(12) TŁUMACZENIE PATENTU EUROPEJSKIEGO (19) PL (11) PL/EP (96) Data i numer zgłoszenia patentu europejskiego:

Transkrypt

1 RZECZPOSPOLITA POLSKA (12) TŁUMACZENIE PATENTU EUROPEJSKIEGO (19) PL (11) PL/EP (96) Data i numer zgłoszenia patentu europejskiego: (13) (51) T3 Int.Cl. C07K 16/28 ( ) A61K 39/00 ( ) Urząd Patentowy Rzeczypospolitej Polskiej (97) O udzieleniu patentu europejskiego ogłoszono: Europejski Biuletyn Patentowy 2016/15 EP B1 (54) Tytuł wynalazku: PRZECIWCIAŁA ANTY-IFNAR1 O ZMNIEJSZONYM POWINOWACTWIE DO LIGANDA FC (30) Pierwszeństwo: US 6962 P US P US P (43) Zgłoszenie ogłoszono: w Europejskim Biuletynie Patentowym nr 2010/46 (45) O złożeniu tłumaczenia patentu ogłoszono: Wiadomości Urzędu Patentowego 2016/11 (73) Uprawniony z patentu: MedImmune, LLC, Gaithersburg, US (72) Twórca(y) wynalazku: PL/EP T3 ANTHONY COYLE, Washington, US PETER KIENER, Potomac, US HERREN WU, Boyds, US RICARDO CIBOTTI, Bethesda, US (74) Pełnomocnik: rzecz. pat. Piotr Godlewski JWP RZECZNICY PATENTOWI DOROTA RZĄŻEWSKA SP. J. ul. Żelazna 28/30 Sienna Center Warszawa Uwaga: W ciągu dziewięciu miesięcy od publikacji informacji o udzieleniu patentu europejskiego, każda osoba może wnieść do Europejskiego Urzędu Patentowego sprzeciw dotyczący udzielonego patentu europejskiego. Sprzeciw wnosi się w formie uzasadnionego na piśmie oświadczenia. Uważa się go za wniesiony dopiero z chwilą wniesienia opłaty za sprzeciw (Art. 99 (1) Konwencji o udzielaniu patentów europejskich).

2 25611/16/ZWA/PG EP PRZECIWCIAŁA ANTY-IFNAR1 O ZMNIEJSZONYM POWINOWACTWIE DO LIGANDA FC Opis 1. DZIEDZINA WYNALAZKU [0001] Wynalazek dotyczy wyizolowanych przeciwciał i kompozycji swoistych dla receptora interferonu alfa 1 (IFNAR1) o zmniejszonym powinowactwie do ligandów Fc. Wynalazek obejmuje również kwasy nukleinowe kodujące takie przeciwciała, komplementarne kwasy nukleinowe, wektory, komórki gospodarza i sposoby ich wytwarzania i ich zastosowanie, włączając kompozycje terapeutyczne, formulacje, podawanie i urządzenia. 2. TŁO WYNALAZKU 2.1 Interferony: [0002] Interferony typu I (IFN) (IFNα, IFNβ, IFNω, IFNτ) to rodzina strukturalnie spokrewnionych cytokin o działaniu przeciwwirusowym, przeciwnowotworowym i immunomodulującym (Hardy et al. (2001) Blood 97:473; Cutrone i Langer (2001) J. Biol. Chem. 276:17140). Lokus ludzkiego IFN obejmuje dwie podrodziny. Pierwsza podrodzina składa się z 14 nieallelicznych genów i 4 pseudogenów mających co najmniej 80% homologię. Druga podrodzina, αii lub omega (ω), zawiera 5 pseudogenów i 1 gen funkcyjny, które wykazują 70% homologię z genami IFNα (Weissmann and Weber (1986) Prog. Nucl. Acid Res. Mol. Biol., 33: ). Podtypy IFNα mają różne swoiste aktywności, ale posiadają ten sam biologiczny zakres (Streuli et al. (1981) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:2848) i mają ten sam receptor komórkowy (Agnet M. et al. in "Interferon 5" Ed. I. Gresser p. 1-22, Academic Press, London 1983). Podtypy interferonu alfa identyfikuje się za pomocą następującej nomenklatury: IFNα 1, 2a, 2b, 4, 4b, 5, 6, 7, 8, 10, 14, 16, 17 i 21. [0003] Interferon β (IFNβ) jest kodowany przez pojedynczy gen, który ma około 50% homologię z genami IFNα. [0004] Interferon γ, który jest wytwarzany przez aktywowane limfocyty, nie posiada żadnej homologii z interferonami alfa/beta i nie reaguje z ich receptorem Receptory interferonu: [0005] Wszystkie ludzkie interferony typu I wiążą się z receptorem powierzchni komórkowej (receptor IFN alfa IFNAR) składającym się z dwóch białek transbłonowych IFNAR1 i IFNAR2 (Uze et al. (1990) Cell 60:225; Novick et al. (1994) Cell 77:391). IFNAR1 jest niezbędny dla wiązania z wysokim powinowactwem i różnicowania swoistości kompleksu IFNAR (Cutrone et al. (2001) J. Bio Chem 276(20): ). Chociaż nie zidentyfikowano różnic funkcjonalnych dla poszczególnych podtypów IFN typu I, uważa się, że każdy z nich może wykazywać inne oddziaływania z komponentami receptora IFNAR prowadząc do potencjalnie różnych efektów sygnałowania (Cook et al. (1996) J. Biol. Chem. 271:13448). Konkretnie, badania wykorzystujące zmutowane formy IFNAR1 i IFNAR2 sugerują, że interferony alfa i

3 -2- beta różnie przekazują sygnał przez receptor różnie oddziałując z odpowiednimi łańcuchami (Lewerenz et al. (1998) J. Mol. Biol. 282:585) Funkcja interferonów: [0006] Wczesne badania nad funkcjonalnością IFN typu I były skoncentrowane na wrodzonej obronie przed infekcjami wirusowymi (Haller et al. (1981) J. Exp. Med. 154:199; Lindenmann et al. (1981) Methods Enzymol. 78:181). Jednakże ostatnie badania pokazują IFN typu I jako silnie immunoregulatorowe cytokiny w nabytej odpowiedzi immunologicznej. Konkretnie, wykazano, że IFN typu I ułatwiają różnicowanie naiwnych komórek T w szlaku Th1 (Brinkmann et al. (1993) J. Exp. Med. 178:1655) w celu zwiększenia wytwarzania przeciwciał i wzmocnienia aktywności funkcjonalnej i przeżywalności komórek T pamięci (Santini et al. (2000) J. Exp. Med. 191:1777; Tough et al. (1996) Science 272:1947). [0007] Ostatnie prace licznych grup wskazują, że IFNα może wzmagać/pobudzać dojrzewanie lub aktywację komórek dendrytycznych (DC Santini et al. (2000) J. Exp. Med. 191:1777; Luft et al. (1998) J. Immunol. 161:1947; Luft et al. (2002) Int. Immunol. 14:367; Radvanyi et al. (1999) Scand. J. Immunol. 50:499). Ponadto, przy licznych chorobach autoimmunologicznych opisano zwiększoną ekspresję interferonów typu I (Foulis et al. (1987) Lancet 2:1423; Hooks et al. (1982) Arthritis Rheum. 25:396; Hertzog et al. (1988) Clin. Immunol. Immunopathol. 48:192; Hopkins and Meager (1988) Clin. Exp. Immunol. 73:88; Arvin and Miller (1984) Arthritis Rheum. 27:582). Najlepiej przebadanymi tego przykładami są cukrzyca insulinozależna (IDDM) (Foulis (1987)) i toczeń rumieniowaty układowy (SLE) (Hooks (1982)), które są związane z podwyższonymi poziomami IFNα, i reumatoidalne zapalenie stawów (RA) (Hertzog (1988), Hopkins and Meager (1988), Arvin and Miller (1984, w którym ważniejszą rolę może odgrywać IFNβ. [0008] Ponadto, donoszono, że podawanie interferonu α zaostrza podstawową chorobę u pacjentów z łuszczycą i stwardnieniem rozsianym i wywołuje zespół podobny do SLE u pacjentów bez wcześniejszej historii choroby autoimmunologicznej. Wykazano również, że interferon α indukuje kłębuszkowe zapalenie nerek u normalnych myszy i przyspiesza pojawienie się spontanicznej choroby autoimmunologicznej u myszy NZB/W. Ponadto wykazano, że w pewnych przypadkach terapia IFNα prowadzi do niepożądanych skutków ubocznych takich jak gorączka i zaburzenia neurologiczne. W związku z tym istnieją patologiczne sytuacje, w których hamowanie aktywności IFN typu I może mieć korzystny wpływ na pacjenta i istnieje zapotrzebowanie na środki skuteczne w hamowaniu aktywności IFN typu I Funkcje efektorowe przeciwciał: [0009] Region Fc przeciwciała oddziałuje z wieloma ligandami (określanymi tu również jako "ligandy Fc", które obejmują, nieograniczająco, środki, które swoiście wiążą się z regionem Fc przeciwciał, takie jak receptory Fc i C1q), włączając receptory Fc i C1q, nadając szereg istotnych funkcjonalnych zdolności określanych jako funkcje efektorowe. Receptory Fc pośredniczą w komunikacji między przeciwciałami i komórkową częścią układu immunologicznego (Raghavan et al., 1996, Annu Rev Cell Dev Biol 12: ; Ravetch et

4 -3- al., 2001, Annu Rev Immunol 19: ). U ludzi ta rodzina białek obejmuje FcγRI (CD64),włączając izoformy FcγRIA, FcγRIB i FcγRIC; FcγRII (CD32), włączając izoformy FcγRIIA, FcγRIIB i FcγRIIC; i FcγRIII (CD16), włączając izoformy FcγRIIIA i FcγRIIB (Jefferis et al., 2002, Immunol Lett 82:57-65). Receptory te zazwyczaj mają pozakomórkową domenę wiążącą, która pośredniczy w wiązaniu z Fc, region obejmujący błonę i wewnątrzkomórkową domenę, która może pośredniczyć w pewnych zdarzeniach sygnałowania w komórce. Receptory te są eksprymowane w różnych komórkach układu immunologicznego włączając monocyty, makrofagi, neutrofile, komórki dendrytyczne, eozynofile, komórki tuczne, płytki krwi, komórki B, duże ziarniste limfocyty, komórki Langerhansa, naturalne komórki cytotoksyczne (NK) i komórki T. Powstanie kompleksu Fc/FcγR rekrutuje te komórki efektorowe do miejsc gdzie antygen został związany skutkując zwykle zdarzeniami sygnałowania wewnątrz komórki i istotnymi kolejnymi odpowiedziami immunologicznymi takimi jak uwalnianie mediatorów zapalnych, aktywacja komórek B, endocytoza, fagocytoza i reakcja cytotoksyczna. Zdolność do pośredniczenia w cytotoksycznych i fagocytarnych funkcjach efektorowych jest potencjalnym mechanizmem za pomocą którego przeciwciała niszczą komórki docelowe. Reakcję komórkową, w której nieswoiste komórki cytotoksyczne, które eksprymują FcγR, rozpoznają związane przeciwciało na komórce docelowej, a następnie powodują lizę komórki docelowej, określa się jako cytotoksyczność komórkową zależną od przeciwciał (ADCC) (Raghavan et al., 1996, Annu Rev Cell Dev Biol 12: ; Ghetie et al., 2000, Annu Rev Immunol 18: ; Ravetch et al., 2001, Annu Rev Immunol 19: ). Reakcję komórkową, w której nieswoiste komórki cytotoksyczne, które eksprymują FcγR, rozpoznają związane przeciwciało na komórce docelowej, a następnie powodują fagocytozę komórki docelowej, określa się jako fagocytozę komórek zależną od przeciwciał (ADCP). Ponadto, pokrywające się miejsce w regionie Fc cząsteczki kontroluje również aktywację funkcji cytotoksyczności niezależnej od komórek, mediowanej dopełniaczem, znanej także jako cytotoksyczność zależna od dopełniacza (CDC) Różne typy ludzkiego FcγR: [0010] Ludzkie FcγR można podzielić na trzy odrębne klasy: FcγRI (CD64), FcγRII (CD32) i FcγRIII (CD16). FcγRI jest receptorem o wysokim powinowactwie (Ka: M -1 ) i wiąże zarówno kompleksy immunologiczne jak i monomeryczne cząsteczki IgG, podczas gdy receptory Fc FcγRII i FcγRIII wykazują mniejsze powinowactwo (odpowiednio <10-7 M -1 i 2-3x10 7 ) (Gessner J.E. et al., 1998, Ann. Hematology 76:231-48). Sygnałowanie przez FcγR, dla wszystkich receptorów transbłonowych, zachodzi za pośrednictwem opartego na tyrozynie motywu aktywującego immunoreceptora (ITAM) lub opartego na tyrozynie motywu hamującego immunoreceptora (ITIM) (Presta, 2006, Adv. Drug Deliv. Rev 58: ). [0011] 72 kda zewnątrzkomórkowa glikoproteina FcγRI jest eksprymowana głównie na komórkach mieloidalnych, takich jak monocyty, komórki progenitorowe makrofagów CD4+, i może pobudzać odpowiedzi typu ADCC, endocytoza i fagocytoza (Siberil et al., 2006, J. Immunol. Lett. 106: ). [0012] Grupa receptorów FcγRII o 40 kda (izoformy A, B i C) prezentuje domeny zewnątrzkomórkowe, ale nie ma domen aktywnego przekazywania sygnału. Receptory te

5 -4- rozprzestrzeniają sygnały za pomocą fosforylacji domeny z ogonem cytoplazmatycznym (Amigorena S. et al., 1992 Science. 256: ). FcγRIIA jest eksprymowany głównie na monocytach, makrofagach, neutrofilach i płytkach krwi, podczas gdy receptor FcγRIIC został zidentyfikowany tylko na komórkach NK. Wykazano, że te dwa receptory inicjują ADCC, endocytozę, fagocytozę i uwalnianie mediatorów zapalnych (Cassel et al., Mol Immunol 30:451-60). Natomiast receptory FcγRIIB (typy B1 i B2) są wyrażane na komórkach B, komórkach tucznych, bazofilach, monocytach, makrofagach i komórkach dendrytycznych, i wykazano, że regulują w dół (obniżenie) odpowiedź immunologiczną zainicjowaną przez izoformy A i C. [0013] 50 kda FcγRIIIA jest eksprymowany na komórkach NK, monocytach, makrofagach i podgrupie limfocytów T, gdzie aktywuje ADCC, fagocytozę, endocytozę i uwalnianie cytokin (Gessner et al.). Izoforma FcγRIIIB to powierzchniowe białko zakotwiczone za pomocą glikofosfatydyloinozytolu (GPI) zaangażowane w degranulację i wytwarzanie produktów pośrednich reaktywnego tlenu (Salmon J.E. et al., 1995, J. Clin. Inves. 95: ). [0014] Cząsteczki IgG również wykazują różnicującą swoistość izotypu FcγR. Cząsteczki IgG3 wiążą się silnie do wszystkich izoform FcγR. IgG1, najbardziej powszechna izoforma we krwi, wiąże się do wszystkich FcγR, chociaż z mniejszym powinowactwem do izoform FcγRIIA/B. IgG4 jest pośrednim elementem wiążącym się do FcγRI i słabo wiążącym się do FcγRIIB. Wreszcie, IgG2 jedynie lekko wiąże się do jednej postaci allelicznej FcγRIIA (FcγRIIA-H131) (Siberil et al., 2006, J. Immunol. Lett. 106: ) Dopełniacz [0015] Zapalna kaskada dopełniacza jest częścią wrodzonej odpowiedzi immunologicznej i ma zasadnicze znaczenie dla zdolności osobnika do zapobiegania infekcji. Innym ważnym ligandem Fc jest białko dopełniacza C1q. Związanie Fc z C1q pośredniczy w procesie zwanym cytotoksycznością zależną od układu dopełniacza (CDC) (przegląd w Ward et al., 1995, Ther Immunol 2:77-94). C1q jest zdolne do wiązania sześciu przeciwciał, aczkolwiek wiązanie się z dwoma IgG jest wystarczające do aktywacji kaskady dopełniacza. C1q tworzy kompleks z proteazami serynowymi C1r ic1s tworząc kompleks C1 szlaku dopełniacza Regiony i reszty aminokwasowe IgG zaangażowane w wiązanie FcγR [0016] Intensywnie badano mapowanie miejsc wiązania ludzkiej IgG z różnymi FcγR. Badania te, oparte na genetycznie zmienionych cząsteczkach IgG, zidentyfikowały krótki ciągły odcinek reszt aminokwasowych ( ) N-końcowej części domeny CH2 jako bezpośrednio zaangażowany w wiązanie ze wszystkimi FcγR. Ponadto, reszty 268, 297, 327 i 329 mogą mieć wpływ na wiązanie się z podgrupą FcγR. Ponadto, liczne reszty zlokalizowane w domenach CH2 i CH3 przyczyniają się do wiązania FcγR (Canfield SM. et al., 1991, J. Exp. Med. 173: ; Chappel MS. et al., 1991, Proc Nat Acad Sci USA 888: ; Gergely J. et al., 1990 FASEB J 4: ). 2.2 Toksyczność związana z terapią przeciwciałem

6 -5- [0017] W wielu przypadkach wiązanie i stymulacja funkcji efektorowych mediowanych przez region Fc immunoglobuliny jest bardzo korzystna, jednak w niektórych przypadkach korzystniejsze może okazać się zmniejszenie lub wyeliminowanie funkcji efektorowych. Jest to szczególnie słuszne w odniesieniu do tych przeciwciał przeznaczonych do dostarczania leków (np. toksyn i izotopów) do komórki docelowej, gdzie funkcje efektorowe mediowane Fc/FcγR sprowadzają zdrowe komórki immunologiczne w pobliże śmiercionośnego ładunku skutkując deplecją, wraz z komórkami docelowymi, normalnej tkanki limfatycznej (Hutchins et al., 1995, PNAS USA 92: ; White et al., 2001, Annu. Rev. Med. 52: ). W takich przypadkach zastosowanie przeciwciała, które słabo rekrutuje dopełniacz lub komórki efektorowe byłoby ogromną korzyścią (patrz na przykład Wu et al., 2000, Cell Immunol 200:16-26; Shields et al., 2001, J. Biol. Chem 276: ; U.S. 6,194,551; U.S. 5,885,573 i publikacja PCT WO 04/029207). [0018] W innych przypadkach, na przykład, gdy celem jest blokowanie oddziaływania powszechnie eksprymowanego receptora z jego odpowiednim ligandem, korzystne byłoby zmniejszenie lub wyeliminowanie wszystkich funkcji efektorowych przeciwciał w celu zredukowania niepożądanej toksyczności. Ponadto, w przypadku, gdy przeciwciało terapeutyczne wykazuje swobodne wiązanie z licznymi ludzkimi tkankami byłoby rozsądne ograniczenie kierowania funkcji efektorowych do różnorodnych układów tkanek w celu ograniczenia toksyczności. Chociaż istnieją pewne podklasy ludzkich immunoglobulin, które nie mają określonych funkcji efektorowych, nie są znane żadne naturalnie występujące immunoglobuliny, które nie mają żadnych funkcji efektorowych. Alternatywnym rozwiązaniem byłoby skonstruowanie lub zmutowanie krytycznych reszt w regionie Fc, które są odpowiedzialne za funkcje efektorowe. Przykłady można znaleźć w publikacjach WO , WO US , WO , WO i U.S. 5,624,821. [0019] Zastosowanie przeciwciał monoklonalnych w leczeniu wielu stanów chorobowych jest dobrze udokumentowane. Z licznych funkcji efektorowych, które mogą wywoływać przeciwciała jednym z wymagań terapeutycznych przeciwciał jest to, że są one skierowane swoiście na cel będący przedmiotem zainteresowania. Na przykład, nieograniczająco, swoistość tkanki docelowej analizuje się za pomocą analizy immunohistochemicznej (IHC) tkanki będącej przedmiotem zainteresowania. Ważne jest to, że terapeutyk wiąże się tylko do tkanek, które zawierają cel będący przedmiotem zainteresowania. Niespełnienie tego warunku może skutkować wyższą toksycznością terapeutycznych przeciwciał spowodowaną nieprawidłową aktywacją funkcji efektorowych wywoływaną w miejscu, które nie jest docelowe. Jeśli funkcja efektorowa może być zmniejszona lub wyeliminowana, można uniknąć niebezpieczeństwa rozległego wiązania terapeutyku. Ze wszystkich tych względów, istnieje niezaspokojone zapotrzebowanie na przeciwciała o zmniejszonym lub wyeliminowanym powinowactwie do co najmniej jednego ligandu Fc odpowiedzialnego za zapewnienie funkcji efektorowych. Przeciwciała takie będą szczególnie korzystne do zastosowania w leczeniu przewlekłych chorób zapalnych i autoimmunologicznych.

7 -6- [0020] US 2006/ A1 opisuje wyizolowane ludzkie przeciwciała monoklonalne, które wiążą IFNAR-1 i hamują biologiczną aktywność interferonu typu I; opisano również modyfikację regionu Fc na określonych resztach w celu zmiany funkcji efektorowej przeciwciała. [0021] US 2005/ A1 opisuje różne modyfikacje regionu Fc przeciwciała antyselektyna P w celu zmniejszenia wiązania FcR. [0022] Radaev et al., (2001) J. Biol. Chem., vol. 276: opisuje strukturę ludzkiego receptora Fcγ typu III w kompleksie z regionem Fc ludzkiego przeciwciała IgG. [0023] Shields et al., (2001) J. Bio. Chem., vol 276: opisuje mapowanie o wysokiej rozdzielczości miejsca wiązania na ludzkiej IgG1 dla FcγRI, FcγRII, FcγRIII i FcRn i konstrukty wariantów IgG1 z ulepszonym wiązaniem FcγR. [0024] US 2004/ A1 opisuje region Fc zmodyfikowany w celu zmniejszenia wiązania z ligandem Fc. [0025] WO 2006/ A2 opisuje ludzkie przeciwciała monoklonalne, które wiążą się do IFNAR-1 i są zdolne do inhibicji aktywności biologicznej interferonów typu I. [0026] US 6, 194, 551 B1 opisuje wariant regionu Fc ludzkiego IgG3 ze zmienioną funkcją efektorową. [0027] WO 94/ A2 opisuje modyfikacje Fc, które zmieniają funkcję efektorową. [0028] US 5, 624, 821 A opisuje modyfikacje Fc, które zmieniają funkcję efektorową. [0029] US 5, 648, 260 A opisuje zmiany Fc, które wpływają na funkcję efektorową i obniżają wiązanie do receptora Fc o wysokim powinowactwie. [0030] WO 2006/ A2 opisuje modyfikacje, które mogą osłabić funkcje efektorowe przeciwciał. [0031] EP A1 opisuje modyfikacje Fc, które obniżają ADCC. [0032] Armour et al., (2003) Molecular Immunology tom 40, nr 9: opisuje różne wiązanie przeciwciał IgG typu dzikiego i zmutowanych do ludzkich receptorów FcγRIIa i FcγRIIb. [0033] Organesyan et al., (2008) Acta Crystallographica Section D: Biological Crystallography tom 64, nr 6: opisuje strukturalną charakterystykę ludzkiego fragmentu Fc zmodyfikowanego tak, aby nie miał funkcji efektorowych. 3. KRÓTKI OPIS FIGUR [0034] Figura 1A. Dopasowanie sekwencji nukleinowej (SEQ ID NO: 7) i aminokwasowej (SEQ ID NO: 8) 3F11 VH z regionami CDR oznaczono za pomocą linii powyżej. Figura 1B. Dopasowanie sekwencji nukleinowej (SEQ ID NO:9) i aminokwasowej (SEQ ID NO: 10) 3F11 VK z regionami CDR oznaczono za pomocą linii powyżej.

8 -7- Figura 2A. Dopasowanie sekwencji nukleinowej (SEQ ID NO:17) i aminokwasowej (SEQ ID NO:18) 4G5 VH z regionami CDR oznaczono za pomocą linii powyżej. Figura 2B. Dopasowanie sekwencji nukleinowej (SEQ ID NO:19) i aminokwasowej (SEQ ID NO:20) 4G5 VK z regionami CDR oznaczono za pomocą linii powyżej. Figura 3A. Dopasowanie sekwencji nukleinowej (SEQ ID NO:27) i aminokwasowej (SEQ ID NO:28) 11E2 VH z regionami CDR oznaczono za pomocą linii powyżej. Figura 3B. Dopasowanie sekwencji nukleinowej (SEQ ID NO:29) i aminokwasowej (SEQ ID NO:30) 11E2 VK z regionami CDR oznaczono za pomocą linii powyżej. Figura 4A. Dopasowanie sekwencji nukleinowej (SEQ ID NO:37) i aminokwasowej (SEQ ID NO:38) 9D4 VH z regionami CDR oznaczono za pomocą linii powyżej. Figura 4B. Dopasowanie sekwencji nukleinowej (SEQ ID NO:39) i aminokwasowej (SEQ ID NO:40) 9D4 VK z regionami CDR oznaczono za pomocą linii powyżej. Figura 5. Dopasowanie sekwencji aminokwasowej regionów stałych łańcucha ciężkiego dla 9D4. Strzałki wskazują substytucje aminokwasowe (niezmodyfikowane do zmodyfikowanych) dla zwiększenia stabilności i zmniejszenia powinowactwa do co najmniej jednego ligandu Fc. Figura 6A. Profil barwienia immunohistochemicznego ludzkiej tkanki mózgowej traktowanej różnymi przeciwciałami anty-ifnar1. Przeciwciało 9D4 wykazuje niższy profil barwienia po inkubacji z ludzką tkanką mózgową w porównaniu z przeciwciałami 4G5 i MDX Figura 6B. Profil barwienia immunohistochemicznego ludzkich monocytów traktowanych różnymi przeciwciałami anty-ifnar1. Jako kontrolę pozytywną, różne przeciwciała anty- IFNAR1 badano pod kątem reaktywności z ludzkimi monocytami. Figura 7. Przeciwciało anty-ifnar1 9D4 hamuje sygnałowanie IFNα w teście aktywacji STAT opartym na komórkach. Traktowanie przeciwciałem 9D4 hamuje fosforylację tyrozyny STAT1/3/4 w odpowiedzi na stymulację interferonem alfa, co określono za pomocą analizy Western blot z zastosowaniem komercyjnie dostępnych przeciwciał STAT. Figura 8. Przeciwciała anty-ifnar1 blokują sygnałowanie różnych stężeń IFN typu I pochodzących z komórek pdc. Przedstawiono wartości IC50 dla przeciwciała 9D4 blokującego sygnałowanie IFN w teście reportera lucyferazy wykorzystującym oczyszczone supernatanty IFN typu I od 3 niezależnych dawców. Każdy oczyszczony interferon typu I supernatant zawiera względne ilości IFNα, IFNβ i IFNω. Figura 9 A, B, C. Przeciwciała anty-ifnar1 9D4, 9D4-DM (podwójny mutant) i 9D4-TM (potrójny mutant) wykazują podobne właściwości wiązania. Przedstawiono dane reprezentujące niezmodyfikowane przeciwciało 9D4 wraz z 2 zmodyfikowanymi przeciwciałami 9D4-DM i9d4-tm. Zmodyfikowane przeciwciała wykazują właściwości wiązania IFNAR1 podobne do niezmodyfikowanego przeciwciała. Figura 10A. Przeciwciało anty-ifnar1 9D4 wiąże rozpuszczalny receptor interferonu alfa (sifnαr1). Przedstawiono dane o równowadze wiązania, które pokazują zależne od dawki wiązanie 9D4 z rozpuszczalnym receptorem interferonu alfa.

9 -8- Figura 10B. Określenie Kd 9D4 na ludzkich PBMC. Przedstawiono oznaczanie stałej dysocjacji 9D4 mierzone za pomocą wiązania z ludzkimi PBMC. Figura 11. Przeciwciała anty-ifn hamują sygnałowanie indukowane IFNAR1 w teście reportera lucyferazy. Przeciwciała anty-ifnar1, włączając niezmodyfikowane i zmodyfikowane przeciwciała, wykazują podobne wartości IC50 dla blokowania sygnałowania IFN leukocytów w układzie testu reportera lucyferazy. Figura 12A. Oznaczanie punktu izoelektrycznego dla przeciwciał 9D4 (niezmodyfikowane) i zmodyfikowanego 9D4. Przedstawiono żelu IEF dokumentujący względne wartości pi dla przeciwciał 9D4 WT (niezmodyfikowane), 9D4-DM i 9D4-TM. Figura 12B. Oznaczanie temperatur topnienia dla przeciwciał 9D4 (niezmodyfikowane) i zmodyfikowanego 9D4. Przedstawiono tu krzywą topnienia dokumentującą względne temperatury topnienia (Tm) dla przeciwciał 9D4, 9D4-DM i 9D4-TM. Figura 13. Profilaktyczne leczenie przeciwciałami anty-ifnar blokuje białkomocz indukowany Adv-IFNα. Myszy leczone wektorem kontrolnym, Adv-IFNα, Adv-IFNα + wstępne leczenie kontrolą izotypową i Adv-IFNα + wstępne leczenie anty-ifnar analizowano przez 9 tygodni pod kątem białkomoczu. Myszy wstępnie leczone anty-ifnar nie wykazywały białkomoczu po prowokacji IFNα. Figura 14. Profilaktyczne leczenie przeciwciałami anty-ifnar blokuje regulację w górę genów odpowiedzi IFNα (IFIT1, IFI44, CXCL11, IFI202b, CXCL19, CXCL9) we krwi. Myszy wstępnie leczone przeciwciałami anty-ifnar nie wykazują regulacji w górę wybranych genów odpowiedzi IFNα po prowokacji adenowirusem kodującym IFN alfa w porównaniu do myszy leczonych wirusem kontrolnym, PBS lub kontrolami izotypowymi IgG. Przedstawiono względną ekspresję sześciu genów znanych jako wrażliwe na IFNα w próbkach krwi pobranych od myszy 3 tygodnie po indukcji IFNα przez zakażenie Adv-IFNα. Figura 15 A, B. Profilaktyczne leczenie przeciwciałami anty-ifnar blokuje wytwarzanie autoprzeciwciał indukowane IFNα. Myszy wstępnie leczone przeciwciałami anty-ifnar nie wykazują podwyższonego wytwarzania autoprzeciwciał po ekspozycji na adenowirusa kodującego IFNα w porównaniu do myszy leczonych wirusem kontrolnym, PBS lub kontrolami izotypowymi IgG. Przedstawiono stężenia anty-dsdna i anty-ssa/ro w próbkach krwi pobranych od myszy 6 tygodni po indukcji IFNα przez zakażenie Adv-IFNα. Figura 16 A, B. Profilaktyczne leczenie przeciwciałami anty-ifnar blokuje regulację w górę cytokin w nerkach. Myszy wstępnie leczone przeciwciałami anty-ifnar nie wykazują regulacji w górę cytokin w nerkach po prowokacji adenowirusem kodującym IFNα5 w porównaniu do myszy wstępnie leczonych wirusem kontrolnym, PBS lub kontrolami izotypowymi IgG. Przedstawiono pomiary poziomów IP-10 i IL-18 w próbkach nerek pobranych od myszy 6 tygodni po indukcji IFNα przez zakażenie Adv-IFNα5. Figura 17. Profilaktyczne leczenie przeciwciałami anty-ifnar blokuje wytwarzanie autoprzeciwciał indukowane IFN. Przedstawiono tu względne miana przeciwciał anty-antygen jądrowy (ANA) z surowicy myszy. Myszy wstępnie leczone przeciwciałami anty-ifnar

10 -9- wykazywały niższe miana ANA w surowicy po prowokacji IFN niż myszy leczone wirusem kontrolnym, PBS lub kontrolą izotypową. Figura 18. Hamowanie SLE w osoczu mediowane przeciwciałem pośredniczy w rozwoju komórek dendrytycznych. Przedstawiono wyniki 5 oddzielnych eksperymentów, w których IFN pochodzące od pacjentów z SLE inkubowano w obecności przeciwciała anty-ifnar1 9D4, a następnie dodano do ludzkich monocytów. Obecność przeciwciała anty-ifnar1 9D4 hamowała zdolność IFN pochodzącego od pacjentów z SLE do indukowania markerów CD38 i CD 123 komórek dendrytycznych w różnicowanych monocytach. Figura 19. Przeciwciała anty-ifnar1 suprymują ekspresję CD38, CD123 i CD86 na monocytach stymulowanych interferonem leukocytarnym. Przeciwciała anty-ifnar1 9D4, 9D4-DM 9D4-TM wykazywały podobne profile hamowania dla ekspresji CD38, CD123 i CD86 na różnicujących się monocytach co zmierzono jako procent supresji kontroli stymulującej ekspresję. Figura 20. Zmodyfikowane przeciwciała anty-ifnar1 wykazują zmniejszone powinowactwo do receptora Fc FcγRI w porównaniu z niezmodyfikowanymi przeciwciałami anty-ifnar1. Przeciwciała anty-ifnar1 9D4 (niemodyfikowane) 9D4-DM (zmodyfikowane) 9D4-TM (zmodyfikowane) analizowano pod kątem ich zdolności wiązania FcγRI związanego z płytką w eksperymencie ELISA. Jako kontrolę pozytywną dla wiązania receptora Fc zastosowano niepowiązane niezmodyfikowane przeciwciała (przeciwciało kontrolne). Figura 21, A, B, C. Zmodyfikowane przeciwciała anty-ifnar1 wykazują zmniejszone powinowactwo do receptora Fc FcγRIIIA w porównaniu z niezmodyfikowanymi przeciwciałami anty-ifnar1. Związane z płytką niezmodyfikowane przeciwciało anty- IFNAR1 9D4 (A) i zmodyfikowane przeciwciała anty-ifnar1 9D4-DM (B) i 9D4-TM(C) analizowano pod kątem zdolności do wiązania wolnego FcγRIIIA w doświadczalnym formacie ELISA. Figura 22, A, B, C. Zmodyfikowane przeciwciała anty-ifnar1 wykazują zmniejszone powinowactwo do receptora Fc FcγRIIIA. Wolne niezmodyfikowane przeciwciało anty- IFNAR1 9D4 (A) i zmodyfikowane przeciwciała anty-ifnar1 9D4-DM (B) i 9D4-TM(C) analizowano pod kątem zdolności do wiązania i zmodyfikowane przeciwciała anty-ifnar1 9D4-DM (B) i 9D4-TM(C) analizowano pod kątem zdolności wiązania FcγRIIIA związanego z płytką w doświadczalnym formacie ELISA. Figura 23 A-E. Neutralizacja podtypów IFN w surowicy pacjentów z SLE. co zmierzono za pomocą testu reporterowego Przeciwciała anty-ifnar1 MDX-1333, 9D4-WT i 9D4-TM hamowały sygnałowanie α10 (A), interferonu leukocytarnego (B), α2b (C), ω (D) i β (E) mediowane IFN. Figura 24. Przeciwciała anty-ifnar1 neutralizują interferon typu I od pacjentów z SLE. Przeciwciało anty-ifnar1 9D4 hamowało sygnałowanie mediowane interferonem typu I w porównaniu z kontrolnym niepowiązanym przeciwciałem co zmierzono za pomocą testu reporterowego.

11 -10- Figura 25 A-D. Przeciwciała anty-ifnar suprymują populację pdc indukowaną IFNα w PBMC. Przeciwciała anty-ifnar zablokowały podwyższenie komórek pdc zmierzone przez ekspresję epitopu powierzchni komórkowej indukowaną przez ektopową, indukowaną adenowirusem, ekspresję interferonu alfa w śledzionie (A), węzłach chłonnych (B), krwi obwodowej (C) i szpiku kostnym (D). Figura 26. Analiza wiązania przeciwciał anty-ifnar1 9D4-WT, 9D4-DM i 9D4-TM z receptorem Fc FcγRI określono przez analizę BIACore. Pokrótce, przeciwciała anty-ifnar1 unieruchomiono i dodano wolne FcγRI w celu zmierzenia powinowactwa. Zmodyfikowane przeciwciała 9D4-DM i 9D4-TM wykazywały mniejsze powinowactwo do wolnego FcγRI w porównaniu z niezmodyfikowanym przeciwciałem 9D4-WT co wykazano przez wykrywanie. Figura 27 A-C. Analiza wiązania przeciwciał anty-ifnar1 9D4-WT, 9D4-DM i 9D4-TM z receptorem Fc FcγRI określono za pomocą analizy BiaCore. Pokrótce, wolne przeciwciała anty-ifnar1 przepuszczono przez unieruchomione FcγRI w celu zmierzenia powinowactwa. Zmodyfikowane przeciwciała 9D4-DM (B) i 9D4-TM (C) wykazywały mniejsze powinowactwo do związanego FcγRI w porównaniu z niezmodyfikowanym przeciwciałem 9D4-WT (A) co wykazano przez wykrywanie. Figura 28. Przeciwciała anty-ifnar hamują indukcję genów odpowiedzi IFNα w nerce. Pokrótce, w modelu myszy z pobudzonym toczniem leczenie przeciwciałami anty-ifnar blokuje indukcję sześciu genów (ICAM1, VCAM1, CXCL9, CXCL10 i IFIT1) w nerkach mediowaną ektopową ekspresją IFNα w porównaniu z myszami kontrolnymi co zmierzono za pomocą testu Taqman. Figura 29. Przeciwciała anty-ifnar hamują wytwarzanie przeciwciał anty-ds DNA w modelu myszy z pobudzonym toczniem. Pokrótce, myszy ektopowo eksprymujące IFNα i leczone przeciwciałami anty-ifnar nie akumulują przeciwciał anty-ds DNA na tym samym poziomie co myszy podobnie zakażone i leczonych przeciwciałem kontrolnym IgG. Figura 30. Przeciwciała anty-ifnar są zdolne do zmniejszania białkomoczu w terapeutycznie ustawionym modelu myszy z pobudzonym toczniem. (A) Pokrótce, myszy ektopowo eksprymujące IFNα rozwijają objawy podobne do tocznia, takie jak białkomocz. W terapeutycznym badaniu przeciwciała anty-ifnar podawano myszom aż do osiągnięcia wartości progowej dla białkomoczu. Przeciwciała anty-ifnar, PBS lub kontrolną IgG podawano w środku tygodnia przez 5 tygodniowym cyklu. Podczas eksperymentu grupa leczona przeciwciałem anty-ifnar wykazywała zmniejszone nasilenie białkomoczu w porównaniu z grupami leczonymi samym PBS lub kontrolną IgG. Figura 31. Przeciwciała anty-ifnar są w stanie zwiększyć przeżywalność w terapeutycznie ustawionym modelu myszy z pobudzonym toczniem. (A) Pokrótce, myszy ektopowo eksprymujące IFNα rozwijają objawy podobne do tocznia, takie jak białkomocz. W terapeutycznym badaniu przeciwciała anty-ifnar podawano myszom aż do osiągnięcia wartości progowej dla białkomoczu. Przeciwciała anty-ifnar, PBS lub kontrolną IgG podawano w środku tygodnia przez 5 tygodniowym cyklu. Po pięciu tygodniach leczenie przeciwciałem zatrzymano i prześledzono śmiertelność we wszystkich trzech grupach. Grupa

12 -11- leczona przeciwciałem anty-ifnar wykazywała znacznie mniejszą śmiertelność niż grupy z samym PBS lub kontrolną IgG, gdzie obie wykazały całkowitą śmiertelność w ciągu 9 tygodni. Figura 32. Przykład asymetrycznych jednostek w kryształach Fc-TM, który obejmuje mutacje L234F/L235E/P331S. Mutacja P331 jest oznaczona na czerwono. Jeden jon cynku jest chelatowany przez dwie przestrzennie blisko położone reszty histydyny. Reszty węglowodanowe przyłączone w pozycji 297 modelowano według ich gęstości elektronowej. Figura 33. Kinetyczne obrazy pokazują internalizację 9D4-TM. Komórki THP-1 barwiono 1 µm CFSE przy 37 C w inkubatorze CO2 przez 10 minut, po czym 1 µg/ml Alexa647-9D4-TM na lodzie przez 1 godz. Po usunięciu niezwiązanych, komórki inkubowano w 37 C przy następujących punktach czasowych (0, 15, 30 i 60 minut) i wykonano zdjęcia komórek. Figura 34. Przeciwciało anty-ifnar1, 9D4-TM nie wykazuje aktywności CDC w teście in vitro. W panelu przedstawiono wyniki testu CDC w celu określenia zdolności przeciwciała 9D4-TM do wywołania aktywności CDC. Jak przedstawiono, przeciwciało 9D4-TM nie wykazuje żadnej aktywności CDC w porównaniu z przeciwciałem kontroli pozytywnej. Aktywność CDC była również niewykrywalna dla niezwiązanego przeciwciała kontrolnego, R347. Pokrótce, komórki eksprymujące antygen IFNAR1 inkubowano z przeciwciałem kontroli pozytywnej 9D4-TM, lub R347. Po serii przemywań dodano świeżo przygotowaną ludzką surowicę. Cytotoksyczność zależną od dopełniacza (CDC) mierzono stosując test uwalniania LDH. 4. TERMINOLOGIA [0035] Określenia "interferon alfa", "IFNα", "IFNa", "IFNA" i "IFN alfa" są stosowane zamiennie i w zamierzeniu dotyczą białek IFN alfa kodowanych przez funkcjonalny gen locus genu interferonu alfa o 75% lub większej identyczności sekwencji z IFN alfa 1 (numer dostępu GenBank NP_ lub białko kodowane przez numer dostępu GenBank NM_024013). Przykłady podtypów IFN alfa obejmują IFN alfa 1, alfa 2a, alfa 2b, alfa 4, alfa 4b alfa 5, alfa 6, alfa 7, alfa 8, alfa 10, alfa 13, alfa 14, alfa 16, alfa 17 i alfa 21. Określenia "interferon alfa", "IFNα" i "IFN alfa" w zamierzeniu obejmują rekombinowane formy różnych podtypów IFN alfa, a także naturalnie występujące preparaty zawierające białka IFN alfa, takie jak leukocytarny IFN i limfoblastyczny IFN. [0036] Określenia "receptor interferonu alfa 1", "IFNAR1" "IFNAR-1 i "antygen IFNAR-1" są stosowane zamiennie i obejmują warianty, izoformy, rodzaje homologów ludzkiego IFNAR-1 i analogi mające co najmniej jeden wspólny epitop z IFNAR-1. Zgodnie z tym opisane tu ludzkie przeciwciała mogą reagować krzyżowo z IFNAR-1 z gatunków innych niż człowiek lub innymi białkami, które są strukturalnie powiązane z ludzkim IFNAR-1 (np. homologi ludzkiego IFNAR-1). Alternatywnie, przeciwciała mogą być całkowicie swoiste względem ludzkiego IFNAR-1 i nie wykazują reakcji krzyżowej z innymi rodzajami lub typami. Pełna sekwencja cdna ludzkiego IFNAR-1 ma numer dostępu Genbank NM_ [0037] Stosowane tu określenie "konserwatywne modyfikacje sekwencji" ma obejmować modyfikacje aminokwasowe, które nie wpływają lub nie zmieniają właściwości wiązania przeciwciała zawierającego sekwencję aminokwasową. Takie konserwatywne modyfikacje

13 -12- obejmują aminokwasowe substytucje, addycje i delecje. Modyfikacje mogą być wprowadzane do opisanego tu przeciwciała z zastosowaniem standardowych technik znanych w dziedzinie, takich jak ukierunkowana mutageneza i mutageneza za pośrednictwem PCR. Konserwatywne substytucje aminokwasowe to takie, w których reszta aminokwasowa jest zastąpiona resztą aminokwasową zawierającą podobny łańcuch boczny. Na przykład, jeden lub więcej aminokwasów o podobnej polarności działają jak funkcjonalne ekwiwalenty i skutkują cichą zmianą w sekwencji aminokwasowej peptydu. Substytucje, które mają ładunek obojętny i które zastępują resztę mniejszą resztą mogą być również uznane za "konserwatywne substytucje", nawet jeśli reszty pochodzą z różnych grup (np. zastąpienie fenyloalaniny mniejszą izoleucyną). Rodziny reszt aminokwasowych mających podobne łańcuchy boczne zostały zdefiniowane w dziedzinie. Kilka nieograniczających przykładów rodzin konserwatywnych substytucji aminokwasowych przedstawiono w Tabeli 1. Tabela 1: Rodziny konserwatywnych substytucji aminokwasowych Rodzina niepolarne Polarne bez ładunku kwaśne/ujemnie naładowane zasadowe/dodatnio naładowane beta-rozgałęzione reszty wpływające na orientację łańcucha aromatyczne Aminokwas Trp, Phe, Met, Leu, Ile, Val, Ala, Pro Gly, Ser, Thr, Asn, Gln, Tyr, Cys Asp, Glu Arg, Lys, His Thr, Val, Ile Gly, Pro Tip, Tyr, Phe, His 5. SZCZEGÓŁOWY OPIS [0038] W przeciwieństwie do poprzedniego stanu wiedzy, twórcy stwierdzili, że przeciwciała anty-ifnar1 o zmniejszonej lub wyeliminowanej funkcji efektorowej są pożądane w leczeniu przewlekłych chorób autoimmunologicznych i/lub chorób zapalnych. Poprzednio, przeciwciała skierowane przeciw IFNAR1 wytworzono przy założeniu, że funkcja efektorowa będzie odgrywać rolę w pośredniczeniu leczenia lub przynajmniej złagodzeniu przewlekłego stanu autoimmunologicznego i/lub zapalnego stanu chorobowego (patrz na przykład publikacja US lub publikacja PCT WO ). Według tej koncepcji, większa część poprzedniego stanu wiedzy kierowała znawcę na identyfikację przeciwciał anty-ifnar1 o silnej funkcji efektorowej i na dalsze wzmacnianie funkcji efektorowej przez zwiększanie powinowactwa przeciwciała do receptorów Fc (np. FcRn, FcγRIIIa, FcγRIIb) i/lub białka dopełniacza C1q. Te otrzymane przeciwciała anty-ifnar1 o wzmocnionej funkcji efektorowej miały być korzystne w leczeniu stanów chorobowych.

14 -13- [0039] W przeciwieństwie do tego poprzedniego zrozumienia wynalazek opisuje przeciwciała anty-ifnar1 o zmniejszonej lub wyeliminowanej funkcji efektorowej (takiej jak ADCC i/lub CDC). Przez badanie reaktywności krzyżowej tkanek nieoczekiwanie okazało się, że przeciwciała anty-ifnar1 o silnej lub zwiększonej funkcji efektorowej wykazywały skłonności do niepożądanej toksyczności ze względu na występowanie barwienia anty- IFNAR1 w tkankach innych niż docelowe. Ta toksyczność wynikałaby z nieswoistej aktywacji ADCC i/lub CDC w nieodpowiednich miejscach. Aby zmniejszyć lub wyeliminować tą niepożądaną toksyczność, twórcy uznali za konieczne zmniejszenie funkcji efektorowej polipeptydów zawierających region Fc. [0040] Wynalazek zapewnia zmodyfikowane monoklonalne przeciwciało klasy IgG swoiste względem IFNAR1, przy czym to przeciwciało w region Fc zawiera substytucję aminokwasową L234F, numerowanie według indeksu EU jak określono w Kabat, i przy czym to przeciwciało wykazuje zmniejszone powinowactwo do co najmniej jednego liganda Fc w porównaniu z niezmodyfikowanym przeciwciałem. Korzystnie wspomniane przeciwciało jest przeciwciałem podklasy IgG1 lub IgG4. [0041] Opisane tu przeciwciało może ponadto zawierać substytucję aminokwasową L235E i/lub P331S. [0042] Opisane tu przeciwciało może zawierać: a. ludzki region zmienny łańcucha ciężkiego CDR1 zawierający SEQ ID NO: 1, b. ludzki region zmienny łańcucha ciężkiego CDR2 zawierający SEQ ID NO: 2; c. ludzki region zmienny łańcucha ciężkiego CDR3 zawierający SEQ ID NO: 3; d. ludzki region zmienny łańcucha lekkiego CDR1 zawierający SEQ ID NO: 4; e. ludzki region zmienny łańcucha lekkiego CDR2 zawierający SEQ ID NO: 5; i f. ludzki region zmienny łańcucha lekkiego CDR3 zawierający SEQ ID NO: 6. [0043] Opisane tu przeciwciało może zawierać: a. ludzki region zmienny łańcucha ciężkiego CDR1 zawierający SEQ ID NO: 21, b. ludzki region zmienny łańcucha ciężkiego CDR2 zawierający SEQ ID NO: 22; c. ludzki region zmienny łańcucha ciężkiego CDR3 zawierający SEQ ID NO: 23; d. ludzki region zmienny łańcucha lekkiego CDR1 zawierający SEQ ID NO: 24; e. ludzki region zmienny łańcucha lekkiego CDR2 zawierający SEQ ID NO: 25; i f. ludzki region zmienny łańcucha lekkiego CDR3 zawierający SEQ ID NO: 26. [0044] Opisane tu przeciwciało może zawierać: a. ludzki region zmienny łańcucha ciężkiego zawierający SEQ ID NO: 38, b. ludzki region zmienny łańcucha lekkiego zawierający SEQ ID NO: 40. [0045] Opisane tu przeciwciało może zawierać: a. ludzki region zmienny łańcucha ciężkiego zawierający SEQ ID NO: 18, b. ludzki region zmienny łańcucha lekkiego zawierający SEQ ID NO: 20. [0046] Opisane tu przeciwciało może zawierać: a. ludzki region zmienny łańcucha ciężkiego zawierający SEQ ID NO: 28, b. ludzki region zmienny łańcucha lekkiego zawierający SEQ ID NO: 30.

15 -14- [0047] Opisane tu przeciwciało może zawierać sekwencję regionu stałego łańcucha lekkiego SEQ ID NO: 41. [0048] Opisane tu przeciwciało może zawierać region stały łańcucha ciężkiego o SEQ ID NO: 42. [0049] Opisane tu przeciwciało może zawierać region stały łańcucha lekkiego mający sekwencje aminokwasową SEQ ID NO: 41 i region stały łańcucha ciężkiego mający sekwencje aminokwasową SEQ ID NO: 42. [0050] Opisane tu przeciwciało może zawierać sekwencję aminokwasową łańcucha ciężkiego zawierającą zmienność alleliczną, przy czym wspomniana zmienność alleliczna jest co najmniej jedną lub więcej pozycji wybranych z grupy obejmującej 214, 221, 356 i 358, jak określono za pomocą systemu numerowania indeksem EU. [0051] Wynalazek dostarcza ponadto wyizolowany kwas nukleinowy zawierający sekwencję polinukleotydową kodującą przeciwciało według dowolnego z poprzednich zastrzeżeń. [0052] Ponadto wynalazek zapewnia kompozycję farmaceutyczną zawierającą opisane tu przeciwciało i farmaceutycznie dopuszczalną substancję pomocniczą. [0053] Wynalazek dostarcza także kompozycji farmaceutycznej według wynalazku do stosowania w leczeniu choroby lub zaburzenia wybranego spośród choroby Gravesa, zapalenia tarczycy Hashimoto, choroby Crohna, łuszczycy, łuszczycowego zapalenia stawów, współczulnego zapalenia oka, autoimmunologicznego zapalenia jajników, autoimmunologicznego zapalenia jądra, autoimmunizacyjnego zespołu limfoproliferacyjnego, zespołu antyfosfolipidowego, zespołu Sjögrena, twardziny, choroby Addisona, autoimmunologicznego zespołu niedoczynności wielogruczołowej, zespołu Guillaina-Barrego, immunologicznej plamicy małopłytkowej, anemii złośliwej, miastenii, pierwotnej marskości żółciowej wątroby, mieszanej choroby tkanki łącznej, bielactwa nabytego, autoimmunologicznego zapalenia błony naczyniowej oka, autoimmunologicznej niedokrwistości hemolitycznej, autoimmunologicznej małopłytkowości, celiakii, opryszczkowatego zapalenia skóry, autoimmunologicznego zapalenia wątroby, pęcherzycy, pęcherzycy pospolitej, pęcherzycy liściastej, pemfigoidu pęcherzowego, autoimmunologicznego zapalenia mięśnia sercowego, autoimmunologicznego zapalenia naczyń, łysienia plackowatego, autoimmunologicznej miażdżycy tętnic, choroby Behceta, autoimmunologicznej mielopatii, autoimmunologicznej hemofilii, autoimmunologicznego śródmiąższowego zapalenia pęcherza moczowego, autoimmunologicznej moczówki prostej, autoimmunologicznej endometriozy, nawracającego zapalenia chrząstek, zesztywniającego zapalenia stawów kręgosłupa, autoimmunologicznej pokrzywki, zapalenia skórnomięśniowego, zespołu Millera-Fishera, nefropatii IgA, zespołu Goodpasture'a i pemfigoidu ciężarnych. [0054] W związku z tym opisaliśmy zmodyfikowane przeciwciała i inne polipeptydy zawierające region Fc przeciwciała zawierające addycję, substytucję lub delecję co najmniej jednej reszty aminokwasowej w regionie Fc prowadzące do obniżenia lub wyeliminowania powinowactwa do co najmniej jednego liganda Fc (określane jako "zmodyfikowane"

16 -15- przeciwciała). Region Fc oddziałuje z wieloma ligandami, włączając, nieograniczająco, receptory Fc (np. FcRn, FcγRIIIa, FcγRIIb), białko dopełniacza C1q i inne cząsteczki takie jak białka A i G Oddziaływania te mają zasadnicze znaczenie dla różnych funkcji efektorowych i zdarzeń sygnałowania, włączając, nieograniczająco, cytotoksyczność komórkową zależną od przeciwciał (ADCC) i cytotoksyczność zależną od dopełniacza (CDC). Opisane tu przeciwciała mogą mieć zmniejszone lub wyeliminowane powinowactwo do liganda Fc odpowiedzialne za ułatwianie funkcji efektorowej w porównaniu z przeciwciałem mającym tę samą sekwencję aminokwasową, ale nie zawierającym addycji, substytucji lub delecji co najmniej jednej reszty aminokwasowej w regionie Fc (określane tu również jako "niezmodyfikowane przeciwciało"). Opisane tu przeciwciała mogą zawierać co najmniej jedną lub więcej z następujących właściwości: zmniejszoną lub wyeliminowaną funkcję efektorową (ADCC i/lub CDC), zmniejszone lub wyeliminowane wiązanie z receptorami Fc lub zmniejszone lub wyeliminowane toksyczności. Dokładniej, opisaliśmy skierowane przeciwko IFNAR1 przeciwciała o zmniejszonym powinowactwie względem receptorów Fc (np. FcRn, FcγRIIIa, FcγRIIb) i/lub białka dopełniacza C1q. [0055] Opisane tu przeciwciała mogą zawierać region Fc zawierający co najmniej jedną addycję, substytucję lub delecję reszty aminokwasowej wybranej z pozycji składających się z: 234, 235 i 331, przy czym zastosowany w regionie stałym system numerowania to indeks UE przedstawiony w Kabat et al. (1991, NIH Publication , National Technical Information Service, Springfield, VA). Opisane tu przeciwciała mogą zawierać region Fc zawierający co najmniej jedną substytucję aminokwasową wybraną z grupy składającej się z: L234F, L235E i P331S, przy czym pierwsza litera i numer przedstawiają niezmodyfikowany aminokwas i jego pozycję i druga litera oznacza podstawiony w tej pozycji aminokwas. [0056] Opisane tu przeciwciała mogą ponadto zawierać region Fc zawierający co najmniej jedną addycję, substytucję lub delecję reszty aminokwasowej, która jest skorelowana z większą stabilnością przeciwciała. Addycja, substytucja lub delecja reszty aminokwasowej może być w pozycji 228 w regionie Fc, przy czym zastosowany w regionie stałym system numerowania to indeks UE przedstawiony w Kabat et al. Opisane tu przeciwciała mogą zawierać region Fc zawierający substytucję aminokwasową w pozycji 228, przy czym podstawiona jest reszta serynowa. Przeciwciała podtypu IgG4 mogą zawierać substytucję aminokwasową seryny w pozycji 228 regionu Fc. Opisane tu przeciwciała mogą już zawierać resztę serynową w pozycji 228 regionu Fc; takie przeciwciała nie wymagają modyfikacji. Alternatywnie, opisane tu przeciwciała mogą wymagać modyfikacji reszty 228 regionu Fc lub mogą już zawierać serynę w tej pozycji. [0057] Opisane tu przeciwciała mogą być dowolnymi z dowolnej klasy (na przykład, nieograniczająco, IgG, IgM i IgE). Opisane tu przeciwciała są członkami przeciwciał klasy IgG. W konkretnym przykładzie wykonania opisane tu przeciwciała są z podklasy IgG1. W innym konkretnym przykładzie wykonania opisane tu przeciwciała są z podklasy IgG1 i zawierają następujące substytucje aminokwasowe: 234F, 235E i 331S regionu Fc. W alternatywnych przykładach wykonania opisane tu przeciwciała są z podklasy IgG4.

17 -16- Opisane tu przeciwciała podklasy IgG4 mogą zawierać następujące substytucje aminokwasowe: S228P i L235E regionu Fc. [0058] Zmodyfikowane przeciwciała mogą być wytwarzane przez połączenie domen zmiennych, lub ich fragmentów, z domeną Fc zawierającą jedno lub więcej ujawnionych tu substytucji aminokwasowych. Zmodyfikowane przeciwciała mogą być wytwarzane przez modyfikację przeciwciała zawierającego domenę Fc przez wprowadzenie jednej lub więcej substytucji reszt aminokwasowych do domeny Fc. 5.1 Zmniejszone wiązanie do ligandów Fc [0059] Znawca dziedziny będzie wiedział, że opisane tu przeciwciała mogą mieć zmienione (w stosunku do niezmodyfikowanego przeciwciała) właściwości wiązania FcγR i/lub C1q (przykłady właściwości wiązania obejmują, nieograniczającą, specyficzność wiązania, stałą równowagi dysocjacji (KD), szybkości dysocjacji i asocjacji (odpowiednio Koff i Kon), powinowactwo wiązania i/lub awidność), i że pewne zmiany są bardziej lub mniej pożądane. W dziedzinie wiadomo, że stałą równowagi dysocjacji (KD) definiuje się jako koff/kon. Znawca dziedziny może określić, który kinetyczny parametr jest najważniejszy dla danego zastosowania przeciwciał. Na przykład, modyfikacje, które zmniejszają wiązanie z jednym lub więcej pozytywnych regulatorów (np. FcγRIIIA) i/lub wzmacniają wiązanie z hamującym receptorem Fc (np. FcγRIIB) byłyby korzystne dla zmniejszenia aktywności ADCC. W związku z tym współczynnik powinowactwa wiązania (np. stałe równowagi dysocjacji (KD)) może wskazywać czy aktywność ADCC przeciwciała jest zwiększona lub zmniejszona. Ponadto, modyfikacja, która zmniejsza wiązanie z C1q będzie odpowiednia dla zmniejszania lub wyeliminowania aktywności CDC. [0060] Powinowactwo i właściwości wiązania regionu Fc do jego liganda można określić za pomocą różnych znanych w dziedzinie sposobów badania in vitro (testy biochemiczne lub immunologiczne) do określania oddziaływania Fc-FcγR, tj. swoistego wiązania regionu Fc z FcγR włączając, nieograniczająco, sposoby oparte na równoważności (np. enzymatyczny test immunoabsorpcyjny (ELISA) lub test radioimmunologiczny (RIA) lub kinetyczne (np. analizy BIACORE ) i inne sposoby takie jak pośrednie testy wiązania, kompetycyjne testy inhibicji, transfer energii rezonansu fluorescencji (FRET), elektroforeza w żelu i chromatografia (np. filtracja żelowa). Te i inne sposoby mogą wykorzystać znakowanie na jednym lub więcej badanych komponentów i/lub wykorzystać różne sposoby detekcji, włączając, nieograniczająco, znakowanie chromogeniczne, fluorescencyjne, luminescencyjne lub izotopowe. Szczegółowy opis powinowactwa wiązania i kinetyki można znaleźć w Paul, W.E., ed., Fundamental Immunology, 4th Ed., Lippincott-Raven, Philadelphia (1999). [0061] Opisane tu przeciwciała mogą wykazywać zmniejszone powinowactwo wiązania jednego lub więcej receptorów Fc, włączając, nieograniczająco, FcγRI (CD64) włączając izoformy FcγRIA, FcγRIB i FcγRIC; FcγRII (CD32, włączając izoformy FcγRIIA, FcγRIIB i FcγRIIC); i FcγRIII (CD16, włączając izoformy FcγRIIIA i FcγRIIB) w porównaniu z niezmodyfikowanym przeciwciałem. Opisane tu przeciwciała mogą nie obejmować

18 -17- jednoczesnego zwiększenie wiązania receptora FcγRIIB w porównaniu z niemodyfikowanym (np. zawierającego region Fc typu dzikiego) przeciwciałem. [0062] Opisane tu przeciwciała mogą wykazywać zmniejszone powinowactwo do FcγRI w porównaniu z niezmodyfikowanym przeciwciałem. Opisane tu przeciwciała mogą wykazywać powinowactwo do receptora FcγRI, które są co najmniej 2-krotnie, lub co najmniej 3-krotnie, lub co najmniej 5-krotnie, lub co najmniej 7-krotnie, lub co najmniej 10-krotnie, lub co najmniej 20-krotnie, lub co najmniej 30-krotnie, lub co najmniej 40-krotnie, lub co najmniej 50-krotnie, lub co najmniej 60-krotnie, lub co najmniej 70-krotnie, lub co najmniej 80-krotnie, lub co najmniej 90-krotnie, lub co najmniej 100-krotnie, lub co najmniej 200-krotnie mniejsze niż niezmodyfikowanego przeciwciała. [0063] Opisane tu przeciwciała mogą wykazywać powinowactwo do receptora FcγRI, które jest co najmniej 90%, co najmniej 80%, co najmniej 70%, co najmniej 60%, co najmniej 50%, co najmniej 40%, co najmniej 30%, co najmniej 20%, co najmniej 10% lub co najmniej 5% mniejsze niż niezmodyfikowanego przeciwciała. [0064] Opisane tu przeciwciała mogą wykazywać obniżone powinowactwo do receptora FcγRIIIA w stosunku do niezmodyfikowanego przeciwciała. Opisane tu przeciwciała mogą wykazywać powinowactwo do receptora FcγRIIIA, które są co najmniej 2-krotnie, lub co najmniej 3-krotnie, lub co najmniej 5-krotnie, lub co najmniej 7-krotnie, lub co najmniej 10- krotnie, lub co najmniej 20-krotnie, lub co najmniej 30-krotnie, lub co najmniej 40-krotnie, lub co najmniej 50-krotnie, lub co najmniej 60-krotnie, lub co najmniej 70-krotnie, lub co najmniej 80-krotnie, lub co najmniej 90-krotnie, lub co najmniej 100-krotnie, lub co najmniej 200- krotnie mniejsze niż niezmodyfikowanego przeciwciała. [0065] Opisane tu przeciwciała mogą wykazywać powinowactwo do receptora FcγRIIIA, które są co najmniej 90%, co najmniej 80%, co najmniej 70%, co najmniej 60%, co najmniej 50%, co najmniej 40%, co najmniej 30%, co najmniej 20%, co najmniej 10% lub co najmniej 5% mniejsze niż niezmodyfikowanego przeciwciała. [0066] W dziedzinie wiadomo, że alleliczny wariant F158V receptora FcγRIIIA ma zmienione właściwości wiązania przeciwciał. Opisane tu przeciwciała mogą wiązać się ze zmniejszonym powinowactwem do FcγRIIIA (F158V) w stosunku do niezmodyfikowanego przeciwciała. Opisane tu przeciwciała mogą wykazywać powinowactwo do receptora FcγRIIIA (F158V), które są co najmniej 2-krotnie, lub co najmniej 3-krotnie, lub co najmniej 5-krotnie, lub co najmniej 7-krotnie, lub co najmniej 10-krotnie, lub co najmniej 20-krotnie, lub co najmniej 30- krotnie, lub co najmniej 40-krotnie, lub co najmniej 50-krotnie, lub co najmniej 60-krotnie, lub co najmniej 70-krotnie, lub co najmniej 80-krotnie, lub co najmniej 90-krotnie, lub co najmniej 100-krotnie, lub co najmniej 200-krotnie mniejsze niż w przypadku niemodyfikowanego przeciwciała. Opisane tu przeciwciała mogą wykazywać powinowactwo do receptora FcγRIIIA (F158V), które są co najmniej 90%, co najmniej 80%, co najmniej 70%, co najmniej 60%, co najmniej 50%, co najmniej 40%, co najmniej 30%, co najmniej 20%, co najmniej 10% lub co najmniej 5% mniejsze niż niemodyfikowanego przeciwciała.

19 -18- [0067] Opisane tu przeciwciała mogą wykazywać zwiększone powinowactwo do receptora FcγRIIB w porównaniu z niezmodyfikowanym przeciwciałem. Opisane tu przeciwciała mogą wykazywać powinowactwo do receptora FcγRIIB, które pozostają niezmienione lub są co najmniej 2-krotnie, lub co najmniej 3-krotnie, lub co najmniej 5-krotnie, lub co najmniej 7- krotnie, lub co najmniej 10-krotnie, lub co najmniej 20-krotnie, lub co najmniej 30-krotnie, lub co najmniej 40-krotnie, lub co najmniej 50-krotnie, lub co najmniej 60-krotnie, lub co najmniej 70-krotnie, lub co najmniej 80-krotnie, lub co najmniej 90-krotnie, lub co najmniej 100-krotnie lub co najmniej 200-krotnie zwiększone niż w przypadku niemodyfikowanego przeciwciała. Opisane tu przeciwciała mogą wykazywać powinowactwo do receptora FcγRIIB, które są zwiększone o co najmniej 5%, co najmniej 10%, co najmniej 20%, co najmniej 30%, co najmniej 40%, co najmniej 50%, co najmniej 60%, co najmniej 70%, co najmniej 80%, co najmniej 90% lub co najmniej 95% w stosunku do niezmodyfikowanego przeciwciała. [0068] Opisane tu przeciwciała mogą wykazywać powinowactwo do receptorów FcγRI, FcγRIIIA lub FcγRIIIA (F158V), które są w zakresie od około 100 nm do około 100 µm, lub około 100 nm do około 10 µm, lub około 100 nm do około 1 µm, lub około 1 nm do około 100 µm, lub około 10 nm do około 100 µm, lub około 1 µm do około 100 µm, lub około 10 µm do około 100 µm. Opisane tu przeciwciała mogą wykazywać powinowactwo do receptorów FcγRI, FcγRIIIA lub FcγRIIIA (F158V), które są większe niż 1 µm, większe niż 5 µm, większe niż 10 µm, większe niż 25 µm, większe niż 50 µm lub większe niż 100 µm. [0069] Opisane tu przeciwciała mogą wykazywać powinowactwo do receptora FcγRIIB, które wynoszą między około 100 nm do około 100 µm, lub około 100 nm do około 10 µm, lub około 100 nm do około 1 µm, lub około 1 nm do około 100 µm, lub około 10 nm do około 100 µm, lub około 1 µm do około 100 µm, lub około 10 µm do około 100 µm. Opisane tu przeciwciała mogą wykazywać powinowactwo do receptorów FcγRI, FcγRIIIA lub FcγRIIIA (F158V), które są mniejsze niż 100 µm, mniejsze niż 50 µm, mniejsze niż 10 µm, mniejsze niż 5 µm, mniejsze niż 2,5 µm, mniejsze niż 1 µm, lub mniejsze niż 100 nm, lub mniejsze niż 10 nm. [0070] Opisane tu przeciwciała mogą wykazywać powinowactwo do receptora FcγRIIB, które wynoszą między około 100 nm do około 100 µm, lub około 100 nm do około 10 µm, lub około 100 nm do około 1 µm, lub około 1 nm do około 100 µm, lub około 10 nm do około 100 µm, lub około 1 µm do około 100 µm, lub około 10 µm do około 100 µm. Opisane tu przeciwciała mogą wykazywać powinowactwo do receptorów FcγRI, FcγRIIIA lub FcγRIIIA (F158V), które są mniejsze niż 100 µm, mniejsze niż 50 µm, mniejsze niż 10 µm, mniejsze niż 5 µm, mniejsze niż 2,5 µm, mniejsze niż 1 µm, lub mniejsze niż 100 nm, lub mniejsze niż 10 nm. 5.2 Zmniejszona aktywność ADCC [0071] Z dziedziny wiadomo, że przeciwciała są zdolne do nakierowywania ataku i niszczenia docelowego antygenu za pomocą wielu procesów ogólnie znanych w dziedzinie jako funkcje efektorowe przeciwciał. Jeden z tych procesów, znany jako "cytotoksyczność komórkowa zależna od przeciwciał" lub "ADCC" odnosi się do formy cytotoksyczności, w której wydzielane Ig wiążą się z receptorami Fc (FcR) obecnymi na pewnych komórkach cytotoksycznych (np. naturalnych komórkach cytotoksycznych (NK), neutrofilach i

20 -19- makrofagach) umożliwiając tym cytotoksycznym komórkom efektorowym swoiste wiązanie się do komórki docelowej niosącej antygen, a następnie zabicie komórki docelowej za pomocą cytotoksyn. Swoiste wysokie powinowactwo przeciwciała IgG skierowane na powierzchnię komórek docelowych "uzbraja" komórki cytotoksyczne i jest wymagane do takiego zabijania. Liza komórki docelowej jest pozakomórkowa, wymaga bezpośredniego kontaktu komórkakomórka i nie wiąże dopełniacza. Innym procesem objętym określeniem "funkcja efektorowa" jest cytotoksyczność zależna od dopełniacza (zwana dalej "CDC"), która dotyczy biochemicznego zdarzenia zniszczenia komórek docelowych za pośrednictwem przeciwciała, w którym pośredniczy układ dopełniacza. Układ dopełniacza jest złożonym układem białek występujących w normalnym osoczu krwi, które łączą się z przeciwciałami w celu zniszczenia bakterii chorobotwórczych i innych obcych komórek. [0072] Można oznaczyć zdolność dowolnego konkretnego przeciwciała do pośredniczenia w lizie komórki docelowej za pomocą ADCC. Aby ocenić aktywność ADCC przeciwciało będące przedmiotem zainteresowania dodaje się do komórek docelowych w połączeniu z efektorowymi komórkami immunologicznymi, które mogą być zaktywowane przez kompleksy antygen-przeciwciało skutkując cytolizą komórki docelowej. Cytoliza jest ogólnie wykrywana przez uwalnianie znacznika (np. substraty radioaktywne, barwniki fluorescencyjne lub naturalne białka wewnątrzkomórkowe) z poddanych lizie komórek. Użyteczne w takich oznaczeniach komórki efektorowe obejmują komórki jednojądrzaste krwi obwodowej (PBMC) i naturalne komórki cytotoksyczne (NK). Konkretne przykłady testów ADCC in vitro opisano w Wisecarver et al., : ; Bruggemann et al., 1987, J Exp Med 166: ; Wilkinson et al., 2001, J Immunol Methods 258: ; Patel et al., 1995 J Immunol Methods 184: Alternatywnie, lub dodatkowo, aktywność ADCC przeciwciała będącego przedmiotem zainteresowania można oceniać in vivo, np. w modelu zwierzęcym takim jak ujawniony w Clynes et al., 1998, PNAS USA 95: [0073] Rozważa się charakteryzowanie opisanych tu przeciwciał za pomocą funkcjonalnych testów in vitro w celu określenia jednej lub więcej efektorowych funkcji komórkowych mediowanych FcγR. Opisane tu przeciwciała mogą mieć podobne właściwości wiązania i efektorowe funkcje komórkowe w modelach in vivo (takie jak te tu opisane i ujawnione) jak te w testach in vitro. Jednakże przeciwciała według wynalazku, które nie wykazują żądanego fenotypu w testach in vitro mogą wykazywać pożądany fenotyp in vivo. [0074] Opisane tu przeciwciała mogą wykazywać zmniejszone aktywności ADCC w porównaniu z niezmodyfikowanym przeciwciałem. Opisane tu przeciwciała mogą wykazywać aktywności ADCC, które są co najmniej 2-krotnie, lub co najmniej 3-krotnie, lub co najmniej 5-krotnie, lub co najmniej 10-krotnie, lub co najmniej 50-krotnie, lub co najmniej 100-krotnie mniejsze niż niezmodyfikowanego przeciwciała, W jeszcze innym przykładzie wykonania opisane tu przeciwciała mogą wykazywać aktywności ADCC, które są zmniejszone o co najmniej 10%, lub co najmniej 20%, lub co najmniej 30%, lub co najmniej 40%, lub co najmniej 50%, lub o co najmniej 60%, lub co najmniej 70%, lub co najmniej 80%, lub co najmniej 90%, lub o co najmniej 100%, lub co najmniej 200%, lub co najmniej 300%, lub co najmniej 400%, lub co najmniej 500% względem niezmodyfikowanego przeciwciała. Opisane tu przeciwciała

21 -20- mogą nie mieć żadnej wykrywalnej aktywności ADCC. W konkretnych przykładach wykonania zmniejszenie i/lub wyeliminowanie aktywności ADCC można przypisać zmniejszonemu powinowactwu, które opisane tu przeciwciała mogą wykazywać względem ligandów i/lub receptorów Fc. 5.3 Zmniejszona aktywność CDC [0075] Szlak aktywacji układu dopełniacza jest inicjowany przez wiązanie pierwszego komponentu układu dopełniacza (C1q) do cząsteczki, na przykład przeciwciała, w kompleksie z odpowiednim antygenem. W celu oceny aktywacji dopełniacza można przeprowadzić test CDC, np. jak opisano w Gazzano-Santoro et al., 1996, J. Immunol. Methods, 202:163. [0076] Opisane tu przeciwciała mogą wykazywać zmniejszone powinowactwo do C1q względem niezmodyfikowanego przeciwciała. Opisane tu przeciwciała mogą wykazywać powinowactwa do receptora C1q, które są co najmniej 2-krotnie, lub co najmniej 3-krotnie, lub co najmniej 5-krotnie, lub co najmniej 7-krotnie, lub co najmniej 10-krotnie, lub co najmniej 20-krotnie, lub co najmniej 30-krotnie, lub co najmniej 40-krotnie, lub co najmniej 50-krotnie, lub co najmniej 60-krotnie, lub co najmniej 70-krotnie, lub co najmniej 80-krotnie, lub co najmniej 90-krotnie, lub co najmniej 100-krotnie, lub co najmniej 200-krotnie mniejsze niż niezmodyfikowanego przeciwciała. [0077] Opisane tu przeciwciała mogą wykazywać powinowactwo do C1q, które są co najmniej 90%, co najmniej 80%, co najmniej 70%, co najmniej 60%, co najmniej 50%, co najmniej 40%, co najmniej 30%, co najmniej 20%, co najmniej 10% lub co najmniej 5% mniejsze niż niemodyfikowanego przeciwciała. [0078] Opisane tu przeciwciała mogą wykazywać powinowactwo do C1q, które są między około 100 nm do około 100 µm, lub około 100 nm do około 10 µm, lub około 100 nm do około 1 µm, lub około 1 nm do około 100 µm, lub około 10 nm do około 100 µm, lub około 1 µm do około 100 µm, lub około 10 µm do około 100 µm. Opisane tu przeciwciała mogą wykazywać powinowactwo do C1q, które są większe niż 1 µm, większe niż 5 µm, większe niż 10 µm, większe niż 25 µm, większe niż 50 µm, lub większe niż 100 µm. [0079] Opisane tu przeciwciała mogą wykazywać zmniejszone aktywności CDC w porównaniu z niezmodyfikowanym przeciwciałem. Opisane tu przeciwciała mogą wykazywać aktywności CDC, które są co najmniej 2-krotnie, lub co najmniej 3-krotnie, lub co najmniej 5-krotnie, lub co najmniej 7-krotnie, lub co najmniej 10-krotnie, lub co najmniej 50-krotnie, lub co najmniej 100-krotnie mniejsze niż niezmodyfikowanego przeciwciała. W jeszcze innym przykładzie wykonania opisane tu przeciwciała mogą wykazywać aktywności CDC, które są zmniejszone o co najmniej 10%, lub co najmniej 20%, lub o co najmniej 30%, lub o co najmniej 40%, lub o co najmniej 50%, lub o co najmniej 60%, lub o co najmniej 70%, lub o co najmniej 80%, lub o co najmniej 90%, lub o co najmniej 100%, lub o co najmniej 200%, lub o co najmniej 300%, lub o co najmniej 400%, lub o co najmniej 500% względem niezmodyfikowanego przeciwciała. Opisane tu przeciwciała mogą nie wykazywać żadnych wykrywalnych aktywności CDC. W konkretnych przykładach wykonania zmniejszenie i/lub

22 -21- wyeliminowanie aktywności CDC można przypisać zmniejszonemu powinowactwu opisanych tu przeciwciał, które mogą wykazywać względem ligandów i/lub receptorów Fc. 5.4 Zmniejszona toksyczność związana z przeciwciałem [0080] W dziedzinie wiadomo, że terapie biologiczne mogą mieć problemy z niekorzystną toksycznością związaną ze złożonym charakterem nakierowywania układu immunologicznego na rozpoznawanie i atakowanie niechcianych komórek i/lub celów. Gdy rozpoznawanie i/lub kierowanie na atak nie ma miejsca tam, gdzie wymagane jest leczenie, mogą wystąpić niekorzystne skutki takie jak toksyczność. Na przykład, barwienie przeciwciałem tkanek innych niż docelowe może być oznaką potencjalnych problemów z toksycznością. [0081] Opisane tu przeciwciała mogą wykazywać zmniejszone barwienie tkanek innych niż docelowe w porównaniu z niezmodyfikowanym przeciwciałem. Opisane tu przeciwciała mogą wykazywać zmniejszone barwienie tkanek innych niż docelowe, które jest co najmniej 2- krotnie, lub co najmniej 3-krotnie, lub co najmniej 5-krotnie, lub co najmniej 7-krotnie, lub co najmniej 10-krotnie, lub co najmniej 20-krotnie, lub co najmniej 30-krotnie, lub co najmniej 40-krotnie, lub co najmniej 50-krotnie, lub co najmniej 60-krotnie, lub co najmniej 70-krotnie, lub co najmniej 80-krotnie, lub co najmniej 90-krotnie, lub co najmniej 100-krotnie, lub co najmniej 200-krotnie mniejsze niż w przypadku niemodyfikowanego przeciwciała. Opisane tu przeciwciała mogą wykazywać zmniejszone barwienie tkanek innych niż docelowe, które jest zmniejszone o co najmniej 10%, lub o co najmniej 20%, lub o co najmniej 30%, lub o co najmniej 40%, lub o co najmniej 50%, lub o co najmniej 60%, lub o co najmniej 70%, lub o co najmniej 80%, lub o co najmniej 90%, lub o co najmniej 100%, lub o co najmniej 200%, lub o co najmniej 300%, lub o co najmniej 400%, lub o co najmniej 500% względem niezmodyfikowanego przeciwciała. [0082] Opisane tu przeciwciała mogą wykazywać zmniejszoną toksyczność związaną z przeciwciałem w porównaniu z niezmodyfikowanym przeciwciałem. Opisane tu przeciwciała mogą wykazywać toksyczności, które są co najmniej 2-krotnie, lub co najmniej 3-krotnie, lub co najmniej 5-krotnie, lub co najmniej 7-krotnie, lub co najmniej 10-krotnie, lub co najmniej 20-krotnie, lub co najmniej 30-krotnie, lub co najmniej 40-krotnie, lub co najmniej 50-krotnie, lub co najmniej 60-krotnie, lub co najmniej 70-krotnie, lub co najmniej 80-krotnie, lub co najmniej 90-krotnie, lub co najmniej 100-krotnie, lub co najmniej 200-krotnie mniejsze niż w przypadku niemodyfikowanego przeciwciała. Opisane tu przeciwciała mogą wykazywać toksyczności, które są zmniejszone o co najmniej 10%, lub o co najmniej 20%, lub o co najmniej 30%, lub o co najmniej 40%, lub o co najmniej 50%, lub o co najmniej 60%, lub o co najmniej 70%, lub o co najmniej 80%, lub o co najmniej 90%, lub o co najmniej 100%, lub o co najmniej 200%, lub o co najmniej 300%, lub o co najmniej 400%, lub o co najmniej 500% względem niezmodyfikowanego przeciwciała. 5.5 Internalizacja przeciwciał [0083] Opisane tu przeciwciała mogą wiązać się z antygenami powierzchni komórkowej, które mogą ulegać internalizacji wprowadzając następnie przeciwciała do komórki. Po dostaniu się do komórki, przeciwciała mogą być uwalniane do cytoplazmy, kierowane do określonego

23 -22- przedziału lub zawracane na powierzchnię komórkową. Opisane tu przeciwciała mogą wiązać się z antygenem powierzchni komórkowej, który ulega internalizacji. Opisane tu przeciwciała mogą być kierowane do określonych organelli lub przedziałów komórki. Po internalizacji opisane tu przeciwciała mogą być zawracane na powierzchnię komórkową lub na obrzeże. W konkretnym przykładzie wykonania opisane tu przeciwciało jest swoiste względem IFNAR1. [0084] Internalizacja przeciwciała może być zmierzona za pomocą technik dziedziny takich jak te przedstawione w Przykładzie 34. Stopień internalizacji można przedstawić jako odsetek całkowitej ilości przeciwciał związanych z komórką. Stopień internalizacji przeciwciała można przedstawić jako porównanie z nieswoistym przeciwciałem kontrolnym. Stopień internalizacji przeciwciała można przedstawić jako porównanie z przeciwciałem, które wiąże się z antygenem powierzchni komórkowej, który nie ulega internalizacji. Stopień internalizacji przeciwciał może być skorelowany z degradacją przeciwciała. Stopień internalizacji przeciwciała może być przedstawiony jako stosunek barwienia cytoplazmatycznego względem barwienia powierzchni. [0085] Opisane tu przeciwciała po związaniu mogą ulegać internalizacji do komórek, przy czym internalizacja wynosi co najmniej około 10%, co najmniej około 20%, co najmniej około 30%, co najmniej około 40%, co najmniej około 50%, co najmniej około 60%, co najmniej około 70%, co najmniej około 80%, lub co najmniej około 90%, co najmniej około 100%, co najmniej około 110%, co najmniej około 130%, co najmniej około 140%, co najmniej około 150%, co najmniej około 160%, lub co najmniej 170% więcej niż nieswoistego przeciwciała kontrolnego. [0086] Opisane tu przeciwciała po związaniu mogą ulegać internalizacji do komórek, przy czym internalizacja wynosi 1-10%, 10-20%, 20-30%, 30-40%,40-50%, 50-60%, 60-70%, 70-80%, 80-90%, %, %, %, %, %, %, %, % więcej niż nieswoistego przeciwciała kontrolnego. [0087] Opisane tu przeciwciała po związaniu mogą ulegać internalizacji do komórek, przy czym internalizacja wynosi 1-10%, 10-20%, 20-30%, 30-40%,40-50%, 50-60%, 60-70%, 70-80%, 80-90%, %, %, %, %, %, %, %, % więcej niż przeciwciała kontrolnego co określono w teście internalizacji z zastosowaniem przeciwciała drugorzędowego. 5.6 Trójwymiarowa struktura ludzkiego regionu Fc [0088] Opisujemy tu formy krystaliczne regionu Fc ludzkiej IgG, przy czym ludzki region Fc, oznaczony jako Fc-TM, zawiera substytucje aminokwasowe L234F, L235E i P331S numerowane według indeksu EU jak określono w Kabat, i wykazuje zmniejszone lub ma wyeliminowane funkcje efektorowe (ADCC i/lub CDC), zmniejszone lub wyeliminowane wiązanie z receptorami Fc, i/lub zmniejszone lub wyeliminowane toksyczności. Kryształy można charakteryzować za pomocą rombowej grupy przestrzennej C2221 z komórką jednostkową a=50,18, b=147,30 i c=75,47. W pewnych przykładach wykonania kryształy mają jakość dyfrakcyjną aby umożliwić określenie trójwymiarowej rentgenowskiej dyfrakcji

24 -23- struktury krystalicznego polipeptydu(ów) z wysoką rozdzielczością, korzystnie rozdzielczością większą niż około 3 Å, zazwyczaj w zakresie około 2 Å do około 3 Å. [0089] Opisujemy trójwymiarowe struktury i współrzędne struktury atomowej kryształów Fc- TM o wysokiej rozdzielczości. Konkretne sposoby zastosowane do otrzymania kryształów i współrzędnych struktury zapewniono w przykładach poniżej. [0090] Współrzędne struktury atomowej krystalicznego Fc-TM, otrzymano z formy C2221 kryształu do rozdzielczości 2,3 Å, podano w Tabeli 6. Wszystkie reszty aminokwasowe w pozycjach 236 do 445 mogą być odnalezione w gęstości elektronowej, i nie obserwowano gęstości elektronowej w resztach zawiasowych/zmiennych przed pozycją 236, włączając mutacje L234F i L235E. Gęstość elektronowa w pozycji 331 odpowiada serynie. [0091] Ogólna struktura trójwymiarowa Fc-TM była bardzo podobna do poprzednio opisanych struktur ludzkich regionów Fc nie mających ligandów Deisenhofer, (1981). Biochemistry, 20, ; Krapp et al., (2003). J. Mol. Biol. 325, ; Matsumiya et al., (2007). J. Mol. Biol. 368, ; Oganesyan et al., (2007) Molecular Immunology, December 11, 2007, w druku). Domeny Fc-TM CH2 i CH3 rozpatrywane osobno wykazały wysoką konserwatywność i sztywność struktury w porównaniu z innymi niezmutowanymi strukturami ludzkiego Fc nie mającymi ligandów. [0092] Informacje o strukturze mogą być zastosowane w różnych obliczeniowych lub komputerowych sposobach przeszukiwania, projektowania lub identyfikacji przeciwciał anty- IFNAR, które mają zmienione własności biologiczne. Na przykład, uzyskane w ten sposób kryształy i współrzędne strukturalne można wykorzystać w celu przeszukiwania, projektowania lub identyfikacji aminokwasowych addycji, substytucji lub delecje w regionie Fc, które skutkują zmniejszonym lub wyeliminowanym wiązaniem z receptorami Fc, zmniejszoną lub wyeliminowaną funkcją efektorową (ADCC i/lub CDC) lub zmniejszoną lub wyeliminowaną toksycznością. [0093] Po zaprojektowaniu przeciwciała lub wybrania powyższymi sposobami, jego funkcja efektorowa, wiązanie z receptorami Fc lub toksyczności mogą być badane i optymalizowane dowolnymi sposobami znanymi znawcom dziedziny. Przykładowe sposoby są opisane powyżej w sekcjach [0094] Opisujemy przeciwciała anty-ifnar1, które są zaprojektowane lub wybrane z zastosowaniem informacji o strukturze Fc-TM, i które wykazują pożądane aktywności biologiczne. Takie przeciwciała mogą obejmować region Fc z mutacjami L234F, L235E i P331S. Takie przeciwciała mogą obejmować region Fc z jedną lub więcej addycji, substytucji lub delecję reszt aminokwasowych innych niż reszty aminokwasowych 234, 235 i Przeciwciała anty-ifnar1 [0095] Opisane tu przeciwciała są swoiste (tj. swoiście wiążą) dla IFNAR1. Takie przeciwciała mogą być również określane jako "opisane tu przeciwciała anty-ifnar1. Opisane tu przeciwciała są swoiste dla ludzkiego IFNAR1. Opisane tu przeciwciała anty-ifnar1 mogą reagować krzyżowo z IFNAR1 z gatunków innych niż człowiek, lub innymi białkami, które są

25 -24- strukturalnie spokrewnione z ludzkim IFNAR1 (na przykład ludzkie homologi IFNAR1). Opisane tu przeciwciała anty-ifnar1 mogą być swoiste tylko względem ludzkiego IFNAR1 i nie wykazują reakcji krzyżowej względem innych gatunków lub rodzajów. [0096] Opisane tu przeciwciała anty-ifnar1 mogą wykazywać zmniejszone powinowactwo wiązania ligandów Fc i co najmniej jedną z następujących własności: zmniejszona lub wyeliminowana funkcja efektorowa (ADCC i/lub CDC), zmniejszone lub wyeliminowane wiązanie ligandów Fc, lub zmniejszone lub wyeliminowane toksyczności względem niezmodyfikowanego przeciwciała. [0097] Opisane tu przeciwciała anty-ifnar1 mogą obejmować addycję, substytucję lub delecję co najmniej jednej reszty aminokwasowej wybranej z grupy składającej się z: L234F, L235E i P331S. Opisane tu przeciwciała anty-ifnar1 mogą zawierać substytucje aminokwasowe: L234F, L235E i P331S w regionie Fc. Opisane tu przeciwciało anty-ifnar1 może być przeciwciałem o izotypie IgG. [0098] Opisane tu przeciwciała anty-ifnar1 mogą być z podklasy IgG4. Opisane tu przeciwciała IgG4 anty-ifnar1 mogą zawierać substytucję aminokwasową L235E w regionie Fc. Opisane tu przeciwciała IgG4 anty-ifnar1 mogą również zawierać zmianę aminokwasową, która jest skorelowana z większą stabilnością. Opisane tu przeciwciała IgG4 anty-ifnar1 mogą ponadto zawierać substytucję aminokwasową S228P w regionie Fc. [0099] Opisane tu przeciwciała anty-ifnar1 mogą wykazywać zmniejszone lub wyeliminowane powinowactwo do receptorów Fc (na przykład, nieograniczająco, do FcγRI (CD64), włączając izoformy FcγRIA, FcγRIB, i FcγRIC; FcγRII (CD32), włączając izoformy FcγRIIA, FcγRIIB, and FcγRIIC; i FcγRIII (CD16), w tym izoform FcγRIIIA i FcγRIIB) w porównaniu z niezmodyfikowanym przeciwciałem. Opisane tu przeciwciała anty-ifnar1 mogą wykazywać zmniejszone powinowactwo do FcγRI względem niezmodyfikowanego przeciwciała. Opisane tu przeciwciała anty-ifnar1 mogą wykazywać zmniejszone powinowactwo do FcγRIIIA względem niezmodyfikowanego przeciwciała. Opisane tu przeciwciała anty-ifnar1 mogą wiązać się ze zmniejszonymi powinowactwami do allelu F158V FcγRIIIA względem niezmodyfikowanego przeciwciała. [0100] Opisane tu przeciwciała anty-ifnar1 mogą wykazywać zmniejszone lub wyeliminowane powinowactwo do C1q w porównaniu do niezmodyfikowanego przeciwciała. Opisane tu przeciwciała anty-ifnar1 mogą wykazywać zmniejszone powinowactwo do FcγRI względem niezmodyfikowanego przeciwciała. [0101] Opisane tu przeciwciała anty-ifnar1 mogą wykazywać zmniejszoną lub wyeliminowaną funkcję efektorową. Opisane tu przeciwciała anty-ifnar1 mogą wykazywać zmniejszone lub wyeliminowaną aktywność ADCC i/lub CDC. Opisane tu przeciwciała anty- IFNAR1 mogą wykazywać zmniejszoną lub wyeliminowaną toksyczność Sekwencje przeciwciała anty-ifnar1 [0102] Opisane tu sekwencje aminokwasowe regionów zmiennych łańcucha ciężkiego i/lub regionów zmiennych łańcucha lekkiego przeciwciała anty-ifnar1 zapewniono odpowiednio

26 -25- na Figurach 1A, 2A, 3A, 4A i Figurach 1B, 2B, 3B, 4B. Opisane tu sekwencję polinukleotydową kodującą regiony zmienne ciężkiego i regionu zmiennego łańcucha lekkiego łańcucha przeciwciała anty-ifnar1 zapewniono odpowiednio na Figurach 1A, 2A, 3A, 4A i Figurach 1B, 2B, 3B, 4B. [0103] Wybrane sekwencje opisanych tu przeciwciał anty-ifnar1 można znaleźć w patencie US5,919,453, zgłoszeniach patentowych US o nr seryjnych: 10/831459, 10/ / i 11/ Sekwencje opisanych tu przeciwciał anty-ifnar1 mogą nie zawierać sekwencji, które można znaleźć w patencie US5,919,453, zgłoszeniach patentowych US o nr seryjnych: 10/831459, 10/ / i 11/ [0104] Opisane tu przeciwciała ujawniono w tymczasowych zgłoszeniach patentowych US o nr seryjnych 60/842,925, złożonym 08 września 2006 r., 60/866,917; złożonym 22 listopada 2006 r.; 60/911397, złożonym 12 kwietnia 2007 r.; 60/915309, złożonym 22 maja 2007 r.; zgłoszeniu patentowym US o nr seryjnym 11/ , złożonym 7 września 2007 r.; i zgłoszeniu PCT o nr seryjnym US2007/07791, złożonym 07 września 2007 r. [0105] Opisane tu przeciwciała anty-ifnar1 obejmują również przeciwciała, które zawierają sekwencję aminokwasową regionu zmiennego łańcucha ciężkiego i/lub regionu zmiennego łańcucha lekkiego, która jest co najmniej 45%, co najmniej 50%, co najmniej 55%, co najmniej 60%, co najmniej 65%, co najmniej 70%, co najmniej 75%, co najmniej 80%, co najmniej 85%, co najmniej 90%, co najmniej 95% lub co najmniej 99% identyczna z sekwencją aminokwasową zmiennego łańcucha ciężkiego i/lub lekkiego przeciwciał 3F11, 11E2, 4G5 i 9D4 (sekwencje patrz Figury 1-4). [0106] Będzie zrozumiałe, że numery reszt regionów determinujących komplementarność (CDR), o których tu mowa są tymi od Kabat et al., (1991, NIH Publication , National Technical Information Service, Springfield, VA). Konkretnie, reszty (CDR1), (CDR2) i (CDR3) w domenie zmiennej łańcucha lekkiego i (CDR1), (CDR2) i (CDR3) w domenie zmiennej łańcucha ciężkiego. Należy zauważyć, że CDR różnią się znacznie między przeciwciałami (i z definicji nie wykazują homologii z sekwencjami konsensusu Kabata). Maksymalne wyrównanie reszt zrębowych często wymaga insercji reszt "spacerów" w systemie numeracji, który ma być zastosowany dla regionu Fv. Będzie zrozumiałe, że CDR, o których tu mowa są tymi od Kabat et al. supra. Ponadto, tożsamość niektórych poszczególnych reszt w dowolnym miejscu o numeracji Kabata mogą się różnić między łańcuchami przeciwciał ze względu na rozbieżność międzygatunkową i alleliczną. [0107] Opisane tu przeciwciała anty-ifnar1 mogą zawierać co najmniej jeden CDR VH mający sekwencję aminokwasową dowolnego z CDR VH wymienionych w Tabeli 2. Opisane tu przeciwciała anty-ifnar1 mogą zawierać co najmniej jeden CDR VL mający sekwencję aminokwasową dowolnego z CDR VL wymienionych w Tabeli 2. Opisane tu przeciwciała anty-ifnar1 mogą zawierać jeden lub więcej CDR VH i jeden lub więcej CDR VL wymienione w Tabeli 2. Opisane tu przeciwciała anty-ifnar1 mogą zawierać dowolną kombinację CDR VH i CDR VL wymienionych w Tabeli 2. Opisane tu przeciwciała anty-

27 -26- IFNAR1 mogą zawierać co najmniej 1, lub co najmniej 2, lub co najmniej 3, lub co najmniej 4, lub co najmniej 5, lub co najmniej 6 CDR wymienionych w Tabeli 2. Opisane tu przeciwciała anty-ifnar1 mogą zawierać domenę VH i/lub domenę VL, każda zawierająca 1, 2 lub 3 CDR. Opisane tu przeciwciała anty-ifnar1 mogą zawierać domenę VH zawierającą dodatkowo 1, 2 lub 3 CDR łańcucha ciężkiego (CDRH #) wymienionych w Tabeli 2. Opisane tu przeciwciała anty-ifnar1 mogą zawierać VL ponadto zawierającą 1, 2, lub 3 CDR łańcucha lekkiego (CDRL #) wymienionych w Tabeli 2. [0108] Opisane tu przeciwciała anty-ifnar1 mogą zawierać CDR przeciwciała 3F11 (patrz na przykład Tabela 2). Opisane tu przeciwciała anty-ifnar1 mogą zawierać CDR przeciwciała 4G5 (patrz na przykład Tabela 2). Opisane tu przeciwciała anty-ifnar1 mogą zawierać CDR przeciwciała 11E2 (patrz na przykład Tabela 2). Opisane tu przeciwciała anty- IFNAR1 mogą zawierać CDR przeciwciała 9D4 (patrz na przykład Tabela 2). Tabela 2. Sekwencje CDR przeciwciała anty-ifnar1 Przeciwciało CDR Sekwencja SEQ ID NO: 3F11 CDRL1 RASQGIYSVLA 1 3F11 CDRL2 DASRLES 2 3F11 CDRL3 QQFNSYIT 3 3F11 CDRH1 GYFWS 4 3F11 CDRH2 EIDHSGKTNYNPSLKS 5 3F11 CDRH3 ESKYYFGLDV 6 4G5 CDRL1 RATQDISIALV 11 4G5 CDRL2 DASGLGS 12 4G5 CDRL3 QQFNSYPYT 13 4G5 CDRH1 NYYWS 14 4G5 CDRH2 EIILSGSTNYNPSLKS 15 4G5 CDRH3 ESKWGYYFDS 16 11E2 CDRL1 RASQSVSSSFFA 21 11E2 CDRL2 GASSRAT 22 11E2 CDRL3 QQYYDSSAIT 23

28 -27- Przeciwciało CDR Sekwencja SEQ ID NO: 11E2 CDRH1 NYWIA 24 11E2 CDRH2 IIYPGDSDIRYSPSFQG 25 11E2 CDRH3 HDIEGFDY 26 9D4 CDRL1 RASQSVSSSFFA 31 9D4 CDRL2 GASSRAT 32 9D4 CDRL3 QQYDSSAIT 33 9D4 CDR11 NYWIA 34 9D4 CDRH2 IIYPGDSDIRYSPSFQG 35 9D4 CDRH3 HDIEGFDY 36 [0109] Opisane tu przeciwciała anty-ifnar1 mogą zawierać sekwencje aminokwasowe regionu zmiennego łańcucha ciężkiego i/lub regionu zmiennego łańcucha lekkiego, które zawierają co najmniej 1, co najmniej 2, co najmniej 3, co najmniej 4, co najmniej 5, co najmniej 10, co najmniej 15, lub co najmniej 20 aminokwasowych substytucji, addycji lub delecji w stosunku do zmiennych łańcuchów ciężkich i/lub lekkich łańcuchów przedstawionym na Figurach 1, 2, 3 lub 4. Opisane tu przeciwciała anty-ifnar1 mogą zawierać jeden lub więcej CDR z co najmniej 1, co najmniej 2, co najmniej 3, co najmniej 4, co najmniej 5, lub co najmniej 10 aminokwasowymi substytucjami, delecjami lub addycjami w jednym lub więcej CDR wymienionych w Tabeli 2. [0110] Opisane tu przeciwciała anty-ifnar1 mogą obejmować przeciwciała kodowane przez sekwencję polinukleotydową, która w warunkach ostrych hybrydyzuje do sekwencji nukleotydowej przedstawionej na Figurach 1, 2, 3 lub 4. Opisane tu przeciwciała anty-ifnar1 mogą zawierać jeden lub więcej CDR kodowanych przez sekwencję nukleotydową, która w warunkach ostrych hybrydyzuje do sekwencji nukleotydowej jednego lub więcej regionów CDR wymienionych na Figurach 1, 2, 3 lub 4. Ostre warunki hybrydyzacji obejmują, nieograniczająco, hybrydyzację ze związanym na sączku DNA w 6X chlorku sodu/cytrynian sodu (SSC) przy około 45 C, a następnie jedno lub więcej przemyć 0,2X SSC/0,1% SDS przy około C, bardzo ostre warunki takie jak hybrydyzacja ze związanym na sączku DNA w 6X SSC przy około 45 C, a następnie jedno lub więcej przemyć w 0,1 X SSC/0,2% SDS przy około 60 C, lub inne ostre warunki hybrydyzacji znane znawcom dziedziny (patrz, na przykład, Ausubel, F.M. et al., edyt Current Protocols in Molecular Biology, tom 1, Green Publishing Associates, Inc. i John Wiley and Sons, Inc., NY strony do i ). Opisane tu przeciwciała anty-ifnar1 obejmują, nieograniczająco, przeciwciała kodowane przez sekwencję polinukleotydową, która jest co najmniej w 70%, co najmniej 80%, co

29 -28- najmniej 85%, co najmniej 90%, co najmniej 95%, co najmniej 96 %, co najmniej 97%, co najmniej 98% lub co najmniej 99% identyczna z sekwencją polinukleotydową kodującą przeciwciała 3F11, 11E2, 4G5, lub 9D4 (patrz Figury 1-4) Powinowactwo wiązania anty-ifnar1 [0111] Opisane tu przeciwciała anty-ifnar1 mogą wykazywać wysokie powinowactwo wiązania do IFNAR1. Opisane tu przeciwciała anty-ifnar1 mogą wykazywać szybkość asocjacji (kon) co najmniej 10 5 M -1 s -1, co najmniej M - s -1, co najmniej 10 6 M -1 s -1, co najmniej M -1 s -1, co najmniej 10 7 M -1 s -1, co najmniej M -1 s -1 lub co najmniej 10 8 M -1 s - 1. Opisane tu przeciwciała anty-ifnar1 mogą wykazywać kon co najmniej M -1 s -1, co najmniej M -1 s -1, co najmniej 10 6 M -1 s -1, co najmniej M -1 s -1, co najmniej 10 7 M -1 s -1, co najmniej M -1 s -1 lub co najmniej 10 8 M -1 s -1. [0112] Opisane tu przeciwciała anty-ifnar1 mogą wykazywać szybkość dysocjacji (koff) mniejszą niż 10-1 s -1, mniejszą niż s -1, mniejszą niż 10-2 s -1, mniejszą niż s -1, mniejszą niż 10-3 s -1, mniejszą niż s -1, mniejszą niż 10-4 s -1, mniejszą niż s -1, mniejszą niż 10-5 s -1, mniejszą niż s -1, mniejszą niż 10-6 s -1, mniejszą niż s -1, mniejszą niż 10-7 s -1, mniejszą niż s -1, mniejszą niż 10-8 s -1, mniejszą niż s -1, mniejszą niż 10-9 s -1, mniejszą niż s -1 lub mniejszą niż s -1. Opisane tu przeciwciała anty-ifnar1 mogą wykazywać koff mniejszą niż s -1, mniejszą niż 10-5 s -1, mniejszą niż s -1, mniejszą niż 10-6 s -1, mniejszą niż s -1, mniejszą niż 10-7 s -1, mniejszą niż s -1, mniejszą niż 10-8 s -1, mniejszą niż s -1, mniejszą niż 10-9 s -1, mniejszą niż s -1 lub mniejszą niż s -1. [0113] Opisane tu przeciwciała anty-ifnar1 mogą wykazywać stałą powinowactwa lub Ka (kon/koff) co najmniej 10 2 M -1, co najmniej M -1, co najmniej 10 3 M -1, co najmniej M - 1, co najmniej 10 4 M -1, co najmniej M -1, co najmniej 10 5 M -1, co najmniej M -1, co najmniej 10 6 M -1, co najmniej M -1, co najmniej 10 7 M -1, co najmniej M -1, co najmniej 10 8 M -1, co najmniej M -1, co najmniej 10 9 M -1, co najmniej M -1, co najmniej M - 1, co najmniej M -1, co najmniej M -1, co najmniej M -1, co najmniej M -1, co najmniej M, co najmniej M -1, co najmniej M -1, co najmniej M -1, co najmniej M -1, co najmniej M -1 lub co najmniej M -1. [0114] Opisane tu przeciwciała anty-ifnar1 mogą wykazywać stałą dysocjacji lub Kd (koff/kon) mniejszą niż 10-2 M, mniejszą niż M, mniejszą niż 10-3 M, mniejszą niż M, mniejszą niż 10-4 M, mniejszą niż M, mniejszą niż 10-5 M, mniejszą niż M, mniejszą niż 10-6 M, mniejszą niż M, mniejszą niż 10-7 M, mniejszą niż M, mniejszą niż 10-8 M, mniejszą niż M, mniejszą niż 10-9 M, mniejszą niż M, mniejszą niż M, mniejszą niż M, mniejszą niż M, mniejszą niż M, mniejszą niż M, mniejszą niż M, mniejszą niż M, mniejszą niż M, mniejszą niż M, mniejszą niż M, mniejszą niż M lub mniejszą niż M Swoistość interferonu podtyp alfa [0115] Opisane tu przeciwciała anty-ifnar1 mogą wykazywać zdolność do blokowania wiązania z IFNAR1 i/lub neutralizowania biologicznej aktywności jednego lub więcej

30 -29- interferonów typu I (IFN), włączając, nieograniczająco, IFNα, IFNβ i IFNω. Wiązanie podtypów IFNα mogą być określone za pomocą rutynowych testów kompetycyjnych takich jak opisane w "Antibodies: A Laboratory Manual", CSHL. Opisane tu przeciwciała anty-ifnar1 mogą wykazywać zdolność do blokowania wiązania z IFNAR1 i/lub neutralizowania biologicznej aktywności IFNα, IFNβ i IFNω. Opisane tu przeciwciała anty-ifnar1 mogą wykazywać zdolność do blokowania wiązania z IFNAR1 i/lub neutralizowania biologicznej aktywności jednego lub więcej podtypów IFNα, włączając, nieograniczająco, podtypy IFNα 11, 2a, 2b, 4, 4b, 5, 6, 7, 8, 10, 14, 16, 17 i 21. Opisane tu przeciwciała anty-ifnar1 mogą wykazywać zdolność do blokowania wiązania z IFNAR1 i/lub neutralizowania biologicznej aktywności wszystkich podtypów IFNα. W związku z tym, opisane tu przeciwciała anty- IFNAR1 mogą wykazywać zdolność do blokowania wiązania i/lub neutralizowania biologicznej aktywności podtypów IFNα - IFNα 1, 2a, 2b, 4, 4b, 5, 6, 7, 8, 10, 14, 16, 17 i 21. Opisane tu przeciwciała anty-ifnar1 mogą nie wykazywać zdolności do blokowania wiązania z IFNAR1 i/lub neutralizowania biologicznej aktywności jednego lub więcej podtypów IFNα, włączając, nieograniczająco, podtypy IFNα 1, 2a, 2b, 4, 4b, 5, 6, 7, 8, 10, 14, 16, 17 i 21. W konkretnym przykładzie wykonania przeciwciała anty-ifnar1 opisane tu przeciwciała anty- IFNAR1 mogą wykazywać zdolność do blokowania wiązania z IFNAR1 i/lub neutralizowania biologicznej aktywności wszystkich podtypów IFNα z wyjątkiem IFNα21. [0116] Opisane tu przeciwciała anty-ifnar1 mogą wykazywać zdolność do blokowania wiązania z IFNAR1 i/lub neutralizowania biologicznej aktywności co najmniej 1, co najmniej 2, co najmniej 3, co najmniej 4, co najmniej 5, co najmniej 6, co najmniej 7, co najmniej 8, co najmniej 9, co najmniej 10, przynajmniej 11, przynajmniej 12, lub przynajmniej 13 następujących podtypów IFNα: 1, 2a, 2b, 4, 4b, 5, 6, 7, 8, 10, 14, 16, 17 i 21. W alternatywnym przykładzie wykonania opisane tu przeciwciała anty-ifnar1 mogą nie wykazywać zdolności do blokowania wiązania z IFNAR1 i/lub neutralizowania biologicznej aktywności co najmniej 1, co najmniej 2, co najmniej 3, co najmniej 4, co najmniej 5, co najmniej 6, co najmniej 7, co najmniej 8, co najmniej 9, co najmniej 10, przynajmniej 11, przynajmniej 12, lub co najmniej 13 następujących podtypów IFNα: 1, 2a, 2b, 4, 4b, 5, 6, 7, 8, 10, 14, 16, 17 i 21. [0117] Opisane tu przeciwciała anty-ifnar1 mogą wykazywać zdolność do blokowania wiązania z IFNAR1 i/lub neutralizowania biologicznej aktywności niewystępujących naturalnie interferonów podobnych do typu I. Takie niewystępujące naturalnie interferony podobne do typu I, lub hybrydowe interferony podobne do typu I reprezentują cząsteczki, które zostały zmienione w stosunku do ich naturalnie występujących struktur za pomocą technik rekombinacji lub syntezy. Hybrydowe interferony jak opisano w patencie US7,232,563, reprezentują wymianę cząsteczkowe w różnych segmentach naturalnie występujących struktur interferonu w celu wytworzenia cząsteczki, która ma większą siłę i/lub zmniejszoną toksyczność. [0118] Opisane tu przeciwciała anty-ifnar1 mogą wykazywać zdolność do blokowania wiązania z IFNAR1 i/lub neutralizowania biologicznej aktywności zmutowanych interferonów typu I. Zmutowane interferony typu I opisano w patentach US6,299,870 i 6,300,474.

31 -30- [0119] Opisane tu przeciwciała anty-ifnar1 mogą wykazywać zdolność do blokowania wiązania z IFNAR1 i/lub neutralizowania biologicznej aktywności interferonów podobnych do typu I, takich jak interferony pochodzące z innych gatunków zwierząt. Takie interferony podobne do typu I izoluje się z kurczaka, kota, myszy, szczura, królika, kozy, konia lub z innych gatunków zwierząt. W konkretnych przykładach wykonania ludzkie interferony typu I izoluje się z komórek pochodzących z kurczaka, kota, myszy, szczura, królika, kozy, konia lub innych gatunków zwierząt. W innych przykładach wykonania ludzkie interferony typu I powodują różne wzorce glikozylacji gdy pochodzą z kurczaka, kota, myszy, szczura, królika, kozy, konia lub innych gatunków zwierząt. Dalsze omówienie interferonów innych gatunków zwierząt znajduje się w publikacji WIPO nr WO A3. [0120] Dla celów wynalazku, zdolność opisanych tu przeciwciał anty-ifnar1 do neutralizacji aktywności IFNα można monitorować, na przykład, w teście aktywacji receptora kinazy (KIRA), jak opisano w WO 95/14930 opublikowanym 1 czerwca 1995 r., przez pomiar zdolności kandydującego przeciwciała do zmniejszania fosforylacji tyrozyny (wynikającej z wiązania liganda) w kompleksie receptora IFNAR1/R2. [0121] Alternatywnie lub opcjonalnie, zdolność opisanych tu przeciwciał anty-ifnar1 do neutralizowania wywoływania odpowiedzi komórkowej przez IFNα można zbadać przez monitorowanie neutralizacji przeciwwirusowej aktywności IFNα jak opisano w Kawade, J. Interferon Res. 1:61 70 (1980) lub Kawade i Watanabe, J. Interferon Res. 4: (1984) lub Yousefi, et al., Am. J. Clin. Pathol. 83: (1985), lub przez badanie zdolności opisanych tu przeciwciał anty-ifnar1 do neutralizowania zdolności IFNα do aktywowania wiązania cząsteczki sygnałowej, czynnika stymulowany przez interferon 3 (ISGF3), z oligonukleotydem pochodzącym z region odpowiedzi stymulowanej przez interferon (ISRE) w elektroforetycznym teście zmiany ruchliwości, jak opisano w Kurabayashi et al., Mol. Cell Biol., 15: 6386 (1995). [0122] Opisane tu przeciwciała anty-ifnar1 mogą wykazywać zdolność do hamowania co najmniej jednej funkcji receptora IFNAR1 mediowanej przez IFNα. Opisane tu przeciwciała anty-ifnar1 mogą wykazywać hamowanie aktywności receptora IFNAR1 w odpowiedzi na IFNα lub jego podtypy o co najmniej około 60%, co najmniej około 70%, co najmniej około 75%, co najmniej około 80%, co najmniej około 85 %, co najmniej około 90%, co najmniej około 95%, lub co najmniej około 99%. Opisane tu przeciwciała anty-ifnar1 mogą wykazywać hamowanie aktywności receptora IFNAR1 w odpowiedzi na IFNα lub jego podtypy, co zmierzono za pomocą opisanego powyżej testu KIRA, o co najmniej około 60%, co najmniej około 70%, co najmniej około 75%, co najmniej około 80%, co najmniej około 85%, co najmniej około 90%, co najmniej około 95%, lub co najmniej około 99%. Opisane tu przeciwciała anty-ifnar1 mogą wykazywać hamowanie aktywności receptora IFNAR1 w odpowiedzi na IFNα lub jego podtypy, co zmierzono za pomocą wiązania cząsteczki sygnałowej, czynnika stymulowany przez interferon 3 (ISGF3), z oligonukleotydem pochodzącym z region odpowiedzi stymulowanej przez interferon (ISRE) w elektroforetycznym teście zmiany ruchliwości, jak opisano w Kurabayashi et al., Mol. Cell Biol., 15: 6386 (1995), o co najmniej około 60%, co najmniej około 70%, co najmniej około

32 -31-75%, co najmniej około 80%, co najmniej około 85%, co najmniej około 90%, co najmniej około 95%, lub co najmniej około 99%. Opisane tu przeciwciała anty-ifnar1 mogą wykazywać aktywność receptora IFNAR1 w odpowiedzi na IFNα lub jego podtypy, co zmierzono w teście znanym w dziedzinie, o co najmniej około 60%, co najmniej około 70%, co najmniej około 75%, co najmniej około 80%, co najmniej około 85%, co najmniej około 90%, co najmniej około 95%, lub co najmniej około 99%. [0123] Opisane tu przeciwciała anty-ifnar1 mogą wykazywać zdolność do neutralizowania właściwości przeciwwirusowych IFNα lub jego podtypów. Opisane tu przeciwciała anty- IFNAR1 mogą neutralizować co najmniej około 60%, co najmniej około 70%, co najmniej około 75%, co najmniej około 80%, co najmniej około 85%, co najmniej około 90%, co najmniej około 95%, lub co najmniej około 99% aktywności przeciwwirusowej IFNα lub jego podtypów, co określono za pomocą testu przeciwwirusowego od Kawade (1980), or Yousefi (1985). W alternatywnym przykładzie wykonania opisane tu przeciwciała anty-ifnar1 mogą neutralizować właściwości przeciwwirusowe IFNα lub jego podtypów. [0124] Opisana tu zdolność przeciwciał anty-ifnar1 do blokowania wiązania IFNα lub jego podtypów do IFNAR1 może zostać ustalona w rutynowym teście kompetycyjnym, takim jak opisano w Antibodies: A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratory, Ed Harlow and David Lane (1988). Opisane tu przeciwciała anty-ifnar1 mogą wykazywać zdolność do blokowania lub hamowania wiązania następujących podtypów IFNα: 1, 2, 4, 5, 8, 10 i 21 do IFNAR1. Opisane tu przeciwciała anty-ifnar1 mogą wykazywać zdolność do blokowania lub hamowania wiązania: co najmniej 1, co najmniej 2, co najmniej 3, co najmniej 4, co najmniej 5, co najmniej 6, a przynajmniej 7 z następujących podtypów IFNα: 1, 2, 4, 5, 8, 10 i 21 do IFNAR1. [0125] Opisane tu przeciwciała anty-ifnar1 mogą działać na IFNAR w celu regulowania genów odpowiedzi IFN-I. Geny odpowiedzi IFN-I zidentyfikowano w amerykańskich zgłoszeniach patentowych zatytułowanych "IFN alpha-induced Pharmacodynamic Markers o następujących numerach seryjnych; 60/873008, złożonym 6 grudnia 2006 r.; 60/907762, złożonym 16 kwietnia 2007 r.; 60/924, 584, złożonym 21 maja, 2007 r. i 60/960,187, złożonym 19 września 2007 r Przeciwciała [0126] Opisane tu przeciwciała mogą obejmować przeciwciała monoklonalne, przeciwciała wieloswoiste, ludzkie przeciwciała, humanizowane przeciwciała, przeciwciała o nadanej charakterystyce przeciwciał wielbłądzich, chimeryczne przeciwciała, jednołańcuchowe Fv (scfv), połączone dwusiarczkiem Fv (sdfv), i anty-idiotypowe (anty-id) przeciwciała, i wiążące epitop fragmenty dowolnego z powyższych. W szczególności przeciwciała obejmują cząsteczki immunoglobulin i immunologicznie aktywne fragmenty cząsteczek immunoglobulin, tj. cząsteczki zawierające miejsce wiążące antygen, fragmenty te mogą być lub mogą nie być połączone z inną domeną immunoglobuliny, włączając, nieograniczająco, region Fc lub jego fragment. Jak tu wskazano, określenie "przeciwciało" i "przeciwciała" swoiście obejmują opisane tu zmodyfikowane przeciwciała. Cząsteczki immunoglobulin mogą

33 -32- być dowolnego rodzaju (np. IgG, IgE, IgM, IgD, IgA i IgY), klasy (np. IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 i IgA2) lub podklasy. Opisane tu przeciwciała mogą być dowolnego izotypu. Przeciwciała tu opisane mogą być z izotypu IgG1, IgG2, IgG3 lub IgG4. Opisane tu przeciwciała mogą być przeciwciałami pełnej długości zawierającymi regiony zmienne i stałe, lub mogą być ich fragmentami wiążącymi antygen takimi jak przeciwciało jednołańcuchowe. [0127] Stosowane tu określenie "fragment wiążący antygen" przeciwciała (lub po prostu "fragment przeciwciała") dotyczy jednego lub więcej fragmentów przeciwciała, które zachowują zdolność swoistego wiązania się z antygenem (np. IFNAR1). Wykazano, że funkcja wiązania antygenu przeciwciała może być pełniona przez fragmenty przeciwciała pełnej długości. Przykłady fragmentów wiążących objętych określeniem "fragment wiążący antygen" przeciwciała obejmują (i) fragment Fab, jednowartościowy fragment składający się z domen VL, VH, CL i CH1; (ii) fragment F(ab')2, dwuwartościowy fragment zawierający dwa fragmenty Fab połączone mostkiem dwusiarczkowym w regionie zawiasowym; (iii) fragment Fd składający się z domen VH i CH1; (Iv) fragment Fv składający się z domen VL i VH pojedynczego ramienia przeciwciała, (v) fragment dab (Ward et al., (1989) Nature 341: ), który składa się z domeny VH; i (vi) wyizolowany region determinujący komplementarność (CDR). Ponadto, mimo że dwa fragmenty domeny Fv, VL i VH, są kodowane przez oddzielne geny, można je połączyć stosując sposoby rekombinacji za pomocą syntetycznego linkera, który umożliwia ich wytwarzanie jako pojedynczego łańcucha białkowego, w którym regiony VL i VH dopasowują się tworząc cząsteczki monowalentne (znane jako jednołańcuchowy Fv (scfv), patrz na przykład Bird et al. (1988) Science 242: ; i Huston et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: ). Takie jednołańcuchowe przeciwciała mają być również objęte określeniem "fragment wiążący antygen" przeciwciała. Te fragmenty przeciwciał uzyskuje się stosując konwencjonalne techniki, znane znawcom dziedziny, a fragmenty są przeszukiwane pod kątem użyteczności w ten sam sposób co nienaruszone przeciwciała. [0128] Opisujemy białka fuzyjne (dalej określane jako "opisane tu białka fuzyjne") zawierające zmodyfikowany region Fc o zmniejszonym lub wyeliminowanym powinowactwie do liganda Fc odpowiedzialnym za ułatwianie funkcji efektorowych w porównaniu z regionem Fc o tej samej sekwencji aminokwasowej jak opisane tu białko fuzyjne, ale nie zawierające addycji, substytucji lub delecji co najmniej jednej reszty aminokwasowej w regionie Fc. [0129] Opisane tu białka fuzyjne mogą obejmować peptyd, polipeptyd, białko, rusztowanie białkowe, scfv, dsfv, diaciała, Tandab, lub mimetyk przeciwciała w fuzji ze zmodyfikowanym regionem Fc. Opisane tu białka fuzyjne mogą zawierać region linkerowy łączący peptyd, polipeptyd, białko, rusztowanie białkowe, scfv, dsfv, diaciała, Tandab, lub mimetyk przeciwciała ze zmodyfikowanym regionem Fc. Zastosowanie naturalnie występujących, jak i syntetycznych, peptydowych linkerów do łączenia polipeptydów w nowe, połączone fuzyjnie polipeptydy jest dobrze znane w literaturze (Hallewell et al., (1989), J. Biol. Chem. 264, ; Alfthan et al., (1995), Protein Eng. 8, ; Robinson i Sauer (1996), Biochemistry 35, ; Khandekar et al., (1997), J. Biol. Chem. 272, ; Fares et al., (1998), Endocrinology 139, ; Smallshaw et al., (1999), Protein Eng. 12, ; patent US5,856,456).

34 -33- [0130] Opisane tu białka fuzyjne mogą zawierać region Fc zawierający co najmniej jedną addycję, substytucję lub delecję reszty aminokwasowej wybranej z grupy składającej się z: 234, 235 i 331, przy czym stosowanym w regionie stałym systemem numerowania jest indeksem EU jak przedstawiono w Kabat et al. (1991, NIH Publication , National Technical Information Service, Springfield, VA). Opisane tu białka fuzyjne mogą zawierać region Fc zawierający co najmniej jedną resztę aminokwasową wybraną z grupy składającej się z: L234F, L235E i P331S. [0131] Opisane tu białka fuzyjne mogą ponadto zawierać region Fc zawierający co najmniej jedną addycję, substytucję lub delecję reszty aminokwasowej, która jest skorelowana z większą stabilnością białka fuzyjnego. Addycja, substytucja lub delecja reszty aminokwasowej może być w pozycji 228 w regionie Fc, przy czym stosowanym w regionie stałym systemem numerowania jest indeks EU jak przedstawiono w Kabat et al. (supra). Opisane tu białka fuzyjne mogą ponadto zawierać region Fc zawierający substytucję aminokwasową w pozycji 228, przy czym substytucją jest reszta serynowa. [0132] Przeciwciała i białka fuzyjne mogą zawierać jeden lub więcej zmodyfikowanych form glikozylowanych, tj. kompozycji węglowodanowej, która jest kowalencyjnie przyłączona do cząsteczki zawierającej region Fc. Modyfikowane formy glikozylowane mogą być użyteczne do różnych celów, włączając, nieograniczająco, zmniejszanie funkcji efektorowej. Modyfikowane formy glikozylowane można wytworzyć dowolnym sposobem znanym znawcy dziedziny, na przykład przez zastosowanie zmodyfikowanych lub eksprymujących wariantów szczepów, przez koekspresję z jednym lub więcej enzymów, na przykład DI N- acetyloglukozaminylotransferazą III (GnTI11), przez ekspresję cząsteczki zawierającej region Fc w różnych organizmach lub linie komórkowe pochodzące z różnych organizmów, lub przez modyfikację węglowodanu(ów) po eksprymowaniu cząsteczki zawierającej region Fc. Sposoby wytwarzania zmodyfikowanych form glikozylowanych są znane w dziedzinie i obejmują, nieograniczająco, te opisanych w Umana et al., 1999, Nat. Biotechnol 17: ; Davies et al., Biotechnol Bioeng 74: ; Shields et al., 2002, J Biol Chem 277: ; Shinkawa et al., 2003, J Biol Chem 278: ) patent US 6,602,684; US 10/277,370; US 10/113,929; PCT WO 00/61739A1; PCT WO 01/292246A1; PCT WO 02/311140A1; PCT WO 02/30954A1; technologia Potillegent (Biowa, Inc. Princeton, N.J.); technologia modyfikacji za pomocą glikozylizacji GlycoMAb (GLYCART biotechnology AG, Zurich, Switzerland); WO ; EA ; US ; Okazaki et al., 2004, JMB, 336: Koniugaty przeciwciał [0133] Opisujemy zastosowanie przeciwciał lub ich fragmentów skoniugowanych lub w fuzji z jednym lub więcej ugrupowań, włączając, nieograniczająco, peptydy, polipeptydy, białka, białka fuzyjne, cząsteczki kwasu nukleinowego, małe cząsteczki, środki mimikujące, leki syntetyczne, cząsteczki nieorganiczne i cząsteczki organiczne. [0134] Opisujemy zastosowanie przeciwciał lub ich fragmentów rekombinacyjnie poddanych fuzji lub chemicznie sprzężonych (włączając zarówno kowalencyjne jak i niekowalencyjne) z heterologicznym białkiem lub polipeptydem (lub jego fragmentem, z polipeptydem o co

35 -34- najmniej 10, co najmniej 20, co najmniej 30, co najmniej 40, co najmniej 50, co najmniej j 60, co najmniej 70, co najmniej 80, co najmniej 90 lub co najmniej 100 aminokwasach) w celu wytworzenia białek fuzyjnych. Fuzje nie muszą koniecznie być bezpośrednie, ale mogą następować przez sekwencje linkerowe. Na przykład, przeciwciała mogą być stosowane do skierowania heterologicznych polipeptydów do określonych rodzajów komórek, zarówno in vitro jak i in vivo, przez fuzję lub sprzężenie przeciwciała z przeciwciałami swoistymi dla konkretnych receptorów powierzchni komórkowej. Przeciwciała w fuzji lub sprzężone z heterologicznymi polipeptydami można także stosować w testach immunologicznych in vitro i w sposobach oczyszczania z zastosowaniem sposobów znanych w dziedzinie. Patrz np. międzynarodowa publikacja WO 93/21232; patent europejski EP 439,095; Naramura et al., 1994, Immunol. Lett. 39:91-99; patent US 5,474,981; Gillies et al., 1992, PNAS 89: ; i Fell et al., 1991, J. Immunol. 146: [0135] Dodatkowe białka fuzyjne mogą być generowane za pomocą technik tasowania genów, tasowania motywów, tasowania eksonów i/lub tasowania kodonów (zbiorczo określanych jako "tasowanie DNA"). Tasowanie DNA może być zastosowane do zmiany aktywności opisanych tu przeciwciał lub ich fragmentów (np. przeciwciał lub ich fragmentów o wyższym powinowactwie i niższej dysocjacji). Patrz, ogólnie, patent US ; ; ; ; i i Patten et al., 1997, Curr. Opinion Biotechnol. 8:724-33; Harayama, 1998, Trends Biotechnol. 16(2):76-82; Hansson, et al., 1999, J. Mol. Biol. 287:265-76; i Lorenzo i Blasco, 1998, Biotechniques 24(2): Przeciwciała lub ich fragmenty, lub kodowane przeciwciała lub ich fragmenty, przed rekombinacją mogą być modyfikowane przez poddanie losowej mutagenezie za pomocą PCR podatnej na błędy, losowej insercji nukleotydów lub innymi sposobami. Jedna lub więcej części polinukleotydu kodującego przeciwciało lub fragment przeciwciała, którego część swoiście wiąże się do IFNAR1 może być rekombinowany z jednym lub więcej składników, motywów, sekcji, części, fragmentów, domen, itp., jednej lub więcej heterologicznych cząsteczek. [0136] Ponadto, przeciwciała lub ich fragmenty można łączyć z sekwencjami markerowymi, takimi jak peptyd, w celu ułatwienia oczyszczania. Sekwencja markera aminokwasowego może być peptydem heksahistydynowym, takim jak znacznik dostarczony w wektorze pqe (QIAGEN, Inc., 9259 Eton Avenue, Chatsworth, Calif., 91311), pośród innych, z których wiele jest komercyjnie dostępnych. Jak opisano w Gentz et al., 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: , na przykład, heksahistydyna zapewnia wygodne oczyszczanie białka fuzyjnego. Inne znaczniki peptydowe użyteczne do oczyszczania obejmują, nieograniczająco, znacznik hemaglutyninowy "HA", który odpowiada epitopowi pochodzącemu z białka hemaglutyniny grypy (Wilson et al., 1984, Cell 37:767), i znacznik "Flag". [0137] Przeciwciała lub ich fragmenty, analogi lub pochodne mogą być sprzężone ze środkiem diagnostycznym lub wykrywanym. Takie przeciwciała mogą być użyteczne do monitorowania lub prognozowania rozwoju lub postępu schorzenia zapalnego jako część procedury badania klinicznego, takiej jak określanie skuteczności konkretnej terapii. Taką diagnozę i wykrywanie można przeprowadzić przez sprzęganie przeciwciała z wykrywalnymi substancjami, włączając, nieograniczająco, różne enzymy takie jak, nieograniczająco, peroksydaza chrzanowa, fosfataza

36 -35- alkaliczna, beta-galaktozydaza lub acetylocholinesteraza; grupy prostetyczne, takie jak, nieograniczająco, streptawidyna/biotyna i awidyna/biotyna; materiały fluorescencyjne takie jak, nieograniczająco, umbeliferon, fluoresceina, fluoresceina izotiocyjanianu, rodamina, fluoresceina dichlorotriazynyloaminy, chlorek dansylu lub fikoerytryna; materiały luminescencyjne takie jak, nieograniczająco, luminol; materiały bioluminescencyjne takie jak, nieograniczająco, lucyferaza, lucyferyna i ekworyna; materiały radioaktywne takie jak, nieograniczająco, jod ( 131 I, 125 I, 123 I, 121 I), węgiel ( 14 C), siarka ( 35 S), tryt ( 3 H), ind ( 115 In, 113 In, 112 In, 111 In,), i technet ( 99 Tc), tal ( 201 Ti), gal ( 68 Ga, 67 Ga), pallad ( 103 Pd), molibden ( 99 Mo), ksenon ( 133 Xe), fluor ( 18 F), 153 Sm, 177 Lu, 159 Gd, 149 Pm, 140 La, 175 Yb, 166 Ho, 90 Y, 47 Sc, 186 Re, 188 Re, 142 Pr, 105 Ph, 97 Ru, 68 Ge, 57 Co, 65 Zn, 85 Sr, 32 P, 153 Gd, 169 Yb, 51 Cr, 54 Mn, 75 Se, 113 Sn, i 117 Tin; metale emitujące pozytrony z zastosowaniem różnych pozytronowych tomografii emisyjnych, nieradioaktywne paramagnetyczne jony metali, i cząsteczki, które są radioznakowane lub sprzężone ze specyficznymi radioizotopami. [0138] Techniki sprzęgania ugrupowań terapeutycznych z przeciwciałami są dobrze znane, patrz, np. Arnon et al., "Monoclonal Antibodies For Immunotargeting Of Drugs In Cancer Therapy", w Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy, Reisfeld et al. (edyt.), str (Alan R. Liss, Inc. 1985); Hellstrom et al., "Antibodies For Drug Delivery", w Controlled Drug Delivery (ed. 2), Robinson et al. (edyt.), str (Marcel Dekker, Inc. 1987); Thorpe, "Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy: A Review", w Monoclonal Antibodies 84: Biological And Clinical Applications, Pinchera et al. (edyt.), str (1985); "Analysis, Results, And Future Prospective Of The Therapeutic Use Of Radiolabeled Antibody In Cancer Therapy", w Monoclonal Antibodies For Cancer Detection And Therapy, Baldwin et al. (edyt.), str (Academic Press 1985), i Thorpe et al., 1982, Immunol. Rev. 62: [0139] Alternatywnie, przeciwciało może być sprzężone z drugim przeciwciałem tworząc heterokoniugat przeciwciała jak opisał Segal w patencie US 4,676,980. [0140] Ugrupowanie terapeutyczne lub lek sprzężony z przeciwciałem lub jego fragmentem, który wiąże się swoiście z IFNAR1 powinno być wybrane tak, aby osiągać pożądany efekt(y) profilaktyczny lub terapeutyczny dla danego zaburzenia u osobnika. Lekarz lub inny personel medyczny, przy podejmowaniu decyzji, które ugrupowanie terapeutyczne lub lek sprzęgać z przeciwciałem lub jego fragmentem, który swoiście wiąże się z IFNAR1, powinien rozważyć następujące: rodzaj choroby, nasilenie choroby i stan osobnika Sposoby wytwarzania przeciwciał [0141] Przeciwciała lub ich fragmenty mogą być wytwarzane dowolnym sposobem znanym w dziedzinie do syntezy przeciwciał, w szczególności, za pomocą syntezy chemicznej lub technikami rekombinacyjnej ekspresji. [0142] Monoklonalne przeciwciała mogą być wytwarzane z zastosowaniem wielu różnych technik znanych w dziedzinie, włączając zastosowanie technik hybrydoma, rekombinacji i prezentacji na fagu, lub ich kombinacji. Na przykład, przeciwciała monoklonalne mogą być wytwarzane z zastosowaniem technik hybrydoma włączając te znane w dziedzinie i wykładane

37 -36- na przykład w Harlow et al., "Antibodies: A Laboratory Manual", (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2 wyd. 1988); Hammerling, et al., w: Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas (Elsevier, N.Y., 1981). Stosowane tu określenie "przeciwciało monoklonalne" nie jest ograniczone do przeciwciał wytwarzanych za pomocą technologii hybrydoma. Określenie "przeciwciało monoklonalne" dotyczy przeciwciała, które pochodzi z pojedynczego klonu, włączając dowolny klon eukariotyczny, prokariotyczny lub faga, a nie do sposobu jakim jest wytwarzane. [0143] Sposoby wytwarzania i przeszukiwania dla konkretnych przeciwciał z zastosowaniem technologii hybrydoma są rutynowe i znane w dziedzinie. Pokrótce, myszy mogą być immunizowane IFNAR1, a kiedy wykrywa się odpowiedź immunologiczną, np. w surowicy myszy wykrywa się przeciwciała swoiste dla IFNAR1, pobiera się śledziony i izoluje splenocyty. Splenocyty są następnie poddawane fuzji za pomocą dobrze znanych technik z dowolnymi odpowiednimi komórkami szpiczaka, na przykład komórkami z linii komórkowej SP20 dostępnej z ATCC. Hybrydomy są selekcjonowane i klonowane przez ograniczone rozcieńczanie. Klony hybrydoma są następnie badane sposobami znanymi w dziedzinie pod kątem komórek, które wydzielają przeciwciała zdolne do wiązania opisanego tu polipeptydu. Płyn puchlinowy, która zazwyczaj zawiera duże ilości przeciwciał, może być generowany przez immunizację myszy pozytywnymi klonami hybrydoma. [0144] Zgodnie z tym, monoklonalne przeciwciała można wytwarzać przez hodowanie komórki hybrydoma wydzielającej opisane tu przeciwciało, przy czym hybrydoma jest generowana przez fuzję splenocytów izolowanych od myszy immunizowanych IFNAR1 z komórkami szpiczaka, a następnie hybrydomy powstałe z fuzji klonów są przeszukiwane pod kątem klonów hybrydoma wydzielających przeciwciało zdolne do wiązania IFNAR1. [0145] Fragmenty przeciwciała, które rozpoznają swoiste epitopy IFNAR1 mogą być wytwarzane dowolnym sposobem znanym znawcy dziedziny. Na przykład, opisane tu fragmenty Fab i F(ab')2 mogą być wytwarzane przez proteolityczne rozszczepienie cząsteczek immunoglobulin z zastosowaniem enzymów takich jak papaina (w celu wytworzenia fragmentów Fab) lub pepsyna (w celu wytworzenia fragmentów F(ab')2). Fragmenty F(ab')2 zawierają region zmienny, region stały łańcucha lekkiego i domenę CH1 łańcucha ciężkiego. Ponadto, przeciwciała mogą być również wytwarzane za pomocą różnych znanych w dziedzinie sposobów prezentacji na fagu. [0146] W sposobach prezentacji na fagu funkcjonalne domeny przeciwciał są prezentowane na powierzchni cząstek faga, które niosą kodujące je sekwencje polinukleotydowe. Konkretnie, sekwencje DNA kodujące domeny VH i VL są amplifikowane z biblioteki cdna pochodzenia zwierzęcego (np. ludzkie lub mysie biblioteki cdna tkanek limfatycznych). DNA kodujące domeny VH i VL są rekombinowane wraz z linkerem scfv przez PCR i klonowane do wektora fagmidowego (np. p CANTAB 6 lub pcomb 3 HSS). Wektor jest włączany do E. coli za pomocą elektropolacji i E. coli jest infekowana fagiem pomocniczym. Fag stosowany w takich sposobach jest zazwyczaj fagiem nitkowatym włączając fd i M13, a domeny VH i VL są zwykle poddawane fuzji przez rekombinację z genem III lub z genem VIII faga. Fag eksprymujący domenę wiążącą antygen, która wiąże się z epitopem IFNAR1 będącym przedmiotem

38 -37- zainteresowania, może być wybrany lub zidentyfikowany za pomocą antygenu, np. przez zastosowanie wyznakowanego antygenu lub antygenu związanego lub wychwyconego przez powierzchnię ciała stałego lub kulki. Przykłady sposobów prezentacji na fagu, które mogą być zastosowane do wytworzenia przeciwciał według wynalazku obejmują te ujawnione w Brinkman et al., 1995, J. Immunol. Methods 182:41-50; Ames et al., 1995, J. Immunol. Methods 184: ; Kettleborough et al., 1994, Eur. J. Immunol. 24: ; Persic et al., 1997, Gene 187:9-18; Burton et al., 1994, Advances in Immunology 57: ; międzynarodowe zgłoszenie PCT/GB91/01134; międzynarodowe publikacje WO 90/02809, WO 91/10737, WO 92/01047, WO 92/18619, WO 93/11236, WO 95/15982, WO 95/20401 i WO97/13844; i patenty US 5,698,426, 5,223,409, 5,403,484, 5,580,717, 5,427,908, 5,750,753, 5,821,047, 5,571,698, 5,427,908, 5,516,637, 5,780,225, 5,658,727, 5,733,743 i 5,969,108. [0147] Jak opisano w powyższych referencjach, po selekcji fagów, regiony faga kodujące przeciwciało można wyizolować i zastosować do wytworzenia całych przeciwciał, włączając ludzkie przeciwciała, lub dowolnego innego pożądanego fragmentu wiążącego antygen, i eksprymowania w dowolnym pożądanym gospodarzu, włączając komórki ssacze, komórki owadzie, komórki roślinne, drożdże i bakterie, np. jak opisano poniżej. Techniki wytwarzania rekombinowanych Fab, Fab' i F(ab')2 mogą być również stosowane z wykorzystaniem sposobów znanych w dziedzinie, takich jak te ujawnione w międzynarodowej publikacji WO 92/22324; Mullinax et al., 1992, BioTechniques 12(6): ; Sawai et al., 1995, AJRI 34:26-34; i Better et al., 1988, Science 240: [0148] Do wytworzenia całych przeciwciał, do amplifikacji sekwencji VH i VL w klonach scfv można zastosować primery PCR włączając sekwencje nukleotydowe VH lub VL, miejsce restrykcyjne i sekwencję flankującą do ochrony miejsca restrykcyjnego. Wykorzystując techniki klonowania znane znawcy dziedziny, domeny VH zamplifikowane za pomocą PCR mogą być klonowane do wektorów eksprymujących region stały VH, np. ludzki region stały gamma 4, a VL zamplifikowane za pomocą PCR mogą być klonowane do wektorów eksprymujących region stały VL, np. ludzkie regiony stałe kappa lub lambda. W pewnych przykładach wykonania wektory do ekspresji domen VH lub VL zawierają promotor EF-1 alfa, sygnał sekrecji, miejsce klonowania dla domen zmiennych, domen stałych i marker selekcyjny taki jak neomycyna. Domeny VH i VL mogą być klonowane do jednego wektora eksprymującego niezbędne regiony stałe. Wektory konwersji łańcucha ciężkiego i wektory konwersji łańcucha lekkiego następnie kotransfekuje się, z zastosowaniem technik znanych znawcom dziedziny, do linii komórkowych w celu wytwarzania stabilnych lub przejściowych linii komórkowych, które eksprymują przeciwciała pełnej długości, np. IgG. [0149] Dla niektórych zastosowań, włączając zastosowanie przeciwciał u ludzi in vivo i w testach wykrywania in vitro, korzystne może być zastosowanie przeciwciał ludzkich lub chimerycznych. W pełni ludzkie przeciwciała są szczególnie pożądane do terapeutycznego leczenia osobników ludzkich. Ludzkie przeciwciała można wytwarzać różnymi sposobami znanymi w dziedzinie, włączając opisane powyżej sposoby prezentacji na fagu z zastosowaniem bibliotek przeciwciał pochodzących z sekwencji ludzkich immunoglobulin.

39 -38- Patrz także patenty US4,444,887 i 4,716,111; i międzynarodowe publikacje WO 98/46645, WO 98/50433, WO 98/24893, WO98/16654, WO 96/34096, WO 96/33735 i WO 91/ [0150] Chimeryczne przeciwciało jest cząsteczką, w której różne fragmenty przeciwciała pochodzą z różnych cząsteczek immunoglobulin. Sposoby wytwarzania przeciwciał chimerycznych są znane w dziedzinie. Patrz np. Morrison, 1985, Science 229:1202; Oi et al., 1986, BioTechniques 4:214; Gillies et al., 1989, J. Immunol. Methods 125: ; i patenty US 5,807,715, 4,816,567, 4,816,397 i 6,311,415. [0151] Humanizowane przeciwciało to przeciwciało lub jego fragment, który jest zdolny do wiązania się z wstępnie określonym antygenem, i który zawiera region zrębowy zasadniczo o sekwencji aminokwasowej ludzkiej immunoglobuliny oraz CDR zasadniczo o sekwencji aminokwasowej immunoglobuliny innej niż ludzka. Humanizowane przeciwciało zawiera zasadniczo wszystkie z co najmniej jednej, a zazwyczaj dwóch domen zmiennych (Fab, Fab', F(ab')2, Fabc, Fv), w których wszystkie lub zasadniczo wszystkie regiony CDR odpowiadają tym z immunoglobuliny innej niż ludzka (tj. przeciwciało donorowe) i wszystkie lub zasadniczo wszystkie regiony zrębowe są regionami o sekwencji konsensusowej ludzkiej immunoglobuliny. W pewnych przypadkach humanizowane przeciwciało zawiera także co najmniej część regionu stałego immunoglobuliny (Fc), zazwyczaj tego z ludzkiej immunoglobuliny. Zazwyczaj przeciwciało zawierać będzie zarówno łańcuch lekki jak i przynajmniej domenę zmienną łańcucha ciężkiego. Przeciwciało może również obejmować CH1, region zawiasowy, regiony CH2, CH3, CH4 łańcucha ciężkiego. Humanizowane przeciwciało może być wybrane z dowolnej klasy immunoglobulin, włączając IgM, IgG, IgD; IgA i IgE, i dowolnego izotypu, włączając IgG1, IgG2, IgG3 i IgG4. Zazwyczaj domena stała jest domeną stałą uzupełniającą stabilizację, gdy jest to pożądane, aby humanizowane przeciwciało wykazywało: aktywność cytotoksyczną, a klasa to zwykle IgG1. W przypadku gdy taka aktywność cytotoksyczna nie jest pożądana, domena stała może należeć do klasy IgG2. Humanizowane przeciwciało może zawierać sekwencje z więcej niż jednej klasy lub izotypu, a wybór konkretnych domen stałych w celu optymalizacji pożądanych funkcji efektorowych mieści się w zakresie biegłości znawcy dziedziny. Region zrębowy i regiony CDR humanizowanego przeciwciała nie muszą dokładnie odpowiadać sekwencjom macierzystym, np. donorowy CDR lub konsensus regionu zrębowego może być mutagenizowany za pomocą substytucji, insercji lub delecji co najmniej jednej reszty tak, że reszta w takim miejscu CDR lub regionu zrębowego nie odpowiada konsensusowi lub importowanemu przeciwciału. Takie mutacje jednakże nie będą rozległe. Zazwyczaj, przynajmniej 75% reszt humanizowanego przeciwciała odpowiadać będzie tym rodzicielskim regionu zrębowego (FR) i sekwencjom CDR, częściej 90%, i prawdopodobnie więcej niż 95%. Humanizowane przeciwciało może być wytworzone za pomocą różnych technik znanych w dziedzinie, włączając, nieograniczająco, przeszczepianie CDR (europejski patent nr EP 239,400; międzynarodowa publikacja nr WO 91/09967; i patenty US 5,225,539, 5,530,101 i 5,585,089), techniki licowania (ang. veneering) i zmieniania powierzchni (ang. resurfacing) (europejskie patenty nr EP 592,106 i EP 519,596; Padlan, 1991, Molecular Immunology 28(4/5): ; Studnicka et al., 1994, Protein Engineering 7(6): ; i Roguska et al., 1994, PNAS 91: ), tasowanie łańcuchów (patent US 5,565,332), i techniki ujawnione np. w patentach US 6,407,213, 5,766,886, WO

40 , Tan et al., J. Immunol. 169: (2002), Caldas et al., Protein Eng. 13(5): (2000), Morea et al., Methods 20(3): (2000), Baca et al., J. Biol. Chem. 272(16): (1997), Roguska et al., Protein Eng. 9(10): (1996), Couto et al., Cancer Res. 55 (23 Supp):5973s-5977s (1995), Couto et al., Cancer Res. 55(8): (1995), Sandhu J S, Gene 150(2): (1994) i Pedersen et al., J. Mol. Biol. 235(3): (1994). Często reszty zrębowe z regionów zrębowych będą podstawione odpowiadającymi resztami CDR przeciwciała donorowego w celu zmiany lub poprawy wiązania antygenu. Te substytucje zrębowe są identyfikowane za pomocą sposobów znanych w dziedzinie, np. za pomocą modelowania oddziaływań CDR i reszt zrębowych w celu zidentyfikowania reszt zrębowych ważnych dla wiązania antygenu i porównywania sekwencji w celu zidentyfikowania nietypowych reszt zrębowych w konkretnych pozycjach. (Patrz np. Queen et al., patent US 5,585,089; i Riechmann et al., 1988, Nature 332: Polinukleotydy kodujące przeciwciało [0152] Opisujemy polinukleotydy, które ulegają hybrydyzacji w warunkach wysokiej ostrości, średniej lub niskiej ostrości hybrydyzacji, np. zgodnie z powyższą definicją, do polinukleotydów, które kodują opisane tu przeciwciała. [0153] Polinukleotydy można otrzymać, a sekwencję nukleotydową polinukleotydów określić, dowolną metodą znaną w dziedzinie. Ponieważ sekwencje aminokwasowe przeciwciał są znane, sekwencje nukleotydowe kodujące te przeciwciała można określić za pomocą sposobów znanych w dziedzinie, tj. kodony nukleotydowe, o których wiadomo, że kodują swoiste aminokwasy są składane w taki sposób, aby wytworzyć kwas nukleinowy, który koduje opisane tu przeciwciało lub jego fragment. Taki polinukleotyd kodujący przeciwciało może być składany z syntetycznych oligonukleotydów (np. jak opisano w Kutmejer et al., 1994, BioTechniques 17:242), co, w skrócie, obejmuje syntezę pokrywających się oligonukleotydów zawierających części sekwencji kodującej przeciwciało; annealing i ligację tych oligonukleotydów, a następnie amplifikację zligowanych oligonukleotydów za pomocą PCR. [0154] Alternatywnie, polinukleotyd kodujący przeciwciało można wytworzyć z kwasu nukleinowego z odpowiedniego źródła. Jeżeli klon zawierający kwas nukleinowy kodujący konkretne przeciwciało jest niedostępny, ale sekwencja cząsteczki przeciwciała jest znana, kwas nukleinowy kodujący immunoglobulinę można zsyntetyzować chemicznie lub otrzymać z odpowiedniego źródła (np. biblioteki cdna przeciwciał, lub wygenerowanych z biblioteki cdna, lub kwasu nukleinowego, zazwyczaj poli A + RNA, wyizolowanego z dowolnej tkanki lub komórek wyrażających przeciwciało takich jak komórki hybrydoma wybranych do ekspresji opisanego tu przeciwciała) przez amplifikację PCR z zastosowaniem syntetycznych primerów zdolnych do hybrydyzacji do końców 3' i 5' sekwencji lub przez klonowanie z zastosowaniem sondy oligonukleotydowej swoistej dla określonej sekwencji genu w celu zidentyfikowania np. klonu cdna z biblioteki cdna, który koduje przeciwciało. Powielone kwasy nukleinowe wytworzone za pomocą PCR można następnie klonować do replikacyjnych wektorów do klonowania przy zastosowaniu dowolnego sposobu znanego w dziedzinie.

41 -40- [0155] Gdy sekwencja nukleotydowa przeciwciała jest określona, sekwencją nukleotydową przeciwciała można manipulować za pomocą sposobów znanych w dziedzinie do manipulacji sekwencji nukleotydowych, np. techniki rekombinacji DNA, ukierunkowana mutageneza, PCR itd. (patrz na Sambrook et al., 1990, "Molecular Cloning, A Laboratory Manual", 2 wyd., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y. and Ausubel et al., edyt., 1998, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, NY), w celu wytworzenia przeciwciał o różnej sekwencji aminokwasowej, na przykład w celu wytworzenia aminokwasowych substytucji, delecji i/lub insercji. [0156] W konkretnym przykładzie wykonania za pomocą rutynowych technik rekombinacji DNA do regionów zrębowych wstawia się jeden lub więcej CDR. Regiony zrębowe mogą być naturalnie występującymi lub konsensusowymi regionami zrębowymi, a w niektórych przypadkach ludzkimi regionami zrębowymi (patrz np. ludzkie regiony zrębowe wymienione w Chothia et al., 1998, J. Mol. Biol. 278: ). Ewentualnie, polinukleotyd wytworzony przez kombinację regionów zrębowych i CDR koduje przeciwciało, które swoiście wiąże się z IFNAR1. Ewentualnie, jedna lub więcej substytucji aminokwasowych można wykonać w regionach zrębowych, a w niektórych przypadkach, substytucje aminokwasowe poprawiają wiązanie się przeciwciała z jego antygenem. Ponadto, takie sposoby mogą być stosowane do wykonywania substytucji aminokwasowych lub delecji jednej lub więcej reszt cysteinowych w regionach zmiennych uczestniczących w wewnątrzłańcuchowym wiązaniu disiarczkowym w celu wytworzenia cząsteczek przeciwciał bez jednego lub więcej wewnątrzłańcuchowych mostków disiarczkowych. Inne zmiany polinukleotydu są w zakresie wynalazku i w zakresie umiejętności znawcy dziedziny. [0157] W konkretnych przykładach wykonania opisane tu przeciwciała są kodowane przez sekwencje polinukleotydowe przedstawione na Figurach 1-4. W innych szczególnych przykładach wykonania polinukleotydy kodują opisane tu przeciwciała zawierające regiony stałe łańcucha lekkiego i łańcucha ciężkiego odpowiadające, odpowiednio, SEQ ID NO: 41 i 42. W jeszcze innych konkretnym przykładzie wykonania opisane tu polinukleotydy kodują przeciwciała zawierające regiony stałe łańcucha ciężkiego odpowiadające SEQ ID NO: 42 z uwzględnieniem zmienności alleli, przy czym zmieniona jest co najmniej jedna lub więcej reszt wybranych z grupy obejmującej pozycje 214, 221, 356 i 358 zdefiniowane przez system numerowania indeksem EU Rekombinacyjna ekspresja przeciwciała [0158] Rekombinacyjna ekspresja opisanego tu przeciwciała, jego pochodnej, analogu lub fragmentu (np. łańcuch ciężki lub lekki opisanego tu przeciwciała lub ich część lub opisane tu jednołańcuchowe przeciwciało) wymaga konstrukcji wektora ekspresyjnego zawierającego polinukleotyd, który koduje przeciwciało. Po uzyskaniu polinukleotydu kodującego opisaną tu cząsteczkę przeciwciała lub łańcuch ciężki lub lekki przeciwciała lub jego część (ale nie koniecznie zawierający domenę zmienną łańcucha ciężkiego lub lekkiego) można wytworzyć wektor do wytwarzania cząsteczki przeciwciała za pomocą technologii rekombinacji DNA stosując sposoby znane w dziedzinie. Tak więc, sposoby wytwarzania białka za pomocą ekspresji polinukleotydu zawierającego sekwencję nukleotydową kodującą opisane tu

42 -41- przeciwciało. Sposoby, które są dobrze znane znawcom dziedziny można stosować do wytwarzania wektorów ekspresyjnych zawierających sekwencje kodujące przeciwciało i odpowiednie sygnały kontrolujące transkrypcję i translację. Sposoby te obejmują, na przykład, techniki rekombinacji DNA in vitro, techniki syntezy i rekombinację genetyczną in vivo. W ten sposób opisano replikację wektorów zawierających sekwencję nukleotydową kodującą opisaną tu cząsteczkę przeciwciała, łańcuch ciężki lub lekki przeciwciała, łańcuch ciężki lub lekki domeny zmiennej przeciwciała lub jej część, lub CDR łańcucha ciężkiego lub lekkiego, funkcjonalnie połączony z promotorem. Takie wektory mogą zawierać sekwencję nukleotydową kodującą region stały cząsteczki przeciwciała (patrz np. międzynarodowa publikacja WO 86/05807; międzynarodowa publikacja WO 89/01036;. i patent US5,122,464), a domena zmienna przeciwciała może być wklonowana do takiego wektora w celu ekspresji całego ciężkiego, lub całego lekkiego łańcucha, lub zarówno całego łańcucha ciężkiego jak i lekkiego. [0159] Wektor ekspresyjny przeniesiono do komórki gospodarza z zastosowaniem konwencjonalnych technik, a następnie transfekowane komórki hodowano konwencjonalnymi technikami w celu wytwarzania opisanych tu przeciwciał. Tak więc, opisujemy komórki gospodarza zawierające polinukleotyd kodujący opisane tu przeciwciało lub jego fragmenty, lub jego łańcuch ciężki lub lekki, lub jego część, lub opisane tu przeciwciało jednołańcuchowe, funkcjonalnie połączone z heterologicznym promotorem. W celu ekspresji przeciwciał o podwójnym łańcuchu, wektory kodujące oba łańcuchy, lekki i ciężki, mogą być koeksprymowane w komórce gospodarza w celu ekspresji całej cząsteczki immunoglobuliny, jak opisano poniżej. [0160] Można wykorzystać różne systemy gospodarz-wektor ekspresyjny do ekspresji opisanych tu cząsteczek przeciwciał (patrz, np. patent US5,807,715). Takie systemy gospodarzwektor ekspresyjny to nośniki, w których sekwencje kodujące będące przedmiotem zainteresowania mogą zostać wytworzone, a następnie oczyszczone, ale również komórki, które mogą, po transformacji lub transfekcji odpowiednich sekwencji kodujących nukleotyd, eksprymować opisane tu cząsteczki przeciwciał in situ. Obejmują one, nieograniczająco, mikroorganizmy takie jak bakterie (np. E. coli i B. subtilis) transformowane wektorami ekspresyjnymi z rekombinowanym DNA bakteriofaga, DNA plazmidowym lub kosmidowym DNA zawierającym sekwencje kodujące przeciwciało; drożdże (np. Saccharomyces i Pichia) transformowane drożdżowymi rekombinowanymi wektorami ekspresyjnymi zawierającymi sekwencje kodujące przeciwciało; systemy komórek owadzich zakażone rekombinowanymi wirusowymi wektorami ekspresyjnymi (np. bakulowirusem) zawierającymi sekwencje kodujące przeciwciało; systemy komórek roślinnych zakażone rekombinowanymi wirusowymi wektorami ekspresyjnymi (np. wirusa mozaiki kalafiora, CaMV; wirusa mozaiki tytoniu, TMV) lub transformowane rekombinowanymi plazmidowymi wektorami ekspresyjnymi (np. plazmidem Ti) zawierającymi sekwencje kodujące przeciwciało; lub systemy komórek ssaczych (np. komórek COS, CHO, BHK, 293, NS0 i 3T3) niosące rekombinowane konstrukty ekspresyjne zawierające promotory pochodzące z genomu komórek ssaczych (np. promotor metalotioneinowy) lub z wirusów ssaczych (np. adenowirusowy późny promotor, promotor wirusa krowianki 7.5K). Komórki bakteryjne takie jak Escherichia coli, a w innych

43 -42- alternatywach komórki eukariotyczne, przeznaczone specjalnie do ekspresji pełnej rekombinowanej cząsteczki przeciwciała mogą być stosowane do ekspresji rekombinowanej cząsteczki przeciwciała. Na przykład, komórki ssacze, takie jak komórki jajnika chomika chińskiego (CHO), w połączeniu z wektorem, takim jak region promotorowy dla genu bezpośrednio-wczesnego z ludzkiego cytomegalowirusa, jest skutecznym systemem ekspresyjnym dla przeciwciał (Foecking et al., 1986, Gene 45:101; and Cockett et al., 1990, Bio/Technology 8:2). W konkretnym przykładzie wykonania ekspresja sekwencji nukleotydowych kodujących przeciwciała lub ich fragmenty, które wiążą się swoiście do IFNAR1, jest regulowana przez konstytutywny promotor, indukowalny promotor lub promotor swoisty tkankowo. [0161] W systemach bakteryjnych liczne wektory ekspresyjne mogą być korzystnie wybrane w zależności od zamierzonego zastosowania cząsteczki przeciwciała, która ma być eksprymowana. Na przykład, gdy ma zostać wytworzona duża ilość takiego białka do wytwarzania kompozycji farmaceutycznych cząsteczki przeciwciała, pożądane mogą być wektory, które kierują ekspresją wysokich poziomów produktów białka fuzyjnego, które jest łatwe do oczyszczania. Takie wektory obejmują, nieograniczająco, wektor ekspresyjny E. coli pur278 (Ruther et al., 1983, EMBO 12:1791), w którym sekwencję kodującą przeciwciała można wligować indywidualnie do wektora, w ramce z regionem kodującym lac Z tak, że wytwarzane jest białko fuzyjne; wektory pin (Inouye & Inouye, 1985, Nucleic Acids Res. 13: ; Van Heeke & Schuster, 1989, J. Biol. Chem. 24: ); i tym podobne. Wektory pgex mogą być również stosowane do ekspresji obcych polipeptydów jako białek fuzyjnych z S-transferazą glutationową (GST). Ogólnie, takie białka fuzyjne są rozpuszczalne i można je łatwo oczyścić z poddanych lizie komórek przez adsorpcję i wiązanie do macierzy glutationowego podłoża kulek agarozowych, a następnie elucję w obecności wolnego glutationu. Wektory pgex są zaprojektowane tak, aby zawierać miejsca cięcia dla proteaz trombiny lub czynnika Xa tak, że sklonowany docelowy produkt genowy można uwolnić od ugrupowania GST. [0162] W ssaczych komórkach gospodarza można wykorzystywać liczne oparte na wirusach systemy ekspresyjne. W przypadkach gdy wektor ekspresyjny stosowany jest adenowirus, sekwencja kodująca przeciwciało będące przedmiotem zainteresowania może być przyłączona do adenowirusowego kompleksu kontrolującego transkrypcję/ translację, np. późnego promotora i trzyczęściowej sekwencji liderowej. Taki gen chimeryczny może być następnie umieszczony w genomie adenowirusa przez rekombinację in vitro lub in vivo. Insercja do nieistotnego regionu genomu wirusa (np. region E1 lub E3) będzie skutkowało rekombinowanym wirusem, który będzie żywotny i zdolny do ekspresji cząsteczki przeciwciała w zainfekowanych gospodarzach (patrz np. Logan & Shenk, 1984, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 8 1: ). Poszczególne sygnały inicjujące mogą być także wymagane dla wydajnej translacji wstawionych sekwencji kodujących przeciwciało. Sygnały te obejmują kodon inicjacji ATG i sąsiadujące sekwencje. Ponadto, kodon inicjacji musi być w fazie z ramką odczytu pożądanej sekwencji kodującej, aby zapewnić translację całej wstawki. Te egzogenne translacyjne sygnały kontrolne i kodony inicjacji mogą być różnego pochodzenia, zarówno naturalne jak i syntetyczne. Wydajność ekspresji może być zwiększona przez wprowadzenie

44 -43- odpowiednich elementów enhancerów transkrypcji, terminatorów transkrypcji, itp. (patrz, np. Bittner et al., 1987, Methods in Enzymol. 153: ). [0163] Ponadto, można wybrać szczep komórki gospodarza, który moduluje ekspresję wprowadzonych sekwencji lub modyfikuje i procesuje produkt genu w swoisty, pożądany sposób. Takie modyfikacje (np. glikozylacja) i procesowanie (np. rozszczepianie) produktów białkowych mogą być ważne dla funkcji białka. Różne komórki gospodarza mają charakterystyczne i swoiste mechanizmy potranslacyjnego procesowania i modyfikacji białek i produktów genowych. Odpowiednie linie komórkowe lub systemy gospodarzy mogą zostać wybrane w celu zapewnienia prawidłowej modyfikacji i procesowania obcego eksprymowanego białka. W tym celu można zastosować eukariotyczne komórki gospodarza, które posiadają maszynerię komórkową do prawidłowego procesowania pierwotnego transkryptu, glikozylację i fosforylację produktu genu. Takie ssacze komórki gospodarza obejmują, nieograniczająco, komórki CHO, VERY, BHK, HeLa, COS, MDCK, 293, 3T3, W138, BT483, Hs578T, HTB2, BT2O i T47D, NS0 (mysia linia komórkowa szpiczaka, które endogennie nie wytwarza żadnych łańcuchów immunoglobulinowych), CRL7O3O i HsS78Bst. [0164] Dla długoterminowego wytwarzania o wysokiej wydajności rekombinowanych białek korzystna jest stabilna ekspresja. Przykładowo, linie komórkowe, które stabilnie wyrażają cząsteczki przeciwciała mogą być modyfikowane. Zamiast stosowania wektorów ekspresyjnych, które zawierają wirusowe miejsca startu replikacji, komórki gospodarza mogą być transformowane DNA kontrolowanym przez odpowiednie elementy kontrolujące ekspresję (np. promotor, enhancer, sekwencje, terminatory transkrypcji, miejsca poliadenylacji itd.) i marker selekcyjny. Po wprowadzeniu obcego DNA, zmodyfikowane komórki można pozostawić do wzrostu na 1-2 dni we wzbogaconym podłożu, a następnie przenieść do podłoża selekcyjnego. Marker selekcyjny w rekombinowanym plazmidzie nadaje oporność na selekcję i pozwala komórkom na stabilną integrację plazmidu do ich chromosomów i rosnąć tworząc skupiska, które z kolei mogą być klonowane i namnażane w liniach komórkowych. Sposób ten może być korzystnie stosowany do modyfikowania linii komórkowych, które eksprymują cząsteczki przeciwciała. Takie zmodyfikowane linie komórkowe mogą być szczególnie użyteczne w przeszukiwaniu i ocenie kompozycji, które działają bezpośrednio lub pośrednio z cząsteczką przeciwciała. [0165] Można wykorzystać liczne systemy selekcji włączając, nieograniczająco, można wykorzystać geny kinazy tymidynowej wirusa opryszczki pospolitej (Wigler et al., 1977, Cell 11:223), fosforybozylotransferazy hipoksantynowo-guaninowej (Szybalska i Szybalski, 1992, Proc.Natl. Acad. Sci. USA 48:202) i fosforybozylotransferazy adeninowej (Lowy et al., 1980, Cell 22:8-17), odpowiednio, w komórkach tk-, hgprt- lub aprt-. Można wykorzystać również odporność na antymetabolity jako podstawę selekcji dla następujących genów: dhfr, który nadaje oporność na metotreksat (Wigler et al., 1980, Natl. Acad. Sci. USA 77:357; O'Hare et al., 1981, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:1527); gpt, który nadaje oporność na kwas mykofenolowy (Mulligan & Berg, 1981, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:2072); neo, który nadaje oporność na aminoglikozyd G-418 (Wu and Wu, 1991, Biotherapy 3:87-95; Tolstoshev, 1993, Ann. Rev. Pharmacol. Toxicol. 32: ; Mulligan, 1993, Science 260: ; i

45 -44- Morgan i Anderson, 1993, Ann. Rev. Biochem. 62: ; Maj 1993, TIB TECH 11(5): ); i hygro, który nadaje oporność na higromycynę (Santerre et al., 1984, Gene 30:147). Sposoby powszechnie znane w dziedzinie techniki rekombinacji DNA mogą być rutynowo stosowane do wyboru pożądanego rekombinowanego klonu i takie sposoby są opisane, na przykład, w Ausubel et al. (edyt.), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, NY (1993); Kriegler, Gene Transfer and Expression, A Laboratory Manual, Stockton Press, NY (1990); i w rozdziale 12 i 13, Dracopoli et al. (edyt), Current Protocols in Human Genetics, John Wiley & Sons, NY (1994); Colberre-Garapin et al., 1981, J. Mol. Biol. 150: 1, które są w całości włączone przez odniesienie. [0166] Poziomy ekspresji cząsteczki przeciwciała mogą być zwiększone przez wektor amplifikacyjny (przegląd, patrz Bebbington i Hentschel, The use of vectors based on gene amplification for the expression of cloned genes in mammalian cells in DNA cloning, tom 3. (Academic Press, New York, 1987)). Gdy marker w wektorowym systemie eksprymującym przeciwciało jest amplifikowalny, wzrost poziomu inhibitora obecnego w hodowli komórek gospodarza zwiększa liczbę kopii genu markerowego. Ponieważ zamplifikowany region jest związany z genem przeciwciała, wytwarzanie przeciwciała również będzie zwiększone (Crouse et al., 1983, Mol. Cell. Biol. 3:257). [0167] Komórki gospodarza mogą być kotransfekowane dwoma opisanymi tu wektorami ekspresyjnymi, pierwszy wektor kodujący polipeptyd pochodzący z łańcucha ciężkiego i drugi wektor kodujący polipeptyd pochodzący z łańcucha lekkiego. Te dwa wektory mogą zawierać identyczne markery selekcyjne, które umożliwiają równą ekspresję polipeptydów łańcucha ciężkiego i lekkiego. Alternatywnie, można zastosować pojedynczy wektor, który koduje i jest zdolny do eksprymowania polipeptydów zarówno łańcucha ciężkiego jak i lekkiego. W takich sytuacjach łańcuch lekki powinien być umieszczony przed łańcuchem ciężkim, aby uniknąć nadmiaru toksycznego wolnego łańcucha ciężkiego (Proudfoot, 1986, Nature 322:52; i Kohler, 1980, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:2 197). Sekwencje kodujące dla łańcuchów ciężkich i lekkich mogą obejmować cdna lub genomowe DNA. [0168] Po wytworzeniu opisanej tu cząsteczki przeciwciał za pomocą rekombinacyjnej ekspresji, można ją oczyszczać dowolnym sposobem znanym w dziedzinie oczyszczania cząsteczki immunoglobuliny, na przykład, za pomocą chromatografii (np. jonowymiennej, powinowactwa, w szczególności powinowactwa do swoistego antygenu z(od) białka A i chromatografii kolumnowej sita molekularnego), wirowania, różnic w rozpuszczalności, lub dowolnej innej standardowej techniki do oczyszczania białek. Ponadto, opisane tu przeciwciała lub ich fragmenty mogą być połączone z opisanymi tu heterologicznymi sekwencjami polipeptydowymi lub znanymi w dziedzinie do ułatwiania oczyszczania. 5.8 Skalowalne wytwarzanie przeciwciał [0169] W celu uzyskania większej ilości, opisane tu przeciwciała mogą być wytwarzane za pomocą skalowalnego sposobu (zwany dalej "opisany tu skalowalny sposób"). W niektórych przykładach wykonania przeciwciała mogą być wytwarzane opisanym tu skalowalnym sposobem w laboratorium badawczym, który może być skalowany w celu wytwarzania

46 -45- opisanych tu przeciwciał w bioreaktorach na skalę analityczną (na przykład, nieograniczająco, bioreaktory 5L, 10L, 15L, 30L lub 50L). W innych przykładach wykonania przeciwciała mogą być wytwarzane opisanym tu skalowalnym sposobem w laboratorium badawczym, który może być skalowany w celu wytwarzania opisanych tu przeciwciał w bioreaktorach na skalę produkcyjną (na przykład, nieograniczająco, 75L, 100L, 150L, 300L lub 500L). W niektórych przykładach wykonania opisany tu skalowalny sposób skutkuje niewielkim lub brakiem zmniejszenia efektywności wytwarzania w porównaniu z procesem wytwarzania przeprowadzanym w laboratorium badawczym. W innych przykładach wykonania opisany tu skalowalny sposób wytwarzania przeciwciała z wydajnością około 10 mg/l, około 20 m/l, około 30 mg/l, około 50 mg/l, około 75 mg/l, około 100 mg/ L, około 125 mg/l, około 150 mg/l, około 175 mg/l, około 200 mg/l, około 250 mg/l, około 300 mg/l lub większą. W innych przykładach wykonania białka fuzyjne mogą być wytwarzane opisanymi tu skalowalnymi sposobami. [0170] W innych przykładach wykonania opisany tu skalowalny sposób wytwarza przeciwciała z wydajnością co najmniej około 10 mg/l, co najmniej około 20 m/l, co najmniej około 30 mg/l, co najmniej około 50 mg/l, co najmniej około 75 mg/l, co najmniej około 100 mg/l, co najmniej około 125 mg/l, co najmniej około 150 mg/l, co najmniej około 175 mg/l, co najmniej około 200 mg/l, co najmniej około 250 mg/l, co najmniej około 300 mg/l lub większą. [0171] W innych przykładach wykonania opisany tu skalowalny sposób wytwarza przeciwciała z wydajnością od około 10 mg/l do około 300 mg/l, od około 10 mg/l do około 250 mg/l, od około 10 mg/l do około 200 mg/l, od około 10 mg/l do około 175 mg/l, od około 10 mg/l do około 150 mg/l, od około 10 mg/l do około 100 mg/l, od około 20 mg/l do około 300 mg/l, od około 20 mg/l do około 250 mg/l, od około 20 mg/l do około 200 mg/l, from 20 mg/l do około 175 mg/l, od około 20 mg/l do około 150 mg/l, od około 20 mg/l do około 125 mg/l, od około 20 mg/l do około 100 mg/l, od około 30 mg/l do około 300 mg/l, od około 30 mg/l do około 250 mg/l, od około 30 mg/l do około 200 mg/l, od około 30 mg/l do około 175 mg/l, od około 30 mg/l do około 150 mg/l, od około 30 mg/l do około 125 mg/l, od około 30 mg/l do około 100 mg/l, od około 50 mg/l do około 300 mg/l, od około 50 mg/l do około 250 mg/l, od około 50 mg/l do około 200 mg/l, from 50 mg/l do około 175 mg/l, od około 50 mg/l do około 150 mg/l, od około 50 mg/l do około 125 mg/l, lub od około 50 mg/l do około 100 mg/l Dalsze sposoby modyfikowania przeciwciał [0172] Region zawiasowy Fc opisanego tu przeciwciała można zmutować w celu zmniejszenia biologicznego okresu półtrwania przeciwciała. Bardziej szczegółowo, jedną lub więcej mutacji aminokwasowych można wprowadzić do regionu powierzchni stykowej domen CH2-CH3 fragmentu Fc regionu zawiasowego tak, że przeciwciało ma ograniczone wiązanie gronkowcowego białka A (SpA) względem wiązania SpA z natywną domeną Fc regionu zawiasowego. To podejście jest opisane bardziej szczegółowo w patencie US 6,165,745 od Ward et al. [0173] Przeciwciało może być modyfikowane w celu zwiększenia biologicznego okresu półtrwania. Różne podejścia są możliwe. Na przykład, można wprowadzić jedną lub więcej z

47 -46- następujących mutacji: T252L, T254S, T256F, jak opisano w patencie US 6,277,375. W innym przykładzie wykonania można wprowadzić jedną lub więcej z następujących mutacji: M252Y, S254T, T256E, jak opisano w patencie US 7,083,784. Alternatywnie, w celu zwiększenia biologicznego okresu półtrwania, przeciwciała można modyfikować w regionie CH1 lub Cl, aby zawierał odzyskany receptor wiążący epitop pochodzący z dwóch pętli domeny CH2 regionu Fc IgG, jak opisano w patentach US i od Presta et al. [0174] Region Fc może być zmodyfikowany przez zastąpienie co najmniej jednej reszty aminokwasowej inną resztą aminokwasową w celu zmniejszenia funkcji efektorowej(ych) przeciwciała. Na przykład, jeden lub więcej aminokwasów wybranych z reszt aminokwasowych 234, 235, 236, 237, 297, 318, 320 i 322 można zastąpić innymi resztami aminokwasowymi tak, że przeciwciało ma zmniejszone powinowactwo do efektorowego liganda, ale zachowuje zdolność przeciwciała macierzystego do wiązania antygenu. Efektorowy ligand, dla którego powinowactwo jest zmniejszone może być, na przykład, receptorem Fc lub składnikiem dopełniacza C1. To podejście jest opisane bardziej szczegółowo w patentach US 5,624,821 i 5,648,260 oba od Winter et al. [0175] W innym przykładzie jeden lub więcej aminokwasów wybranych z reszt aminokwasowych 329, 331 i 322 można zastąpić innymi resztami aminokwasowymi tak, że przeciwciało ma zmniejszone wiązanie C1q i/lub zmniejszoną lub wyeliminowaną cytotoksyczność zależną od dopełniacza (CDC). To podejście jest opisane bardziej szczegółowo w patencie US 6,194,551 od Idusogie et al. [0176] W kolejnym przykładzie jedna lub więcej reszt aminokwasowych w pozycjach aminokwasowych 231 i 239 zmodyfikowano zmniejszając w ten sposób zdolność przeciwciała do wiązania dopełniacza. Takie podejście opisano w publikacji PCT WO 94/29351 od Bodmer et al. [0177] Region Fc opisanego tu przeciwciała może być dalej modyfikowany w celu zmniejszenia zdolności przeciwciała do pośredniczenia w zależnej od przeciwciał cytotoksyczności komórkowej (ADCC) i/lub zmniejszenia powinowactwa przeciwciała do receptora Fcγ przez modyfikację jednej lub więcej aminokwasów w następujących pozycjach: 238, 239, 248, 249, 252, 254, 255, 256, 258, 265, 267, 268, 269, 270, 272, 276, 278, 280, 283, 285, 286, 289, 290, 292, 293, 294, 295, 296, 298, 301, 303, 305, 307, 309, 312, 315, 320, 322, 324, 326, 327, 329, 330, 333, 334, 335, 337, 338, 340, 360, 373, 376, 378, 382, 388, 389, 398, 414, 416, 419, 430, 434, 435, 437, 438 lub 439. Podejście to opisano w publikacji PCT WO 00/42072 przez Presta. [0178] Inną rozważaną modyfikacją tych przeciwciał jest pegylacja. Przeciwciało może być pegylowane, na przykład, w celu zwiększenia biologicznego (np. w osoczu) okresu półtrwania tego przeciwciała. W celu pegylacji przeciwciała, przeciwciało lub jego fragment zwykle poddaje się reakcji z glikolem polietylenowym (PEG) takim jak reaktywna, estrowa lub aldehydowa, pochodna PEG, w warunkach, w których jedna lub więcej grup PEG zostaje przyłączona do przeciwciała lub fragmentu przeciwciała. W niektórych przypadkach pegylację prowadzi się za pomocą reakcji acylowania lub reakcji alkilowania z reaktywną cząsteczką

48 -47- PEG (lub analogicznym reaktywnym polimerem rozpuszczalnym w wodzie). Stosowane tu określenie "glikol polietylenowy" ma obejmować dowolną z form PEG, która została zastosowana do utworzenia pochodnych innych białek, takie jak mono (C1-C10) alkoksy- lub aryloksy-glikol polietylenowy lub glikol polietylenowy-maleimid. W niektórych przykładach wykonania przeciwciało, które ma być pegylowane jest przeciwciałem nieglikozylowanym. Sposoby pegylacji białek są znane w dziedzinie i mogą być stosowane dla opisanych tu przeciwciał. Patrz na przykład EP od Nishimura et al. i EP od Ishikawa et al. [0179] Tak więc, w innym opisanym tu aspekcie cechy strukturalne przeciwciał anty-ifnar1, na przykład, nieograniczająco, 3F11, 4G5, 11E2 i 9D4, są wykorzystywane do tworzenia strukturalnie pokrewnych przeciwciał anty-ifnar1, które zachowały co najmniej jedną właściwość funkcjonalną opisanych tu przeciwciał, taką jak wiązanie z IFNAR1. Na przykład, jeden lub więcej regionów CDR 3F11, 4G5, 11E2 lub 9D4 lub ich mutacje mogą być rekombinacyjnie połączone ze znanymi regionami zrębowymi i/lub innymi CDR w celu utworzenia opisanych tu dodatkowych, rekombinacyjnie zmodyfikowanych przeciwciał anty- IFNAR1 jak opisano powyżej. Inne rodzaje modyfikacji obejmują te opisane w poprzedniej sekcji. Materiałem wyjściowym dla sposobu modyfikacji jest jedna lub więcej opisanych tu sekwencji VH i/lub VL, lub jedna lub więcej modyfikacji ich regionów CDR. W celu utworzenia zmodyfikowanego przeciwciała, tak właściwie nie jest konieczne przygotowanie (tj. eksprymowanie jako białka) przeciwciała mającego jedną lub więcej opisanych tu sekwencji VH i/lub VL lub jednego lub więcej ich regionów CDR. Do utworzenia sekwencji "drugiej generacji" pochodzącej(ych) z wyjściowej(ych) sekwencji, jako materiał wyjściowy stosuje się raczej informację zawartą w sekwencji(ach), a następnie tą sekwencję(e) "drugiej generacji" wytwarza się i eksprymuje jako białko. 5.9 Kompozycje [0180] W innym aspekcie opisaliśmy kompozycje zawierające jedno lub kombinację opisanych tu przeciwciał monoklonalnych lub białek fuzyjnych zawierających ich region Fc, jak tu opisano, formułowanych razem z nośnikiem. Takie kompozycje mogą obejmować jedno lub kombinację (np. dwa lub więcej różnych) przeciwciał, białek fuzyjnych, immunokoniugatów lub biswoistych cząsteczek. W niektórych przykładach wykonania takie kompozycje są fizjologicznie tolerowane i jako takie są odpowiednie do podawania osobnikowi (określane także jako " opisana tu kompozycję farmaceutyczną"). Na przykład, opisane tu kompozycje farmaceutyczne mogą zawierać kombinację przeciwciał (lub immunokoniugatów lub biswoistych przeciwciał), które wiążą się z różnymi epitopami na docelowym antygenie lub które mają wzajemnie uzupełniające się aktywności. [0181] W innym przykładzie wykonania opisane tu kompozycje mogą zawierać jedną lub więcej farmaceutycznie dopuszczalnych soli. Przykłady takich soli obejmują kwasowe sole addycyjne i zasadowe sole addycyjne. Kwasowe sole addycyjne obejmują sole pochodzące z nietoksycznych kwasów nieorganicznych takich jak kwas solny, azotowy, fosforowy, siarkowy, bromowodorowy, jodowodorowy, fosfor i tym podobne, a także z nietoksycznych kwasów organicznych takich jak alifatyczne kwasy mono- i dikarboksylowe, fenylo-

49 -48- podstawione kwasy alkanowe, kwasy hydroksyalkanowe, kwasy aromatyczne, alifatyczne i aromatyczne kwasy sulfonowe, i podobne. Zasadowe sole addycyjne obejmują te pochodzące z metali ziem alkalicznych takich jak sód, potas, magnez, wapń i tym podobne, a także z nietoksycznymi aminami organicznymi takimi jak N, N'-dibenzyloetylenodiamina, N- metyloglukamina, chloroprokaina, cholina, dietanoloamina, etylenodiamina, prokaina i tym podobne. [0182] Opisane tu kompozycje mogą także zawierać farmaceutycznie dopuszczalny antyoksydant. Przykłady farmaceutycznie dopuszczalnych antyoksydantów obejmują: (1) antyoksydanty rozpuszczalne w wodzie takie jak kwas askorbinowy, chlorowodorek cysteiny, wodorosiarczan sodu, pirosiarczyn sodu, siarczyn sodu i tym podobne; (2) antyoksydanty rozpuszczalne w oleju takie jak palmitynian askorbylu, butylowany hydroksyanizol (BHA), butylowany hydroksytoluen (BHT), lecytyna, galusan propylu, alfa-tokoferol i tym podobne; i (3) środki chelatujące metale takie jak kwas cytrynowy, kwas etylenodiaminotetraoctowy (EDTA), sorbitol, kwas winowy, kwas fosforowy i tym podobne. [0183] Przykłady odpowiednich wodnych i niewodnych nośników, które mogą być stosowane w rozważanych opisanych tu kompozycjach obejmują wodę, etanol, poliole (takie jak glicerol, glikol propylenowy, glikol polietylenowy i tym podobne) i ich odpowiednie mieszaniny, oleje roślinne, takie jak oliwa z oliwek i estry organiczne do iniekcji takie jak oleinian etylu. Właściwą płynność można utrzymać, na przykład, przez zastosowanie materiałów powlekających takich jak lecytyna, przez utrzymanie wymaganej wielkości cząstek w przypadku dyspersji i przez użycie środków powierzchniowo czynnych. [0184] Opisane tu kompozycje mogą również zawierać adiuwanty takie jak środki konserwujące, środki zwilżające, środki emulgujące i środki dyspergujące. Zapobieganie obecności drobnoustrojów można zapewnić zarówno przez procedury sterylizacyjne jak i przez włączenie różnych środków przeciwbakteryjnych i przeciwgrzybicznych, na przykład parabenów, chlorobutanolu, fenol kwas sorbinowy, i tym podobne. Może być również pożądane włączenie do kompozycji środków izotonicznych, takich jak cukry, chlorek sodu i tym podobne. Ponadto, przedłużone wchłanianie wstrzykiwanej postaci farmaceutycznej można uzyskać przez włączenie środków, które opóźniają wchłanianie, takich jak monostearynian glinu i żelatyna. [0185] Farmaceutycznie dopuszczalne nośniki obejmują sterylne wodne roztwory lub dyspersje i sterylne proszki do doraźnego przygotowywania sterylnych roztworów lub dyspersji. Zastosowanie takich podłoży i środków dla substancji farmaceutycznie aktywnych jest znane w dziedzinie. Z wyjątkiem przypadku gdy jakieś konwencjonalne podłoże lub środek są niekompatybilne ze związkiem aktywnym, rozważa się ich zastosowanie w opisanych tu kompozycjach farmaceutycznych. Dodatkowe związki aktywne mogą również być wprowadzone do kompozycji. Zwykle kompozycje terapeutyczne muszą być sterylne i stabilne w warunkach wytwarzania i przechowywania. Kompozycję można formułować w postaci roztworu, mikroemulsji, liposomu lub innej uporządkowanej struktury odpowiedniej dla wysokiego stężenia leku. Nośnikiem może być rozpuszczalnik lub dyspersja zawierająca, na przykład, wodę, etanol, poliol (na przykład gliceryna, glikol propylenowy i ciekły glikol

50 -49- polietylenowy i tym podobne) oraz odpowiednie ich mieszaniny. Właściwą płynność można utrzymać, na przykład, przez zastosowanie powłoki, takiej jak lecytyna, przez utrzymanie wymaganej wielkości cząstek w przypadku dyspersji, i przez zastosowanie środków powierzchniowo czynnych. W wielu przypadkach korzystne będzie włączenie do kompozycji środków izotonicznych, na przykład cukrów, polialkoholi takich jak mannitol, sorbitol, lub chlorku sodu. Przedłużone wchłanianie kompozycji do wstrzykiwania można osiągnąć przez włączenie do kompozycji środka, który opóźnia wchłanianie, na przykład soli monostearynianu i żelatyny. [0186] Sterylne roztwory do wstrzykiwania można wytwarzać przez połączenie, po sterylizacji za pomocą mikrofiltracji, związku aktywnego w wymaganej ilości w odpowiednim rozpuszczalniku z jednym lub kombinacją składników wymienionych powyżej, jak wymagane. Ogólnie, dyspersje wytwarzane są przez połączenie aktywnego związku ze sterylnym nośnikiem, który zawiera podstawowe podłoże dyspersyjne i inne pożądane składniki z tych wymienionych powyżej. W przypadku sterylnych proszków do wytwarzania sterylnych roztworów do wstrzykiwania korzystnymi sposobami wytwarzania są suszenie próżniowe i suszenie sublimacyjne (liofilizacja), które dają proszek składnika aktywnego plus dowolny dodatkowy pożądany składnik z uprzednio wysterylizowanego przez filtrację roztworu. [0187] W jednym przykładzie wykonania opisane tu kompozycje (np. ciekłe formulacje) są kompozycjami wolnymi od pirogenów, które są zasadniczo wolne od endotoksyn i/lub związanych z nimi substancji pirogennych. Endotoksyny obejmują toksyny, które są zamknięte wewnątrz drobnoustrojów i są uwalniane, gdy mikroorganizmy są rozrywane/rozbijane lub giną. Substancje pirogeniczne obejmują także termostabilne substancje wywołujące gorączkę (glikoproteiny) z błony zewnętrznej bakterii i innych drobnoustrojów. Obie te substancje, jeśli są podawane ludziom, mogą powodować gorączkę, niedociśnienie tętnicze i wstrząs. Ze względu na potencjalne szkodliwe działanie korzystne jest usunięcie nawet niewielkich ilości endotoksyn z farmaceutycznych roztworów leku podawanych dożylnie. Agencja żywności i leków ( "FDA") ustaliła górną granicę 5 jednostek endotoksyny (EU) na dawkę na kilogram masy ciała w ciągu jednej godziny dla zastosowań dożylnych leku (konwencja Pharmacopei w Stanach Zjednoczonych, Pharmacopeial Forum 26 (1):223 (2000)). Gdy terapeutyczne białka są podawane w ilości kilkuset lub tysięcy miligramów na kilogram masy ciała, co może mieć miejsce w przypadku przeciwciał monoklonalnych, to korzystne jest usunięcie nawet śladowych ilości endotoksyny. Poziomy endotoksyn i pirogenów w kompozycji to korzystnie mniej niż 10 EU/mg, lub mniej niż 5 EU/mg, lub mniej niż 1 EU/mg, lub mniej niż 0,1 EU/mg, lub mniej niż 0,01 EU/mg, lub mniej niż 0,001 EU/mg. Poziomy endotoksyn i pirogenów w kompozycji mogą być niższe niż 10 EU/mg, lub mniej niż około 5 EU/mg, lub mniej niż około 1 EU/mg, lub mniej niż około 0,1 EU/mg, lub mniej niż około 0,01 EU/mg, lub mniej niż około 0,001 EU/mg. [0188] Ilość składnika aktywnego, który można połączyć z materiałem nośnikowym w celu wytworzenia pojedynczej postaci dawkowania będzie się zmieniać zależnie od leczonego osobnika i konkretnego sposobu podawania. Ilość składnika aktywnego, który można połączyć z materiałem nośnikowym w celu wytworzenia pojedynczej postaci dawkowanej będzie

51 -50- zazwyczaj tą ilością kompozycji, która wywołuje efekt terapeutyczny. Ogólnie, poza sto procent, ta ilość będzie mieścić się w zakresie od około 0,01 procent do około dziewięćdziesięciu dziewięciu procent składnika aktywnego, a także od około 0,1 procent do około 70 procent, a także od około 1 procent do około 30 procent składnika aktywnego w połączeniu z farmaceutycznie dopuszczalnym nośnikiem. [0189] Schematy dawkowania są regulowane, aby zapewnić optymalną pożądaną odpowiedź (np. odpowiedź terapeutyczną). Na przykład, można podawać pojedynczy bolus, można podawać kilka podzielonych dawek w czasie lub dawkę można proporcjonalnie zmniejszać lub zwiększać co jest wskazane w nagłej sytuacji terapeutycznej. Szczególnie korzystne jest formułowanie kompozycji pozajelitowych w postaci jednostkowych dawek dla łatwego podawania i jednorodności dawkowania. Stosowana tu jednostkowa postać dawkowania dotyczy fizycznie oddzielnych jednostek odpowiednich jako dawki jednostkowe dla leczonego osobnika; każda jednostka zawiera określoną ilość substancji aktywnej obliczoną w celu wywołania pożądanego efektu terapeutycznego w połączeniu z wymaganym nośnikiem farmaceutycznym. Specyfikacja opisanych tu jednostkowych postaci dawkowania jest podyktowana i bezpośrednio zależne od (a) unikalnych właściwości związku aktywnego i konkretnego efektu terapeutycznego, który ma być osiągnięty, i (b) ograniczeń właściwych dziedzinie wytwarzania takiego związku aktywnego do leczenia wrażliwości u osobników. [0190] Do podawania przeciwciała zakresy dawek to od około 0,0001 do 100 mg/kg, a częściej 0,01 do 5 mg/kg masy ciała osobnika. Na przykład dawkowanie może wynosić 0,3 mg/kg masy ciała, 1 mg/kg masy ciała, 3 mg/kg masy ciała, 5 mg/kg masy ciała lub 10 mg/kg masy ciała lub w zakresie 1-10 mg/kg. Schemat leczenia może wymagać podawania raz na tydzień, raz na dwa tygodnie, raz na trzy tygodnie, raz na cztery tygodnie, raz na miesiąc, raz na 3 miesiące lub raz na trzy do 6 miesięcy. Schematy dawkowania dla opisanego tu przeciwciała anty- IFNAR1 obejmują 1 mg/kg masy ciała, lub 3 mg/kg masy ciała przy podawaniu dożylnym, gdy przeciwciało jest podawane przy zastosowaniu jednego z następujących schematów dawkowania: (i) co cztery tygodnie dla sześciu dawek, a następnie co trzy miesiące; (ii) co trzy tygodnie; (iii) 3 mg/kg masy ciała jeden raz, a następnie 1 mg/kg masy ciała raz na trzy tygodnie. [0191] Alternatywnie, przeciwciało lub białko fuzyjne można podawać w postaci preparatu o przedłużonym uwalnianiu, w którym to przypadku wymagane jest rzadsze podawanie. Dawkowanie i częstość różnią się zależnie od okresu półtrwania przeciwciała u pacjenta. Ogólnie, ludzkie przeciwciała wykazują najdłuższy okres półtrwania, a następnie humanizowane przeciwciała, chimeryczne przeciwciała i przeciwciała nie będące ludzkimi. Dawkowanie i częstość podawania mogą się różnić w zależności od tego czy leczenie jest profilaktyczne czy terapeutyczne. W zastosowaniach profilaktycznych podawane są stosunkowo niskie dawki w interwałach stosunkowo rzadkich przez długi czas. Niektórzy pacjenci otrzymują terapię do końca swojego życia. W zastosowaniach terapeutycznych konieczne są czasem stosunkowo wysokie dawki w stosunkowo krótkich odstępach czasu do momentu zredukowania progresji lub zakończenia choroby, a zazwyczaj do momentu gdy

52 -51- pacjent wykaże częściowe lub całkowite złagodzenie objawów choroby. Następnie pacjentowi można podawać schemat profilaktyczny. [0192] Rzeczywiste poziomy dawkowania aktywnych składników w opisanych tu kompozycjach farmaceutycznych można zmieniać tak, aby uzyskać ilość składnika aktywnego, która jest skuteczna do osiągnięcia pożądanej odpowiedzi terapeutycznej dla konkretnego pacjenta, kompozycja i sposób podawania, który nie jest toksyczny dla pacjenta. Wybrany poziom dawkowania będzie zależał od wielu czynników farmakokinetycznych włączając aktywność konkretnej zastosowanej kompozycji, lub jej estru, soli lub amidu, drogi podawania, czas podawania, szybkości wydalania konkretnego zastosowanego związku, czasu trwania leczenia, inne leki, związki i/lub materiały stosowane w kombinacji z konkretnymi zastosowanymi kompozycjami, wiek, płeć, masa ciała, stan, ogólny stan zdrowia i wcześniejsza historia medyczna leczonego pacjenta i podobne czynniki dobrze znane w dziedzinie medycyny. [0193] Terapeutycznie skuteczna dawka opisanego tu przeciwciała anty-ifnar1 prowadzi do zmniejszenia nasilenia objawów choroby, wzrostu częstości i czasu trwania okresu wolnego od objawów choroby, lub zapobiega osłabieniu lub niepełnosprawności w związku z dolegliwością chorobową. W przypadku, na przykład, tocznia rumieniowatego układowego (SLE), terapeutycznie skuteczna dawka może zapobiegać dalszemu pogorszeniu objawów fizycznych związanych z SLE takich jak, na przykład, ból, zmęczenie i osłabienie. Terapeutycznie skuteczna dawka może również zapobiegać lub opóźniać wystąpienia SLE, na przykład może być pożądana przy wczesnych lub wstępnych oznakach choroby. Obejmuje to również opóźnienie przewlekłej progresji związanej z SLE. Testy laboratoryjne stosowane w diagnostyce SLE obejmują chemię, hematologię, serologię i radiologię. Zgodnie z tym, kliniczny lub biochemiczny test, który monitoruje każdy z powyższych może być stosowany do określania czy konkretne leczenie jest terapeutycznie skuteczną dawką do leczenia SLE. Przecięty znawca dziedziny będzie w stanie określić takie ilości w oparciu o takie czynniki jak wielkość osobnika, nasilenie objawów u osobnika, a w szczególności w oparciu o wybraną kompozycję lub drogę podawania. [0194] Opisana tu kompozycja może być podawana za pomocą jednej lub więcej dróg podawania z zastosowaniem jednego lub więcej z wielu różnych sposobów znanych w dziedzinie. Znawca dziedziny zauważy, że droga i/lub sposób podawania będą się różnić w zależności od pożądanych rezultatów. Wybrane drogi podawania dla opisanych tu przeciwciał obejmują dożylne, domięśniowe, śródskórne, dootrzewnowe, podskórne, do rdzenia kręgowego lub inne pozajelitowe drogi podania, na przykład przez wstrzyknięcie lub infuzję. Podawanie pozajelitowe może być modułami podawania innymi niż podawanie dojelitowe i miejscowe, zazwyczaj przez wstrzyknięcie, i obejmuje, nieograniczająco, wstrzykiwanie i infuzję, podawanie dożylne, domięśniowe, dotętnicze, dooponowe, wewnątrztorebkowe, wewnątrzoczodołowe, dosercowe, śródskórne, śródotrzewnowe, przeztchawiczne, podskórne, dostawowe, podtorebkowe, podpajęczynówkowe, wewnątrzrdzeniowe, zewnątrzoponowe i domostkowe.

53 -52- [0195] Alternatywnie, opisane tu przeciwciało może być podawane za pomocą drogi innej niż pozajelitowa, na przykład droga podawania miejscowo, przez naskórek lub dośluzówkowo, na przykład, donosowo, doustnie, dopochwowo, doodbytniczo, podjęzykowo lub miejscowo. [0196] Związki aktywne mogą być wytwarzane z nośnikami, które będą chronić związek przed szybkim uwalnianiem, na przykład w postaci preparatu o kontrolowanym uwalnianiu, włączając implanty, plastry przezskórne i mikrokapsułkowane systemy uwalniania. Można zastosować biodegradowalne, biokompatybilne polimery takie jak etylen-octan winylu, polibezwodniki, kwas poliglikolowy, kolagen, poliortoestry i kwas polimlekowy. Wiele sposobów wytwarzania takich preparatów zostało opatentowanych lub są ogólnie znane znawcom dziedziny. Patrz np. Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems, J.R. Robinson, ed., Marcel Dekker, Inc., New York, [0197] Kompozycje terapeutyczne można podawać za pomocą urządzeń medycznych znanych w dziedzinie. Na przykład, opisane tu kompozycje lecznicze można podawać za pomocą urządzenia do bezigłowego podskórnego wstrzykiwania takiego jak urządzenia ujawnione w patentach US 5,399,163; 5,383,851; 5,312,335; 5,064,413; 4,941,880; 4,790,824; lub 4,596,556. Przykłady dobrze znanych implantów i modułów użytecznych w wynalazku obejmują: patent US 4,487,603, który ujawnia wszczepialną mikroinfuzyjną pompę do dozowania leku z kontrolowaną szybkością; patent US 4,486,194, który ujawnia terapeutyczne urządzenie do podawania leków przez skórę; patent US 4,447,233, który ujawnia infuzyjną pompę do dostarczania leków z dokładnie określoną szybkością infuzji; patent US 4,447,224, który ujawnia wszczepialny aparat do infuzji o zmiennym przepływie do dostarczania leku w sposób ciągły; patent US 4,439,196, który ujawnia osmotyczny system dostarczania leków z przedziałami wielo-komorowymi; i patent US 4,475,196, który ujawnia osmotyczny system dostarczania leków. Wiele innych takich implantów, systemów dostarczania i modułów jest znanych znawcom dziedziny. [0198] Opisane tu przeciwciała mogą być formułowane w celu zapewnienia odpowiedniej dystrybucji in vivo. Na przykład, bariera krew-mózg (BBB) wyklucza wiele związków silnie hydrofilowych. Aby mieć pewność, że opisane tu związki przekraczają barierę krew-mózg (jeśli jest to pożądane), mogą być formułowane, na przykład, w liposomach. W przypadku sposobów wytwarzania liposomów, patrz np. patenty US 44,522,811; 5,374,548; i 5,399,331. Liposomy mogą zawierać jedno lub więcej ugrupowań, które są selektywnie transportowane do określonych komórek lub narządów tym samym zwiększają ukierunkowane dostarczanie leku (patrz np. V.V. Ranade (1989) J. Clin. Pharmacol. 29:685). Przykładowe kierujące ugrupowania obejmują kwas foliowy lub biotynę (patrz np. patent US 5,416,016 od Low et al.); mannozydozy (Umezawa et al., (1988) Biochem. Biophys. Res. Commun. 153:1038); przeciwciała (P.G. Bloeman et al. (1995) FEBS Lett. 357:140; M. Owais et al. (1995) Antimicrob. Agents Chemother. 39:180); receptor białka surfakanta A (Briscoe et al. (1995) Am. J. Physiol. 1233:134); p120 (Schreier et al. (1994) J. Biol. Chem. 269:9090); patrz także K. Keinanen; M.L. Laukkanen (1994) FEBS Lett. 346:123; J.J. Killion; I.J. Fidler (1994) Immunomethods 4: Zastosowania diagnostyczne

54 -53- [0199] W innych przykładach wykonania opisane tu przeciwciała mają zastosowania diagnostyczne i terapeutyczne in vitro i in vivo. Na przykład, cząsteczki te mogą być podawane do komórek w hodowli, np. in vitro lub ex vivo, lub do [komórek] pacjenta, np. in vivo w celu leczenia, zapobiegania lub diagnozowania różnych zaburzeń. [0200] Opisane tu przeciwciała można stosować do wykrywania poziomów IFNAR1, lub poziomów komórek, które eksprymują IFNAR1. Można to osiągnąć, na przykład, przez kontaktowanie próbki (takiej jak próbka in vitro) i próbki kontrolnej z przeciwciałem anty- IFNAR1 w warunkach, które pozwalają na tworzenie kompleksu między przeciwciałem i IFNAR1. Wszystkie kompleksy utworzone między przeciwciałem i IFNAR1 wykrywa się i porównuje w próbce i kontroli. Na przykład, standardowe sposoby wykrywania, znane w dziedzinie, takie jak ELISA i testy przepływu cytometrycznego można przeprowadzić stosując opisane tu kompozycje. [0201] W związku z tym opisujemy sposoby wykrywania obecności IFNAR1 (np. antygenu ludzkiego IFNAR1) w próbce, lub pomiaru ilości IFNAR1, obejmujące kontaktowanie próbki i próbki kontrolnej z opisanymi tu przeciwciałami, lub ich części wiążących antygen, które swoiście wiążą IFNAR1 w warunkach, które pozwalają na tworzenie kompleksu między przeciwciałem lub jego częścią i IFNAR1. Tworzenie kompleksu jest następnie wykrywane, przy czym różnica w tworzeniu kompleksu między próbką w porównaniu do próbki kontrolnej wskazuje na obecność IFNAR1 w próbce Zastosowania terapeutyczne [0202] IFNAR1 jest częścią receptora komórkowego dla interferonów typu I, a interferony typu I są znane jako immunoregulacyjne cytokiny, które są zaangażowane w różnicowanie komórek T, wytwarzanie przeciwciał i aktywność i przeżywalność komórek T pamięci. Ponadto, zwiększoną ekspresję interferonów typu I opisano dla wielu chorób autoimmunologicznych, przy infekcji HIV, odrzuceniu przeszczepu i dla choroby przeszczep przeciwko gospodarzowi (GVHD). W związku z powyższym opisane tu przeciwciała anty-ifnar1 lub ich fragmenty, które hamują funkcjonalną aktywność interferonu typu I można stosować w różnych wskazaniach klinicznych związanych ze zmienioną lub niepożądaną aktywnością interferonu typu I. Opisujemy sposoby zapobiegania, leczenia, opanowywania/kontrolowania, łagodzenia lub hamowania choroby lub zaburzenia mediowanego interferonu typu I, przy czym sposoby obejmują podawanie opisanych tu przeciwciał lub ich części wiążących antygen. [0203] Konkretne przykłady chorób autoimmunologicznych, w których można stosować opisane tu przeciwciała obejmują, nieograniczająco, następujące: toczeń rumieniowaty układowy (SLE), cukrzycę insulino-zależną (IDDM), nieswoiste zapalenie jelit (IBD) (włączając chorobę Crohna, wrzodziejące zapalenie jelita grubego i celiakię), stwardnienie rozsiane (MS), łuszczycę, zapalenie tarczycy, reumatoidalne zapalenie stawów (RA) i kłębuszkowe zapalenie nerek. Ponadto, opisane tu kompozycje przeciwciał można stosować do hamowania lub zapobiegania odrzuceniu przeszczepu lub do leczenia choroby przeszczep przeciwko gospodarzowi (GVHD) lub do leczenia infekcji HIV/AIDS.

55 -54- [0204] Wysokie poziomy IFN zaobserwowano w surowicy chorych na toczeń rumieniowaty układowy (SLE) (patrz np. Kim et al. (1987) Clin. Exp. Immunol. 70: ). Ponadto, wykazano, że podawanie IFNα, na przykład w leczeniu nowotworu i infekcji wirusowych, indukuje SLE (Garcia-Porrua et al. (1998) Clin. Exp. Rheumatol. 16: ). W związku z tym, opisane tu przeciwciała anty-ifnar1 mogą być stosowane w leczeniu SLE przez podawanie przeciwciała osobnikowi wymagającemu leczenia. [0205] Inne sposoby leczenia SLE opisano w zgłoszeniach patentowych US zatytułowanych " Methods of treating SLE" o następujących numerach seryjnych 60/907, 767, złożono 16 kwietnia, 2000 r. i 60/966,174, złożono 5 listopad 2007 r. [0206] IFNα również odgrywa rolę w patologii cukrzycy typu I. Na przykład, zgłoszono obecność immunoreaktywnego IFNα w komórkach beta trzustki u pacjentów z cukrzycą typu I (Foulis et al. (1987) Lancet 2: ). Dla długotrwałego stosowania IFNα w terapii przeciwwirusowej również wykazano, że indukuje cukrzycę typu I (Waguri et al. (1994) Diabetes Res. Clin. Pract. 23:33-36). W związku z powyższym, opisane tu przeciwciała anty- IFNAR1 lub ich fragmenty można stosować w leczeniu cukrzycy typu I przez podawanie przeciwciała osobnikowi wymagającemu leczenia. Przeciwciało można stosować samodzielnie lub w kombinacji z innymi środkami przeciwcukrzycowymi takimi jak insulina. [0207] Przeciwciała wobec IFNAR1 okazały się być skuteczne w zwierzęcym modelu nieswoistego zapalenia jelit (patrz zgłoszenie patentowe US 60/465,155). Tak więc, opisane tu przeciwciała anty-ifnar1 lub ich fragmenty można stosować w leczeniu nieswoistego zapalenia jelit (IBD), takiego jak wrzodziejące zapalenie jelita grubego i choroba Crohna, przez podawanie przeciwciała pacjentowi wymagającemu leczenia. [0208] Zaobserwowano również, że leczenie IFNα indukuje autoimmunologiczne zapalenie tarczycy (Monzani et al. (2004) Clin. Exp. Med. 3: ; Prummel and Laurberg (2003) Thyroid 13: ). W związku z powyższym, opisane tu przeciwciała anty-ifnar1 można stosować w leczeniu chorób autoimmunologicznych tarczycy włączając autoimmunologiczną pierwotną niedoczynność tarczycy, chorobę Gravesa, chorobę Hashimoto i destrukcyjne zapalenie tarczycy z niedoczynnością tarczycy, przez podawanie opisanego tu przeciwciała osobnikowi wymagającemu leczenia. Opisane tu przeciwciała można stosować samodzielnie lub w kombinacji z innymi lekami lub terapiami takimi jak leki przeciwko zapaleniu tarczycy, radioaktywny jod i prawie całkowita tyreoidektomia. [0209] Wysokie poziomy IFNα obserwowano także w krążeniu u pacjentów zakażonych wirusem HIV, a jego obecność jest markerem predykcyjnym rozwoju AIDS (DeStefano et al. (1982) J. Infec. Disease 146:451; Vadhan-Raj et al. (1986) Cancer Res. 46:417). Tak więc, opisane tu przeciwciała anty-ifnar1 można stosować w leczeniu zakażenia HIV lub AIDS przez podawanie opisanego tu przeciwciała osobnikowi wymagającemu leczenia. Opisane tu przeciwciała można stosować samodzielnie lub w kombinacji z innymi środkami anty-hiv takimi jak nukleozydowe inhibitory odwrotnej transkryptazy, nienukleozydowe inhibitory odwrotnej transkryptazy, inhibitory proteazy, inhibitory fuzyjne.

56 -55- [0210] Wykazano, że przeciwciała wobec IFNAR1 są skuteczne w hamowaniu odrzucenia przeszczepu i przedłużeniu czasu przetrwania alloprzeszczepu (patrz np. Tovey et al. (1996) J. Leukoc. Biol. 59: ; Benizri et al. (1998) J. Interferon Cytokine Res. 18: ). W związku z powyższym, opisane tu przeciwciała anty-ifnar1 można także stosować u biorców przeszczepów w celu hamowania odrzucenia przeszczepu i/lub przedłużeniu przetrwania alloprzeszczepu. Opisano sposób hamowania odrzucenia przeszczepu przez podawanie opisanych tu przeciwciał anty-ifnar1 biorcy przeszczepu wymagającemu leczenia. Przykłady przeszczepów tkanek, które można leczyć obejmują, nieograniczająco, wątroby, płuc, nerek, serca, jelita cienkiego i komórek wysepek trzustkowych, jak również leczenie choroby przeszczep przeciwko gospodarzowi (GVHD). Opisane tu przeciwciała można stosować samodzielnie lub w kombinacji z innymi środkami do hamowania odrzucenia przeszczepu, na przykład środkami immunosupresyjnymi (np. cyklosporyną, azatiopryną, metyloprednizolonem, prednizolonem, prednizonem, mykofenolanem mofetylu, sirilimusem, rapamycyną, takrolimusem), środkami przeciwzapalnymi (np. acyklowirem, klotrimazolem, gancyklowirem, nystatyną, mieszaniną trimetoprim/sulfametoksazol), lekami moczopędnymi (np. bumetanidem, furosemidem, metolazonem) i lekami na wrzody (np. cymetydyną, famotydyną, lansoprazolem, omeprazolem, ranitydyną, sukralfatem). [0211] Opisano sposoby podawania i zastosowania opisanych tu kompozycji i przeciwciał do leczenia i zapobiegania szerokiemu zakresowi stanów zapalnych włączając zarówno przewlekłe jak i ostre stany takie jak, nieograniczająco, zapalenie wyrostka robaczkowego, wrzody na żołądku i dwunastnicy, zapalenie otrzewnej, zapalenie trzustki, wrzodziejące zapalenie jelita, rzekomobłoniaste, ostre i niedokrwienne zapalenie okrężnicy, zapalenie uchyłków, nagłośni, achalazja przełyku, zapalenie dróg żółciowych, zapalenie pęcherzyka żółciowego, zapalenie wątroby, choroba Crohna, zapalenie jelit, choroba Whipple'a, astma, alergia, wstrząs anafilaktyczny, choroba kompleksów immunologicznych, niedokrwienie narządu, uszkodzenie reperfuzyjne, martwica narządu, katar sienny, sepsa, posocznica, wstrząs endotoksyczny, wyniszczenie, gorączka, płucna postać histiocytozy z komórek Langerhansa, ziarniniakowatość, sarkoidoza, poronienie septyczne, zapalenie najądrza, zapalenie pochwy, zapalenie gruczołu krokowego, zapalenie cewki moczowej, zapalenie oskrzeli, rozedma, nieżyt nosa, zwłóknienie torbielowate, zapalenie płuc, pylica krzemowa, zapalenie pęcherzyków płucnych, zapalenie oskrzelików, zapalenie gardła, zapalenie opłucnej, zapalenie zatok, grypa, zakażenie RVS, zakażenie opryszczką, zakażenie wirusem HIV, zakażenie wirusem zapalenia wątroby typu B, zakażenie wirusem zapalenia wątroby typu C, bakteriemia rozsiana, gorączka denga, kandydoza, malaria, filarioza, ameboza, bąblowica, oparzenia, zapalenie skóry, zapalenie skórno-mięśniowe, oparzenie słoneczne, pokrzywka, brodawki, pęcherze, układowe zapalenia naczyń, zapalenie ścian naczyń, zapalenie wsierdzia, zapalenie tętnic, miażdżyca tętnic, zakrzepowe zapalenie żył, zapalenie osierdzia, zapalenie mięśnia sercowego, zawał mięśnia sercowego, guzkowe zapalenie tętnic, gorączka reumatyczna, choroba Alzheimera, celiakia, zastoinowa niewydolność serca, restenoza, zespół dorosłej niewydolności oddechowej spowodowanej POChP, zapalenie opon mózgowo-rdzeniowych, zapalenie mózgu, stwardnienie rozsiane, udar mózgu, zator mózgowy, zespół Guillaina-Barrego, zapalenie nerwu, nerwoból, uraz rdzenia kręgowego, porażenie, zapalenie błony naczyniowej oka,

57 -56- zapalenia stawów, artralgia, zapalenie szpiku, zapalenie powięzi, choroba Pageta, dna moczanowa, choroba przyzębia, reumatoidalne zapalenie stawów, zapalenie błony maziowej, miastenia rzekomoporaźna, zapalenie tarczycy, toczeń rumieniowaty układowy, zespół Goodpasture'a, zespół Behceta'a, odrzucenie alloprzeszczepu, choroba przeszczep przeciwko gospodarzowi, cukrzyca typu 1, zesztywniające zapalenie stawów kręgosłupa, choroba Bergera, zespół Retier a i choroba Hodgkina. [0212] W innym przykładzie wykonania sposoby podawania i kompozycje opisanych tu przeciwciał mogą być użyteczne do zapobiegania, leczenia, łagodzenia objawów związanych z następującymi stanami lub stanami chorobowymi: chorobą Gravesa, zapaleniem tarczycy Hashimoto, chorobą Crohna, łuszczycą, łuszczycowym zapaleniem stawów, współczulnym zapaleniem oka, autoimmunologicznym zapaleniem jajników, autoimmunologicznym zapaleniem jądra, autoimmunizacyjnym zespołem limfoproliferacyjnym, zespołem antyfosfolipidowym, zespołem Sjögrena, twardziną, chorobą Addisona, autoimmunologicznym zespołem niedoczynności wielogruczołowej, zespołem Guillaina- Barrego, immunologiczną plamicą małopłytkową, anemią złośliwą, miastenią, pierwotna marskością żółciową wątroby, mieszana chorobą tkanki łącznej, bielactwem nabytym, autoimmunologicznym zapaleniem błony naczyniowej oka, autoimmunologiczną niedokrwistością hemolityczną, autoimmunologiczną małopłytkowością, celiakią, opryszczkowatym zapaleniem skóry, autoimmunologicznym zapaleniem wątroby, pęcherzycą, pęcherzycą pospolitą, pęcherzycą liściastą, pemfigoidem pęcherzowym, autoimmunologicznym zapaleniem mięśnia sercowego, autoimmunologicznym zapaleniem naczyń, łysieniem plackowatym, autoimmunologiczną miażdżycą tętnic, chorobą Behceta, autoimmunologiczna mielopatią, autoimmunologiczną hemofilią, autoimmunologicznym śródmiąższowym zapaleniem pęcherza moczowego, autoimmunologiczną moczówką prostą, autoimmunologiczną endometriozą, nawracającym zapaleniem chrząstek, zesztywniającym zapaleniem stawów kręgosłupa, autoimmunologiczną pokrzywką, zapaleniem skórnomięśniowym, zespołem Millera-Fishera, nefropatią IgA, zespołem Goodpasture'a i pemfigoidem ciężarnych. [0213] W innym przykładzie wykonania sposoby podawania i kompozycje opisanych tu przeciwciał mogą być użyteczne do zapobiegania, leczenia, łagodzenia objawów związanych z zespołem Sjögrena. Zespół Sjögrena jest chorobą autoimmunologiczną, w której komórki układu odpornościowego atakują i niszczą gruczoły wydzielania zewnętrznego, które wytwarzają łzy i ślinę. Jego nazwa pochodzi od szwedzkiego okulisty Henrika Sjögrena ( ), który jako pierwszy ją opisał. Zespół Sjögrena jest również związany z zaburzeniami reumatycznymi takimi jak reumatoidalne zapalenie stawów i jest dodatnim czynnikiem reumatoidalnym w 90 procentach przypadków. Charakterystycznymi objawami tego zaburzenia są suchość w ustach i suchość oczu. Ponadto, zespół Sjögrena może powodować suchość skóry, nosa i pochwy i może wpływać na inne narządy, w tym nerki, naczynia krwionośne, płuca, wątrobę, trzustkę i mózg. Dziewięciu na dziesięciu pacjentów z zespołem Sjögrena to kobiety, a średni wiek zachorowania to późne lata 40-te, chociaż zespół Sjögrena występuje we wszystkich grupach wiekowych zarówno u kobiet jak i u mężczyzn. Szacuje się,

58 -57- że dopadło to 4 miliony ludzi w samych Stanach Zjednoczonych co czyni ją drugą najczęstszą autoimmunologiczną chorobą reumatyczną. [0214] Zapalenie mięśni jest ogólnym stanem charakteryzującym się zapaleniem mięśni szkieletowych i mięśni poprzecznie prążkowanych. Zapalenie mięśni może być spowodowane reakcją alergiczną, ekspozycją na działanie substancji toksycznych lub leków, innymi chorobami takimi jak nowotwór lub choroby reumatoidalne, lub wirusem lub innym czynnikiem zakaźnym. Przewlekłe zapalne miopatie są idiopatyczne, co oznacza, że ich przyczyna jest nieznana. Są rozumiane jako zaburzenia autoimmunologiczne, w których białe krwinki organizmu (które normalnie zwalczają chorobę) atakują naczynia krwionośne, zdrowe włókna mięśniowe i tkankę łączną narządów, kości i stawów. [0215] Zapalenie wielomięśniowe wpływa na mięśnie szkieletowe (zaangażowane w wykonywanie ruchów) po obu stronach ciała. Jest to rzadko spotykane u osób poniżej 18 roku życia; większość przypadków to pacjenci w wieku 31 do 60. Oprócz wyżej wymienionych objawów, postępujące osłabienie mięśni prowadzi do trudności w przełykaniu, mówieniu, podnoszeniu się z pozycji siedzącej, wchodzeniu po schodach, podnoszeniu przedmiotów lub sięganiu ponad głowę. Pacjenci z zapaleniem wielomięśniowym mogą również cierpieć na zapalenie stawów, duszności i zaburzenia rytmu serca. [0216] Zapalenie skórno-mięśniowe charakteryzuje się wysypką skórną, która poprzedza i towarzyszy postępującemu osłabieniu mięśni. Wysypka wygląda jak plamy, niebieskawofioletowe lub czerwone przebarwienia i charakterystycznie rozwija się na powiekach i mięśniach wykorzystywanych do rozciągania lub prostowania stawów, w tym na kostkach, kolanach, piętach i palcach. Czerwone wysypki mogą również występować na twarzy, szyi, ramionach, górnej części klatki piersiowej, plecach i innych miejscach, a na dotkniętych obszarach może występować obrzęk. Wysypka występuje czasami bez oczywistego zaangażowania mięśni. U dorosłych z zapaleniem skórno-mięśniowym może wystąpić utrata masy ciała lub stany podgorączkowe, zapalenie płuc i wrażliwość na światło. U dorosłych zapaleniu skórno-mięśniowemu, w przeciwieństwie do zapalenia wielomięśniowego, może towarzyszyć nowotwór sutka, płuca, kobiecych narządów płciowych lub jelit. U dzieci i dorosłych z zapaleniem skórno-mięśniowym mogą powstać złogi wapnia, które pojawiają się jako twarde guzy pod skórą lub w mięśniach (tzw. zwapnienia). Zwapnienia występują najczęściej 1-3 lata po wystąpieniu objawów choroby, ale mogą pojawić się wiele lat później. Depozyty te są częstsze w dziecięcym zapaleniu skórno-mięśniowym niż zapaleniu skórnomięśniowym, na które zachorował dorosły. Zapalenie skórno-mięśniowe może być związane z kolagenozą lub chorobą autoimmunologiczną. [0217] Wtrętowe zapalenie mięśni (IBM) charakteryzuje się postępującym osłabieniem i utratą mięśni. IBM jest podobne do zapalenia wielomięśniowego, ale ma swoje charakterystyczne cechy. Początkowo osłabienie mięśni jest zwykle stopniowe (w ciągu miesięcy lub lat) i dotyczy zarówno mięśni dystalnych jak i proksymalnych. Osłabienie mięśni może dotykać tylko na jedną stronę ciała. Małe otwory zwane wakuolami są widoczne w komórkach dotkniętych chorobą włókien mięśniowych. Upadanie i potykanie są zwykle pierwszymi zauważalnymi objawami IBM. Dla niektórych pacjentów choroba zaczyna się od osłabienia

59 -58- nadgarstków i palców, co powoduje trudności ze szczypaniem, zapinaniem guzików i chwytaniem przedmiotów. Może występować osłabienie mięśni nadgarstka i palców i zanik (obniżenie gęstości lub utrata masy mięśniowej) mięśni przedramienia i mięśni czworogłowych w nogach. Trudności w przełykaniu występują w około połowie przypadków IBM. Objawy choroby rozpoczynają się zazwyczaj w wieku powyżej 50 lat, chociaż choroba może wystąpić wcześniej. W przeciwieństwie do zapalenia wielomięśniowego i zapalenia skórnomięśniowego, IBM występuje częściej u mężczyzn niż u kobiet. [0218] Młodzieńcze zapalenie mięśni ma pewne podobieństwa do zapalenia skórnomięśniowego u dorosłych i zapalenia wielomięśniowego. Zazwyczaj dotyka ono dzieci w wieku od lat 2 do 15, z objawami, które obejmują osłabienie i stan zapalny mięśni proksymalnych, obrzęk (nieprawidłowe gromadzenie się płynów w obrębie tkanek organizmu, które powoduje obrzęk), ból mięśni, zmęczenie, wysypki skórne, bóle brzucha, gorączkę i przykurcze (przewlekłe skrócenie mięśni i ścięgien wokół stawów spowodowane przez zapalenia ścięgien, co zapobiega swobodnemu przesuwaniu się stawów). Dzieci z młodzieńczym zapaleniem mięśni mogą mieć również trudności z przełykaniem i oddychaniem, i może dotknąć serce. Około 20 do 30 procent dzieci z młodzieńczym zapaleniem skórno-mięśniowym ma zwapnienia. Młodociani pacjenci mogą nie wykazywać wyższych niż normalne poziomów mięśniowej kinazy kreatyninowej we krwi, ale mają wyższe niż normalne poziomy innych enzymów mięśniowych. [0219] Opisane tu przeciwciała mogą być użyteczne do zapobiegania, leczenia lub łagodzenia miopatii, zapalenia mięśni, idiopatycznego zapalenia mięśni, zapalenia wielomięśniowego, zapalenia skórno-mięśniowego, wtrętowego zapalenia mięśni (IBM), młodzieńczego zapalenia mięśni lub objawów związanych z tymi stanami. [0220] Opisane tu przeciwciała mogą być użyteczne do zapobiegania, leczenia lub łagodzenia objawów związanych z zapaleniem naczyń. [0221] Opisane tu przeciwciała mogą być użyteczne do leczenia twardziny. Sposoby leczenia twardziny opisano w zgłoszeniu patentowym US zatytułowanym "Methods Of Treating Scleroderma" o numerze seryjnym zgłoszenia 60/996,175, złożonym 5 listopada 2007 r. i w zgłoszeniu PCT/US2008/82481 (WO 2009/061818). [0222] Opisane tu przeciwciała mogą być użyteczne do zapobiegania, leczenia lub łagodzenia objawów związanych z sarkoidozą. Sarkoidoza (zwana również sarkoidem lub chorobą Besnier-Boeck) jest chorobą układu immunologicznego charakteryzującą się nienekrotycznymi ziarniniakami(małe grudki zapalne). Praktycznie każdy organ może być dotknięty; jednak najczęściej ziarniniaki pojawiają się w płucach lub węzłach chłonnych. Objawy mogą od czasu do czasu pojawiać się nagle, ale zwykle pojawiają się stopniowo. Podczas obrazowania rentgenowskiego płuc, sarkoidoza może wyglądać jak gruźlica lub chłoniak. [0223] Opisano tu również zestawy zawierające opisane tu kompozycje (np. przeciwciała anty- IFNAR1 i instrukcje zastosowania. Zestaw może ponadto zawierać przynajmniej jeden dodatkowy reagent, lub jedno lub więcej dodatkowych opisanych tu przeciwciał (np. przeciwciało o komplementarnej aktywności, które, w odróżnieniu od pierwszego przeciwciała,

60 -59- wiąże się z epitopem na docelowym antygenie). Zestawy zazwyczaj zawierają etykietę wskazującą zamierzone wykorzystanie zawartości zestawu. Etykieta obejmuje dowolne napisy lub nagrany materiał dostarczony na lub w zestawie, lub który w inny sposób dołączono do zestawu Kombinacje [0224] Opisane tu kompozycje można także podawać w terapii skojarzonej, na przykład w połączeniu z innymi środkami. Na przykład, leczenie skojarzone może obejmować opisane tu przeciwciało anty-ifnar1 w kombinacji z co najmniej jednym innym immunosupresantem. [0225] W niektórych sposobach dwa lub więcej przeciwciał monoklonalnych o różnych właściwościach wiązania podawane są jednocześnie, w takim przypadku dawka każdego podawanego przeciwciała mieści się w podanych zakresach. Przeciwciało zazwyczaj podaje się w wielu sytuacjach. Odstępy między pojedynczymi dawkami mogą być, na przykład, tygodniowe, miesięczne, co trzy miesiące lub co roku. Interwały mogą być nieregularne co pokazano za pomocą pomiaru poziomów przeciwciała względem antygenu docelowego we krwi u pacjenta. W niektórych sposobach dawka jest dostosowana do uzyskania stężenia przeciwciał w osoczu około µg/ml, a w niektórych sposobach około µg/ml. [0226] Gdy przeciwciała przeciwko IFNAR1 są podawane razem z innym środkiem, te dwa mogą być podawane w dowolnej kolejności lub jednocześnie. Na przykład, opisane tu przeciwciało anty-ifnar1 może być stosowane w połączeniu z jednym lub więcej z następujących środków: lekami zawierającymi mesalazynę (włączając sulfasalazynę i inne środki zawierające kwas 5-aminosalicylowy (5-ASA) takie jak olsalazyna i balsalazyd), niesteroidowe leki przeciwzapalne (NLPZ), środki przeciwbólowe, kortykosteroidy (np. prednizon, hydrokortyzon), inhibitory TNF (w tym adalimumab (HUMIRA ), etanercept (ENBREL ) i infliksymab (REMICADE )), immunosupresanty (takie jak 6-merkaptopuryna, azatiopryna i cyklosporyna, A) i antybiotyki przeciwciało anty- IFNα, przeciwciało antyreceptor IFNγ i rozpuszczalny receptor IFNγ. Ponadto, przeciwciało anty-ifnar1 może być stosowane w połączeniu z antagonistą liganda Flt3 (patrz np. zgłoszenie patentowe US 2002/ ). [0227] Opisane tu kompozycje mogą również zawierać środki użyteczne w leczeniu SLE. Takie środki obejmują środki przeciwbólowe, kortykosteroidy (np. prednizon, hydrokortyzon), immunosupresanty (takie jak cyklofosfamid, azatiopryna i metotreksat), leki antymalaryczne (takie jak hydroksychlorochina) i biologiczne, które hamują wytwarzanie przeciwciał dsdna (np. LJP 394) Równoważniki [0228] Znawcy dziedziny będą znali, lub będą w stanie ustalić stosując wyłącznie rutynowe doświadczenia, wiele równoważników opisanych tu cech Specyficzne ujawnienia [0229]

61 Zmodyfikowane monoklonalne przeciwciało klasy IgG swoiste dla IFNAR1, przy czym to przeciwciało w regionie Fc zawiera co najmniej jedną substytucję aminokwasową wybraną z L234F, L235E i P331S według numeracji indeksem EU jak określono w Kabat, i przy czym przeciwciało wykazuje zmniejszone powinowactwo do co najmniej jednego liganda Fc w porównaniu do niezmodyfikowanego przeciwciała. 2. Przeciwciało według klauzuli 1, przy czym to przeciwciało jest przeciwciałem podklasy IgG1 lub IgG4. 3. Przeciwciało według klauzuli 2, przy czym to przeciwciało jest cząsteczką podklasy IgG1. 4. Przeciwciało według klauzuli 3, przy czym to przeciwciało zawiera substytucję aminokwasową P331S. 5. Przeciwciało według klauzuli 3, przy czym to przeciwciało zawiera substytucje aminokwasowe: L234F i L235E. 6. Przeciwciało według klauzuli 3, przy czym to przeciwciało zawiera substytucje aminokwasowe: L234F, L235E i P331S. 7. Przeciwciało według klauzuli 3, przy czym to przeciwciało jest cząsteczką podklasy IgG4. 8. Przeciwciało według klauzuli 7, przy czym to przeciwciało zawiera substytucję aminokwasową L235E regionu Fc. 9. Przeciwciało według klauzuli 7, przy czym to przeciwciało w regionie Fc zawiera ponadto substytucję aminokwasową S228P. 10. Przeciwciało według dowolnej z klauzul 1-9, przy czym to przeciwciało zawiera co najmniej jeden region determinujący komplementarność (CDR) wybrany z Tabeli Przeciwciało według dowolnej z klauzul 1-10, przy czym to przeciwciało zawiera: a. ludzki region zmienny CDR1 łańcucha ciężkiego zawierający SEQ ID NO: 31, b. ludzki region zmienny CDR2 łańcucha ciężkiego zawierający SEQ ID NO: 32; c. ludzki region zmienny CDR3 łańcucha ciężkiego zawierający SEQ ID NO: 33; d. ludzki region zmienny CDR1 łańcucha lekkiego zawierający SEQ ID NO: 34; e. ludzki region zmienny CDR2 łańcucha lekkiego zawierający SEQ ID NO: 35; i f. ludzki region zmienny CDR3 łańcucha lekkiego zawierający SEQ ID NO: Przeciwciało według dowolnej z klauzul 1-10, przy czym to przeciwciało zawiera: a. ludzki region zmienny CDR1 łańcucha ciężkiego zawierający SEQ ID NO: 1; b. ludzki region zmienny CDR2 łańcucha ciężkiego zawierający SEQ ID NO: 2; c. ludzki region zmienny CDR3 łańcucha ciężkiego zawierający SEQ ID NO: 3; d. ludzki region zmienny CDR1 łańcucha lekkiego zawierający SEQ ID NO: 4; e. ludzki region zmienny CDR2 łańcucha lekkiego zawierający SEQ ID NO: 5; i

62 -61- f. ludzki region zmienny CDR3 łańcucha lekkiego zawierający SEQ ID NO: Przeciwciało według dowolnej z klauzul 1-10, przy czym to przeciwciało zawiera: a. ludzki region zmienny CDR1 łańcucha ciężkiego zawierający SEQ ID NO: 11; b. ludzki region zmienny CDR2 łańcucha ciężkiego zawierający SEQ ID NO: 12; c. ludzki region zmienny CDR3 łańcucha ciężkiego zawierający SEQ ID NO: 13; d. ludzki region zmienny CDR1 łańcucha lekkiego zawierający SEQ ID NO: 14; e. ludzki region zmienny CDR2 łańcucha lekkiego zawierający SEQ ID NO: 15; i f. ludzki region zmienny CDR3 łańcucha lekkiego zawierający SEQ ID NO: Przeciwciało według dowolnej z klauzul 1-10, przy czym to przeciwciało zawiera: a. ludzki region zmienny CDR1 łańcucha ciężkiego zawierający SEQ ID NO: 21; b. ludzki region zmienny CDR2 łańcucha ciężkiego zawierający SEQ ID NO: 22; c. ludzki region zmienny CDR3 łańcucha ciężkiego zawierający SEQ ID NO: 23; d. ludzki region zmienny CDR1 łańcucha lekkiego zawierający SEQ ID NO: 24; e. ludzki region zmienny CDR2 łańcucha lekkiego zawierający SEQ ID NO: 25; and f. ludzki region zmienny CDR3 łańcucha lekkiego zawierający SEQ ID NO: Przeciwciało według dowolnej z klauzul 1-10, przy czym to przeciwciało zawiera: a. ludzki region zmienny łańcucha ciężkiego zawierający sekwencje aminokwasową SEQ ID NO: 38; i b. ludzki region zmienny łańcucha lekkiego zawierający sekwencje aminokwasową SEQ ID NO: Przeciwciało według dowolnej z klauzul 1-10, przy czym to przeciwciało zawiera: a. ludzki region zmienny łańcucha ciężkiego zawierający sekwencje aminokwasową SEQ ID NO: 8; i b. ludzki region zmienny łańcucha lekkiego zawierający sekwencje aminokwasową SEQ ID NO: Przeciwciało według dowolnej z klauzul 1-10, przy czym to przeciwciało zawiera: a. ludzki region zmienny łańcucha ciężkiego zawierający sekwencje aminokwasową SEQ ID NO: 18; i b. ludzki region zmienny łańcucha lekkiego zawierający sekwencje aminokwasową SEQ ID NO: The antibody of any of clauses 1-10, wherein, said antibody comprises: a. ludzki region zmienny łańcucha ciężkiego zawierający sekwencje aminokwasową SEQ ID NO: 28; and

63 -62- b. ludzki region zmienny łańcucha lekkiego zawierający sekwencje aminokwasową SEQ ID NO: Przeciwciało według dowolnej z klauzul 1-18, przy czym to przeciwciało zawiera sekwencję regionu stałego łańcucha lekkiego o SEQ ID NO: Przeciwciało według dowolnej z klauzul 1-18, przy czym to przeciwciało zawiera sekwencję regionu stałego łańcucha ciężkiego o SEQ ID NO: Przeciwciało według dowolnej z klauzul 1-18, przy czym to przeciwciało zawiera region stały łańcucha lekkiego o sekwencji aminokwasowej SEQ ID NO:41 i region stały łańcucha ciężkiego o sekwencji aminokwasowej SEQ ID NO: Przeciwciało według dowolnej z klauzul 19-21, przy czym to przeciwciało zawiera sekwencję aminokwasową łańcucha ciężkiego zawierającą zmianę alleliczną, przy czym ten zmiana alleliczna jest co najmniej jedną lub więcej pozycji wybranych z grupy składającej się z 214, 221, 356 i 358 jak zdefiniowano za pomocą systemu numeracji indeksem UE. 23. Przeciwciało według dowolnej z powyższych klauzul, przy czym to przeciwciało jest wybrane z grupy składającej się z: ludzkiego przeciwciała, humanizowanego przeciwciała, chimerycznego przeciwciała, intraciała i syntetycznego przeciwciała. 24. Wyizolowany kwas nukleinowy zawierający sekwencję polinukleotydową kodującą przeciwciało według dowolnej z powyższych klauzul. 25. Kwas nukleinowy według klauzuli 24, przy czym taki kwas nukleinowy jest wektorem do replikacji. 26. Kwas nukleinowy według klauzuli 25, przy czym taka sekwencja polinukleotydowa jest funkcjonalnie połączona z promotorem. 27. Komórka gospodarza zawierająca lub stransformowana wektorem według klauzuli 25 lub Transgeniczne myszy zawierające transgeny łańcucha ciężkiego i lekkiego ludzkiej immunoglobuliny, przy czym mysz eksprymuje przeciwciało według dowolnej z klauzul Hybrydoma wytworzona z myszy według klauzuli 28, przy czym hybrydoma wytwarza takie przeciwciało. 30. Kompozycja farmaceutyczna zawierająca przeciwciało według dowolnej z klauzul 1-23 i farmaceutycznie dopuszczalną substancję pomocniczą. 31. Sposób leczenia stanu lub choroby związanej z zaburzeniami odporności obejmujący podawanie pacjentowi, który takiego potrzebuje skutecznej ilości kompozycji według klauzuli Sposób według klauzuli 31, przy czym taką choroba jest choroba mediowana interferonem typu I. 33. Sposób według klauzuli 32, przy czym takim interferonem typu I jest interferon alfa.

64 Sposób według klauzuli 33, przy czym taka choroba mediowana interferonem typu I jest związana z receptorem interferonu typu I. 35. Sposób według klauzuli 31, przy czym taką chorobą lub zaburzeniem jest AIDS wywołane zakażeniem HIV. 36. Sposób według klauzuli 31, przy czym taką chorobą lub zaburzeniem jest toczeń rumieniowaty układowy. 37. Sposób według klauzuli 31, przy czym taką chorobą lub zaburzeniem jest zespół Sjögrena. 38. Sposób według klauzuli 31, przy czym taką chorobą lub zaburzeniem jest zapalenie mięśni. 39. Sposób według klauzuli 31, przy czym taką chorobą lub zaburzeniem jest miopatyczne zapalenie. 40. Sposób według klauzuli 31, przy czym taką chorobą lub zaburzeniem jest zapalenie wielomięśniowe. 41. Sposób według klauzuli 31, przy czym taką chorobą lub zaburzeniem jest zapalenie skórnomięśniowe. 42. Sposób według klauzuli 31, przy czym taką chorobą lub zaburzeniem jest wtrętowe zapalenie mięśni. 43. Sposób według klauzuli 31, przy czym taką chorobą lub zaburzeniem jest młodzieńcze zapalenie mięśni. 44. Sposób według klauzuli 31, przy czym taką chorobą lub zaburzeniem jest idiopatyczne miopatyczne zapalenie. 45. Sposób według klauzuli 31, przy czym taką chorobą lub zaburzeniem jest układowe zapalenia naczyń. 46. Sposób według klauzuli 31, przy czym taką chorobą lub zaburzeniem jest sarkoidoza. 47. Sposób według klauzuli 31, przy czym taka choroba lub zaburzenie jest wybrane z grupy składającej się z: zapalnej choroby jelit, stwardnienia rozsianego, zapalenia tarczycy, reumatoidalnego zapalenia stawów, cukrzycy zależnej od insuliny, kłębuszkowego zapalenia nerek i choroby przeszczep przeciwko gospodarzowi. 48. Sposób według klauzuli 31, przy czym taką chorobą lub zaburzeniem jest łuszczyca lub wynikające z niej stany. 49. Sposób według klauzuli 31, przy czym taką chorobą lub zaburzeniem jest odrzucenie przeszczepu lub choroba przeszczep przeciw gospodarzowi. 50. Sposób według klauzuli 31, przy czym taka choroba lub zaburzenie jest wybrane z grupy składającej się z: choroby Gravesa, zapalenia tarczycy Hashimoto, choroby Crohna, łuszczycy, łuszczycowego zapalenia stawów, współczulnego zapalenia oka, autoimmunologicznego zapalenia jajników, autoimmunologicznego zapalenia jądra, autoimmunizacyjnego zespołu limfoproliferacyjnego, zespołu antyfosfolipidowego, zespołu Sjögrena, twardziny, choroby

65 -64- Addisona, autoimmunologicznego zespołu niedoczynności wielogruczołowej, zespołu Guillaina-Barrego, immunologicznej plamicy małopłytkowej, anemii złośliwej, miastenii, pierwotnej marskości żółciowej wątroby, mieszanej choroby tkanki łącznej, bielactwa nabytego, autoimmunologicznego zapalenia błony naczyniowej oka, autoimmunologicznej niedokrwistości hemolitycznej, autoimmunologicznej małopłytkowości, celiakii, opryszczkowatego zapalenia skóry, autoimmunologicznego zapalenia wątroby, pęcherzycy, pęcherzycy pospolitej, pęcherzycy liściastej, pemfigoidu pęcherzowego, autoimmunologicznego zapalenia mięśnia sercowego, autoimmunologicznego zapalenia naczyń, łysienia plackowatego, autoimmunologicznej miażdżycy tętnic, choroby Behceta, autoimmunologicznej mielopatii, autoimmunologicznej hemofilii, autoimmunologicznego śródmiąższowego zapalenia pęcherza moczowego, autoimmunologicznej moczówki prostej, autoimmunologicznej endometriozy, nawracającego zapalenia chrząstek, zesztywniającego zapalenia stawów kręgosłupa, autoimmunologicznej pokrzywki, zapalenia skórnomięśniowego, zespołu Millera-Fishera, nefropatii IgA, zespołu Goodpasture'a i pemfigoidu ciężarnych. 51. Sposób według dowolnej z klauzul ponadto obejmujący podawanie co najmniej jednego środka wybranego z grupy składającej się z: fototerapii, kortykosteroidów, prednizonu, NLPZ, plazmaferezy, immunosupresantów, metotreksatu, kwasu retinowego, tioguaniny, mykofenolanu mofetylu, estrów fumarowych, cyklofosfamidu, azatiopryny, cyklosporyny lub immunoglobulin. 52. Sposób według dowolnej z klauzul ponadto obejmujący podawanie co najmniej jednego środka wybranego z grupy składającej się z: alefaceptu (AMEVIVE ), etanerceptu (ENBREL ), adalimumabu (HUMIRA ), infliksymabu (REMICADE ), belimumabu (LYMPHOSTATB ), rytuksymabu (RITUXAN ) i efalizumabu (RAPTIVA ). 53. Kryształ zawierający ludzki region Fc IgG, przy czym ludzki region Fc IgG zawiera co najmniej jedną substytucję aminokwasową wybrane z grupy składającej się z L234F, L235E i P331S według numeracji indeksem EU jak określono w Kabat i przy czym taki fragment wykazuje zmniejszone powinowactwo do co najmniej jednego liganda Fc w porównaniu do niezmodyfikowanego regionu Fc. 54. Kryształ według klauzuli 53, przy czym ludzki region Fc IgG zawiera substytucję aminokwasową L234F, L235E i P331S. 55. Kryształ według klauzuli 53, który ma jakość dyfrakcyjną. 56. Kryształ według klauzuli 53, który jest natywnym kryształem. 57. Kryształ według klauzuli 53, który jest scharakteryzowany za pomocą rombowej komórki jednostki a=50.18±0.2 Å, b=147.30±0.2 Å i c=75.47 ±0.2 Å. 58. Kryształ według klauzuli 53, który ma grupę przestrzenną C Zmodyfikowane monoklonalne przeciwciało, przy czym to przeciwciało zawiera region Fc, substytucje aminokwasowe L234F, L235E i P331S według numeracji indeksem EU jak

66 -65- określono w Kabat i przy czym to przeciwciało wykazuje zmniejszone powinowactwo do co najmniej jednego liganda Fc w porównaniu z niemodyfikowanym przeciwciałem. 60. Białko fuzyjne zawierające zmodyfikowany region Fc, przy czym taki region Fc obejmuje substytucje aminokwasowe L234F, L235E i P331S według numeracji indeksem EU jak określono w Kabat i przy czym region Fc wykazuje zmniejszone powinowactwo do co najmniej jednego liganda Fc w porównaniu z regionem Fc. 61. Sposób wytwarzania przeciwciała według dowolnej z klauzul 1-23 lub Przeciwciało według dowolnej z klauzul 1-23 lub 59, przy czym to przeciwciało jest przeciwciałem, które ulega internalizacji. 63. Białko fuzyjne według klauzuli 60, przy czym to białko fuzyjne jest białkiem fuzyjnym, które ulega internalizacji. 64. Białko fuzyjne według klauzuli 63, przy czym to białko fuzyjne swoiście wiąże IFNAR Przeciwciało według dowolnej z klauzul 1-23, 59 lub 62, przy czym to przeciwciało wykazuje zmniejszoną lub wyeliminowaną cytotoksyczność komórkową zależną od przeciwciał (ADCC) w porównaniu z takim niezmodyfikowanym przeciwciałem. 66. Przeciwciało według dowolnej z klauzul 1-23, 59 lub 62, przy czym to przeciwciało wykazuje zmniejszoną lub wyeliminowaną cytotoksyczność zależną od dopełniacza (CDC) w porównaniu z takim niezmodyfikowanym przeciwciałem. 67. Przeciwciało według dowolnej z klauzul 1-23, 59 lub 62, przy czym to przeciwciało wykazuje zmniejszoną lub wyeliminowaną ADCC i CDC w porównaniu z takim niezmodyfikowanym przeciwciałem Sekwencje [0230] Region stały łańcucha lekkiego (SEQ ID NO:41) Region stały łańcucha ciężkiego (SEQ ID NO:42) 6. PRZYKŁADY [0231] Wynalazek opisano w odniesieniu do następujących przykładów Przykład 1: Profil IHC różnych przeciwciał anty-ifnar1

67 -66- [0232] Cel: Ocena profilu IHC przeciwciał anty-ifnar1 na grupie różnych tkanek. [0233] Sposoby: Techniki immunohistochemiczne w celu zbadania charakterystyk wiązania przeciwciał dobrze znanych w dziedzinie i na przykład mogą zostać przeprowadzone przez wyizolowanie pożądanych komórek lub tkanek i przygotowanie ich do mikroskopii za pomocą standardowych technik unieruchomienia i zamontowano. [0234] Mysie makrofagi: Zawiesinę komórek wirowano w celu utworzenia luźnego osadu. Osad zamrożono w podłożu do zamrażania OCT w celu utworzenia bryłki. Preparaty wycinków pocięto na 5 mikronowe grubości, moczono w acetonie przez 10 min i pozostawiono do wysuszenia przez noc. Przed zastosowaniem preparaty zanurzono w 10% obojętnej buforowanej formalinie na 10 sek. i przemyto 3x w buforze (1X TBS z 0,01% Tween20). [0235] Ludzkie monocyty: Zawiesinę komórek rozmazano/nakroplono bezpośrednio na wycinki. Preparaty pozostawiono do wyschnięcia przez noc, a następnie moczono w acetonie przez 10 min. i pozostawiono do wyschnięcia na powietrzu. Przed zastosowaniem preparaty zanurzono w 10% obojętnej buforowanej formalinie przez 10 sek., przemyto 3x w buforze (1X TBS z 0,01% Tween20). [0236] Ludzka tkanka kresomózgowia i serca: Próbki tkanek od dawców zamrożono w podłożu do zamrażania OCT w celu utworzenia bryłki. Preparaty wycinków pocięto na grubość 5 mikronów, moczono w acetonie przez 10 min. i pozostawiono do wysuszenia przez noc. Przed zastosowaniem preparaty zanurzono w 10% obojętnej buforowanej formalinie na 10 sek. i przemyto 3x w buforze (1X TBS z 0,01% Tween20). [0237] Znakowanie przeciwciał: Przeciwciała sprzężono z biotyną za pomocą poniższego protokołu. Około 500 µg przeciwciała zmieszano z 20-krotnym nadmiarem biotyny i inkubowano przez 2 godziny w ciemności w 4 C. Po 2 godzinnej inkubacji, mieszaninę przeciwciało/biotyna nałożono na wstępnie zrównoważoną kolumnę PD10 z 1X PBS. Następnie przeciwciała sprzężone z biotyną zatężono do pożądanego stężenia za pomocą probówki do zatężania YM-30 Centricon. [0238] Barwienie preparatów: Po przemyciu w buforze, preparaty traktowano w celu inaktywacji endogennych peroksydaz za pomocą traktowania roztworem oksydazy glukozowej (1 U/ml, Sigma G0543), B-D(+) glukozy (10 mm, Sigma G5250), azydkiem sodu (1 mm, Sigma, S8032) przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej. Następnie preparaty przemyto buforem do przemywania (1X TBS z 0,01% Tween 20). Preparaty umieszczono w roztworze do blokowania białka (1 x PBS, ph 7,2, 0,5% kazeina (amina N-Z, Sigma C0626), 1% BSA (Sigma A7906), 1,5% normalnej surowicy koziej (Jackson Labs # ) przez 30 min. w temperaturze pokojowej. Biotynylowane przeciwciało (patrz powyżej) nałożono na preparaty przez rozcieńczenie w roztworze do blokowania białek. Inkubację preparatów z biotynylowanym przeciwciałem przeprowadzano w temperaturze pokojowej przez 2 godziny. Preparaty przemyto 3x buforem do przemywania (1X TBS, 0,01% Tween 20). Wykrywanie przeciwciał wykonano z zastosowaniem zestawu Vectastain (Vector Laboratories). Preparaty przemyto i wybarwiono kontrastowo hematoksyliną. Preparaty odwodniono i zamontowano z zastosowaniem szkiełek nakrywkowych przed oglądaniem.

68 -67- [0239] Wyniki: Na Fig. 6A przedstawiono wyniki analizy IHC tkanki ludzkiego mózgu wybarwionego różnymi anty-ifnar1 i kontrolnymi przeciwciałami. Przeciwciała MDX-1333 (75 µg/ml) i 4G5 (50 µg/ml) wykazywały wyraźne wybarwienie tkanki mózgu zobrazowane jako brązowo/czarne wybarwienie całych próbek. Przeciwciało 9D4 (50 µg/ml) nie barwią próbki tkanki ludzkiego mózg, jak również MDX-1333 i 4G5, co przedstawiono jako zmniejszone brązowo/czarne wybarwienie całej próbki. Włączono kontrolę izotypową IgG1 w celu pokazania swoistości wiązania indywidualnych przeciwciał. [0240] Na Fig. 6B przedstawiono wyniki analizy IHC monocytów wybarwionego różnymi anty-ifnar1 i kontrolnymi przeciwciałami. Przeciwciała MDX-1333 (50 i 20 µg/ml), 4G5 (50 µg/ml) i 9D4 (50 i 20 µg/ml) wszystkie wykazywały wyraźne wybarwienie ludzkich monocytów zobrazowane jako brązowo/czarne wybarwienie próbek. Przeciwciało kontroli izotypowej R3-47 (50 ug/ml) nie wykazywało wyraźnego wybarwienia ludzkich monocytach. Ponadto, MDX-1333 (50 µg/ml) nie barwi oczyszczonych mysich makrofagów. [0241] Wnioski: W badaniu IHC przeciwciało anty-ifnar1 9D4 wykazywało niższy poziom wybarwienia w porównaniu z innymi przeciwciałami anty-ifnar1 takimi jak MDX G Przykład 2: Wytwarzanie przeciwciała 9D4 TM [0242] Zmodyfikowane przeciwciało anty-ifnar1 nazwane "9D4-TM" wytworzono za pomocą poniższej procedury; [0243] Ludzki Fc γ1 sklonowano i zmodyfikowano z ludzkich PBL najpierw izolując całkowite RNA, poddając transkrypcji cdna i amplifikacji PCR region stały z zastosowaniem primerów swoistych dla genów zawierających miejsca restrykcyjne Apa I i EcoRI do klonowania do ssaczego wektora PEE6. Potrójny mutant (TM) zawiera trzy zmiany aminokwasowe w ludzkiej IgG w celu zmniejszenia funkcji efektorowych ADCC (L234F, L235E i P331S). TM zmodyfikowano stosując ludzką IgG1 (KOL) jako matrycy i ukierunkowaną mutagenezę (QuickChange XL, Stratagene) w celu kodowania trzech zmian reszt w Fc. Sekwencje mutagennych primerów zastosowanych do kodowania zmian L234F/L235E/P331S były następujące: MD1056 = 5' cgtgcccagcacctgaattcgaggggggaccgtcagtcttc 3'L234F, L235E forward (SEQ ID NO:43) MD1057 = 5' gaagactgacggtcccccctcgaattcaggtgctgggcacg 3' L234F, L235E reverse (SEQ ID NO:44) MD1058 = 5' ccaacaaagccctcccagcctccatcgagaaaaccatctcc 3' P331S forward (SEQ ID NO:45) MD1059 = 5' ggagatggttttctcgatggaggctgggagggctttgttgg 3' P331S reverse (SEQ ID NO:46) [0244] Klony kodujące przeciwciało 9D4-TM zsekwencjonowano w celu potwierdzenia potrójnych mutacji i rozdzielono na analizatorze genetycznym ABI Przykład 3: Wytwarzanie przeciwciała 9D4 DM

69 -68- [0245] Zmodyfikowane przeciwciało anty-ifnar1 nazwane "9D4-DM" wytworzono za pomocą poniższej procedury; [0246] Ludzki Fc γ4 sklonowano i zmodyfikowano z ludzkich PBL najpierw izolując całkowite RNA, poddając transkrypcji cdna i amplifikacji PCR region stały z zastosowaniem primerów swoistych dla genów zawierających miejsca restrykcyjne Apa I i EcoRI do klonowania do ssaczego wektora PEE6. [0247] Podwójny mutant (DM) zawierający dwie mutacje w Fc ludzkiej IgG4: S228P i L235E. Mutagenne primery do kodowania DM zawierały: MD1060 = 5' ggtcccccatgcccaccatgcccagcacctg 3' region zrębowy S228P forward (SEQ ID NO:47) MD1061 = 5' caggtgctgggcatggtgggcatgggggacc 3' region zrębowy S228P reverse (SEQ ID NO:48) MD1062 = 5' ccagcacctgagttcgaggggggaccatcagtc 3'IgG4 L234F, L235E forward (SEQ ID NO:49) MD1063 = 5' gactgatggtcccccctcgaactcaggtgctgg 3' IgG4 L234F, L235E reverse (SEQ ID NO:50) [0248] Klony kodujące przeciwciało 9D4-DM zsekwencjonowano w celu potwierdzenia potrójnych mutacji i rozdzielono na analizatorze genetycznym ABI Przykład 4: Przeciwciała anty-ifnar1 hamują fosforylację STAT mediowaną IFN. [0249] Cel: Określenie zdolności przeciwciała anty-ifnar1 9D4-TM do hamowania fosforylacji STAT mediowanej IFN w jednojądrzastych komórkach krwi obwodowej. [0250] Sposoby: Komórki jednojądrzaste krwi obwodowej od zdrowych ludzkich dawców oczyszczono stosując podłoże LSM (MP Biomedical, Solon, OH). PBMC określono ilościowo i wysiano przy 10 6 komórek na warunki hodowlane na studzienkę. Przeciwciała dodano w ilości 10 µg/ml do właściwych studzienek i inkubowano w 37 C, 5% CO2 przez 10 minut. Po wstępnej inkubacji z zastosowaniem rekombinowanych ludzkich przeciwciał IFNα2a (PBL Biomedical, Piscataway NJ) lub ludzkich plazmacytoidalnych IFN pochodzących z komórek (dla wytwarzania supernatantów IFN typu I pochodzących z PDC patrz poniżej) na 20 minut do odpowiednich studzienek dodano 100 lub 500 IU/ml. Komórki odwirowano przy 1200 rpm przez 5 minut i przemyto sterylnym 1x PBS. Po jednym dodatkowym obrocie usunięto PBS i komórki poddano lizie stosując reagent ssaczego ekstraktu białkowego (Pierce, Rockford IL), uzupełnionego 300 µl 1x koktajlu inhibitorów fosfatazy 1 i 2 (Sigma, St. Louis MO) i inhibitora proteazy (Roche Biomedical, Nutley NJ). Lizat inkubowano przez 10 minut w wytrząsarce orbitalnej w celu zapewnienia całkowitej lizy, przeniesiono do probówek mikrowirówkowych i wirowano przy rpm w celu usunięcia pozostałości komórkowych. Bufor do próbek NuPAGE (Invitrogen, Carlsbad CA) i dtt (Sigma, St. Louis MO) dodano do lizatu do końcowego stężenia 1x i wszystkie próbki zdenaturowano w bloku grzewczym w 100 C przez około 10 minut. 15 µl każdej próbki nałożono na 10% Bis-Tris żel poliakryloamidowy NuPage (Invitrogen, Carlsbad CA) w buforze do badania NuPAGE MES SDS uzupełnionym 1x buforu

70 -69- antyoksydacyjnego NuPAGE. Próbki badano przy 180V przez 30 minut w celu rozdzielenia prążków białkowych. Następnie białka przeniesiono na membranę nitrocelulozową i bloty blokowano 1xPBS (Gibco BRL, Carlsbad CA) zawierającym 5% BSA (Sigma, St. Louis MO, USA) przez noc w 4 C. Następnie podłoże blokujące usunięto i do odpowiednich blotów dodano 0,2 µg/ml przeciwciała anty-stat1, anty-stat1 py701 lub rozcieńczone 1: 1000 przeciwciało β-aktyna (Cell Signaling Technology, Danvers MA) i inkubowano przez noc w 4 C przeciwciała beta-aktyny. Bloty przemyto 3x w 1 x TBS zawierającym 0,05% Tween20 (Sigma, St. Louis, MO). Na bloty dodano drugorzędowe przeciwciało anty-królicze sprzężone z HRP rozcieńczone 1: 2500 i inkubowano przez 1 godz. w temperaturze pokojowej. Bloty przemyto jak opisano powyżej i do każdego blotu dodano 3 ml 1:1 mieszaniny reagenta Pico Supersignal West (Pierce, Rockford IL) na 1 minutę. Błony odsączono, usunięto nadmiar reagenta i prążki wizualizowano stosując procesor Kodak X-omat 1000A. [0251] Wyniki: Na Figurze 7 przedstawiono wyniki testu aktywacji STAT, w którym komórki stymulowano leukocytarnym IFN w obecności lub przy braku przeciwciał anty-ifnar1. W przypadku braku przeciwciał leukocytarny interferon stymuluje fosforylację izoform 1, 3 i 5 STAT. Inkubacja komórek z przeciwciałem 9D4-TM hamuje fosforylację mediowaną działaniem leukocytarnego interferonu. Komórki traktowane izotypowym przeciwciałem kontrolnym R3-47 nie wykazują hamowania fosforylacji STAT w odpowiedzi na stymulację leukocytarnym interferonem. [0252] Wnioski: Wyniki na Fig. pokazują, że 9D4-TM jest zdolny do hamowania odpowiedzi na IFNα takie jak indukcja fosforylacji STAT w jednojądrzastych komórkach krwi obwodowej. 6.5 Przykład 5: Przeciwciała anty-ifnar1 hamują sygnałowanie IFN typu I. [0253] Cel: Aby zbadać zdolność przeciwciał anty- IFNAR1 do hamowania sygnałowania IFN typu I, stosując test reporterowy, zastosowano oczyszczony IFN typu I z komórek PDC. [0254] Sposoby: Plazmacytoidalne komórki dendrytyczne (PDC) wyizolowano z pełnej krwi zdrowych dawców z zastosowaniem podłoża do rozdzielania limfocytów (MP Biomedical, Solon OH), a następnie za pomocą pozytywnej selekcji z zastosowaniem zestaw MicroBead (Milteny Biotec, Auburn CA) CD304 (BDCA-4/Neuropilina-1). Oczyszczone PDC hodowano następnie przy 1x10 6 komórek/ml w RPMI 1640 uzupełnionej 10% FBS (Gibco BRL) i 6 mg/ml CpGA (Invivogen, San Diego, CA). Po 20 godzinach hodowli supernatanty zebrano i sklarowano i IFN typu I oznaczano ilościowo stosując stabilnie transfekowaną linię komórkową HEK293-ISRE wobec krzywej standardowej ludzkich leukocytarnych IFN PBL Biomedical, Piscataway NJ). [0255] pdc z trzech zdrowych ludzkich dawców zastosowano do wytworzenia supernatantów interferonu typu I pochodzących z ludzkich pdc jak opisano powyżej. Komórki HEK293 (ATCC, Manassas VA) trwale transfekowane reporterowym plazmidem phts-isre (Biomyx Technology, San Diego, CA) i utrzymywano w podłożu DMEM uzupełnionym 10% 10% FBS, 1x NEAA i 700 µg/ml G418 (Invitrogen, Carlsbad CA). Komórki wysiewano w stężeniu komórek na studzienkę na 96 studzienkowe białe/przezroczyste płytki Optilix (VWR, West Chester, PA). Do każdej studzienki dodano odpowiednie stężenia przeciwciał (611

71 -70-0,00004nM), a następnie przez dodanie odpowiedniego stężenia supernatantów interferonu typu I pochodzących z ludzkich PDC pochodnych typu I interferon supernatantach. Komórki, IFN, i przeciwciała inkubowano przez noc w 37 C, 5% CO2 i oceniano amplifikacje białka lucyferazy za pomocą lizy komórek reagentem do lizy hodowli komórkowej i wizualizacji zastosowaniem testu Luciferase Assay System (Promega, Madison WI). Sygnał zmierzono w cps i wygenerowano wartości IC50. [0256] Wyniki: Z komórek pdc pochodzących od trzech indywidualnych dawców zebrano supernatanty IFN typu I. W teście z reporterową lucyferazą, inkubacja z przeciwciałami anty- IPNAR1 hamował zdolność sygnałowania różnych stężeń supernatantów IFN typu I (Figura 8). [0257] Wnioski: Wyniki te pokazują, że przeciwciała anty-ifnar1 są zdolne do hamowania sygnałowanie mediowane IFN typu I zmierzono reporterowym testem aktywności. 6.6 Przykład 6: Zmodyfikowane przeciwciała anty-ifnar1 wykazują podobne charakterystyki wiązania do macierzystego niezmodyfikowanego przeciwciała. [0258] Cel: W celu zbadania charakterystyk wiązania IFNAR1 przez przeciwciała zmodyfikowane w porównaniu do niezmodyfikowanych wersji macierzystych. Na Figurze 9 przedstawiono krzywe powinowactwa wiązania dla 9D4, 9D4DM i 9D4TM. Stałe wiązania (Kd) dla przeciwciał 9D4, 9D4DM i 9D4TM przeciw IFNAR1 określano z krzywych wiązania. [0259] Sposoby: komórek HEK 293F wysiano na okrągłodenną 96-studzienkową płytkę stosując 50 µl podłoża RPMI 1640 uzupełnionego 10% FBS. 9D4-TM znakowane europem przygotowano na podstawie umowy przez PerkinElmer Life and Analytical Sciences. W celu zmierzenia nieswoistego sygnału europu do odpowiednich studzienek na płytce 96- studzienkowej dodano 25 µl 100-krotnego nadmiaru niewyznakowanych seryjnie rozcieńczonych przeciwciał anty-ifnari na 5-10 minut przed dodaniem znakowanego 9D4- TM. Do odpowiednich studzienek dodano 25 µl sprzężonego z europem seryjnie rozcieńczonego przeciwciała i komórki i przeciwciała delikatnie mieszano w temperaturze pokojowej przez 1-2 godziny. Po inkubacji w celu związania, do każdej studzienki dodano 150 µl podłoża i płytki wirowano przy 1200 rpm przez 5 minut w temperaturze pokojowej. Płytki szybko zdekantowano i 250 µl pożywki komórkowej dodaje się do wszystkich zagłębień. Wirowania i przemywania powtarzano do uzyskania 3 przemyć. Następnie komórki ponownie zawieszono w 100 µl podłoża dla komórek. 50 µl zawiesiny komórek przeniesiono do 200 µl roztworu wzmacniającego DELFIA (PerkinElmer) na żółtą płytkę do mikromiareczkowania DELPHIA i emisje europu mierzono na czytniku Victor2 Multilabel (PerkinElmer). Sygnał zmierzono w cps i wygenerowano wartości Kd i Bmax z zastosowaniem oprogramowania do analizy GraphPad Prism 4. [0260] Wyniki: Dane przedstawione na Figurze 9 pokazują, że zmodyfikowane przeciwciała 9D4-TM i 9D4-DM wykazują podobne powinowactwo wiązania dla IFNAR1 (9D4 = 0,06 +/- 0,02 nm, 9D4-DM = 0,06 +/- 0,02 nm, 9D4-TM = 0,03 +/- 0,01 nm) do nie- zmodyfikowanego przeciwciała macierzystego.

72 -71- [0261] Wnioski: Dane przedstawione w tym przykładzie pokazują, że zmodyfikowane przeciwciała mają podobne charakterystyki wiązania IFNAR1 do niezmodyfikowanych przeciwciał macierzystych. 6.7 Przykład 7: Dane z testu równowagi wiązania dla 9D4-TM przeciwko sifnαri [0262] Cel: Określenie danych równowagi wiązania dla 9D4-TM z zastosowaniem rozpuszczalnego IFNAR1 (sripnar1) [0263] Sposoby: Kulki UltraLink Biosupport (PIERCE, Rockford, IL) powlekano ligandem srifnar1 w stężeniu 5 µg/ml i 50 µg/ml w buforze do powlekania (50 mm bufor węglanu sodu, ph 9.) przez 1-2 dni w 4 C. Powleczone kulki rozdzielono (delikatne wirowanie impulsowe) od nieprzereagowanego roztworu liganda i delikatnie wytrząsano w buforze bloku (1 ml 1 M Tris, ph 8, zawierający BSA w stężeniu 10 mg/ml) przez około 15 minut w temperaturze pokojowej (RT). Następnie zawiesinę z kulkami ponownie wirowano w celu usunięcia roztworu blokującego, a następnie powtarzano etap blokowania przez 2 godz. w temperaturze pokojowej stosując świeżą porcję buforu blokującego. Po etapie blokowania powleczone kulki przechowywano w 4 C do czasu zastosowania. Przed zastosowaniem powleczone sripnar1 kulki przeniesiono do fiolki na kulki, ponownie zawieszano w 27ml buforze do przeprowadzenia doświadczenia w urządzeniu (PBS, ph 7,4-0,02% NaN3), a następnie przymocowano do urządzenia KinExA [0264] Wszystkie stałe równowagi wiązania (KD) uzyskano z pomiarów dokonanych w urządzeniu KinExA 3000 (Sapidyne Instruments, Boise, ID). Pokrótce, IgG 9D4-TM przygotowano w stęż. 1pM, 10 pm i 50 pm i rozdzielono do trzech grup probówek. Ten zakres stężeń IgG został zaprojektowany, aby umożliwić pomiary dokonywane w warunkach kontrolowanych zarówno receptorem jak i KD. Dwukrotnymi seryjnymi rozcieńczeniami liganda srifnar1 miareczkowano te roztwory IgG w stężeniach wynoszących od 19,5fM - 1 nm. W oparciu o dostarczone przez producenta symulacje teoretycznych krzywych dostępnych za pośrednictwem oprogramowania (Sapidyne Instruments, Boise, Idaho), te mieszaniny do badania równowagi inkubowano w dowolnym miejscu od 2-6 dni w RT. Pod koniec tego czasu, przeprowadzono eksperymenty przeprowadzono badania sygnałów na celu określenie właściwych warunków wirowania. Wykrywanie wolnego przeciwciała było możliwe z zastosowaniem swoistego dla gatunku reagenta - znakowanego Cy5 drugorzędowego przeciwciała (Cy5 AffiniPure F(ab')2 Fragment Goat Anti-Human IgG, Part # , Jackson ImmunoResearch Laboratories) zastosowanego w 0,1, 1,0 lub 2,0 µg/ml w PBS, ph 7,4-0,02% NaN3 zawierającym BSA w stężeniu 1 mg/ml. Dane uzyskane z eksperymentów następnie równocześnie dopasowano z zastosowaniem oprogramowania zapewniającego funkcję analizy n-curve do uzyskania reporterowej stałej wiązania (KD). [0265] Wyniki: Na Fig. 10 przedstawiono krzywe wiązania dla trzech stężeń 9D4-TM (1 pm, 10 pm, and 50 pm) z sifnαri. Dane uzyskane z co najmniej trzech niezależnych doświadczeń dopasowano do oprogramowania przekształcającego krzywą wiązania w celu ustalenia względnej KD dla 9D4-TM. W tym teście wiązania określono, że KD dla TM 9D4 wynosiła 1,1 pm przy 95% przedziale zaufania dka 0,603 pm - 1,8 pm. Błąd procentowy dla KD przy 1,1

73 -72- pm wynosił 1,96%. Określono również, że Kon i Koff dla 9D4-TM wynosiło, odpowiednio, 7 x /- 1,3 x 10 6 S -1 i 7,7 x /- 1,57 x /Ms (dane nie pokazane). [0266] Wnioski: Zmodyfikowane przeciwciało anty-ifnar1 9D4 = TM wykazuje bardzo niską KD około 1,1 pm, na IFNAR1, co określono w teście Kenexa. 6.8 Przykład 8: Określenie powinowactwa wiązania 9D4-TM na ludzkich PBMC [0267] Cel: Określenie powinowactwa wiązania na ludzkich PBMC [0268] Sposoby: Komórki jednojądrzaste krwi obwodowej od zdrowych ludzkich dawców oczyszczono stosując podłoże LSM (MP Biomedical, Solon, OH). Komórki zliczono i komórek wysiano w okrągłodennej, 96-studzienkowej płytce stosując 50 µl podłoża RPMI 1640 uzupełnionej 10% FBS. 9D4-TM znakowane europem przygotowano na podstawie umowy przez PerkinElmer Life and Analytical Sciences. W celu zmierzenia nieswoistego sygnału europu do odpowiednich studzienek na płytce 96-studzienkowej dodano 25 µl 100- krotnego nadmiaru niewyznakowanego seryjnie rozcieńczonego przeciwciała 9D4-TM na 5-10 minut przed dodaniem znakowanego 9D4-TM. Do odpowiednich studzienek dodano 25 µl sprzężonego z europem seryjnie rozcieńczonego przeciwciała i komórki i przeciwciała delikatnie mieszano w temperaturze pokojowej przez 1-2 godziny. Po inkubacji w celu związania, do każdej studzienki dodano 150 µl podłoża i płytki wirowano przy 1200 rpm przez 5 minut w temperaturze pokojowej. Płytki szybko zdekantowano i 250 ul pożywki komórkowej dodaje się do wszystkich zagłębień. Wirowania i przemywania powtarzano do uzyskania 3 przemyć. Następnie komórki ponownie zawieszono w 100 µl podłoża dla komórek. 50 µl zawiesiny komórek przeniesiono do 200 µl roztworu wzmacniającego DELFIA na żółtą płytkę do mikromiareczkowania DELPHIA i emisje europu mierzono na czytniku Victor2 Multilabel (PerkinElmer). Sygnał zmierzono w cps i wygenerowano wartości Kd i Bmax z zastosowaniem oprogramowania do analizy GraphPad Prism 4. [0269] Wyniki: Stosując pomiary powinowactwa przedstawione na Figurze 9 określono, że KD dla 9D4-TM wiążących się z ludzkimi PBMC wynosiło 0,29 nm +/- 0,11 nm z liczbą miejsc wiązania określoną jako / Stosując podobne podejście określono stałą wiązania dla IFNAR makaka jawajskiego jako 0,65 +/- 0,42 nm z liczbą miejsc wiązania 648 +/- 204 (dane nie pokazane). [0270] Wnioski: Wyniki przedstawione na Figurze 10B pokazują, że 9D4-TM swoiście wiąże się i z dużym powinowactwem do ludzkich PBMC. 6.9 Przykład 9: Modyfikowane przeciwciała anty-ifnar1 wykazują podobną siłę do niezmodyfikowanego przeciwciała macierzystego. [0271] Cel: Pokazanie, że zmodyfikowane przeciwciała anty-ifnar2 (tj. przeciwciał anty- IFNAR1 o obniżonym powinowactwie do liganda Fc) wykazują podobną siłę do niezmodyfikowanych przeciwciał macierzystych. [0272] Sposoby: System testowy reportera lucyferazy zastosowany w tym przykładzie został opisany powyżej (patrz Przykład 3). Przeciwciała przeciwko IFNAR1 zastosowane w tym

74 -73- przykładzie obejmują 9D4, 9D4-DM, 9D4-TM, MDX Włączono przeciwciało kontrolne R3-47. [0273] Wyniki: Stosując system reportera lucyferazy wygenerowano wartości IC50 dla różnych opisanych powyżej przeciwciał anty-ifnar1 (patrz Figura 11a). Przeciwciała anty- IFNAR1 9D4 (0,01 nm) i zmodyfikowane przeciwciała takie jak 9D4-DM (0,01 nm) i 9D4- TM (0,02 nm) każde wywoływało podobną wartość IC50 w teście reporterowym pokazując, że wykazują one podobną siłę. Inne przeciwciało anty-ifnar1, MDX1333 (0,04 nm), także wykazuje podobną siłę do niezmodyfikowanego przeciwciała 9D4. Kontrola izotypowa nie hamuje sygnałowania mediowanego IFN typu I w tym teście reportera lucyferazy. [0274] Wnioski: Zmodyfikowane przeciwciała anty-ifnar1 mają podobne siły do niemodyfikowanych wersji co pokazują wartości IC50 uzyskane w systemie testowym reportera lucyferazy zaprojektowanym do określenia zdarzenia sygnałowania IFN Przykład 10: 9D4-TM hamuje aktywność licznych izoform interferonu typu I alfa [0275] Cel: Pokazanie, że 9D4-TM hamuje sygnałowanie przypisać konkretnym i wielu izoformom interferonu alfa. [0276] Sposoby: System testowy lucyferazy zastosowany w tym przykładzie opisano powyżej (patrz Przykład 5). [0277] Wyniki: Wartości IC50 dla aktywności interferonu typu I mediowanej 9D4-TM przedstawiono w Tabeli 4. Tabela 4: Wartości IC50 dla hamowania aktywności interferonu typu I mediowanego 9D4-TM Interferon typu I 9D4-TM IC50 (nm) IFN-α2b 0,07 +/- 0,01 IFN-α2a 0,3 +/- 0,2 IFN-α6 0,04 +/- 0,01 IFN-α16 0,02 +/- 0,03 IFN-α8 0,03 +/- 0,04 IFN-α10 0,01 +/- 0,01 Interferon leukocytarny 0,01 +/- 0,01 IFN-α17 0,04 +/- 0,03 IFN-α14 0,02 +/- 0,01

75 -74- Interferon typu I 9D4-TM IC50 (nm) IFN-α1 0,004 +/- 0,01 IFN-α21 0,01 +/- 0,002 IFN-α7 0,04 +/- 0,01 IFN-α4b 0,02 +/- 0,01 IFN-β1 6,8 +/- 9,4 IFN-ω 0,1 +/- 0 [0278] Jak pokazano, 9D4-TM wykazuje wartości IC50 w zakresie subnanomolarnym dla licznych izoform interferonu alfa, interferonu leukocytarnego i interferonu omega. [0279] Wnioski: Zmodyfikowane przeciwciało anty-ifnar1 9D4-TM w teście reporterowym wykazuje zdolność do hamowania sygnałowania przypisanego do wieloswoistych podtypów interferonu alfa jak również leukocytarnego interferonu alfa Przykład 11: Wyznaczanie punktu izoelektrycznego 9D4, 9D4DM i 9D4TM [0280] Cel: Ocena właściwości biofizyczne macierzystego niezmodyfikowanego przeciwciała 9D4 w stosunku do zmodyfikowanych przeciwciał 9D4-DM i 9D4-TM. [0281] Sposoby: Analizę natywnej elektroforezy na żelu poliakrylamidowym z ogniskowaniem izoelektrycznym (IEF-PAGE) przeprowadzono w następujący sposób: wstępnie przygotowane przez producenta amfolityczne żele (Amersham Biosciences, zakres pi 3,5-9,5) załadowano 8 µg białka. Przed załadowaniem na żel próbki białka dializowano w 10 mm histydynie ph-6. Standardy markerowe o szerokim zakresie pi (Amersham, zakres pi 3-10, 8 µl) zastosowano do określenia względnego pi dla Mabs. Elektroforezę prowadzono przy 1500 V, 50 ma przez 105 minut. Żel utrwalano przez 45 minut z zastosowaniem roztworu utrwalającego Sigma (5x) rozcieńczonego oczyszczoną wodą do 1x. Barwienie prowadzono przez noc w temperaturze pokojowej stosując barwnik Simply Blue (Invitrogen). Odbarwianie prowadzono roztworem, który składał się z 25% etanolu, 8% kwasu octowego i 67% oczyszczonej wody. Punkty izoelektryczne określono z zastosowaniem densytometru Bio-Rad GS-800 z oprogramowaniem Quantity One Software Imaging. [0282] Wyniki: Na Figurze 12A przedstawiono punkt izoelektryczny (pi) określony dla przeciwciał 9D4WT, 9D4DM i 9D4TM. Próbki przeciwciał analizowano zgodnie ze sposobami opisanymi powyżej, i wykazywały one następujące cechy. Przeciwciało 9D4 WT wykazało dominujące prążki białkowe odpowiadające 8,2, 8,35 i 8,51. Przeciwciało DM 9D4 wykazało jeden wyraźny prążek białkowy odpowiadający 7,13. Przeciwciało 9D4 TM wykazało dominujące prążki białkowe odpowiadające 8,09 i 8,18.

76 -75- [0283] Wnioski: Jak przedstawiono w tym Przykładzie zmodyfikowane przeciwciała 9D4-DM i 9D4-TM wykazują bardzo podobne właściwości biofizyczne (pi) do macierzystego niezmodyfikowanego przeciwciała 9D Przykład 12: Termostabilność 9D4, 9D4-DM i 9D4-TM [0284] Cel: Ocena właściwości biofizycznych macierzystego niezmodyfikowanego przeciwciała 9D4 w stosunku do zmodyfikowanych przeciwciał 9D4-DM i 9D4-TM. [0285] Sposoby: Skaningową kalorymetrię różnicową przeprowadzono w następujący sposób: temperatury topnienia (Tm) mierzono z VP-DSC (MicroCal, LLC) stosując skanowania wynoszącej 1,0 C/min w zakresie temperatur od C. Zastosowano okres filtrowania 8 sekund wraz z 15 minutowym skanowaniem wstępnym. Próbki przygotowano przez dializę w 10 mm histydyna-hcl, ph 6 stosując kasety do dializy Pierce (3,5 kda). Stężenia mab wynosiły 0,14 mg/ml, 0,79 mg/ml i 0,64 mg/ml jak określono przez A280. Temperatury topnienia wyznaczono stosując się do procedur producenta stosując oprogramowanie Origin dostarczone z systemem. Pokrótce, liczne linie odniesienia puszczano z buforem zarówno dla komórki próbki i komórki odniesienia w celu uzyskania równowagi termicznej. Po odjęciu linii bazowej od termogramu próbki, dane normalizowano wobec stężenia. [0286] Wyniki: Przeciwciała 9D4, 9D4-DM, 9D4-TM poddano skaningowej kalorymetrii różnicowej jak opisano powyżej z wynikami przedstawionymi na Figurze 12B. Każde z badanych przeciwciał wykazywało w teście podobne temperatury topnienia. Konkretnie, przeciwciała wykazywały następujące temperatury topnienia: 9D4 WT = 70,41 C, 9D4-DM = 70,41 C i 9D4-TM = 70,88 C. [0287] Wnioski: Jak przedstawiono w tym Przykładzie zmodyfikowane przeciwciała 9D4-DM i 9D4-TM wykazują bardzo podobne właściwości biofizyczne (Tm) do macierzystego niezmodyfikowanego przeciwciała 9D Przykład 13: Zastępcze przeciwciała anty-ifnar chronią myszy przed białkomoczem indukowanym IFN [0288] Cel: Wykazanie, że przeciwciała anty-ifnar chronią myszy przed indukowanym białkomoczem w modelu SLE. [0289] Sposoby: Samice myszy NZB/W F1 zakupiono z Jackson Labs i trzymano w placówce z barierą zapewniającą środowisko wolne od patogenów. Rekombinowany wektor adenowirusowy zawierający mysi cdna IFN podtypu 5 pod kontrolą promotora /wzmacniacza CMV (Adv-mIFNα5) zastosowano do zaindukowania wczesnego tocznia u tych myszy. Myszy (8 myszy/grupę) w wieku 8-11 tyg. leczono pojedynczym wstrzyknięciem i.v. 0,3x10 10 cząstek wirusowych (vp) Adv-mIFNα5. Kontroli podawano taką samą ilość cząstek kontrolnych Adv. W niektórych doświadczeniach myszom wstrzyknięto gradualne dawki Adv-mIFNα5 w zakresie od 0,01 x10 10 do 1,0x10 10 vp/mysz. W celu zbadania skuteczności anty-ipnar1 myszy leczono 5 dawkowaniami i.p przeciwciała dziennie począwszy od dostarczenia 10 mg/kg Adv. Dla białkomoczu, moczu badano stosując paski do pomiaru (Chemstrip 2 GP, Roche Diagnostics). Białkomocz oceniono jako 1 dla poziomu 30 mg/dl, 2 dla 100 mg/dl i 3

77 -76- dla poziomie 500 mg/dl. Uznano, że myszy mają białkomocz jeśli dwie kolejne próbki moczu zdobyły wynik 2 lub wyższy. [0290] Wyniki: Wyniki dla myszy zakażonych adenowirusem leczonych przeciwciałami anty- IFNAR1 przedstawiono na Figurze 13. Myszy zakażone Adv-mIFNα5 wykazują białkomocz począwszy od około 3 tygodnia. Zakażone myszy leczone mysim przeciwciałem kontrolnym IgG nie są chronione przed wystąpieniem białkomoczu podczas eksperymentu co wykazano jako początek białkomoczu około 4 tygodnia. Myszy leczone przeciwciałami anty-ifnar nie wskazują białkomoczu przez całe 8 tygodni badania. Myszy leczone adenowirusową kontrolą nie wykazują białkomoczu przez czas trwania doświadczenia. [0291] Wnioski: Zebrane razem, dane w tym Przykładzie wykazują, że obecność przeciwciała anty-ifnar chroni przed białkomoczem indukowanym adv-ifn w badaniu in vivo w mysim modelu Przykład 14: Przeciwciała anty-ifnar blokują regulacje genów indukowaną IFN typu I [0292] Cel: Wykazanie, że przeciwciała anty-ifnar1 hamują lub zmniejszają regulację genów interferonem typu I w mysim modelu SLE. [0293] Sposoby: Myszy z procedury doświadczalnej opisanej w Przykładzie 13 zapewniły również próbki do analizy w tym przykładzie. RNA przygotowano z tkanek stosując bufor do lizy RLT (Qiagen). Dla tkanek litych (nerka, śledziona, skóra) zastosowano nie więcej niż 50 mg tkanki do każdorazowej obróbki RNA. Próbki umieszczono w buforze do lizy i lizującej matrycy (Qbiogene) i procesowano przez 30 s przy 4,5 m/s stosując homogenizator urządzenie Fastprep24 (Thermo Electron Corporation, Waltham, MA). W przypadku PBMC próbki krwi pełnej odwirowano i osad poddano lizie w buforze RLT. Po lizie próbki natychmiast zamrożono w temperaturze -80 C do dalszej obróbki. W celu wyizolowania RNA, rozmrożone lizaty tkanek najpierw procesowano za pomocą kolumny do wirowania Qiashredder, a następnie dodano równe objętości 70% etanolu do lizatu tkanki i RNA oczyszczono stosując zestawy minikolumny do wirowania Rneasy zgodnie z instrukcją producenta. [0294] cdna wytworzono z 3 µg RNA za pomocą odwrotnej transkryptazy SuperScript III i oligo d(t) jak opisano w protokole producenta (Invitrogen, Corp. Carlsbad, CA). Próbki cdna rozcieńczono w wodzie wolnej od nukleaz i przechowywano w temperaturze -80 C. [0295] Poziomy ekspresji wybranych genów mierzono za pomocą analizy PCR w czasie rzeczywistym TaqMan stosując system ABI 7900HT Fast Real-time PCR (Applied Biosystems, Foster City, CA). Gen metabolizmu podstawowego β-aktyny zastosowano jako kontrolę endogenną. Mieszanina reakcyjna miała końcową objętość 20 µl składając się z 1 µl cdna, 2 µl primerów 20x i sond (TaqMan Gene Expression Assays, Applied Biosystems) i 18 µl rozcieńczonego TaqMan Fast Universal PCR Master Mix. Warunki amplifikacji były następujące: 20 sekund w 95 C, 50 cykli po 1 sekundzie w 95 C i 20 sekund w 60 C. Wartości CT miały zakres od 0 do 50, przy czym ostatnia liczba zakłada, że nie doszło do wytworzenia produktu. Ilościowe określenie ekspresji genów przeprowadzono za pomocą sposobu

78 -77- porównawczego CT (Sequence Detector User Bulletin 2; Applied Biosystems) i przedstawiono jako krotność różnicy w stosunku do genu metabolizmu podstawowego. [0296] Wyniki: Interferon typu I ektopowo eksprymowany u myszy (patrz przykład 13) prowadzi do indukcji licznych genów. Na Figurze 14 przedstawiono krotność zmiany dla sześciu genów reagujących na interferon typu I u różnych populacji myszy zastosowanych w tym doświadczeniu. Konkretnie, geny IFIT1, IFI44, IFI202b, CXCL9, CXCL10 i CXCL11 zaindukowano u myszy ektopowo eksprymujących IFNα i leczono nieswoistą mysią IgG. Myszy ektopowo eksprymujące IFNα i leczone przeciwciałami anty-ifnar nie wykazują żadnej indukcji sześciu genów reagujących na interferon typu I. Jako kontrolę do wykazania swoistości adenowirusowo kodowanego IFNα, myszy leczone PBS lub kontrolnym adenowirusem nie wykazują żadnej indukcji tych 6 genów. Wyniki te wskazują, że podawanie przeciwciał anty-ifnar może blokować indukcję genów reagujących na IFN alfa w modelu mysim in vivo. [0297] Wnioski: Przeciwciała anty-ifnar mogą blokować regulowanie genów reagujących na interferon typu I w mysim modelu SLE Przykład 15: Przeciwciała anty-ifnar blokują wytwarzanie przeciwciał antydsdna i anty-ssa/ro (antygen anty-jądrowy) indukowanych interferonem typu I [0298] Cel: Wykazanie zdolności przeciwciał anty-ifnar do blokowania wytwarzania przeciwciał anty-jądrowych takich jak anty-dsdna i anty-ssa/ro indukowanych przez interferon typu I w mysim modelu SLE. [0299] Sposoby: Myszy przygotowano i leczono jak opisano w Przykładzie 13. Poziomy autoprzeciwciał anty-dsdna w surowicy oceniano za pomocą testu ELISA. Pokrótce, płytki ELISA wstępnie traktowane poli(l-lizyną) (100 µg/ml) opłaszczono aktywowanym DNA grasicy cielęcej (5 µg/ml w buforze węglan-wodorowęglan) (SIGMA). Po całonocnej inkubacji w 4 C, płytki blokowano PBS/10% FCS. Surowice (rozcieńczenie 1/200) inkubowano przez 30 minut w temperaturze pokojowej. Związane IgG wykrywano za pomocą sprzężonego z peroksydazą koziego anty-mysiego IgG (1/4000) (KPL) dodanego do płytek na 30 minut. Wiązanie zmierzono przez dodanie substratu TMB (KPL) i roztworu zatrzymującego reakcję (KPL) i odczytywano OD przy 450 nm. Mysi standard anty-dsdna IgG w surowicy badano w serii rozcieńczeń (od 625 ng/ml) (Alpha Diagnostic) na każdej płytce w celu umożliwienia standaryzacji. Poziomy przeciwciał anty-ssa/ro w surowicy mierzono za pomocą testu ELISA (Alpha Diagnostic) zgodnie z instrukcjami producenta. [0300] Wyniki: Interferon typu I ektopowo eksprymowany w myszach (patrz Przykład 13) prowadzi do akumulacji przeciwciał anty-dsdna i anty-ssa/ro. Na Figurze 15 przedstawiono względne ilości przeciwciał anty-dsdna (A) i anty-ssa/ro (B) w różnych populacjach myszy (kontrolny adenowirus, Adv-IFNα + PBS, Adv-IFNα+MuIgG i Adv-IFNα + Anty-IFNAR) zmierzono za pomocą ELISA. Myszy zakażone adenowirusem kontrolnym wykazują małe gromadzenie przeciwciał anty-dsdna, lub anty-ssa/ro w tym doświadczeniu. Myszy zakażone adenowirusem kodującym IFNα i leczone PBS gromadzą przeciwciała anty-dsdna i anty-ssa/ro. Myszy zakażone Adv-IFNα leczone przeciwciałami

79 -78- anty-ifnar nabywają mniej przeciwciał anty-dsdna i anty-ssa/ro przeciwciał niż myszy zakażone Adv-IFNα leczone nieswoistym IgG. Wyniki te pokazują, że leczenie za pomocą przeciwciał anty-ifnar hamuje akumulację przeciwciał anty-dsdna i przeciwciała anty- SSA/Ro w odpowiedzi na ektopową ekspresję IFN typu I Przykład 16: Przeciwciała anty-ifnar blokują wytwarzanie IP-10 i IL-18 indukowane interferonem typu I [0301] Cel: Wykazanie zdolności przeciwciał anty-ifnar do blokowanie akumulacji cytokin indukowanych IFN w mysim modelu SLE. [0302] Sposoby: Myszy z procedury doświadczalnej opisanej w Przykładzie 13 zapewniają również próbki do analizy w tym przykładzie. Poziomy cytokin w surowicy mierzono za pomocą ELISA (R & D Systems) zgodnie z instrukcją producenta. [0303] Wyniki: Interferon typu I ektopowo eksprymowany w myszach (patrz Przykład 13) prowadzi do akumulacji cytokin IP-10 i IL-18. Na Figurze 16 przedstawiono względne ilości IP-10 (A) i IL-18 (B) w różnych populacjach myszy (PBS, kontrolny adenowirus, Adv- IFNα+MuIgG i Adv-IFNα + Anty-IFNAR) zmierzone za pomocą ELISA. Interferon typu I ektopowo eksprymowany w myszach (patrz Przykład 12) prowadzi do akumulacji cytokin IP- 10 i IL-18. Myszy zakażone adenowirusem kontrolnym wykazują małą akumulację cytokin IP- 10 (A) lub IL-18 (B) w tym doświadczeniu. Myszy zakażone Adv-IFNα leczone przeciwciałami anty-ifnar akumulują mniej cytokin IP-10 i IL-18 niż myszy zakażone Adv-IFNα leczone nieswoistą IgG. Wyniki te pokazują, że leczenie za pomocą przeciwciał anty-ifnar hamuje akumulację cytokin IP-10 i IL-18 w odpowiedzi na ektopową ekspresję IFN typu I. [0304] Wnioski: Przeciwciała anty-ifnar są zdolne do blokowania akumulacji cytokin indukowanych IFNα w mysim modelu SLE Przykład 17: Przeciwciała anty-ifnar blokują wytwarzanie ANA (przeciwciała anty-jądrowe) indukowane interferonem typu I [0305] Cel: Wykazanie zdolności przeciwciał anty-ifnar do blokowania akumulacji przeciwciał anty-jądrowych indukowanych IFNα w modelu mysim SLE. [0306] Sposoby: Myszy z procedury doświadczalnej opisanej w Przykładzie 13 zapewniono również próbki do analizy w tym przykładzie. Poziomy przeciwciał anty-jądrowe (ANA) w surowicy mierzono zestawem testowym ANA (Antibodies Incorporated) z substratem stabilizowanym Hep-2 i figurami mitotycznymi zgodnie z instrukcją producenta. Surowicę rozcieńczono seryjnie i inkubowano z komórkami Hep-2 na szkiełkach i związane przeciwciała anty-jądrowe wykrywano za pomocą kozich anty-mysich IgG (H+L) znakowanych Hi-FITC (Antibodies Incorporated). Miano ANA zdefiniowano jako współczynnik rozcieńczenia surowicy, w którym ANA nie jest już wykrywalne. [0307] Wyniki: Interferon typu I ektopowo eksprymowany w myszach (patrz Przykład 13) prowadzi do akumulacji przeciwciał anty-ana. Na Figurze 17 przedstawiono miana przeciwciał anty-ana w surowicy różnych populacji myszy (bez wirusa, kontrolny adenowirus, Adv-IFNα + PBS, Adv-IFNα+MuIgG i Adv-IFNα + Anty-IFNAR) zmierzono za

80 -79- pomocą barwienia komórek HEP2 z seryjnym rozcieńczeniem. Myszy zakażone adenowirusem kontrolnym wykazują małą akumulację przeciwciał anty-ana w tym doświadczeniu. Myszy zakażone adenowirusem kodującym IFNα i leczone PBS akumulują przeciwciała anty-ana. Myszy zakażone Adv-IFNα leczone przeciwciałami anty-ifnar nabywają mniej przeciwciał anty-ana niż myszy zakażone Adv-IFNα leczone niespecyficzną IgG. Wyniki te pokazują, że leczenie z przeciwciałami anty-ifnar hamuje akumulację przeciwciał anty-ana w odpowiedzi do ektopową ekspresję IFN typu I. [0308] Wnioski: Przeciwciała anty-ifnar są zdolne do blokowania akumulacji przeciwciał anty-jądrowych indukowanych IFNα w mysim modelu SLE Przykład 18: Hamowanie przeciwciałami rozwój komórek dendrytycznych mediowanych osoczem SLE [0309] Cel: Osocz SLE indukuje rozwój komórek dendrytycznych z normalnych ludzkich monocytów. W tym przykładzie, oczyszczone monoklonalne przeciwciało 9D4-TM badano pod kątem hamowania rozwoju komórek dendrytycznych jak oszacowano za pomocą zdolności przeciwciała do hamowania indukcji za pomocą osocza SLE markerów powierzchni komórkowej CD38 i CD 123. [0310] Sposoby: Sposoby opisane wcześniej w zgłoszeniu patentowym US 2006/ Zasadniczo, doświadczenia prowadzono w następujący sposób: 25 ml kożuszka rozcieńczono czterokrotnie solą fizjologiczną buforowaną fosforanem (PBS). Próbkę rozdzielono po 4x50 ml do stożkowych probówek i pod spód nałożono 15 ml podłoża do separacji limfocytów (ICN Biomedicals). Po 30 minutach wirowania przy 500 g warstwę kożuszka zawierającą komórki jednojądrzaste krwi obwodowej (PBMC) usunięto i przemyto w PBS. Komórki zawieszono ponownie w podłożu zawierającym 1% inaktywowanej termicznie surowicy ludzkiej przy 4x10 6 komórek/ml. Monocyty izolowano przez inkubację PBMC (2,0x107 komórek/5 ml/25 cm 2 kolbę) przez 1,5 godziny w 37 C w podłożu hodowlanym, a następnie dwukrotnie wypłukano nie przyczepione komórki. W celu indukcji dojrzewania monocytów komórki inkubowano z podłożem zawierającym 25% ludzkiego osocza od zdrowych ochotników lub pacjentów z SLE. Badanie blokowania przeciwciałem przeprowadzono przez dodanie do hodowli 30 µg/ml przeciwciała anty- IFNAR1 lub kontroli izotypowej IgG1. Komórki inkubowano przez 4 dni, przemywano za pomocą PBS i traktowano 1: 5000 Versene przez 10 minut w 37 C. Gdy było to konieczne komórki oddzielano przez ostrożne zdrapanie komórek, po czym przemyto i poddano analizie. Każdą hodowlę zawieszono ponownie w podłożu do barwienia (zrównoważony roztwór soli Hanksa z 0,2% roztworem wodorowęglanu sodowego, 0,01% azydkiem sodu, 0,1 mm EDTA, 20 mm HEPES i 2% płodową surowicą cielęcą) i rozdzielono równo do sześciu dołków 96- studzienkowej płytki z dnem w kształcie V. Komórki wirowano impulsowo przy 2100 rpm w rotorze Sorvall RTH-750 i ponownie zawieszono w 25 µl podłoża do barwienia. Jeden mikrogram swoistego przeciwciała sprzężonego z fikoerytryną dodano do każdej studzienki i inkubowano na lodzie przez 45 minut. Komórki przemyto trzykrotnie, ponownie zawieszano w 200 µl 2% paraformaldehydu w PBS i analizowano za pomocą cytometrii przepływowej

81 -80- stosując Becton Dickinson FACScalibur. Na wykresie odczytu rozproszenia z przedniego detektora wobec detektora bocznego wykreślono bramki w celu usunięcia z analizy komórek zanieczyszczających. [0311] Wyniki: W tym doświadczeniu różnicowanie ludzkich monocytów do komórek dendrytycznych w odpowiedzi na IFN pochodzący z osocza pacjentów z SLE zablokowane przez traktowanie 9D4-TM mierzono za pomocą ekspresji dwóch markerów komórek dendrytycznych, CD38 i CD123. Na figurze 18, w obecności 9D4-TM, liczne próbki surowicy od pacjentów z SLE nie zwiększają ekspresji powierzchniowej CD38 i CD123. Wartości IC50 dla 9D4-TM wahały się od 0,02 nm do 0,06 nm zarówno dla CD38 jak i CD123. [0312] Wnioski: Przeciwciało anty-ifnar1 9D4-TM było zdolne do blokowania zdolności IFNα, pochodzącego od pacjentów z SLE, do indukowania dojrzewania pdc zmierzonego za pomocą ekspresji markerów powierzchni komórkowej Przykład 19: Przeciwciała anty-ifnar suprymują ekspresję CD38, CD123 i CD86 w monocytach stymulowanych leukocytarnym IFN [0313] Cel: W tym przykładzie przeciwciała 9D4, 9D4-DM 9D4 TM badano pod kątem hamowania rozwoju komórek dendrytycznych co oceniono za pomocą zdolności przeciwciał do hamowania indukcji markerów powierzchni komórkowej CD38, CD 123 przez leukocytarny IFN. [0314] Sposoby: Monocyty wyizolowano z krwi zdrowych dawców za pomocą podłoża do oddzielania limfocytów (MP Biomedical, Solon OH), a następnie przez pozytywną selekcję z zastosowaniem zestawu do izolacji monocytów - Monocyte Isolation kit II (Milteny Biotec, Auburn CA). Oczyszczone monocyty następnie hodowano przy 1x10 6 komórek/ml w podłożu RPMI 1640 uzupełnionym 10% FBS (Gibco BRL). Seryjnie rozcieńczone przeciwciała przygotowano w końcowym stężeniu 3 µg/ml - 20pg/ml w podłożu i dodano do odpowiednich studzienek z komórkami. Po wstępnej inkubacji przez około 5 minut, dodano 100 IU/ml IFN ludzkich leukocytów (PBL Biomedical, Piscataway NJ) do odpowiednich studzienek i inkubowano w 37 C, 5% CO2 przez 48 godziny, po czym oceniano powierzchniową ekspresję CD38 i CD123. Pokrótce, komórki odwirowano przy 1200 rpm przez 5 minut i usunięto podłoże hodowlane z pojedynczych warstw przez odsysanie, po czym raz przemyto 1x sterylnym PBS. PBS usunięto i dodano 1 ml sterylnego buforu do dysocjacji komórkowej (Gibco BRL, Carlsbad CA) lub 0,05% trypsyny (Invitrogen, Carlsbad CA) do studzienek w celu usunięcia komórek z pojedynczych warstw. Po 5 minut i krótkim wytrząsaniu równe objętości RPMI 1640 uzupełnionego 10% FBS dodano do każdej studzienki, a następnie wirowano dwa cykle i przemyto sterylnym PBS. Dodano 50 µl 1x PBS uzupełnionego 5% BSA (Sigma, St. Louis, MO) i 10 µg/ml pełnej ludzkiej IgG (Jackson ImmunoResearch Laboratories, West Grove PA) do każdej studzienki w celu zablokowania wiązania nieswoistego Fc przeciwciała i inkubowano przez 10 minut w temperaturze pokojowej. Dodano 50 µl 1x PBS uzupełnionego 5% BSA i przeciwciał PE-anty-ludzkie CD123 i FITC-anty-ludzkie CD38 (Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ) do odpowiednich studzienek i inkubowano przez 30

82 -81- minut na lodzie. Komórki przemyto jeden raz w 1x PBS uzupełnionym 5% BSA i ekspresję białka na powierzchni zmierzono na LSRII BD (Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ). 0315] Wyniki: Na Figurze 19 przedstawiono krzywe supresji ekspresji CD38 (A), CD123 (B) i CD86(C) wykazywanej przez stymulowane leukocytarnym IFN PBMC inkubowane z przeciwciałami anty-ifnar 9D4, 9D4DM i 9D4TM. Dla każdej cząsteczki CD przeciwciała anty-ifnar miały podobne krzywe supresji, które wykorzystano do generowania wartości IC50. Dla ekspresji CD38 na komórkach PBMC stymulowanych leukocytarnym IFN (A) przeciwciała anty-ifnar miały następujące wartości IC50: 9D4=4,3 ng/ml, 9D4DM=40 ng/ml, 9D4TM=25 ng/ml. Dla ekspresji CD123 na komórkach PBMC stymulowanych leukocytarnym IFN (B) przeciwciała anty-ifnar miały następujące wartości IC50: 9D4=7 ng/ml, 9D4DM=21 ng/ml, 9D4TM=10 ng/ml. Dla ekspresji CD38 na komórkach PBMC stymulowanych leukocytarnym IFN (C) przeciwciała anty-ifnar miały następujące wartości IC50: 9D4=20 ng/ml, 9D4DM=20 ng/ml, 9D4TM=26 ng/ml. [0316] Wnioski: Wyniki w tym przykładzie pokazują, że przeciwciała 9D4-DM i 9D4-TM wykazują podobne krzywe supresji indukcji IFN markerów powierzchni komórkowych pdc w porównaniu do macierzystego przeciwciała 9D Przykład 20: Zmodyfikowane przeciwciała anty-ifnar1 wykazują obniżone wiązanie do receptora Fc FcγRI [0317] Cel: Wykazanie zmniejszonego wiązanie swoistego receptora Fc do zmodyfikowanych przeciwciał anty-ifnar1. [0318] Sposoby: Aktywność wiązania zmodyfikowanych przeciwciał 9D4-DM i 9D4-TM do ludzkiego FcγRI (CD64) oceniano za pomocą ELISA. FcγRI w PBS (ph 7,4) powlekano w ilości 25 µl/studzienkę na płytce do mikromiareczkowania (Costar, nr kat. 3690) w stężeniu 20 µg/ml, przez noc w 4 C. Po przemyciu i blokowaniu z 4% mlekiem przez 1 godz. w temperaturze pokojowej do uprzednio zablokowanej płytki dodano biotynylowane przeciwciała 9D4, 9D4TM, 9D4DM i kontrolne i inkubowano w 37 C przez godzinę, rozpoczynając od 500 µg/ml, a następnie w dwukrotnych seryjnych rozcieńczeniach. Płytkę przemyto PBS (ph 7,4) zawierającym 0,05% Tween 20 i do każdej studzienki dodano 25 µl awidyny sprzężonej z HRP. Po godzinnej inkubacji w 37 C płytki przemyto ponownie i dodano 50 µl/studzienkę substratu - peroksydazy SureBlue TMB (KPL nr kat ). Reakcję zatrzymano za pomocą 50 µl 0,2 M H2SO4 po 5-10 minutach reakcji. Sygnał ELISA odczytano przy 450 nm. [0319] Wyniki: W teście wiązania opartym na ELISA (Figura 20) zmodyfikowane przeciwciała anty-ifnar1 9D4DM i 9D4TM wykazywały niższe powinowactwo wiązania do FcγRI niż niezmodyfikowane przeciwciało 9D4WT jak również przeciwciało kontrolne. [0320] Wnioski: Wyniki te pokazują, że zmodyfikowane przeciwciała anty-ifnar1 9D4-DM i 9D4-TM mają mniejsze powinowactwo do receptora Fc FcγRI w porównaniu do niezmodyfikowanego przeciwciała 9D4. Obniżone powinowactwo w stosunku do receptora FcγRI może prowadzić do obniżenia indukcji ADCC.

83 Przykład 21: Receptor Fc FcγRIIIA wykazuje zmniejszone wiązanie do zmodyfikowanych przeciwciał anty-ifnar1. [0321] Cel: Wykazanie zmniejszonego wiązania swoistego receptora Fc do zmodyfikowanych przeciwciał anty-ifnar1 9D4-DM i 9D4-TM w porównaniu do niezmodyfikowanego przeciwciała anty-ifnar1 9D4. [0322] Sposoby: Pięćdziesiąt µg/ml przeciwciał 9D4, 9D4TM i 9D4DM rozcieńczonych w PBS powlekano na płytkę do mikromiareczkowania Immunlon IV przez noc w 4 C. Po przemyciu i blokowaniu z 4% mlekiem przez 1 godz. w temperaturze pokojowej, do studzienek zablokowanej płytki dodano warianty FcγRIIIA 158F (niskie powinowactwo) i 158V (wysokie powinowactwo) ze znacznikiem FLAG rozpoczynając od 50 µg/ml, a następnie w dwukrotnych seryjnych rozcieńczeniach. Płytkę później przemywano jedną godzinę i inkubowano ze przeciwciałem anty-flag sprzężonym z biotyną (Sigma) przy 2 µg/ml. Po przemyciu do każdej studzienki dodano 25 µl awidyny sprzężonej z HRP. Niezwiązany materiał usunięto przez przemycie po godzinie inkubacji. Sygnał wiązania wykrywano substratem TMB. [0323] Wyniki: Wyniki uzyskane w teście wiązania opartym na ELISA między przeciwciałami anty-ifnar1 (9D4WT, 9D4DM i 9D4TM) i receptorem Fc FcγRIIIA o wysokim i niskim powinowactwie przedstawiono na Figurze 21 (A, B, C). Na Fig. 21(A) przeciwciała 9D4WT powleczone na płytce ELISA skutecznie wiążą się z wysokim powinowactwem do receptora FcγRIIIA w stężeniach większych niż 3 ng/ml, podczas gdy we wszystkich badanych stężeniach wiązanie jest ograniczone dla receptora FcγRIIIA o niskim powinowactwie. Na Figurze 21(B) zmodyfikowane przeciwciała 9D4DM powleczone na płytce ELISA nie wiążą się skutecznie do receptorów FcγRIIIA o wysokim lub niskim powinowactwie przy żadnym badanym stężeniu. Podobnie, na Fig. 21(C) zmodyfikowane przeciwciała 9D4TM powleczone na płytce ELISA nie skutecznie wiążą się skutecznie do receptorów FcγRIIIA o wysokim lub niskim powinowactwie przy żadnym badanym stężeniu. [0324] Wnioski: Wyniki te sugerują, że zmodyfikowane przeciwciała anty-ifnar1 9D4-DM i 9D4-TM mają zmniejszone powinowactwo do receptora FcγRIIIA w porównaniu do niezmodyfikowanego przeciwciała anty-ifnar1 9D4. Ponadto, obniżone powinowactwo do swoistego receptora Fc może prowadzić do zmniejszenia funkcji efektorowej ADCC Przykład 22: Zmodyfikowane przeciwciała 9D4DM i 9D4TM wykazują zmniejszone wiązanie dla receptora Fc FcγRIIIA [0325] Cel: Wykazanie zmniejszonego wiązania swoistego receptora Fc do zmodyfikowanych przeciwciał 9D4DM i 9D4TM. [0326] Sposoby: Pięćdziesiąt µg/ml wariantów FcγRIIIA (FcγRIIIA F i FcγRIIIA V) w PBS powlekano na płytkę do mikromiareczkowania Immunlon IV przez noc w 4 C. Po przemyciu i blokowaniu z 4% mlekiem przez 1 godz. w temperaturze pokojowej, do studzienek zablokowanej dodano biotynylowane przeciwciała 9D4, 9D4TM, 9D4DM. Płytkę przemyto i inkubowano z awidyną sprzężoną z HRP. Niezwiązany materiał usunięto przez przemycie po godzinie inkubacji. Sygnał wiązania wykrywano substratem TMB.

84 -83- [0327] Wyniki: Wyniki uzyskane w teście wiązania opartym na ELISA między receptorami Fc FcγRIIIA o wysokim i niskim powinowactwie przedstawiono na Figurze 22 (A, B, C) i przeciwciałami anty-ifnar1 (9D4WT, 9D4DM i 9D4TM). Na Fig. 22(A) niezmodyfikowane przeciwciało anty-ifnar1 w stężeniu większym niż 3 ng/ml skutecznie wiążą się z wysokim powinowactwem do receptora FcγRIIIA unieruchomionego na płytce ELISA, podczas gdy we wszystkich badanych stężeniach wiązanie przeciwciała wykazują ograniczone wiązanie do unieruchomionego receptora FcγRIIIA o niskim powinowactwie. Na Figurze 22(B) zmodyfikowane przeciwciała 9D4DM nie wiążą się skutecznie do unieruchomionych receptorów FcγRIIIA o wysokim lub niskim powinowactwie przy żadnym badanym stężeniu w porównaniu do niezmodyfikowanego przeciwciała anty-ifnar1 9D4WT. Na Figurze 22(C) zmodyfikowane przeciwciała 9D4TM nie wiążą się skutecznie do unieruchomionych receptorów FcγRIIIA o wysokim lub niskim powinowactwie przy żadnym badanym stężeniu w porównaniu do niezmodyfikowanego przeciwciała anty-ifnar1 9D4WT. [0328] Wnioski: Wyniki te pokazują, że zmodyfikowane przeciwciała 9D4-DM i 9D4-TM mają zmniejszone powinowactwo do receptora Fc FcγRIIIA w porównaniu do niezmodyfikowanego macierzystego przeciwciała 9D4. To obniżone powinowactwo może prowadzić do zmniejszenia funkcji efektorowej ADCC mediowanej FcγRIIIA w porównaniu do przeciwciała macierzystego Przykład 23: Neutralizacja podtypów IFNα przez przeciwciała anty-ifnar1 [0329] Cel: Pokazanie zdolności przeciwciał anty-ifnar1 MDX-1333, 9D4WT i 9D4TM do neutralizowania swoistych podtypów IFNα w teście reporterowym. [0330] Sposoby: Testy reporterowe dla neutralizowania IFNα zostały dobrze udokumentowane w dziedzinie. W tym przykładzie, neutralizację IFNα mierzono za pomocą testu reporterowego opartego na HiL3. Przykład jak test neutralizowania IFNα wykorzystuje komórki HiL3 jako reportera jest następujący: ludzką linię komórek raka wątroby HiL3 stransfekowano plazmidem zawierającym element odpowiedzi stymulowany IFNα-lucyferaza (ISRE-Luc) i gen oporności na neomycynę. Komórki te zostały uzyskane dzięki uprzejmości dr Michaela Tovey (CNRS, Paryż, Francja). Hil3, komórek/studzienkę, hodowano w białych odbijających światło 96-studzienkowych płytkach (DYNEX Microlite) i hodowano przez noc w podłożu Eagle zmodyfikowanym przez Dulbecco zawierającym 10% płodowej surowicy bydlęcej i 1 mg/ml G418 (+ penicylinę/streptomycynę/l-glutaminę). Po tej inkubacji dodano różne formy interferonu i płytki hodowane przez 18 godziny. Reakcję zakończono przez dodanie 10 ml buforu do lizy do fiolki z substratem lucyferazy (zestaw Luc Lite Plus, Perkin-Elmer); 100 µl roztworu substratu dodano do każdej studzienki i odczytywano na Top Count przez 10 minut (10 minut oczekiwania w ciemności, a następnie 1 sekunda na odczyt/studzienkę). Określono zliczenia na sekundę (cps) dla każdego stężenia IFN i stężenie lub cps w każdej próbce obliczono z krzywej miareczkowania IFN stosując oprogramowanie Prism (San Diego, CA) z parametrami regresji liniowej. [0331] Wyniki: Zdolność neutralizacji przeciwciał anty-ifnar1 dla różnych gatunków IFN w teście reporterowym HiL3 przedstawiono na Figurze 23 (A-E). Przeciwciała anty-ifnar1

85 -84- MDX D4WT i 9D4TM hamują liczne podtypy interferonu typu I z podobną siłą. Przeciwciała anty-ifnar1 MDX-1333, 9D4WT i 9D4TM neutralizują IFNα10 (A) z wartościami IC50, odpowiednio, 0,09880 µg/ml, 0, µg/ml i 0, µg/ml. Przeciwciała anty-ifnar1 MDX-1333, 9D4WT i 9D4TM neutralizują IFN ludzkich leukocytów (B) z wartościami IC50, odpowiednio, 1,121 µg/ml, 0,02104 µg/ml i 0,02120 µg/ml. Przeciwciała anty-ifnar1 MDX-1333, 9D4WT i 9D4TM neutralizują IFNα 2b (C) z wartościami IC50, odpowiednio, 0, µg/ml, 0, µg/ml i 0, µg/ml. Przeciwciała anty-ifnar1 MDX-1333, 9D4WT i 9D4TM neutralizują IFNω (D) z wartościami IC50, odpowiednio, 5,323 µg/ml, 0,01015 µg/ml i 0,01423 µg/ml. Przeciwciała anty-ifnar1 MDX-1333, 9D4WT i 9D4TM neutralizują IFNβ (E) z wartościami IC50, odpowiednio, 18,97 µg/ml, 0,7403 µg/ml i 0,2611 µg/ml. [0332] Wnioski: Wyniki te wskazują, że przeciwciała anty-ifnar1 MDX-1333, 9D4WT (niemodyfikowane) i 9D4TM (zmodyfikowane) wykazują podobną specyfikę i zdolność neutralizacji dla licznych interferonów typu I Przykład 24: Przeciwciała anty-ifnar1 neutralizują IFN typu I w osoczu od pacjentów z SLE [0333] Cel: Wykazanie zdolności przeciwciał anty-ifnar1 do neutralizacji IFN typu I w osoczu krwi wyizolowanej od pacjentów z SLE zmierzone za pomocą testu reporterowego. [0334] Sposoby: Stabilnie transfekowane komórki PIL-5 ISRE utrzymywano w RPMI X Pen.-Strep.-glutamina + 10% FBS i wysiano przy komórek na studzienkę na 96 studzienkowe białe/przezroczyste płytki Optilix (VWR, West Chester, PA). Przeciwciała dodano miareczkując do odpowiednich studzienek w celu uzyskania końcowego stężenia w zakresie od 90 µg/ml - 60pg/ml. Próbki osocza ludzkich pacjentów z SLE dodatnie na interferon typu I dodano do każdej studzienki do końcowego procentu surowicy 50% na studzienkę. Komórki IFN i przeciwciała inkubowano przez noc w 37 C, 5% CO2. Po całonocnej inkubacji komórki krótko odwirowano przy 1200 rpm przez 5 minut i oceniano amplifikację białka lucyferazy przez lizowanie komórek reagentem do lizy kultur komórkowych i wizualizowano z zastosowaniem systemu testowego lucyferazy (Promega, Madison WI). Sygnał zmierzono w cps, a krzywe IC50 wygenerowano z zastosowaniem oprogramowania do analizy GraphPad Prism 4. [0335] Wyniki: 9D4-TM neutralizuje interferony typu I w osoczu pacjentów z SLE. Wyniki testu neutralizacji interferonów typu I w osoczu pacjenta z SLE przedstawiono na figurze 24. Neutralizacja interferonu typu I zawartego w próbce osocza pacjenta z SLE jest specyficznie neutralizowana 9D4-TM w porównaniu z kontrolą izotypową przy wzrastających stężeniach przeciwciał. Konkretnie, 9D4-TM wykazuje IC50 0,04 nm dla neutralizacji interferonów typu I w tej próbce osocza pobranej od pacjenta z SLE. [0336] Wnioski: Wynik ten sugeruje, że zmodyfikowane przeciwciało anty-ifnar1 9D4-TM jest w stanie efektywnie neutralizować interferon typu I u pacjentów z SLE Przykład 25: Przeciwciała anty-ifnar suprymują indukowaną IFNα populację pdc w PBMC

86 -85- [0337] Cel: Pokazanie zdolności przeciwciał anty-ifnar do supresji akumulacji komórek pdc w krwi obwodowej myszy z modelu SLE. [0338] Sposoby: Myszy z procedury doświadczalnej opisanej w Przykładzie 13 zapewniły również próbki do analizy w tym przykładzie. PBMC wyizolowano ze śledziony, węzłów chłonnych, szpiku kostnego i krwi obwodowej stosując standardowe techniki izolacji i barwiono pod kątem markerów powierzchniowych B220 i Ly6C. Wyizolowane PBMC analizowano metodą FACS i podwójnie dodatnie (B220 i Ly6C) komórki zliczano jako komórki pdc i względne populacje przedstawiono na Figurze 25. [0339] Wyniki: Jak przedstawiono na Figurze 25, ektopowa ekspresja IFNα wywołuje wzrost komórek pdc w PBMC wyizolowanych ze śledziony (A), węzłów chłonnych (B), krwi (C) i szpiku kostnego (D) w obecności samego PBS lub niespecyficznej mysiej IgG. Myszy leczone przeciwciałami anty-ifnar nie akumulują komórek pdc w odpowiedzi na IFN-alfa. Myszy leczone kontrolnym adenowirusem nie akumulują pdc w populacji PBMC. [0340] Wnioski: Wyniki te sugerują, że przeciwciała anty-ifnar swoiście blokują indukowaną IFNα regulację w górę komórek pdc Przykład 26: Zmodyfikowane przeciwciała anty-ifnar1 wykazują niższe powinowactwo wiązania do receptorów Fc. [0341] Cel: Ocena względnych powinowactw wiązania zmodyfikowanych przeciwciał anty- IFNAR1 9D4-DM i 9D4-TM w porównaniu z rodzicielskim niezmodyfikowanym przeciwciałem 9D4 do różnych receptorów Fc. [0342] Sposoby: Wszystkie doświadczenia przeprowadzono na urządzeniu BIAcore 3000 (BIAcore, Inc., Uppsala, Szwecja). W typowym eksperymencie wykorzystano 1 µm roztworów IgG 9D4 do unieruchomienia jakiejkolwiek od 7000 RU - ~ 11,000 RU białka na powierzchniach układu czujnika CM5 stosując standardowy protokół sprzęgania aminokwasów (BIAcore, Inc.). Oddzielnie przygotowano również pustą powierzchnię na każdym układzie za pomocą identycznego protokołu ale bez białka. Tę pustą powierzchnię zastosowano jako odniesienie w całym doświadczeniu i stosowano w celu skorygowania zarówno nieswoistego wiązania jak i pewnych artefaktów w układzie. Do doświadczeń badania wiązania FcγRI przygotowano przy 20 nm w buforze HBS-EP (BIAcore, Inc., o następującym składzie: 10 mm bufor HEPES, ph 7,4, 150 mm NaCl, 3 mm EDTA i 0,005% P20. Między wstrzyknięciami FcγRI. Powierzchnię IgG regenerowano za pomocą 1 minutowego wstrzykiwania 5 mm HCI. Zapisy sensorogramu generowano za pomocą oprogramowania BIAevaluation 4.1 (BIAcore, Inc., Uppsala, Szwecja). [0343] Wyniki: Przeciwciało anty-ifnar1 9D4 i zmodyfikowane przeciwciało przeciwciała anty-ifnar1 9D4-TM i 9D4-DM badano pod kątem powinowactwa wiązania z unieruchomionym białkiem FcγRI w formacie testu BIAcore. Jak przedstawiono na Figurze 26, przeciwciało anty-ifnar1 9D4 wykazuje wysokie powinowactwo do unieruchomionego FcγRI. Wiązanie przeciwciała anty-ifnar1 9D4 do FcγRI jest swoiste, ponieważ podobny testu z albuminą jaja kurzego wykazuje bardzo małe powinowactwo do unieruchomionego receptora. Zmodyfikowane przeciwciała anty-ifnar1 9D4-TM i 9D4-DM wykazują mniejsze

87 -86- powinowactwo do unieruchomionego receptora FcγRI w porównaniu do niezmodyfikowanego przeciwciała anty-ifnar1 9D4. [0344] Wnioski: Otrzymane niższe powinowactwo dla FcγRI wykazywane przez zmodyfikowane przeciwciała anty-ifnar1 9D4-TM i 9D4-DM wskazują, że przeciwciała będą miały zmniejszoną zdolność do aktywacji ADCC w warunkach in vivo Przykład 27: Receptory Fc wykazują zmniejszone powinowactwo wiązania zmodyfikowanych przeciwciał anty-ifnar1 [0345] Cel: Ocena względnego powinowactwa wiązania różnych receptorów Fc do zmodyfikowanych przeciwciał anty-ifnar1 9D4-DM i 9D4-TM i macierzystego niemodyfikowanego przeciwciała anty-ifnar1 9D4. [0346] Sposoby: Pomiary powierzchniowego rezonansu plazmonowego [0347] Wszystkie doświadczenia przeprowadzono na urządzeniu BIAcore 3000 (BIAcore, Inc., Uppsala, Szwecja). W typowym eksperymencie wykorzystano 1 µm roztworu FcγRI do unieruchomienia jakiejkolwiek od 7000 RU - ~ 11,000 RU białka na powierzchniach układu czujnika CM5 stosując standardowy protokół sprzęgania aminokwasów (BIAcore, Inc.). Oddzielnie przygotowano również pustą powierzchnię na każdym układzie za pomocą identycznego protokołu ale bez białka. Tą pustą powierzchnię zastosowano jako odniesienie w całym doświadczeniu i stosowano w celu skorygowania zarówno nieswoistego wiązania jak i pewnych artefaktów w układzie. Do doświadczeń badania wiązania FcγRI przygotowano przy 333nM w buforze HBS-EP (BIAcore, Inc., o następującym składzie: 10 mm bufor HEPES, ph 7,4, 150 mm NaCl, 3 mm EDTA i 0,005% P20. Między wstrzyknięciami FcγRI. Powierzchnię IgG regenerowano za pomocą 1 minutowego wstrzykiwania 3M MgCl2. Zapisy sensorogramu generowano za pomocą oprogramowania BIAevaluation 4.1 (BIAcore, Inc., Uppsala, Szwecja). [0348] Wyniki: Przeciwciała anty-ifnar1 9D4, 9D4-TM i 9D4-DM unieruchomiono i inkubowano z rozpuszczalnym FcγRI. Powinowactwo wiązania rozpuszczalnego receptora FcγRI do każdego z przeciwciał anty-ifnar1 mierzono w teście Biacore i otrzymane zapisy przedstawiono na Figurze 27 A, B, C. FcγRI wiąże się z unieruchomionym przeciwciałem anty- IFNAR1 9D4 z wysokim powinowactwem co przedstawiono na Figurze 27A. Interakcja ta była bardzo specyficzna, ponieważ rozpuszczalna albumina jaja kurzego nie wykazała żadnego wiązania do unieruchomionego przeciwciała anty-ifnar1 9D4. Zmodyfikowane przeciwciała 9D4-TM i 9D4-DM nie wiążą FcγRI tak silnie jak niezmodyfikowane przeciwciała typu dzikiego 9D4. Na Fig. 27B zmodyfikowane przeciwciało anty-ifnar1 9D4-DM unieruchomiono i inkubowano z FcγRI lub z rozpuszczalną albuminą jaja kurzego. FcγRI wykazywało niskie powinowactwo wiązania do unieruchomionego przeciwciała 9D4-DM. Powinowactwo wiązania jest podobne do nieswoistego oddziaływania obserwowanego dla rozpuszczalnej albuminy jaja kurzego. Na Fig. 27C zmodyfikowane przeciwciało anty- IFNAR1 9D4-TM unieruchomiono i inkubowano z FcγRI lub z rozpuszczalną albuminą jaja kurzego. FcγRI wykazywało niskie powinowactwo wiązania do unieruchomionego przeciwciała 9D4-TM. Powinowactwo wiązania jest podobne do nieswoistego oddziaływania obserwowanego dla rozpuszczalnej albuminy jaja kurzego.

88 -87- [0349] Wnioski: Niższe powinowactwo wykazywane przez receptor Fc FcγRI do unieruchomionych zmodyfikowanych przeciwciał anty-ifnar1 9D4-DM i 9D4-TM w stosunku do niezmodyfikowanego przeciwciała anty-ifnar1 9D4 sugeruje, że zmodyfikowane przeciwciała będą wykazywać mniejszą zdolność do wywoływania reakcji ADCC Przykład 28: Przeciwciała anty-ifnar blokują indukcję genu reagującego na IFNα. [0350] Cel: Pokazanie zdolności przeciwciał anty-ifnar do blokowania indukcji genów reagujących na IFNα w modelu mysim SLE. [0351] Sposoby:. Myszy z procedury doświadczalnej opisanej w Przykładzie 13 zapewniły również próbki do analizy w tym przykładzie. Po upływie 8 tygodni doświadczenia myszy uśmiercono i usuwano tkanki nerki. Nie więcej niż 50 mg tkanki zastosowano do ekstrakcji RNA z zastosowaniem buforu do lizy RLT (Qiagen). Próbki umieszczono w buforze do lizy i lizującej matrycy (Qbiogene) i procesowano przez 30 s przy 4,5 m/s stosując homogenizator urządzenie Fastprep24 (Thermo Electron Corporation, Waltham, MA). W celu wyizolowania RNA, rozmrożone lizaty tkanek najpierw procesowano za pomocą kolumny do wirowania Qiashredder, a następnie dodano równe objętości 70% etanolu do lizatu tkanki i RNA oczyszczono stosując zestawy minikolumny do wirowania Rneasy zgodnie z instrukcją producenta. cdna wygenerowano z 3 µg RNA za pomocą odwrotnej transkryptazy SuperScript III i oligo d(t), jak opisano w protokole producenta (Invitrogen, Corp. Carlsbad, CA). Próbki cdna rozcieńczono w wodzie wolnej od nukleaz i przechowywano w temperaturze -80 C. [0352] Poziomy ekspresji wybranych genów mierzono za pomocą analizy PCR w czasie rzeczywistym TaqMan za pomocą szybkiego systemu ABI 7900HT Fast Real-time PCR (Applied Biosystems, Foster City, CA). Gen metabolizmu podstawowego β-aktyny zastosowano jako kontrolę endogenną. Mieszanina reakcyjna miała końcową objętość 20 µl składającej się z 1 µl cdna, 2 µl 20x primerów i sond [0353] (TaqMan Gene Expression Assays, Applied Biosystems) i 18 µl rozcieńczonego TaqMan Fast Universal PCR Master Mix. Warunki amplifikacji były następujące: 20 sekund w 95 C, 50 cykli po 1 sekundzie w 95 C i 20 sekund w 60 C. Wartości CT miały zakres od 0 do 50, przy czym ostatnia liczba zakłada, że nie doszło do wytworzenia produktu. Ilościowe określenie ekspresji genów przeprowadzono za pomocą sposobu porównawczego CT (Sequence Detector User Bulletin 2; Applied Biosystems) i przedstawiono jako krotność różnicy w stosunku do genu metabolizmu podstawowego. [0354] Wyniki: Na Figurze 28 przedstawiono wyniki analizy porównawczej ekspresji 6 genów indukowanych przez interferon alfa w nerce po 8 tygodniach w modelu mysim z pobudzonym toczniem. Myszy ektopowo eksprymujące interferon alfa leczono mysią IgG lub przeciwciałami anty-ifnar. Po 8 tygodniach myszy leczone kontrolną IgG wykazywały wysoką indukcję reagujących na IFNα genów zwanych ICAM1, VCAM1, CXCL9, CXCL10 i IFIT1. Po 8 tygodniach myszy leczone przeciwciałami anty-ifnar nie wykazują indukcji genów reagujących na IFNα.

89 -88- [0355] Wnioski: W modelu mysim z pobudzonym toczniem leczenie przeciwciałami anty- IFNAR blokuje indukcję sześciu genów (ICAM1, VCAM1, CXCL9, CXCL10 i IFIT1) w nerkach mediowaną przez ektopową ekspresję IFN-alfa w porównaniu z myszami kontrolnymi co zmierzono za pomocą testu Taqmana. Wyniki te pokazują, że przeciwciała anty-ifnar mogą blokować sygnałowanie mediowane IFNα w mysim modelu SLE Przykład 29: Przeciwciała anty-ifnar hamują akumulację autoprzeciwciał w surowicy [0356] Cel: Pokazanie zdolności przeciwciał anty-ifnar do hamowania akumulacji autoprzeciwciał w surowicy krwi myszy w modelu SLE. [0357] Sposoby: Myszy z procedury doświadczalnej opisanej w Przykładzie 13 zapewniły również próbki do analizy w tym przykładzie. Próbki pełnej krwi pobierano w 1 tygodniowych interwałach od tygodnia 2-7 schematu. Poziomy autoprzeciwciał anty-dsdna w surowicy oceniano za pomocą testu ELISA. Pokrótce, płytki ELISA wstępnie traktowane poli(l-lizyną) (100 µg/ml) opłaszczono aktywowanym DNA grasicy cielęcej (5 µg/ml w buforze węglanwodorowęglan) (SIGMA). Po całonocnej inkubacji w 4 C, płytki blokowano PBS/10% FCS. Surowice (rozcieńczenie 1/200) inkubowano przez 30 minut w temperaturze pokojowej. Związane IgG wykrywano za pomocą sprzężonego z peroksydazą koziego anty-mysiego IgG (1/4000) (KPL) dodanego do płytek na 30 minut. Wiązanie zmierzono przez dodanie substratu TMB (KPL) i roztworu zatrzymującego reakcję (KPL) i odczytywano OD przy 450 nm. Mysi standard anty-dsdna IgG w surowicy badano w serii rozcieńczeń (od 625 ng/ml) (Alpha Diagnostic) na każdej płytce w celu umożliwienia standaryzacji. [0358] Wyniki: Na Figurze 29 przedstawiono wyniki analizy opartej na ELISA poziomów przeciwciał anty-dsdna w surowicy myszy w przebiegu modelu mysiego z pobudzonym toczniem. Myszy ektopowo eksprymujące IFNα leczono przeciwciałami anty-ifnar lub przeciwciałami kontrolnymi mysiej IgG podczas 7 tygodniowego schematu. Myszy leczone przeciwciałami anty-ifnar nie akumulują przeciwciał anty-dsdna z tą samą szybkością lub w takim samym stopniu co myszy leczone przeciwciałami kontrolnymi IgG. Myszy zakażone adenowirusem kontrolnym nie rozwinęły przeciwciała anty-dsdna w czasie leczenia. [0359] Wnioski: Wyniki te pokazują, że przeciwciała anty-ifnar zmniejszają akumulację przeciwciała anty-dsdna w odpowiedzi na podwyższone poziomy IFN alfa Przykład 30: Przeciwciała anty-ifnar zmniejszają białkomocz w mysim modelu z pobudzonym toczniem [0360] Cel: Wykazanie zdolności przeciwciał anty-ifnar do zmniejszania białkomoczu (ustanowionego terapeutycznie) w modelu mysim SLE. [0361] Sposoby: Myszy z procedury doświadczalnej opisanej w Przykładzie 13 zapewniły również próbki do analizy w tym przykładzie. Jednakże, w podejściu terapeutycznym przed zastosowaniem przeciwciał myszom pozwolono rozwinąć białkomoczu jako objaw tocznia. Konkretnie, myszom pozwolono rozwinąć białkomocz z punktacją 2,0-2,5, jak opisano poprzednio. Gdy przekroczono poziom progowy białkomoczu, przez 5 dodatkowych tygodni

90 -89- prowadzono schemat leczenia semi-tygodniowych dawek PBS, kontrolnej IgG lub przeciwciał anty-ifnar. W interwałach semi-tygodniowych badano próbki moczu i przyznawano wynik dla białkomoczu. [0362] Wyniki: Na Figurze 30A przedstawiono wyniki z terapeutycznego badania przeciwciał anty-ifnar zmniejszających wynik dla białkomoczu u myszy z modelu z pobudzonym toczniem. Pokrótce, myszom pozwolono rozwijać białkomocz podając im w tym czasie jako leczenie PBS, kontrolną IgG lub przeciwciała anty-ifnar. Jak udokumentowano na figurze punktacja dla białkomoczu spadła jedynie w grupie otrzymującej przeciwciała anty-ifnar. U myszy otrzymujących PBS lub kontrolną IgG w trakcie leczenia z biegiem czasu zwiększył się wynik dla białkomoczu. (B) Analiza powierzchni pod krzywą dla wyników uzyskanych przez pięć tygodni wykazała, że grupa leczona przeciwciałem anty-ifnar różniła się od grupy z samym PBS lub kontrolną IgG, z których oba były bardzo podobne. [0363] Wnioski: Wyniki te pokazują, że przeciwciała anty-ifnar można zastosować w terapeutycznie ustanowionym SLE Przykład 31: Przeciwciała anty-ifnar zmniejszają śmiertelność w mysim modelu z pobudzonym toczniem [0364] Cel: Wykazanie zdolności przeciwciał anty-ifnar do zmniejszenia śmiertelności w terapeutycznym ustanowionym mysim modelu tocznia SLE. [0365] Sposoby: Myszy z procedury doświadczalnej opisanej w Przykładzie 30 zapewniły również próbki do analizy w tym przykładzie. W podejściu terapeutycznym przed zastosowaniem przeciwciał myszom pozwalano rozwinąć białkomocz jako objaw tocznia. terapeutycznym przed zastosowaniem przeciwciał myszom pozwolono rozwinąć białkomoczu jako objaw tocznia. Konkretnie, myszom pozwolono rozwinąć białkomocz z punktacją 2,0-2,5, jak opisano poprzednio. Gdy przekroczono poziom progowy białkomoczu, przez 5 dodatkowych tygodni prowadzono schemat leczenia semi-tygodniowych dawek PBS, kontrolnej IgG lub przeciwciał anty-ifnar. Całkowitą śmiertelność śledzono przez dodatkowe 4 tygodnie. [0366] Wyniki: Na Figurze 31 przedstawiono wskaźniki śmiertelności z terapeutycznego badania przeciwciał anty-ifnar w modelu z pobudzonym toczniem. Pokrótce, myszom pozwalano rozwinąć białkomocz, jako leczenie podając kohorcie PBS, kontrolną IgG lub przeciwciała anty-ifnar. Myszy leczone przeciwciałami anty-ifnar wykazują brak śmiertelności w 5 tygodniu, natomiast myszy leczone PBS lub kontrolną IgG wykazywały śmiertelność, odpowiednio, 87,5% i 62,5%. Ponadto, przez dziewięć tygodni badania zwierzęta leczone anty-ifnar wykazywały wysoki wskaźnik przeżywalności w porównaniu do zwierząt leczonych PBS lub kontrolną IgG. [0367] Wnioski: Wyniki w tym Przykładzie pokazują, że przeciwciała anty-ifnar mogą zmniejszyć śmiertelność związaną z toczniem Przykład 32: Brak aktywności ADCC mediowanej 9D4-TM.

91 -90- [0368] Cel: Aby zweryfikować to, że 9D4-TM nie jest w stanie indukować aktywności ADCC ze względu na jego słabe powinowactwo wiązania do FcγRI i FcγRIIIA przeprowadzono serie doświadczeń. [0369] Sposoby: Docelowe komórki 293F wyznakowano znacznikiem komórkowym DIO (Invitrogen, doświadczenia I i II), w połączono z niewyznakowanych efektorami PBMC (przez 4 h w 37 C, przy braku lub w obecności 10 µg/ml 9D4-TM, negatywnej kontroli izotypowej ludzkiej IgG1 R3-47, przeciwciałem 9D4-WT lub anty-epha2 stosowanym jako kontrola pozytywna. Lizy docelowych komórek oceniano przez pomiar podwójnego pozytywnego barwienia DiO + /PI + (jodek propidyny). Stosunek efektor-cel = 50-1, procent lizy, obliczono według wzoru: [(procent podwójnego pozytywnego barwienia w obecności przeciwciał - procent podwójnego dodatniego barwienia w samym podłożu)/(procent podwójnego pozytywnego barwienia w obecności buforu do lizy - procent podwójnego dodatniego barwienia w samym podłożu)]. Sto procent lizy uzyskano przez dodanie buforu do lizy (Promega). [0370] Alternatywnie, docelowe komórki 293F inkubowano z komórkami z transgenicznej linii komórek NK stabilnie eksprymujących FcγRIIIA (doświadczenie III) przez 4 h w 37 C, przy braku lub w obecności 10 µg/ml 9D4-TM, negatywnej kontroli izotypowej ludzkiej IgG1 R3-47, przeciwciałem 9D4-WT lub anty-epha2 stosowanym jako kontrola pozytywna. Stosunek efektor-cel = 4-1, procent lizy, obliczono według wzoru: 100 x (doświadczalna spontaniczna efektora spontaniczna celu)/(maksimum dla celu - spontaniczna celu). [0371] W doświadczeniach I i II (stosunek PBMC-293H = 50-1) procent lizy obliczono według wzoru: [(procent podwójnego pozytywnego barwienia w obecności przeciwciał - procent podwójnego dodatniego barwienia w samym podłożu)/(procent podwójnego pozytywnego barwienia w obecności buforu do lizy - procent podwójnego dodatniego barwienia w samym podłożu)]. W doświadczeniu III (transgeniczna linia komórek NK wyrażające stosunek FcγIIIA-293H = 4-1) procent lizy obliczono według wzoru: 100 x (doświadczalna spontaniczna efektora spontaniczna celu)/(maksimum dla celu - spontaniczna celu). [0372] Wyniki: Zmodyfikowane przeciwciało 9D4-TM lub niezmodyfikowane przeciwciało 9D4-WT nie wykazywało wykrywalnej aktywności ADCC w komórkach 293F ponad obserwowaną z przeciwciałem R3-47 (Tabela 4). Natomiast przeciwciało kontroli pozytywnej, przeciwciało anty-epha2 wywołało dwukrotny wzrost cytotoksyczności poziomu tła. Wyniki te potwierdzają, że 9D4-TM nie może pośredniczyć w ADCC na celach eksprymujących IFNAR1. Tabela 5: Ocena aktywności ADCC przeciwciał anty-ifnar1. Przeciwciała Przykład I Przykład II Przykład III % lizy docelowej % lizy docelowej % lizy docelowej Kontrola pozytywna: anty-epha2 33±4 36±1 43,4±0,5

92 -91- Przeciwciała Przykład I Przykład II Przykład III % lizy docelowej % lizy docelowej % lizy docelowej Kontrola negatywna: R ±1 18±3 18,1±1,1 9D4-WT 14±2 20±2 17,5±1,6 9D-TM 14±2 20±2 ND Przykład I/II/III: eksperymenty I/II/III, ND: nie wykonano, [0373] Wnioski: Wyniki te pokazują, że zmodyfikowane przeciwciało anty-ifnar1 9D4-TM nie stymuluje wykrywalnej aktywności ADCC skierowanej na komórki docelowe eksprymujące IFNAR Przykład 33: Trójwymiarowe struktury ludzkiego regionu Fc zawierającego mutacje L234F/L235E/P331S. [0374] Cel: Określenie trójwymiarowej struktury regionu Fc ludzkiej IgG1 zawierającego mutacje L234F/L235E/P331S (FC-TM). Sposoby: [0375] Oczyszczanie Fc-TM: ludzki fragment Fc/TM otrzymano z enzymatycznego rozszczepienia 9D4-TM. Trawienie przeprowadzono za pomocą unieruchomionej ficyny zgodnie z instrukcją producenta (Pierce). Pierwsze oczyszczanie przeprowadzono na kolumnie HiTrap z białkiem A zgodnie z instrukcją producenta (GE Healthcare, Piscataway, NJ). Po dializie w 50 mm octanu sodu/ph 5,2, roztwór białka nałożono na kolumnę HiTrap SP HP (GE Healthcare) i zebrano z przepływu. Przepływ załadowano na kolumnę HiTrap Q (GE Healthcare) i eluowano w gradiencie NaCl do uzyskania jednorodnego preparatu Fc/TM, co oceniono przez redukujący i nieredukujący SDS-PAGE. Profil FC-TM z SDS-PAGE wykazał obecność tylko jednego prążka około 25 kda lub 50 kda, odpowiednio, w warunkach redukujących lub nieredukujących. Obserwacja ta wyraźnie wskazuje na obecność co najmniej jednego wiązania disiarczkowego w pozycjach C226 i/lub C229. W związku z tym, zmutowane "downstream" reszty F234 i E235 były obecne w łańcuchu polipeptydowym zawierającym kryształ. [0376] Krystalizacja Fc-TM: oczyszczony Fc-TM zatężono do około 5 mg/ml w koncentratorze Centricon (Millipore, Billerica, MA, odcięcie 30 kda). Warunki krystalizacji zidentyfikowano za pomocą komercyjnych badań przesiewowych z Hampton Research (Hampton Research, Aliso Viejo, CA), Emerald BioSystems (Emerald BioSystems, Inc., Bainbridge Island, WA) i Molecular Dimensions (Molecular Dimensions Inc., Apopka, FL). Każde badanie przesiewowe dało kilka potencjalnie użytecznych warunków krystalizacji. Po optymalizacji kryształy o jakości dyfrakcji otrzymano z 0,2 M octanem cynku, 0,1 M imidazol-jabłczan, ph 8,0, 5% PEG 3350, 5% glicerol przy stężeniu białka 2,0 mg/ml. W tych warunkach w ciągu 2-3 dni urosły dobrze wykształcone kryształy o trójwymiarowym zakresie od 0,1 do 0,2 mm.

93 -92- [0377] Zbieranie danych: Dane dyfrakcyjne zbierano z pojedynczego kryształu w Centrum Zaawansowanych Badań Biotechnologicznych (CARB, University of Maryland Biotechnology Institute, Rockville, MD) stosując generator obracający anodę Rigaku MicroMax z płytą do obrazowania R-AXIS IV++ (Rigaku/MSC, The Woodlands, TX). Przed schłodzeniem kryształ utrzymywano przez kilka minut w jego roztworze do wzrostu z dodatkiem 20% glicerolu. Kryształ następnie schłodzono do 105 stopni Kelvina w chłodnicy X-stream 2000 Cryogenic (Rigaku/MSC). Uzyskano dyfrakcję do 2.3 Å po jednej rundzie annealingu jak opisano (Oganesyan et al., 2007). Dane dyfrakcji zawierające 234 obrazów wykonano stosując zakres oscylacji 0,5, odległość kryształ/detektor 200 mm i czas naświetlania 600 sekund. Dane zintegrowano i zeskalowano za pomocą oprogramowania HKL 2000 (Otwinowski & Minor, 1997). [0378] Określenie struktury: zmianę molekularną, rafinację i obliczenia gęstości elektronowej przeprowadzono stosując program CCP4 (Collaborative Computational Project). C-nominalny wyśrodkowany rombowy kryształ o zawartości rozpuszczalnika 58% i VM 2,9 zakładając jeden polipeptyd Fc w asymetrycznej jednostce komórki. Strukturę krystaliczną Fc/TM określano przez zmianę molekularną i rafinację przy rozdzielczości 2,3 Å. Strukturę ludzkiego Fc odpowiadającą numerowi ID PDB 2DTQ (Matsumiya et al., (2007) J. Mol. Biol. 368: ) zastosowano jako model ze względu na wysoką rozdzielczość i stan bez liganda. Konkretnie, domeny CH2 i CH3 uznano za oddzielne w celu zminimalizowania odchylenia w zakresie względnej konformacji domen. Dane do 3,0 Å zastosowano do problemu zmiany molekularnej stosując Phaser (McCoy et al., (2005) Acta Cryst. D61, ). Po oczyszczeniu rozpuszczalników końcowy zysk-ll i wynik-z wynosiły, odpowiednio, 1192 i 31. Obliczona ważona gęstość elektronowa z FWT/PHWT przy 3,0 Å pokazała dobre dopasowanie do modelu z wyjątkiem niektórych pętli w domenach CH2 i CH3. Silna dodatnia różnica gęstości elektronowej obliczona z DELFWT/PHDELWT była widoczna w oczekiwanym miejscu N- połączonych reszt węglowodanowych przyłączonych do N297. Nie zaobserwowano żadnych gęstości dla żadnej reszty regionu zawiasowego poprzedzającej dla pozycji 236, co przypuszczalnie jest wynikiem dużej elastyczności tego regionu. Należy zaznaczyć, że tylko dwie opisane powyżej struktury ludzkiego Fc bez liganda mogłyby pokazywać pozycje 234 i 235 (2DTQ/2DTS; Matsumiya et al., (2007) J. Mol. Biol. 368: ). Podobnie, reszty w pozycjach 446 i 447 nie mogą być widoczne. Reszta w pozycji 331 została najpierw modelowana jako alaniną. [0379] Kilka naprzemiennych rund rafinacji z zastosowaniem 'Refmac 5' (Murshudov et al., (1997) Acta Cryst. D53, ) i manualne budowanie z zastosowaniem programu graficznego "O" ((Jones et al., (1991) Acta Cryst. A47, ) konwergowane za pomocą Rczynnik 21,6 i wolnego Rczynnik 27,5 z danych o rozdzielczości do 2,3 Å. Po pierwszym etapie rafinacji, gęstość elektronowa pozwoliła na umieszczenie węglowodanów jak również na substytucję reszty serynowej w pozycji 331. W późniejszych etapach rafinowania model analizowano stosując program TLS Motion Determination (TLSMD) pracujący na serwerze swojej strony internetowej (Painter et al. (2006). J. Appl. Cryst. 39, ; Painter et al. (2006) Acta Cryst. D62, ). Następnie przeprowadzono dodatkowe rafinowanie za pomocą Refmac 5 w TLS i tryb rafinowania ograniczono stosując pięć odrębnych grup reszt

94 , , , and ). Jony cynku obecne w buforze do krystalizacji wykryto w gęstości elektronowej i modelowano jako takie, gdy pozwalały na to sfera koordynacyjna i odległość. Konkretnie, dla jednego jonu cynku stwierdzono skoordynowanie przez H310 i H435. Innym był skoordynowany przez H285 i H268 polipeptydu o powiązanej symetrii powiązane. Dwa inne zostały związane z E318 i E345. We wszystkich przypadkach, cząsteczki wody dopełniły oczekiwaną czworościenną sferę koordynacyjną jonów cynku. Ugrupowanie węglowodanowe modelowano według jego gęstości elektronowej i ostateczny model zawierał dziewięć reszt cukrowych, zasadniczo jak opisano przez nas w związku z inną strukturą ludzkiego Fc (Oganesyan et al., (2007) Molecular Immunology, December 11, 2007, in press). Ostateczny model zawierał 75 cząsteczek rozpuszczalnika. Dane krystalograficzne i statystyki rafinacji podano w Tabeli 6. Tabela 6. Statystyki danych zebranych z badania rentgenowskiego i modelu rafinacji. Długość fali, Å 1,54 Rozdzielczość Å 36,83-2,30 (2,38-2,30) a Grupa specerowa C2221 Parametry komórkowe Å 50,18, 147,30, 75,47 Całkowite odbicia 54,409 Niepowtarzalne odbicia 12,617 Średnia redundancja Kompletność, % Rmerge I/σ(I) 4,31 (2,72) a 98,3 (90,0) a 0,062 (0,300) a 13,0 (3,3) a Czynnik R /wolny czynnik R 0,216/0,275 Wiązania RMSD, Å 0,012 Kąty RMSD, 1,48 Reszty w najbardziej uprzywilejowanym regionie {ϕ,ψ} przestrzeni, % 89,9 Reszty w dodatkowo dozwolonym regionie {ϕ,ψ} przestrzeni, % 10,1 Liczba atomów białkowych 1678

95 -94- Tabela 6. Statystyki danych zebranych z badania rentgenowskiego i modelu rafinacji. Liczba atomów niebiałkowych 189 Czynnik B (Model/Wilson), Å 2 43/40 a Wartości w nawiasach odpowiadają najwyższej powłoce rozdzielczości [0380] Wyniki: FC-TM krystalizuje w grupie przestrzennej C2221 z jednym polipeptydem w asymetrycznej jednostce, (Figura 32). Kryształ dyfrakcjonowano do rozdzielczości 2,3Å i wykazywał on stosunkowo wysoką średnią mozaikowatość przy Ta wysoka mozaikowatość okazała się być właściwością zarówno schłodzonych jak i nie schłodzonych kryształów. Wszystkie reszty w pozycjach 236 do 445 można wyśledzić w gęstości elektronowej i nie obserwowano dla reszt regionu zawiasowego poprzedzającego pozycję 236, co czyni mutacje L234F i L235E niewidocznymi. Gęstość elektronowa w pozycji 331 odpowiada serynie. [0381] Współrzędne atomowe i czynniki struktury doświadczalnej Fc-TM zdeponowano w Protein Data Bank pod numerem dostępu 3C2S. [0382] Ogólna struktura trójwymiarowa Fc-TM była bardzo podobna do poprzednio opisanych struktur z ludzkich regionów Fc bez liganda (Deisenhofer, (1981). Biochemistry, 20: ; Krapp et al., (2003). J. Mol. Biol. 325, ; Matsumiya et al., (2007). J. Mol. Biol. 368: ; Oganesyan et al., (2007) Molecular Immunology, December 11, 2007, in press). Dokładniej, struktury ludzkiego Fc odpowiadają nr identyfikacyjnym PDB 1H3W (Krapp et al., (2003). J. Mol. Biol. 325: ) i 2QL1 (Oganesyan et al., (2007) Molecular Immunology, December 11, 2007, In the press) były najbliżej Fc-TM pod względem parametrów komórkowych, zawartości jednostki asymetrycznej, grupy przestrzennej i upakowania. Rozpatrywane osobno, domeny CH2 i CH3 Fc-TM wykazywały wspaniałe zachowanie strukturalnej i sztywność w porównaniu z innymi niezmutowanymi strukturami ludzkiego Fc bez liganda. Na przykład, przemieszczenia współrzędnej rms atomów Cα wynosiły 0,6 i 0,4 A dla domen CH2 i CH3, odpowiednio, gdy składano/nakładano Fc-TM z łańcuchem A o nr identyfikacyjnym PDB 2DTQ (Matsumiya et al., (2007). J. Mol. Biol. 368, ). [0383] Poniższa tabela 7 zapewnia współrzędne struktury atomowej Fc-TM. Następujące skróty zastosowano w poniższej Tabeli 7 [0384] "Typ atomu" dotyczy elementu, którego współrzędne są zapewnione. Pierwsza litera w kolumnie określa element. [0385] "A.A." dotyczy aminokwasu. [0386] "X, Y i Z" zapewniają kartezjańskie współrzędne elementu.

96 -95- [0387] "B" jest to czynnik termiczny, który mierzy ruch atomu wokół jego atomowego centrum. [0388] "OCC" dotyczy użytkowania, i stanowi odsetek czasu jaki typ atomu zajmuje konkretną współrzędną. Wartości OCC w zakresie od 0 do 1, gdzie 1 to 100%.

97 -96-

98 -97-

99 -98-

100 -99-

101 -100-

102 -101-

103 -102-

104 -103-

105 -104-

106 -105-

107 -106-

108 -107-

109 -108-

110 -109-

111 -110-

112 -111-

113 -112-

114 -113-

115 -114-

116 -115-

117 -116-

118 -117-

119 -118-

120 -119-

121 -120-

122 -121-

123 -122-

124 -123-

125 -124-

126 -125-

127 -126-

128 -127-

129 -128-

130 -129-

131 -130-

132 -131-

133 -132-

134 -133-

135 -134-

136 -135-

137 -136-

138 -137-

139 -138-

140 -139-

141 -140-

142 -141-

143 -142-

144 -143-

145 -144-

146 -145-

147 -146-

148 -147-

149 -148-

150 -149-

151 -150-

152 -151-

153 -152-

154 -153-

155 -154-

156 -155-

157 -156-

158 -157-

159 -158-

160 -159-

161 -160-

162 -161-

163 -162-

164 -163-

165 -164-

166 -165-

167 -166-

168 -167-

169 -168-

170 -169-

171 -170-

172 -171-

173 -172-

174 -173-

175 -174-

176 -175-

177 -176-

178 -177-

179 -178-

180 -179-

181 -180-

182 -181-

183 -182-

184 -183-

185 -184-

186 -185-

187 -186-

188 -187-

189 -188-

190 -189-

191 -190-

192 -191-

193 -192-

194 -193-

195 -194-

196 -195-

197 -196-

198 -197-

199 -198-

200 -199-

201 -200-

202 -201-

203 -202-

204 -203-

205 -204-

206 -205-

207 -206-

208 -207-

209 -208-

210 -209-

211 -210-

212 -211-

213 -212-

214 -213-

215 -214-

216 -215-

217 -216-

218 -217-

219 -218-

220 -219-

221 -220-

222 -221-

223 -222-

224 -223-

225 -224-

226 -225-

227 -226-

228 -227- [0389] Wniosek: stwierdzono, że trójwymiarowa struktura Fc/TM jest bardzo podobna do innych niezmutowanych ludzkich regionów Fc bez liganda. Dramatyczne, szeroko zakrojone funkcjonalne skutki zestawu substytucji TM nie zostały spowodowane przez poważne strukturalne rearanżacje w strukturze Fc, ale raczej przez miejscową utratę kilku oddziaływań w miejscach mutacji Przykład 34: Internalizacja przeciwciał anty-ifnar1

229 -228- [0390] Cel: Zbadanie zdolności przeciwciał anty-ipnar1 do internalizacji do komórek. [0391] Sposoby: Komórki THP-1 hodowano w RPMI-1640 zawierającym 0,05 mm 2- merkaptoetanolu i 10% płodową surowicę bydlęcą w 37 C w inkubatorze z 5% CO2. Komórki THP-1 wysiano przy 2 x 10 5 komórek/ml w świeżym podłożu hodowlanym jeden dzień przed doświadczeniami. W dniu doświadczenia komórki przemyto, policzono i ponownie zawieszano w PBS przy 3x 10 6 komórek/ml. Komórki wybarwiano CFSE 1 µm w 37 C w inkubatorze CO2 przez 10 minut. Po dwóch dodatkowych przemyciach PBS komórki umieszczono na lodzie i inkubowano na lodzie przez 5 minut z odcinkiem FcR stosując 20 µl na 10 6 komórek, a następnie barwiono 1 µg/ml Alexa647-9D4-TM lub Alexa 647-R347 (nieswoiste przeciwciało kontrolne) na lodzie przez 1 godzinę. Po usunięciu niezwiązanego mab przez 3-krotne płukanie z PBS, komórki ponownie zawieszano w PBS zawierającym 2% BSA i azydek sodu. Internalizację rozpoczęto przez przeniesienie komórek do komory o kontrolowanym środowisku z 37 C, 5% CO2 i 70% wilgotnością i zarejestrowano kinetykę internalizacji Alexa647-9D4-TM w czasie za pomocą obrazowania fluorescencji komórek. [0392] Obrazy fluorescencji komórek analizowano stosując algorytmu. Algorytm wykorzystuje cytozolowy barwnik CFSE w celu określenia granicy komórki i regionu błony. Algorytm określa ilościowo powiązaną z 9D4-TM fluorescencję wewnątrz komórek jak i na błonie. Oszacowanie fluorescencji zakumulowanej wewnątrz komórek obliczono za pomocą modelu dopasowania danych stosując oprogramowanie SAAMII. [0393] Wyniki: Alexa647-9D4-TM wiąże się do komórek THP-1. Na tych samych komórkach nie obserwowano wiązania dla Alexa647-R347, kontroli izotypowej dla 9D4-TM. Wynik ten pokazuje swoiste wiązanie 9D4-TM do komórek THP-1 (Figura 33). W 4 C 9D4-TM wiązało się głównie na powierzchni komórkowej (0 min - Figura 33). Gdy komórki inkubowano w 37 C, sygnał barwienia fluorescencyjnego 9D4-TM zmniejszył się znacząco na powierzchni komórki i zakumulował w przedziałach komórkowych cytozolu jako punktowe struktury. Kinetyczne obrazy zarejestrowane przez 60 min pokazały stopniową migrację fluorescencji z powierzchni komórkowej do punktowych struktur znajdujących się w przedziale komórkowym cytozolu (punkty czasowe 15, 30 i 50 min, Figura 33). Wynik wyraźnie pokazuje internalizację 9D4-TM do komórek THP Przykład 35: Brak aktywności CDC mediowanej 9D4-TM [0394] Cel: W celu ustalenia czy 9D4-TM nie jest w stanie indukować aktywności CDC przeprowadzono szereg doświadczeń. [0395] Sposoby: Świeżo wyizolowaną z ludzkiej krwi od zdrowych ludzkich dawców zebrano (około 100 ml) i wirowano przez 10 minut przy 3000 g w celu oddzielenia surowicy od komórek. Frakcję surowicę podzielono do dwóch probówek. Pierwszą probówkę rozcieńczono podłożem RPMI 1640 wolnym od fenolu do końcowego stężenia 10% surowicy (nie inaktywowaną cieplnie lub NHI). Drugą probówkę umieszczono w 56 C w łaźni wodnej na 30 minut w celu inaktywacji cieplnej składników dopełniacza. Następnie, drugą probówkę rozcieńczono podłożem RPMI 1640 wolnym od fenolu do końcowego stężenia 10% inaktywowanej cieplnie (HI) ludzkiej surowicy.

230 -229- [0396] Komórki B Daudi zastosowano jako komórki docelowe, ponieważ eksprymują CD20 (cel dla przeciwciała kontroli pozytywnej) i IFNAR1. Komórki docelowe przemyto i ponownie zawieszono w podłożu RPMI 1640 wolnym od fenolu z 10% nie inaktywowaną ciepłem surowicą lub w podłożu RPMI 1640 wolnym od fenolu z 10% inaktywowaną ciepłem surowicą w końcowym stężeniu 0,4 x 10 6 komórek/ml. Roztwory przeciwciał przygotowano w jako serie 3-krotnych rozcieńczeń ze stężeniami od 50 µg/ml, 1,3x10-6 μg/ml. Powielone rozcieńczenia preparatów przeciwciał wykonano w podłożu z inaktywowaną cieplnie lub nie inaktywowaną cieplnie ludzką surowicą. Test CDC przygotowano przez dodanie 50 μl podłoża NHI lub HI do odpowiednich studzienek 96-studzienkowej okrągłodennej płytki. 50 ul do serii rozcieńczeń przeciwciał dodano do odpowiednich studzienek. Następnie, 50 μl preparatu komórek docelowych dodawano do studzienek, w tym do dodatkowych studzienek z samymi komórkami docelowymi jako kontrole. Płytki inkubowano w 37 C przez 4 godziny w 5% CO2. Po 3,5-godzinnej inkubacji, do odpowiednich studzienek kontrolnych przeznaczonych do określenia maksymalnego sygnału do lizy dodano bufor do lizy 20 μl. Test uwalniania LDH Quantitate przeprowadzono stosując protokoły zdefiniowane w teście nieradioaktywnej toksyczności Promega, # G1780. Absorbancję mierzono przy 490 nm i zastosowaniem oprogramowania do analizy GraphPad Prism 4wygenerowano wartości Kd z. [0397] Wyniki: Na Figurze 34 przedstawiono wyniki z CDC przeprowadzonego jak opisano powyżej. Zmodyfikowane przeciwciało anty-ifnar1 9D4-TM nie wykazywało wykrywalnej aktywności CDC w docelowych komórkach B Daudi powyżej tej obserwowanej z przeciwciałem R347. Natomiast, przeciwciało kontroli dodatniej, które wiąże CD20 na komórkach B Daudi wywołało zależny od dawki wzrost cytotoksyczności w porównaniu z poziomem tła. Wyniki te potwierdzają, że 9D4-TM nie może pośredniczyć w CDC na komórkach docelowych eksprymujących IFNAR Przykład 36: Zmodyfikowane przeciwciało anty-ifnar1 9D4-TM nie wykazuje żadnej negatywnej toksyczności [0398] Cel: W celu ustalenia, że 9D4-TM nie wykazuje żadnej negatywnej toksyczności u makaków przeprowadzono badanie toksyczności pojedynczej dawki. [0399] Sposoby: W tym badaniu, 4 grupy po 10 zwierząt w każdej (5/płeć/grupę) otrzymały pojedynczą dawkę 0, 5, 30 lub 100 mg/kg 9D4-TM w dniu 1. Po podaniu 2 zwierzęta/płeć/grupę przypisano do sekcji zwłok w dniu 3, a wszystkie pozostałe zwierzęta monitorowano do dnia 70, a następnie usunięto z badania bez sekcji zwłok. Toksyczność oceniano na podstawie śmiertelności, objawów klinicznych (w tym miesiączki), immunofenotypowania, masy ciała, badaniu lekarskim/ogólnym (w tym tętna, częstość oddechów i temperatury ciała), patologii klinicznej, masy narządów i danych mikroskopowych. [0400] Wyniki: Zgodnie z warunkami określonymi powyżej, nie było żadnych związanych z 9D4-TM zmian w śmiertelności, objawach klinicznych (w tym miesiączki), masie ciała, badaniu lekarskim (tętno, częstość oddechów i temperatura ciała), patologii klinicznej, masie narządów i danych mikroskopowe. Wyniki te sugerują, że zmodyfikowane przeciwciało anty- IFNAR1 9D4-TM nie wywołuje żadnego niepożądanego działania toksycznego.

231 -230- LISTA SEKWENCJI [0401] <110> MedImmune LLC. <120> przeciwciała anty-ifnar1 ze zmniejszonym powinowactwem do liganda fc <130> IA161PCT <150> US 61/006,962 <151> <150> US 61/034,618 <151> <150> US 61/049,970 <151> <160> 50 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 11 <212> PRT <213> Sekwencja sztuczna <220> <223> syntetyczny konstrukt <400> 1 <210> 2 <211> 7 <212> PRT <213> Sekwencja sztuczna <220> <223> syntetyczny konstrukt <400> 2 <210> 3 <211> 8 <212> PRT <213> Sekwencja sztuczna <220> <223> syntetyczny konstrukt

232 -231- <400> 3 <210> 4 <211> 5 <212> PRT <213> Sekwencja sztuczna <220> <223> syntetyczny konstrukt <400> 4 <210> 5 <211> 16 <212> PRT <213> Sekwencja sztuczna <220> <223> syntetyczny konstrukt <400> 5 <210> 6 <211> 10 <212> PRT <213> Sekwencja sztuczna <220> <223> syntetyczny konstrukt <400> 6 <210> 7 <211> 354 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna <220> <223> syntetyczny konstrukt <400> 7

233 -232- <210> 8 <211> 118 <212> PRT <213> Sekwencja sztuczna <220> <223> Syntetyczny konstrukt <400> 8 <210> 9 <211> 318 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna <220> <223> syntetyczny konstrukt <400> 9

234 -233- <210> 10 <211> 106 <212> PRT <213> Sekwencja sztuczna <220> <223> syntetyczny konstrukt <400> 10 <210> 11 <211> 11 <212> PRT <213> Sekwencja sztuczna <220> <223> syntetyczny konstrukt

235 -234- <400> 11 <210> 12 <211> 7 <212> PRT <213> Sekwencja sztuczna <220> <223> syntetyczny konstrukt <400> 12 <210> 13 <211> 9 <212> PRT <213> Sekwencja sztuczna <220> <223> syntetyczny konstrukt <400> 13 <210> 14 <211> 5 <212> PRT <213> Sekwencja sztuczna <220> <223> syntetyczny konstrukt <400> 14 <210> 15 <211> 16 <212> PRT <213> Sekwencja sztuczna <220> <223> syntetyczny konstrukt <400> 15

236 -235- <210> 16 <211> 10 <212> PRT <213> Sekwencja sztuczna <220> <223> syntetyczny konstrukt <400> 16 <210> 17 <211> 354 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna <220> <223> syntetyczny konstrukt <400> 17 <210> 18 <211> 118 <212> PRT <213> Sekwencja sztuczna <220> <223> syntetyczny konstrukt <400> 18

237 -236- <210> 19 <211> 321 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna <220> <223> syntetyczny konstrukt <400> 19 <210> 20 <211> 107 <212> PRT <213> Sekwencja sztuczna <220> <223> syntetyczny konstrukt <400> 20

238 -237- <210> 21 <211> 12 <212> PRT <213> Sekwencja sztuczna <220> <223> syntetyczny konstrukt <400> 21 <210> 22 <211> 7 <212> PRT <213> Sekwencja sztuczna <220> <223> syntetyczny konstrukt <400> 22 <210> 23 <211> 10 <212> PRT <213> Sekwencja sztuczna <220> <223> syntetyczny konstrukt

239 -238- <400> 23 <210> 24 <211> 5 <212> PRT <213> Sekwencja sztuczna <220> <223> syntetyczny konstrukt <400> 24 <210> 25 <211> 17 <212> PRT <213> Sekwencja sztuczna <220> <223> syntetyczny konstrukt <400> 25 <210> 26 <211> 8 <212> PRT <213> Sekwencja sztuczna <220> <223> syntetyczny konstrukt <400> 26 <210> 27 <211> 351 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna <220> <223> syntetyczny konstrukt

240 -239- <400> 27 <210> 28 <211> 117 <212> PRT <213> Sekwencja sztuczna <220> <223> syntetyczny konstrukt <400> 28 <210> 29 <211> 324 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna <220> <223> syntetyczny konstrukt

241 -240- <400> 29 <210> 30 <211> 108 <212> PRT <213> Sekwencja sztuczna <220> <223> syntetyczny konstrukt <400> 30 <210> 31 <211> 12 <212> PRT <213> Sekwencja sztuczna <220> <223> syntetyczny konstrukt <400> 31

242 -241- <210> 32 <211> 7 <212> PRT <213> Sekwencja sztuczna <220> <223> syntetyczny konstrukt <400> 32 <210> 33 <211> 9 <212> PRT <213> Sekwencja sztuczna <220> <223> syntetyczny konstrukt <400> 33 <210> 34 <211> 5 <212> PRT <213> Sekwencja sztuczna <220> <223> syntetyczny konstrukt <400> 34 <210> 35 <211> 17 <212> PRT <213> Sekwencja sztuczna <220> <223> syntetyczny konstrukt <400> 35 <210> 36 <211> 8

243 -242- <212> PRT <213> Sekwencja sztuczna <220> <223> syntetyczny konstrukt <400> 36 <210> 37 <211> 351 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna <220> <223> syntetyczny konstrukt <400> 37 <210> 38 <211> 117 <212> PRT <213> Sekwencja sztuczna <220> <223> syntetyczny konstrukt <400> 38

244 -243- <210> 39 <211> 324 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna <220> <223> syntetyczny konstrukt <400> 39 <210> 40 <211> 108 <212> PRT <213> Sekwencja sztuczna <220> <223> syntetyczny konstrukt <400> 40

245 -244- <210> 41 <211> 107 <212> PRT <213> Sekwencja sztuczna <220> <223> syntetyczny konstrukt <400> 41

246 -245- <210> 42 <211> 330 <212> PRT <213> Sekwencja sztuczna <220> <223> syntetyczny konstrukt <400> 42

247 -246-

248 -247- <210> 43 <211> 41 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna <220> <223> syntetyczny konstrukt <400> 43 cgtgcccagc acctgaattc gaggggggac cgtcagtctt c 41 <210> 44 <211> 41 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna <220> <223> Syntetyczny konstrukt <400> 44 gaagactgac ggtcccccct cgaattcagg tgctgggcac g 41 <210> 45 <211> 41 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna <220> <223> syntetyczny konstrukt <400> 45 ccaacaaagc cctcccagcc tccatcgaga aaaccatctc c 41 <210> 46 <211> 41 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna <220> <223> syntetyczny konstrukt

249 -248- <400> 46 ggagatggtt ttctcgatgg aggctgggag ggctttgttg g 41 <210> 47 <211> 31 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna <220> <223> syntetyczny konstrukt <400> 47 ggtcccccat gcccaccatg cccagcacct g 31 <210> 48 <211> 31 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna <220> <223> syntetyczny konstrukt <400> 48 caggtgctgg gcatggtggg catgggggac c 31 <210> 49 <211> 33 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna <220> <223> syntetyczny konstrukt <400> 49 ccagcacctg agttcgaggg gggaccatca gtc 33 <210> 50 <211> 33 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna <220> <223> syntetyczny konstrukt <400> 50 gactgatggt cccccctcga actcaggtgc tgg 33 Piotr Godlewski Rzecznik patentowy

250 -249- Zastrzeżenia patentowe 1. Zmodyfikowane monoklonalne przeciwciało klasy IgG swoiste dla IFNAR1, przy czym takie przeciwciało w regionie Fc zawiera substytucję aminokwasową L234F według numeracji indeksem EU jak określono w Kabat, i przy czym przeciwciało wykazuje zmniejszone powinowactwo do co najmniej jednego liganda Fc w porównaniu do niezmodyfikowanego przeciwciała. 2. Przeciwciało według zastrzeżenia 1, przy czym takie przeciwciało jest przeciwciałem podklasy IgG1 lub IgG4. 3. Przeciwciało według zastrzeżenia 1 albo zastrzeżenia 2, przy czym przeciwciało zawiera dodatkowo substytucję aminokwasową L235E i/lub P331S. 4. Przeciwciało według dowolnego z zastrzeżeń 1-3, przy czym takie przeciwciało zawiera: a. ludzki region zmienny CDR1 łańcucha ciężkiego zawierający SEQ ID NO: 1, b. ludzki region zmienny CDR2 łańcucha ciężkiego zawierający SEQ ID NO: 2; c. ludzki region zmienny CDR3 łańcucha ciężkiego zawierający SEQ ID NO: 3; d. ludzki region zmienny CDR1 łańcucha lekkiego zawierający SEQ ID NO: 4; e. ludzki region zmienny CDR2 łańcucha lekkiego zawierający SEQ ID NO: 5; i f. ludzki region zmienny CDR3 łańcucha lekkiego zawierający SEQ ID NO: Przeciwciało według dowolnego z zastrzeżeń 1-3, przy czym takie przeciwciało zawiera: a. ludzki region zmienny CDR1 łańcucha ciężkiego zawierający SEQ ID NO: 21; b. ludzki region zmienny CDR1 łańcucha ciężkiego zawierający SEQ ID NO: 22; c. ludzki region zmienny CDR1 łańcucha ciężkiego zawierający SEQ ID NO: 23; d. ludzki region zmienny CDR1 łańcucha lekkiego zawierający SEQ ID NO: 24; e. ludzki region zmienny CDR1 łańcucha lekkiego zawierający SEQ ID NO: 25; i f. ludzki region zmienny CDR1 łańcucha lekkiego zawierający SEQ ID NO: Przeciwciało według dowolnego z zastrzeżeń 1-3, przy czym takie przeciwciało zawiera: a. ludzki region zmienny łańcucha ciężkiego zawierający sekwencję aminokwasową SEQ ID NO: 38; i

251 -250- b. ludzki region zmienny łańcucha lekkiego zawierający sekwencję aminokwasową SEQ NO: Przeciwciało według dowolnego z zastrzeżeń 1-3, przy czym takie przeciwciało zawiera: a. ludzki region zmienny łańcucha ciężkiego zawierający sekwencję aminokwasową SEQ ID NO: 18; i b. ludzki region zmienny łańcucha lekkiego zawierający sekwencję aminokwasową SEQ ID NO: Przeciwciało według dowolnego z zastrzeżeń 1-3, przy czym takie przeciwciało zawiera: a. ludzki region zmienny łańcucha ciężkiego zawierający sekwencję aminokwasową SEQ ID NO: 28; i b. ludzki region zmienny łańcucha lekkiego zawierający sekwencję aminokwasową SEQ ID NO: Przeciwciało według dowolnego z zastrzeżeń 1-8, przy czym takie przeciwciało zawiera sekwencję regionu stałego łańcucha lekkiego SEQ ID NO: Przeciwciało według dowolnego z zastrzeżeń 1-8, przy czym takie przeciwciało zawiera region stały łańcucha ciężkiego o SEQ ID NO: Przeciwciało według dowolnego z zastrzeżeń 1-10, przy czym takie przeciwciało zawiera region stały łańcucha lekkiego o sekwencji aminokwasowej SEQ ID NO: 41 i region stały łańcucha ciężkiego o sekwencji aminokwasowej SEQ ID NO: Przeciwciało według dowolnego z zastrzeżeń 1-11, przy czym takie przeciwciało zawiera sekwencję aminokwasową łańcucha ciężkiego zawierającą alleliczną zmianę, przy czym taka alleliczna zmiana znajduje się w co najmniej jednej lub więcej pozycji wybranych z grupy obejmującej 214, 221, 356 i 358 jak zdefiniowano za pomocą systemu numeracji według indeksu UE. 13. Wyizolowany kwas nukleinowy zawierający sekwencję polinukleotydową kodującą przeciwciało według dowolnego z poprzednich zastrzeżeń. 14. Kompozycja farmaceutyczna zawierająca przeciwciało według dowolnego z zastrzeżeń 1-12 i farmaceutycznie dopuszczalną substancję pomocniczą.

252 Kompozycja farmaceutyczna według zastrzeżenia 14 do zastosowania w leczeniu choroby lub zaburzenia wybranego spośród choroby Gravesa, zapalenia tarczycy Hashimoto, choroby Crohna, łuszczycy, łuszczycowego zapalenia stawów, współczulnego zapalenia oka, autoimmunologicznego zapalenia jajników, autoimmunologicznego zapalenia jądra, autoimmunizacyjnego zespołu limfoproliferacyjnego, zespołu antyfosfolipidowego, zespołu Sjögrena, twardziny, choroby Addisona, autoimmunologicznego zespołu niedoczynności wielogruczołowej, zespołu Guillaina-Barrego, immunologicznej plamicy małopłytkowej, anemii złośliwej, miastenii, pierwotnej marskości żółciowej wątroby, mieszanej choroby tkanki łącznej, bielactwa nabytego, autoimmunologicznego zapalenia błony naczyniowej oka, autoimmunologicznej niedokrwistości hemolitycznej, autoimmunologicznej małopłytkowości, celiakii, opryszczkowatego zapalenia skóry, autoimmunologicznego zapalenia wątroby, pęcherzycy, pęcherzycy pospolitej, pęcherzycy liściastej, pemfigoidu pęcherzowego, autoimmunologicznego zapalenia mięśnia sercowego, autoimmunologicznego zapalenia naczyń, łysienia plackowatego, autoimmunologicznej miażdżycy tętnic, choroby Behceta, autoimmunologicznej mielopatii, autoimmunologicznej hemofilii, autoimmunologicznego śródmiąższowego zapalenia pęcherza moczowego, autoimmunologicznej moczówki prostej, autoimmunologicznej endometriozy, nawracającego zapalenia chrząstek, zesztywniającego zapalenia stawów kręgosłupa, autoimmunologicznej pokrzywki, zapalenia skórnomięśniowego, zespołu Millera-Fishera, nefropatii IgA, zespołu Goodpasture'a i pemfigoidu ciężarnych. Piotr Godlewski Rzecznik patentowy

253 -252-

254 -253-

255 -254-

256 -255-

257 -256-

258 -257-

259 -258-

260 -259-

261 -260-

262 -261-

263 -262-

264 -263-

265 -264-

266 -265-

267 -266-

268 -267-

269 -268-

270 -269-

271 -270-

272 -271-

273 -272-

274 -273-

275 -274-

276 -275-

277 -276-

278 -277-

279 -278-

280 -279-

281 -280-

282 -281-

283 -282-

284 -283-

285 -284-

286 -285-

287 -286-

288 -287-

289 -288-

290 -289-

291 -290-

292 -291-

293 -292-

294 -293-

295 -294-

296 -295-

297 -296-

298 -297-

299 -298-

300 -299-

301 -300-

302 -301-

303 -302-

304 -303-

305 -304-