzymania co najmniej 15 reszt N-końca lub wewnętrznej sekwencji aminokwasowej z wykorzystaniem sekwencjonowania spinning cup, lub (3) do homogenności przez SDS-PAGE w redukujących lub nieredukujących warunkach przy użyciu Coomassie blue lub, korzystnie, barwienia srebrem. Wyizolowane przeciwciało obejmuje przeciwciało in situ w komórkach rekombinowanych, ponieważ co najmniej jeden składnik naturalnego otoczenia przeciwciała nie będzie obecny. Zazwyczaj, jednakże, wyizolowane przeciwciało będzie przygotowane przez przynajmniej jeden etap oczyszczania. [0050] Określenia BLyS, polipeptyd BLyS, TALL-1 lub polipeptyd TALL-1, BAFF stosowane w niniejszym dokumencie obejmują polipeptydy BLyS o natywnej sekwencji i warianty BLyS. BLyS to nazwa nadana tym polipeptydom, które są kodowane przez dowolną z sekwencji aminokwasowych pokazanych poniżej: Sekwencja ludzkiego BLyS (Fig. 3; SEQ ID NO._) Sekwencja mysiego BLyS (SEQ ID NO._) i na Figurze 3 i homologi i ich fragmenty i warianty, która mają aktywność biologiczną BLyS o natywnej sekwencje. Aktywność biologiczną BLyS można wybrać z grupy składającej się z promowania przeżywalności komórek B, promowania dojrzewania komórek B i wiązania się z BR3. Warianty BLyS będą korzystnie miały co najmniej 80% lub dowolną liczbę całkowitą rzędu do 100% w tym, bardziej korzystnie, co najmniej 90%, i jeszcze bardziej korzystnie, co najmniej 95% identyczności sekwencji aminokwasowej z natywną sekwencją polipeptydową

18- BLyS. Polipeptyd BLyS o natywnej sekwencji obejmuje polipeptyd mający taką samą sekwencję aminokwasową, jak polipeptyd odpowiadający BLyS pochodzący z natury. Na przykład, BLyS, występuje w postaci rozpuszczalnej, po odcięciu od powierzchni komórki przez proteazę typu furyny. Takie polipeptydy BLYS o natywnej sekwencji można wyizolować ze źródła naturalnego lub można wytworzyć przez metodami rekombinacji i/lub syntezy. Określenie polipeptyd BLyS o natywnej sekwencji specyficznie obejmuje naturalnie występujące postacie skrócone lub wydzielane (np. sekwencja domeny zewnątrzkomórkowej), naturalnie występujące postacie wariantów (np. alternatywnie składane postacie) i naturalnie występujące warianty alleliczne polipeptydu. Określenie BLyS obejmuje te polipeptydy opisane w Shu i wsp., J. Leukocyte Biol., 65:680 (1999); Nr Dostępowy GenBank AF136293; WO98/18921 opublikowany 7 maja, 1998; EP 869,180 opublikowany 7 października, 1998; WO98/27114 opublikowany 25 czerwca, 1998; WO99/12964 opublikowany 18 marca, 1999; WO99/33980 opublikowany 8 lipca,1999; Moore i wsp., Science, 285:260-263 (1999); Schneider i wsp., J. Exp. Med., 189:1747-1756 (1999); Mukhopadhyay i wsp., J. Biol. Chem., 274:15978-15981 (1999). [0051] Określenie antagonista BLyS, w stosowanym tu kontekście, stosuje się w najszerszym znaczeniu i obejmuje każdą cząsteczkę, która (1) wiąże polipeptyd BLyS o natywnej sekwencji lub wiąże polipeptyd BR3 o natywnej sekwencji aby częściowo lub całkowicie blokować oddziaływanie BR3 z polipeptydem BLyS i (2) częściowo lub całkowicie blokuje, hamuje lub neutralizuje sygnalizację BLyS o natywnej sekwencji. Sygnalizacja polipeptydem BLyS o natywnej sekwencji promuje między innymi, przetrwanie komórek B i dojrzewanie komórek B. Hamowanie, blokowanie lub neutralizacja sygnalizacji BLyS skutkuje, wśród innych rzeczy, zmniejszeniem liczby komórek B. Antagonista BLyS według tego wynalazku będzie częściowo lub całkowicie, blokował, hamował lub neutralizował jedną lub więcej aktywności biologicznych polipeptydu BLyS, in vitro lub in vivo. W jednym przykładzie wykonania, biologicznie aktywny BLyS nasila dowolne jedno lub kombinację następujących zdarzeń in vitro lub in vivo: zwiększone przeżycie komórek B, zwiększony poziom IgG i/lub IgM, zwiększona liczba komórek plazmatycznych i przetwarzanie NF-κb2/100 do p52 NF-κb w śledzionowych komórkach B (np. Batten, M i wsp., (2000) J. Exp. Med. 192:1453-1465; Moore, i wsp., (1999) Science 285:260-263; Kayagaki, i wsp., (2002) 10:515-524). Liczne testy użyteczne do badania antagonistów BLyS zostały tutaj opisane. [0052] Jak wspomniano powyżej, antagonista BLyS może działać w sposób bezpośredni lub pośredni, częściowo lub całkowicie, blokując, hamując lub neutralizując sygnalizację BLyS, in vitro lub in vivo. Na przykład, antagonista BLyS może bezpośrednio wiązać BLyS. Na przykład, rozważa się przeciwciała anty-blys, które wiążą się w obrębie regionu ludzkich BLyS zawierającym reszty 162-275 i/lub sąsiadującą resztę reszty wybranej z grupy składającej się z 162, 163, 206, 211, 231, 233, 264 i 265 ludzkiego BLyS tak, że przeciwciało sterycznie utrudnia BLyS wiązanie do BR3. W innym przykładzie, bezpośredni element wiążący jest polipeptydem zawierającym zewnątrzkomórkową domenę receptora BLyS taką, jak TACI, BR3 i BCMA. W innym przykładzie, antagoniści BLyS obejmują polipeptydy o sekwencji takiej, jak o Wzorze I, Wzorze II, Wzorze III, ECFDLLVRAWVPCSVLK (SEQ