Drożdże piekarskie jako organizm modelowy w genetyce W dobie nowoczesnych, szybko rozwijających się metod sekwencjonowania DNA, naukowcy bez problemu potrafią zidentyfikować kolejność par nukleotydowych wielu wariantów danego genu. Jednak rosnącym wyzwaniem, któremu metody bioinformatyczne nie zawsze mogą sprostać, staje się przypisanie funkcji danym allelom z uwzględnieniem mutacji, które odpowiedzialne są za poszczególne choroby. Wyzwanie to podjął międzynarodowy zespół naukowców z uniwersytetów w Stanach Zjednoczonych, Kanadzie i Szwecji. Badacze wzięli pod lupę 179 wariantów 22 genów związanych z chorobami genetycznymi u człowieka i przy pomocy drożdży piekarskich opracowali panel oparty na 26 komplementacjach genetycznych. Od opublikowania w 1996 roku sekwencji genomu Saccharomyces cerevisiae stały się one niezastąpionym elementem każdego laboratorium mikrobiologicznego. Pomimo faktu, iż człowieka i komórki drożdży dzieli aż 1 miliard lat ewolucji, to właśnie drożdże piekarskie stały się modelowym organizmem biologii molekularnej eukariotów. Posiadają one wiele zalet: są nietoksyczne, niepatogenne, nieskomplikowane w hodowli oraz niewymagające dużych nakładów kosztów utrzymania hodowli. Szeroki zakres aktualnie prowadzonych badań nad ekspresją genów wykonuje się z właśnie udziałem drożdży piekarskich. Niezwykle istotnym aspektem jest heterologiczna (obca gatunkowo) ekspresja genów innych eukariontów w komórkach drożdży. Fakt ten
nabrał większego znaczenia, kiedy wykazano, że wiele chorobotwórczych (a czasem śmiertelnych) mutacji znajdujących się w genach ludzkich ma swoje odpowiedniki (znane także jako ortologi) w genomie drożdży. Ponadto, możliwość bezpośredniej heterologicznej ekspresji jak i badania drożdżowych homologów genów ludzkich pozwoliły na lepsze zrozumienie mechanizmu transformacji nowotworowych. Specjalnie zmodyfikowane szczepy S. cerevisiae używane są szeroko na polu biotechnologii medycznej w produkcji: leków (np. hirudiny), insuliny, szczepionek na wirusowe zapalenie wątroby typu B, a także małych molekuł jak hydrokortyzon. Co więcej, na komórkach drożdżowych wykonuje się badania nad zjawiskiem wielolekowej oporności. Ich zastosowanie pozwoliło na scharakteryzowanie białek z rodziny ABC transporterów, które są głównymi mediatorami wielolekooporności u prokariotów i eukariotów [1]. W swoim najnowszym eksperymencie naukowcy opracowali zestaw testów komplementacji opartych na systemie genetycznym drożdży szczepu Saccharomyces cerevisiae. Głównym celem badania było określenie potencjalnej patogeniczności 179 wariantów z 22 ludzkich genów, które są odpowiedzialne za rozwój chorób o podłożu genetycznym. Technika komplementacji genów zmutowanego organizmu modelowego pokrewnymi genami ludzkimi jest klasyczną metodą w biologii molekularnej, pozwalającą na identyfikację i przypisanie funkcji poszczególnym wariantom ludzkich genów. Zjawisko to polega na tym, że funkcja zmutowanego genu u organizmu modelowego zostaje przywrócona na drodze komplementacji z typem dzikim genu ludzkiego. Do celów swoich badań naukowcy wyselekcjonowali 22 geny, odpowiedzialne za rozwój różnych, ludzkich chorób m.in schizofrenii, autyzmu, raka piersi czy raka płuc. W badaniu stworzono dla tych 22 genów klony, które w 101 przypadkach były wariantami odpowiedzialnymi za choroby genetyczne, natomiast pozostałe 78 dotychczas traktowano jako neutralne. Warianty tych genów cechują się tak zwaną mutacją zmiany sensu, która do celów tego eksperymentu została wprowadzona dzięki metodzie mutagenezy miejscowo ukierunkowanej (ang. site directed mutagenesis). Następnie tak przygotowane
sekwencje DNA zostały wprowadzone do drożdżowych wektorów ekspresyjnych za pomocą systemu klonowania Gateway, aż w końcu odpowiednie mutanty wrażliwe na zmiany temperatury (ang. temperature-sensitive, ts mutants) drożdży piekarskich zostały tym wektorem transformowane. Przygotowane w ten sposób genetyczne konstrukty zostały poddane dwóm równoległym testom w celu zaobserwowania wzrostu komórek drożdży. Pierwsza z metod to test komplementacji, polegający na obserwacji wzrostu (lub jego braku) kolonii na płytce ze stałą pożywką (ang. functional complementation by spotting FCS). Podstawową zasadą drugiej metody była hodowla komórek drożdży w płynnej pożywce, gdzie wzrost liczby tych komórek mierzono spektrofotometrycznie poprzez pomiar OD 600 (ang. functional complementation by liquid growth time course FCT). Każdy wariant genetyczny został zbadany równolegle z pozytywną i negatywną kontrolą. Obydwie techniki pomiaru miały na celu pokazać, że wariant genu ludzkiego podejrzewanego o powodowanie choroby genetycznej nie potrafi znieść mutacji w genie ortologicznym organizmu modelowego drożdży. Brak komplementacji oznaczał ujawnienie się fenotypu zmutowanego lub braku wzrostu komórki drożdży. Jeżeli wariant genu ludzkiego okazał się być neutralny, potrafił znieść mutację w konserwatywnym ewolucyjnie, pokrewnym genie u drożdży, co w konsekwencji prowadziło do ujawnienia się typu dzikiego i wzrostu komórek drożdży. Wyniki testów FCS i FCT są obiecujące. Pokryły się one w 81% analizowanych przypadków. Fakt ten sugeruje, że komplementacja lub jej brak jest zachowana niezależnie od metody jej testowania. Pomimo tego, że testy mikrobiologiczne w płynnej pożywce są lepsze jakościowo i ilościowo w porównaniu do metody obserwacji wzrostu komórek mikroorganizmów na podłożu stałym, to w tym wypadku defekt lub brak wzrostu komórek drożdży łatwiej było zaobserwować na płytkach z pożywką stałą. Niepodważalnym dowodem na skuteczność i wiarygodność opracowanych metod stanowią wyniki testów komplementacji na wybranych genach ludzkich. Niektóre warianty związanych z chorobami genów, których ekspresja w różnym stopniu przyczynia się do ujawnienia charakterystycznych fenotypów klinicznych danej choroby, zostały opisane szczegółowo w artykułach naukowych. Analizując
dane z literatury fachowej badacze sprawdzili czułość opracowanych testów komplementacji. W jednym z przypadków przetestowano dwa warianty genu HsGDI1 (gen ortologiczny u drożdży to ScGDI1) [2]. Mutacje w genie GDI1 są powiązane z niespecyficznym, związanym z chromosomem X upośledzeniem umysłowym [3]. Test komplementacji wykazał negatywny wynik dla wariantu R423P, podczas gdy wariant L92P wykazał tylko częściową komplementację. Na podstawie literatury, odpowiednio, pacjent noszący gen o wariancie R423P charakteryzował się silniejszym fenotypem klinicznym niż pacjent z wariantem genu L92P. Wynik ten dowodzi, że opracowane metody mogą posłużyć nie tylko w identyfikowaniu chorobotwórczych wariantów danego genu, ale też w ich ilościowej ocenie [2]. Drożdże piekarskie zostały użyte w badaniu nad patogenicznością poszczególnych wariantów genów ludzkich. Źródło Wikipedia, autor Rainis Venta, licencja CC BY-SA 3.0 Identyfikacja patogenicznych mutacji na podstawie testów komplementacyjnych ma swoje ograniczenia. Jednak we współpracy z dynamicznie rozwijającymi się metodami sekwencjonowania i zastosowaniu modelowego organizmu o bardzo dobrze poznanym genomie, nowo opracowana platforma testów komplementacyjnych niesie ze sobą duże możliwości na polu badań nad genetyką organizmów. Wyniki opisanej pracy potwierdzają tezę, że zastępcze podłoże genetyczne innego eukariotycznego organizmu może posłużyć do identyfikacji i charakteryzacji patogenicznych wariantów genetycznych u ludzi. inż. Adrianna Grzelak, biotechnolog Piśmiennictwo: 1. Wawrzycka D., Drożdże jako model w badaniach chorób neurodegeneracyjnych, Postepy Hig Med. Dosw (online), 2011; 65: 328-337 2. Sun S. et al, An extended set of yeast-based functional assays accurately identifies human disease mutations, Genome Res., 2016 online access
3. NCBI Gene Database Data publikacji: 18.05.2016r.