(12) TŁUMACZENIE PATENTU EUROPEJSKIEGO (19) PL (11) PL/EP (96) Data i numer zgłoszenia patentu europejskiego:

RZECZPOSPOLITA POLSKA (12) TŁUMACZENIE PATENTU EUROPEJSKIEGO (19) PL (11) PL/EP 2383297 Urząd Patentowy Rzeczypospolitej Polskiej (96) Data i numer zgłoszenia patentu europejskiego: 14.08.2007 11173336.6 (97) O udzieleniu patentu europejskiego ogłoszono: 16.01.2013 Europejski Biuletyn Patentowy 2013/03 EP 2383297 B1 (13) (1) T3 Int.Cl. C07K 16/28 (2006.01) C07K 16/46 (2006.01) C12N 1/13 (2006.01) (4) Tytuł wynalazku: Zoptymalizowane przeciwciała ukierunkowane na CD19 (30) Pierwszeństwo: 14.08.2006 US 822362 P (43) Zgłoszenie ogłoszono: 02.11.2011 w Europejskim Biuletynie Patentowym nr 2011/44 (4) O złożeniu tłumaczenia patentu ogłoszono: 28.06.2013 Wiadomości Urzędu Patentowego 2013/06 (73) Uprawniony z patentu: Xencor Inc., Monrovia, US (72) Twórca(y) wynalazku: PL/EP 2383297 T3 MATTHEW J. BERNETT, Monrovia, US SEUNG YUP CHU, Cypress, US JOHN R. DESJARLAIS, Pasadena, US SHER BAHADUR KARKI, Pomona, US GREGORY ALAN LAZAR, Arcadia, US ERIK WEIKING PONG, Temple City, US JOHN O. RICHARDS, Duarte, US EUGENE ALEXANDER ZHUKOVSKY, West Ho (74) Pełnomocnik: rzecz. pat. Katarzyna Rudnicka SULIMA-GRABOWSKA-SIERZPUTOWSKA BIURO PATENTÓW I ZNAKÓW TOWAROWYCH SP.J. skr. poczt. 6 00-96 Warszawa Uwaga: W ciągu dziewięciu miesięcy od publikacji informacji o udzieleniu patentu europejskiego, każda osoba może wnieść do Europejskiego Urzędu Patentowego sprzeciw dotyczący udzielonego patentu europejskiego. Sprzeciw wnosi się w formie uzasadnionego na piśmie oświadczenia. Uważa się go za wniesiony dopiero z chwilą wniesienia opłaty za sprzeciw (Art. 99 (1) Konwencji o udzielaniu patentów europejskich).

SGS-3418/VAL EP 2 383 297 B1 Opis 1 20 2 30 TŁO Komórki B [0001] Komórki B są limfocytami, które odgrywają role w humoralnej odpowiedzi immunologicznej. Wytwarzane są w szpiku kostnym u większości ssaków i stanowią -1% krąŝącego zbioru limfoidalnego. Zasadniczą funkcją komórek B jest wytwarzanie przeciwciał przeciwko róŝnym antygenom i są kluczowymi składnikami adaptacyjnego układu odpornościowego. [0002] Ludzki organizm wytwarza miliony róŝnych typów komórek B kaŝdego dnia, które krąŝą we krwi i limfie pełniąc rolę nadzoru immunologicznego. Komórki B, a takŝe określane jako limfocyty B, nie wytwarzają przeciwciał, aŝ staną się w pełni aktywne. KaŜda komórka B ma unikalne białko receptora (określane jako receptor komórek B (BCR)) na swojej powierzchni, które wiąŝe się do jednego konkretnego antygenu. BCR jest związany z błoną immunoglobuliny i jest to ta cząsteczka, która umoŝliwia rozróŝnienie komórek B od innych typów limfocytów, jak równieŝ jest głównym receptorem zaangaŝowanym w aktywację komórek B. Gdy komórka B napotyka swój odpowiedni antygen i otrzymuje dodatkowy sygnał z komórki pomocniczej T, moŝe się później dalej zróŝnicować do róŝnych typów komórek B wymienionych poniŝej. Komórka B moŝe albo stać się jednym z tych typów komórek bezpośrednio, albo moŝe przejść etap pośredni róŝnicowania, reakcja ośrodków rozmnaŝania, gdzie komórki B będą hipermutowały region zmienny genu swojej immunoglobuliny i moŝliwi to zmianę klasy. [0003] Rozwój komórek B odbywa się poprzez kilka etapów, kaŝdy etap stanowi zmianę zawartości genomu w loci przeciwciał. Etapy rozwoju komórek B obejmują prekursorowe komórki B, wczesne Pro-komórki B, późne Pro-komórki B, duŝe komórki pre-b, małe prekomórki B, niedojrzałe komórki B i dojrzałe komórki B. [0004] Dojrzałe komórki B moŝna podzielić na cztery główne rodzaje: komórki B-1 eksprymują CD, marker zwykle występujący na komórkach T. Komórki B-1 równieŝ eksprymują IgM w większych ilościach niŝ IgG. Wydzielają naturalne polireaktywne przeciwciała o niskim powinowactwie występujące w surowicy i często wykazują specyficzności skierowane na własne antygeny i typowe polisacharydy bakteryjne. Komórki B-1 są obecne w małej ilości w węzłach chłonnych i śledzionie, a zamiast tego występują w przewadze w jamach otrzewnej i opłucnej

2 1 20 2 30 3 komórki B-2 są konwencjonalnymi komórkami B, do których odnosi się większość tekstów. Znajdują się one w szpiku kostnym, śledzionie i węzłach chłonnych. Są krótko Ŝyjące; a gdy są wywoływane przez antygeny, mogą róŝnicować się do komórek B pamięci. W trakcie tych odpowiedzi przeciwciał, IgG moŝe ulegać istotnemu dojrzewaniu powinowactwa. [000] Plazmatyczne komórki B (znane równieŝ jako komórki plazmatyczne) są duŝymi komórkami B, które poddano działaniu antygenu i produkują oraz wydzielają duŝe ilości przeciwciał, które towarzyszą w zniszczeniu drobnoustrojów przez wiązanie oraz ułatwianie nakierowywania ich przez fagocyty, jak równieŝ aktywacji układu dopełniacza. Komórki plazmatyczne czasem określa się jako fabryki przeciwciał. [0006] Komórki pamięci B tworzone są z aktywowanych komórek B, które są specyficzne w stosunku do antygenu napotykanego podczas pierwotnej odpowiedzi immunologicznej. Komórki te Ŝyją przez długi czas i mogą reagować szybko po drugim naraŝeniu na ten sam antygen. [0007] Gdy komórki B nie przejdą jakiegokolwiek etapu procesu dojrzewania, umierają poprzez mechanizm zwany apoptozą. Jeśli rozpoznają własny antygen w procesie dojrzewania, komórki B zostaną stłumione (znane jako anergia) lub ulegną apoptozie. Limfocyty B są ciągle wytwarzane w szpiku kostnym, lecz tylko niewielka część nowo wytworzonych komórek B przetrwa, aby przyłączyć się do długoŝyjącej, obwodowej puli komórek B. [0008] W ostatnich latach pojawiły się dane wskazujące, Ŝe limfocyty B odgrywają większą rolę w odpowiedzi immunologicznej, i nie są tylko pasywnymi odbiorcami sygnałów, które prowadzą do zróŝnicowania komórek produkujących przeciwciała w osoczu. Wraz z ich tradycyjnymi rolami, jako komórka prezentująca antygen i prekursory komórek plazmatycznych produkujących przeciwciała, odkryto, Ŝe komórki B regulują komórki prezentujące antygen (APC) oraz funkcje komórek T, produkują cytokiny oraz eksprymują pary receptor/ligand, co uprzednio uwaŝano za ograniczone do innych typów komórek. Zaburzenia komórek B [0009] Ze względu na ich krytyczną rolę w regulacji układu odpornościowego, zaburzenia regulacji komórek B są związane z róŝnymi zaburzeniami. Zaburzenia komórek B, określane w opisie jako choroby związane z komórkami B, dzielą się nadmierną i niekontrolowaną proliferację (chłoniaki, białaczki), i wady rozwoju komórek B/ produkcji immunoglobuliny (niedobory odporności). Większość (80%) przypadków chłoniaka jest pochodzenia komórek B. Obejmują one chłoniaka nieziarniczego (NHL), ostrą białaczkę limfoblastyczną (ALL), i powiązane choroby autoimmunologiczne.

3 1 20 2 30 3 [00] NHL jest niejednorodnym nowotworem wywodzącym się z limfocytów. W Stanach Zjednoczonych (USA), częstość występowania szacuje się na 6.000/rok ze śmiertelnością około 20.000 (American Cancer Society, 2006; i SEER Cancer Statistics Review). Choroba moŝe wystąpić w kaŝdym wieku, zwykle początek występuje u osób dorosłych powyŝej 40 lat, częstość występowania wzrasta wraz z wiekiem. NHL charakteryzuje się klonalną proliferacją limfocytów, które gromadzą się w węzłach chłonnych, krwi, szpiku kostnym i śledzionie, choć objęty moŝe być kaŝdy waŝny organ. [0011] Diagnoza i charakterystyka histologiczna NHL odbywa się za pomocą kombinacji kryteriów morfologicznych i immunofenotypu. Obecnym systemem klasyfikacji stosowanym przez patologów i klinicystów jest Klasyfikacja Guzów Światowej Organizacji Zdrowia (WHO), który umiejscawia NHL w nowotworach prekursorowych i dojrzałych komórek B lub T. PD dzieli obecnie NHL na przewlekłe lub agresywne w celu włączenia do badań klinicznych. Dla spójności niniejszy dokument będzie równieŝ korzystać z podobnego podziału. Grupa przewlekłych NHL składa się głównie z podtypów grudkowych, chłoniaka limfocytowego (SLL), MALT i strefy brzeŝnej; przewlekłe obejmują około 0% nowo zdiagnozowanych pacjentów B-komórkowych NHL. Agresywne NHL obejmują pacjentów z rozpoznaniem histologicznym głównie rozlanym z duŝych komórek B (40% z wszystkich nowo zdiagnozowanych pacjentów ma rozlane duŝe komórki), Burkitta i z komórek płaszcza. [0012] Przebieg kliniczny NHL jest bardzo zróŝnicowany. Głównymi wyznacznikami przebiegu klinicznego jest histologiczny podtyp. Większość przewlekłych typów NHL jest uwaŝanych za nieuleczalne choroby. Pacjenci reagują początkowo na chemioterapię lub terapię przeciwciałami, a u większości z nich dojdzie do nawrotu. Dotychczasowe badania nie wykazały poprawy przeŝycia w przypadku wczesnej interwencji. U pacjentów bez objawów, akceptowane jest obserwowanie i czekanie, aŝ u pacjenta wystąpią objawy lub tempo choroby będzie wydawało się przyspieszać. Z biegiem czasu, choroba moŝe przekształcić się do bardziej agresywnej histologii. Średni czas przeŝycia wynosi od 8 do lat, a pacjenci przewlekli często otrzymują 3 lub więcej rzutów leczenia w fazie leczenia choroby. Historycznie początkowym leczeniem objawowego pacjenta z przewlekłym NHL była chemioterapia kombinowana. Najczęściej stosowane środki obejmują: cyklofosfamid, winkrystynę i prednizon (CVP), cyklofosfamid, adriamycynę, winkrystynę, prednizon (CHOP) lub analogi puryny, fludarabinę. Około 70% do 80% pacjentów reaguje na początkową chemioterapię, czas trwania remisji jest rzędu 2-3 lat. Ostatecznie u większości pacjentów dochodzi do nawrotu. Odkrycie i zastosowanie kliniczne przeciwciał anty- CD20, rytuksymabu, zapewniło istotną poprawę odpowiedzi oraz przeŝywalności. Obec-

4 1 20 2 30 3 nym standardem leczenia większości chorych jest rytuksymab + CHOP (R-CHOP) lub rytuksymab + CVP (R-CVP). Interferon jest dopuszczony do początkowego leczenia NHL w połączeniu z czynnikami alkilującymi, ale ma ograniczone zastosowanie w USA. [0013] Wykazano, Ŝe terapia rytuksymabem jest skuteczna w kilku typach NHL, oraz jest on obecnie dopuszczony jako leczenie pierwszego rzutu zarówno w NHL przewlekłych (chłoniaka grudkowego), jak i agresywnych (chłoniak rozlany z duŝych komórek B). JednakŜe, istnieją znaczne ograniczenia przeciwciała monoklonalnego anty-cd20 (mab), w tym pierwotna odporność (0% odpowiedzi u przewlekłych pacjentów z nawrotem choroby), oporność nabyta (0% odsetek odpowiedzi na ponowne leczenie), rzadko całkowita odpowiedź (2% całkowity odsetek odpowiedzi w populacji z nawrotem), oraz ten sam wzór nawrotu. Wreszcie, wiele komórek B nie eksprymuje CD20, oraz tym samym zaburzenia komórek B nie dają się leczyć przy uŝyciu terapii przeciwciałem anty-cd20. Przeciwciała przeciwko antygenom innym niŝ CD20 mogą wykazywać działanie przeciwko chłoniakowi, które mogłoby pokonać oporność anty-cd20 lub zwiększyć aktywności terapii anty-cd20. [0014] Oprócz NHL istnieje kilka typów białaczki, które wynikają z zaburzeń komórek B. Przewlekła białaczka limfocytowa (znana równieŝ jako przewlekła białaczki limfatyczna lub cell ), jest typem białaczki dorosłych spowodowanym nieprawidłowym gromadzeniem limfocytów B. W CLL, złośliwe limfocyty mogą wyglądać normalnie i dojrzale, ale nie są w stanie poradzić sobie skutecznie z infekcją. CLL jest najczęstszą postacią białaczki u osób dorosłych. U męŝczyzn dochodzi do rozwoju CLL dwa razy częściej niŝ u kobiet. Jednak głównym czynnikiem ryzyka jest wiek. Ponad 7% nowych przypadków rozpoznaje się u pacjentów powyŝej 0 roku Ŝycia. Ponad.000 przypadków diagnozuje się co roku, a śmiertelność to prawie 000 rocznie (American Cancer Society, 2006; i SEER Cancer Statistics Review). [001] CLL jest chorobą nieuleczalną, ale w większości przypadków rozwija się powoli. Wiele osób z CLL prowadzi normalne i aktywne Ŝycie przez wiele lat. Ze względu na powolny początek, CLL na wczesnym etapie na ogół nie jest leczona, poniewaŝ uwaŝa się, Ŝe na wczesna interwencja CLL nie poprawia czasu przeŝycia lub jakości Ŝycia. Zamiast tego, monitorowany w czasie jest stan. Wstępne leczenie CLL zaleŝy od dokładnej diagnozy i progresji choroby. Istnieją dziesiątki leków stosowanych w terapii CLL. ChociaŜ wykazano, Ŝe analog puryny fludarabina daje lepsze wskaźniki odpowiedzi niŝ chlorambucyl jako terapia pierwszego rzutu, nie ma dowodów, Ŝe wczesne stosowanie fludarabiny zwiększa całkowite przeŝycie. Schematy chemioterapii kombionowanej takie, jak fludarabina z cyklofosfamidem, FCR (fludarabina, cyklofosfamid i rytuksymab) oraz CHOP są skuteczne

1 20 2 30 zarówno w nowo rozpoznanej i nawrotowej CLL. Allogeniczny przeszczep szpiku (komórek macierzystych) jest rzadko stosowany jako leczenie pierwszego rzutu w leczeniu CLL ze względu na ryzyko. [0016] Oporna CLL jest chorobą, która nie reaguje pozytywnie na leczenie. W tym przypadku brane są pod uwagę bardziej agresywne metody leczenia, w tym przeszczep szpiku kostnego (komórek macierzystych). Monoklonalne przeciwciało alemtuzumab, skierowane przeciwko CD2, moŝe być stosowane u pacjentów z oporną na leczenie chorobą wywodzącą się ze szpiku kości. [0017] Innym rodzajem białaczki jest ostra białaczka limfoblastyczna (ALL), znana równieŝ jako ostra białaczka limfocytowa. ALL charakteryzuje nadprodukcją i ciągłym namnaŝaniem się złośliwych i niedojrzałych białych ciałek krwi (znanych równieŝ jako limfoblasty) w szpiku kostnym. Ostra odnosi się do niezróŝnicowanego, niedojrzałego stanu krąŝących limfocytów ( blastów ) oraz dlatego, Ŝe choroba postępuje szybko z przewidywaną długością Ŝycia rzędu tygodni do miesięcy, jeśli nie jest leczona. ALL jest najbardziej powszechna w dzieciństwie, ze szczytem występowania w wieku 4- lat. Dzieci w wieku 12-16 umierają na nią łatwiej niŝ inni. Obecnie, co najmniej 80% dziecięcych ALL uznawanych jest za uleczalne. Niespełna 4.000 przypadków jest diagnozowanych kaŝdego roku, a śmiertelność wynosi niemal 1.00 rocznie (American Cancer Society, 2006; i SE- ER Cancer Statistics Review). [0018] Reakcja autoimmunologiczna wynika z załamania własnej tolerancji wykorzystującej mechanizmy immunologiczne humoralne i/lub mediowane komórkowo. Wśród konsekwencji niewydolności tolerancji centralnej i/lub obwodowej, są przeŝycie i aktywacja samoreaktywnych komórek B i komórek T. Przykłady chorób autoimmunologicznych obejmują, na przykład, reumatoidalne zapalenie stawów (RA), układowy toczeń rumieniowaty (SLE lub toczeń), stwardnienie rozsiane, zespół Sjogrena, oraz małopłytkowość samoistna (ITP). Patogeneza większości chorób autoimmunologicznych jest połączona z produkcją przeciwciał przeciwko własnym antygenom, co prowadzi do róŝnych powiązanych patologii. Przeciwciała są wytwarzane przez komórki plazmatyczne końcowo zróŝnicowane, które pochodzą z komórek B naiwnych lub pamięci. Ponadto, komórki B mogą mieć wpływ na inne autoimmunologiczne patologie, jak komórki prezentujące antygen (APC), które mogą oddziaływać i stymulować pomocnicze limfocyty T, dalej pobudzając cykl odpowiedzi immunologicznej przeciwko sobie. Ubytek komórek B moŝe mieć bezpośredni wpływ na produkcję przeciwciał. Rzeczywiście, wykazano, Ŝe leczenie w SLE i RA terapiami zmniejszającymi komórki B takimi, jak Rituxan ma kliniczne korzyści dla obu klas

6 1 20 2 30 3 chorób (Edwards & Cambridge, Nat. Rev. Immunol. 2006; Dass i współpr., Future Rheumatol. 2006; Martin & Chan, Annu. Rev. Immunol. 2066). [0019] Niestety, nie jest znany a priori, mechanizm działania, który moŝe być optymalny dla danego antygenu docelowego. Ponadto, nie wiadomo, które przeciwciała mogą być zdolne do pośredniczenia danego mechanizmu działania wobec komórki docelowej. W niektórych przypadkach brak aktywności przeciwciał, albo mediowanych Fv, albo mediowanych Fc, moŝe być spowodowany nakierowaniem epitopu na docelowy antygen, który ma słabe właściwości w pośredniczeniu. W innych przypadkach, nakierowany epitop moŝe być odpowiedni do poŝądanej aktywności mediowanej Fv lub mediowanej Fc, jednak powinowactwo to moŝe być niewystarczające (powinowactwo regionu Fv dla antygenu lub powinowactwo regionu Fc dla receptorów Fc). W kierunku rozwiązania tego problemu, niniejszy wynalazek opisuje modyfikacje przeciwciał anty-cd19 zapewniających zoptymalizowane aktywności mediowane Fv i Fc. RozwaŜa się szeroki wachlarz zastosowań tych zoptymalizowanych przeciwciał. STRESZCZENIE WYNALAZKU [0020] Opisane tutaj jest przeciwciało wiąŝące CD19, przy czym wymienione przeciwciało zawiera co najmniej jedną modyfikację w regionie stałym w stosunku do przeciwciała macierzystego. [0021] Opisane powyŝej przeciwciało wiąŝe się ze zmienionym powinowactwem do receptora Fc lub zmienia funkcje efektorowe w porównaniu do macierzystego przeciwciała. [0022] Ujawnione jest równieŝ przeciwciało, które wiąŝe CD19, zawierające przynajmniej jedną modyfikację w regionie stałym względem macierzystego przeciwciała anty-cd19, w którym przeciwciało to wiąŝe się ze zwiększonym powinowactwem do receptora FcγRIIIa w porównaniu do macierzystego przeciwciała. [0023] W pewnych aspektach, modyfikacja jest aminokwasem. Modyfikacja moŝe być w pozycji wybranej z grupy składającej się z 221, 222, 223, 224, 22, 227, 228, 230, 231, 232, 233, 234, 23, 236, 237, 238, 239, 240, 241, 243, 244, 24, 246, 247, 249, 2, 28, 260, 262, 263, 264, 26, 266, 267, 268, 269, 270, 271, 272, 273, 274, 27, 276, 278; 280, 281, 282, 283, 284, 28, 286, 288, 290, 291, 292, 293, 294, 29, 296, 297, 298, 299, 300, 301, 302, 303, 304, 30, 313, 317, 318, 320, 322, 323, 324, 32, 326, 327, 328, 329, 330, 331, 332, 333, 334, 33, 336, oraz 337, przy czym numeracja odbywa się zgodnie z indeksem EU. Modyfikacje aminokwasów mogą być podstawieniem wybranym z grupy składającej się z 221 K, 221 Y, 222E, 222Y, 223E, 223K, 224E, 224Y, 22E, 22K, 22W, 227E, 227G, 227K, 227Y, 228E, 228G, 228K, 228Y, 230A, 230E, 230G, 230Y, 231E, 231G, 231K, 231P, 231Y, 232E, 232G, 232K, 232Y, 233A, 233D, 233F, 233G, 233H,

7 1 20 2 30 3 233I, 233K, 233L, 233M, 233N, 233Q, 233R, 233S, 233T, 233V, 233W, 233Y, 234A, 234D, 234E, 234F, 234G, 234H, 234I, 234K, 234M, 234N, 234P, 234Q, 234R, 234S, 234T, 234V, 234W, 234Y, 23A, 23D, 23E, 23F, 23G, 23H, 23I, 23K, 23M, 23N, 23P, 23Q, 23R, 23S, 23T, 23V, 23W, 23Y, 236A, 236D, 236E, 236F, 236H, 236I, 236K, 236L, 236M, 236N, 236P, 236Q, 236R, 236S, 236T, 236V, 236W, 236Y, 237D, 237E, 237F, 237H, 237I, 237K, 237L, 237M, 237N, 237P, 237Q, 237R, 237S, 237T, 237V, 237W, 237Y, 238D, 238E, 238F, 238G, 238H, 238I, 238K, 238L, 238M, 238N, 238Q, 238R, 238S, 238T, 238V, 238W, 238Y, 239D, 239E, 239F, 239G, 239H, 239I, 239K, 239L, 239M, 239N, 239P, 239Q, 239R, 239T, 239V, 239W, 239Y, 240A, 240I, 240M, 240T, 241D, 241E, 241L, 241R, 241S, 241W, 241Y, 243E, 243H, 243L, 243Q, 243R, 243W, 243Y, 244H, 24A, 246D, 246E, 246H, 246Y, 247G, 247V, 249H, 249Q, 249Y, 2E, 2Y, 28H, 28S, 28Y, 260D, 260E, 260H, 260Y, 262A, 262E, 262F, 262I, 262T, 263A, 263I, 263M, 263T, 264A, 264D, 264E, 264F, 264G, 264H, 264I, 264K, 264L, 264M, 264N, 264P, 264Q, 264R, 264S, 264T, 264W, 264Y, 26F, 26G, 26H, 26I, 26K, 26L, 26M, 26N, 26P, 26Q, 26R, 26S, 26T, 26V, 26W, 26Y, 266A, 266I, 266M, 266T, 267D, 267E, 267F, 267H, 267I, 267K, 267L, 267M, 267N, 267P, 267Q, 267R, 267T, 267V, 267W, 267Y, 268D, 268E, 268F, 268G, 268I, 268K, 268L, 268M, 268P, 268Q, 268R, 268T, 268V, 268W, 269F, 269G, 269H, 2691, 269K, 269L, 269M, 269N, 269P, 269R, 269S, 269T, 269V, 269W, 269Y, 270F, 270G, 270H, 270I, 270L, 270M, 270P, 270Q, 270R, 270S, 270T, 270W, 270Y, 271 A, 271D, 271E, 271F, 271G, 271H, 271I, 271K, 271L, 271M, 271N, 271Q, 271 R, 271 S, 271T, 271V, 271W, 271Y, 272D, 272F, 272G, 272H, 272I, 272K, 272L, 272M, 272P, 272R, 272S, 272T, 272V, 272W, 272Y, 273I, 274D, 274E, 274F, 274G, 274H, 274I, 274L, 274M, 274N, 274P, 274R, 274T, 274V, 274W, 274Y, 27L, 27W, 276D, 276E, 276F, 276G, 276H, 276I, 276L, 276M, 276P, 276R, 276, 276T, 276V, 276W, 276Y, 278D, 278E, 278G, 278H, 278I, 278K, 278L, 278M, 278N, 278P, 278Q, 278R, 278S, 278T, 278V, 278W, 280G, 280K, 280L, 280P, 280W, 281D, 281E, 281K, 281N, 281P, 281Q, 281Y, 282E, 282G, 282K, 282P, 282Y; 283G, 283H, 283K, 283L, 283P, 283R, 283Y, 284D, 284E, 284L, 284N, 284Q, 284T, 284Y, 28D, 28E, 28K, 28Q, 28W, 28Y, 286E, 286G, 286P, 286Y, 288D, 288E, 288Y, 290D, 290H, 290L, 290N, 290W, 291D, 291E, 291G, 291H, 291I, 291Q, 291T, 292D, 292E, 292T, 292Y, 293F, 293G, 293H, 293I, 293L, 293M, 293N, 293P, 293R, 293S, 293T, 293V, 293V, 293Y, 294F, 294G, 294H, 2941, 294K, 294L, 294M, 294P, 294R, 294S, 294T, 294V, 294W, 294Y, 29D, 29SE, 29F, 29G, 29H, 29I, 29M, 29N, 29P, 29R, 29S, 29T, 29V, 29W, 29Y, 296A, 296D, 296E, 296G, 296H, 296I, 296K, 296L, 296M, 296N, 296Q, 296R, 296S,

8 1 20 2 30 3 296T, 296V, 297D, 297E, 297F, 297G, 297H, 2971, 297K, 297L, 297M, 297P, 297Q, 297R, 297S, 297T, 297V, 297W, 297Y, 298A, 298D, 298E, 298F, 298H, 298I, 298K, 298M, 298N, 298Q, 298R, 298T, 298W, 298Y, 299A, 299D, 299E, 299F, 299G, 299H, 299I, 299K, 299L, 299M, 299N, 299P, 299Q, 299R, 299S, 299V, 299W, 299Y, 300A, 300D, 300E, 300G, 300H, 300K, 300M, 300N, 300P, 300Q, 300R, 300S, 300T, 300V, 300W, 301D, 301E, 301H, 301Y, 302I, 303D, 303E, 303Y, 304D, 304H, 304L, 304N, 304T, 30E, 30T, 30Y, 313F, 317E, 317Q, 318H, 318L, 318Q, 318R, 318Y, 320D, 320F, 320G, 320H, 320I, 320L, 320N, 320P, 320S, 320T, 320V, 320W, 320Y, 322D, 322F, 322G, 322H, 322I, 322P, 322S, 322T, 322V, 322W, 322Y, 323I, 324D, 324F, 324G, 324H, 324I, 324L, 324M, 324P, 324R, 324T, 324V, 324W, 324Y, 32A, 32D, 32E, 32F, 32G, 32H, 32I, 32K, 32L, 32M, 32P, 32Q, 32R, 32S, 32T, 32V, 32W, 32Y, 326E, 326I, 326L, 326P, 326T, 327D, 327E, 327F, 327H, 327I, 327K, 327L, 327M, 327N, 327P, 327R, 327S, 327T, 327V, 327W, 327Y, 328A, 328D, 328E, 328F, 328G, 328H, 328T, 328K, 328M, 328N, 328P, 328Q, 328R, 328S, 328T, 328V, 328W, 328Y, 329D, 329E, 329F, 329G, 329H, 329I, 329K, 329L, 329M, 329N, 329Q, 329R, 329S, 329T, 329V, 329W, 329Y, 330E, 330F, 330G, 330H, 3301, 330L, 330M, 330N, 330P, 330R, 330S, 330T, 330V, 330W, 330Y, 331D, 331F, 331H, 331I, 331L, 331M, 331Q, 331R, 331T, 331V, 331W, 331Y, 332A, 332D, 332E, 332F, 332H, 332K, 332L, 332M, 332N, 332P, 332Q, 332R, 332S, 332T, 332V, 332W, 332Y, 333A, 333F, 333H, 333I, 333L, 333M, 333P, 333T, 333Y, 334A, 334F, 334I, 334L, 334P, 334T, 33D, 33F, 33G, 33H, 33I, 33L, 33M, 33N, 33P, 33R, 33S, 33V, 33W, 33Y, 336E, 336K, 336Y, 337E, 337H, oraz 337N, przy czym numeracja odbywa się zgodnie z indeksem EU. [0024] W dalszym z aspektów, modyfikacja aminokwasu moŝe nastąpić w pozycji wybranej z grupy składającej się z 221, 222, 223, 224, 22, 227, 228, 230, 231, 232, 233, 234, 23, 236, 237, 238, 239, 240, 241, 243, 24, 246, 247, 249, 2, 28, 260, 262, 263, 264, 26, 266, 267, 268, 269, 270, 271, 272, 274, 27, 276, 278, 280, 281, 282, 283, 284, 28, 286, 288, 290, 291, 292, 293, 294, 29, 296, 297, 298, 299, 300, 301, 302, 303, 304, 30, 313, 317, 318, 320, 322, 324, 32, 326, 327, 328, 329, 330, 331, 332, 333, 334, 33, 336, oraz 337. W dodatkowych aspektach, podstawienie moŝe być wybrane z grupy składającej się z 221K, 222Y, 223E, 223K, 224E, 224Y, 22E, 22W, 227E, 227G, 227K, 227Y, 228E, 228G, 228K, 228Y, 230A, 230E, 230G, 230Y, 231E, 231G, 231K, 231P, 231Y, 232E, 232G, 232K, 232Y, 233A, 233F, 233H, 233I, 233K, 233L, 233M, 233N, 233Q, 233R, 233S, 233T, 233V, 233W, 233Y, 234D, 234E, 234F, 234G, 234H, 2341, 234K, 234M, 234N, 234P, 234Q, 234R, 234S, 234T, 234W, 234Y, 23D, 23F, 23G, 23H,

9 1 20 2 30 3 23I, 23K, 23M, 23N, 23Q, 23R, 23S, 23T, 23V, 23W, 23Y, 236D, 236E, 236F, 236H, 236I, 236K, 236L, 236M, 236N, 236P, 236Q, 236R, 236S, 236T, 236V, 236W, 236Y, 237D, 237E, 237F, 237H, 237I, 237K, 237L, 237M, 237N, 237P, 237Q, 237R, 237S, 237T, 237V, 237W, 237Y, 238D, 238E, 238F, 238G, 238H, 238I, 238K, 238L, 238M, 238N, 238Q, 238R, 238S, 238T, 238V, 238W, 238Y, 239D, 239E, 239F, 239G, 239H, 2391, 239K, 239L, 239M, 239N, 239P, 239Q, 239R, 239T, 239V, 239W, 239Y, 240M, 240T, 241D, 241E, 241R, 241S, 241W, 241Y, 243E, 243H, 243Q, 243R, 243W, 243Y, 24A, 246D, 246H, 246Y, 247G, 247V, 249H, 249Q, 249Y, 2E, 2Y, 28H, 28S, 28Y, 260D, 260E, 260H, 260Y, 262A, 262E, 262F, 2621, 262T, 263A, 263I, 263M, 263T, 264D, 264E, 264F, 264G, 264H, 264I, 264K, 264L, 264M, 264N, 264P, 264Q, 264R, 264S, 264T, 264W, 264Y, 26F, 26G, 26H, 26I, 26K, 26L, 26M, 26P, 26Q, 26R, 26S, 26T, 26V, 26W, 26Y, 266A, 266I, 266M, 266T, 267D, 267E, 267F, 267H, 267I, 267K, 267L, 267M, 267N, 267P, 267Q, 267R, 267V, 267W, 267Y, 268F, 268G, 268I, 268M, 268P, 268T, 268V, 268W, 269F, 269G, 269H, 269I, 269L, 269M, 269N, 269P, 269R, 269S, 269T, 269V, 269W, 269Y, 270F, 270G, 270H, 270I, 270L, 270M, 270P, 270Q, 270R, 270S, 270T, 270W, 270Y, 271A, 271D, 271E, 271F, 271G, 271H, 271I, 271K, 271L, 271M, 271N, 271Q, 271R, 271S, 271T, 271V, 271W, 271Y, 272F, 272G, 272H, 272I, 272K, 272L, 272M, 272P, 272R, 272S, 272T, 272V, 272W, 272Y, 274D, 274E, 274F, 274G, 274H, 2741, 274L, 274M, 274P, 274R, 274T, 274V, 274W, 274Y, 27W, 276D, 276E, 276F, 276G, 2Z6H, 276I, 276L, 276M, 276P, 276R, 276S, 276T, 276V, 276W, 278D, 278E, 278G, 278H, 278I, 278K, 278L, 278M, 278N, 278P, 278Q, 278R, 278S, 278T, 278V, 278W, 280G, 280P, 280W, 281E, 281K, 281N, 281P, 281Y, 282G, 282P, 282Y, 283G, 283H, 283K, 283L, 283P, 283R, 283Y, 284L, 284N, 284Q, 284T, 284Y, 28K, 28Q, 28W, 28Y, 286G, 286P, 286Y, 288Y, 290H, 290L, 290W, 291D, 291E, 291G, 291H, 291I, 291Q, 291T, 292D, 292E, 292T, 292Y, 293F, 293G, 293H, 293I, 293L, 293M, 293N, 293P, 293R, 293S, 293T, 293W, 293Y, 294F, 294G, 294H, 294I, 294K, 294L, 294M, 294P, 294R, 294S, 294T, 294V, 294W, 294Y, 29D, 29F, 29G, 29H, 29I, 29M, 29N, 29P, 29R, 29S, 29T, 29V, 29W, 29Y, 296A, 296D, 296E, 296G, 296I, 296K, 296L, 296M, 296N, 296Q, 296R, 296S, 296T, 296V, 297D, 297E, 297F, 297G, 297H, 297I, 297K, 297L, 297M, 297P, 297R, 297S, 297T, 297V, 297W, 297Y, 298E, 298F, 298H, 2981, 2981L, 298M, 298Q, 298R, 298W, 298Y, 299A, 299D, 299E, 299F, 299G, 299H, 2991, 299K, 299L, 299M, 299N, 299P, 299Q, 299R, 299S, 299V, 299W, 299Y, 300A, 300D, 300E, 300G, 300H, 300K, 300M, 300N, 300P, 300Q, 300R, 300S, 300T, 300V, 300W, 301D, 301E, 301Y, 302I, 303D, 303E, 303Y, 304H, 304L, 304N, 304T, 30E, 30T, 30Y,

1 20 2 30 3 313F, 317E, 317Q, 318H, 318L, 318Q, 318R, 318Y, 320D, 320F, 320G, 320H, 320I, 320L, 320N, 320P, 320S, 320T, 320V, 320W, 320Y, 322D, 322F, 322G, 322H, 3221, 322P, 322S, 322T, 322V, 322W, 322Y, 324D, 324F, 324G, 324H, 324I, 324L, 324M, 324P, 324R, 324T, 324V, 324W, 324Y, 32A, 32D, 32E, 32F, 32G, 32H, 32I, 32K, 32L, 32M, 32P, 32Q, 32R, 32S, 32T, 32V, 32W, 32Y, 326L, 326P, 326T, 327D, 327E, 327F, 327H, 327I, 327K, 327L, 327M, 327P, 327R, 327V, 327W, 327Y, 328A, 328D, 328E, 328F, 328G, 328H, 328K, 328M, 328N, 328P, 328Q, 328R, 328S, 328T, 328V, 328W, 328Y, 329D, 329E, 329F, 329G, 329H, 329I, 329K, 329L, 329M, 329N, 329Q, 329R, 329S, 329T, 329V, 329W, 329Y, 330E, 330F, 330H, 330I, 330L, 330M, 330N, 330P, 330W, 330Y, 331D, 331F, 331H, 331I, 331L, 331Q, 33IQ, 331R, 331T, 331V, 331W, 331Y, 332A, 332F, 332H, 332L, 332M, 332N, 332P, 332Q, 332S, 332T, 332V, 332W, 332Y, 333F, 333H, 333I, 333L, 333M, 333P, 333T, 333Y, 334F, 334P, 334T, 33D, 33F, 33G, 33H, 331, 33L, 33M, 33P, 33R, 33S, 33V, 33W, 33Y, 336E, 336K, 336Y, 337H, oraz 337N. [002] W dalszym aspekcie, modyfikacja występuje w pozycji wybranej z grupy składającej się z 221, 222, 223, 224, 22, 228, 230, 231, 232, 240, 244, 24, 247, 262, 263, 266, 271, 273, 27, 281, 284, 291, 299, 302, 304, 313, 323, 32, 328, 332, 336, przy czym numeracja pozycji odbywa się zgodnie z indeksem EU. W dodatkowych aspektach, modyfikacja jest wybrana z grupy składającej się z 221K, 221Y, 222E, 222Y, 223E, 223K, 224E, 224Y, 22E, 22K, 22W, 228E, 228G, 228K, 228Y, 230A, 230E, 230G, 230Y, 231E, 231G, 231K, 231P, 231Y, 232E, 232G, 232K, 232Y, 240A, 240I, 240M, 240T, 244H, 24A, 247G, 247V, 262A, 262E, 262F, 262I, 262T, -263A, 263I, 263M, 263T, 266A, 2661, 266M, 266T, 271A, 271D, 271E, 271F, 271G, 271H, 27H, 271K, 271L, 271M, 271N, 271Q, 271R, 271S, 271T, 271V, 271W, 271Y, 273I, 27L, 27W, 281D, 281E, 281K, 281N, 281P, 281Q, 281Y, 284D, 284E, 284L, 284N, 284Q, 284T, 284Y, 291D, 291E, 291G, 291H, 291I, 291Q, 291T, 299A, 299D, 299E, 299F, 299G, 299H, 299I, 299K, 299L, 299M, 299N, 299P, 299Q, 299R, 299S, 299V, 299W, 299Y, 304D, 304H, 304L, 304N, 304T, 313F, 323I, 32A, 32D, 32E, 32F, 32G, 32H, 32I, 32K, 32L, 32M, 32P, 32Q, 32R, 32S, 32T, 32V, 32W, 32Y, 328A, 328D, 328E, 328F, 328G, 328H, 328I, 328K, 328M, 328N, 328P, 328Q, 328R, 328S, 328T, 328V, 328W, 328Y, 332A, 332D, 332E, 332F, 332H, 332K, 332L, 332M, 332N, 332P, 332Q, 332R, 332S, 332T, 332V, 332W, 332Y, 336E, 336K, oraz 336Y. [0026] Przeciwciało moŝe obejmować dalej modyfikację drugiego aminokwasu w pozycji wybranej z grupy składającej się z 221, 222, 223, 224, 22, 227, 228, 230, 231, 232, 233, 234, 23, 236, 237, 238, 239, 240, 241, 243, 244, 24, 246, 247, 249, 2, 28, 260, 262,

11 1 20 2 30 3 263, 264, 26, 266, 267, 268, 269, 270, 271, 272, 273, 274, 27, 276, 278, 280, 281, 282, 283, 284, 28, 286, 288, 290, 291, 292, 293, 294, 29, 296, 297, 298, 299, 300, 301, 302,303, 304, 30, 313, 317, 318, 320, 322, 323, 324, 32, 326, 327, 328, 329, 330, 331, 332, 333, 334, 33, 336, oraz 337, przy czym numeracja odbywa się zgodnie z indeksem EU. Druga modyfikacja aminokwasu moŝe być podstawieniem wybranym z grupy składającej się z 221K, 221Y, 222E, 222Y, 223E, 223K, 224E, 224Y, 22E, 22K, 22W, 227E, 227G, 227K, 227Y, 228E, 228G, 228K, 228Y, 230A, 230E, 230G, 230Y, 231E, 231G, 231K, 231P, 231Y, 232E, 232G, 232K, 232Y, 233A, 233D, 233F, 233G, 233H, 233I, 233K, 233L, 233M, 233N, 233Q, 233R, 233S, 233T, 233V, 233W, 233Y, 234A, 234D, 234E, 234F, 234G, 234H, 234I, 234K, 234M, 234N, 234P, 234Q, 234R, 234S, 234T, 234V, 234W, 234Y, 23A, 23D, 23E, 23F, 23G, 23H, 23I, 23K, 23M, 23N, 23P, 23Q, 23R, 23S, 23T, 23V, 23W, 23Y, 236A, 236D, 236E, 236F, 236H, 236I, 236K, 236L, 236M, 236N, 236P, 236Q, 236R, 236S, 236T, 236V, 236W, 236Y, 237D, 237E, 237F, 237H, 237I, 237K, 237L, 237M, 237N, 237P, 237Q, 237R, 237S, 237T, 237V, 237W, 237Y, 238D, 238E, 238F, 238G, 238H, 2381, 238K, 238L, 238M, 238N, 238Q, 238R, 238S, 238T, 238V, 238W, 238Y, 239D, 239E, 239F, 239G, 239H, 239I, 239K, 239L, 239M, 239N, 239P, 239Q, 239R, 239T, 239V, 239W, 239Y, 240A, 240I, 240M, 240T, 241D, 241E, 241L, 241R, 241S, 241W, 241Y, 243E, 243H, 243L, 243Q, 243R, 243W, 243Y, 244H, 24A, 246D, 246E, 246H, 246Y, 247G, 247V, 249H, 249Q, 249Y, 2E, 2Y, 28H, 28, 28Y, 260D, 260E, 260H, 260Y, 262A, 262E, 262F, 2621, 262T, 263A, 263I, 263M, 263T, 264A, 264D, 264E, 264F, 264G, 264H, 264I, 264K, 264L, 264M, 264N, 264P, 264Q, 264R, 264S, 264T, 264W, 264Y, 26F, 26G, 26H, 261, 26K, 26L, 26M, 26N, 26P, 26Q, 26R, 26S, 26T, 26V, 26W, 266Y, 266A, 266I, 266M, 266T, 267D, 267E, 267F, 267H, 267I, 267K, 267L, 267M, 267N, 267P, 267Q, 267R, 267T, 267V, 267W, 267Y, 268D, 268E, 268F, 268G, 268I, 268K, 268L, 268M, 268P, 268Q, 268R, 268T, 268V, 268W, 269F, 269G, 269H, 269I, 269K, 269L, 269M, 269N, 269P, 269R, 269S, 269T, 269V, 269W, 269Y, 270F, 270G, 270H, 270I, 270L, 270M, 270P, 270Q, 270R, 270S, 270T, 270W, 270Y, 271A, 271D, 271E, 271F, 271G, 271H, 271I, 271K, 271L, 271M, 271N, 271Q, 271R, 271S, 271T, 271V, 271W, 271Y, 272D, 272F, 272G, 272H, 272I, 272K, 272L, 272M, 272P, 272R, 272, 272T, 272V, 272W, 272Y, 273I, 274D, 274E, 274F, 274G, 274H, 2741, 274L, 274M, 274N, 274P, 274R, 274T, 274V, 274W, 274Y, 27L, 27W, 276D, 276E, 276F, 276G, 276H, 2761, 276L, 276M, 276P, 276R, 276S, 276T, 276V, 276W, 276Y, 278D, 278E, 278G, 278H, 278I, 278K, 278L, 278M, 278N, 278P, 278Q, 278R, 278S, 278T, 278V, 278W, 280G, 280K, 280L, 280P, 280W, 281D, 281E, 281K, 281N, 281P, 281Q,

12 1 20 2 30 281Y, 282E, 282G, 282K, 282P, 282Y, 283G, 283H, 283K, 283L, 283P, 283R, 283Y, 284D, 284E, 284L, 284N, 284Q, 284T, 284Y, 28D, 28E, 28K, 28Q, 28W, 28Y, 286E, 286G, 286P, 286Y, 288D, 288E, 288Y, 290D, 290H, 290L, 290N, 290W, 291D, 291E, 291G, 291H, 291I, 291Q, 291T, 292D, 292E, 292T, 292Y, 293F, 293G, 293H, 293I, 293L, 293M, 293N, 293P, 293R, 293S, 293T, 293V, 293W, 293Y, 294F, 294G, 294H, 294I, 294K, 294L, 294M, 294P, 294R, 294S, 294T, 294V, 294W, 294Y, 29D, 29E, 29F, 29G, 29H, 29I, 29M, 29N, 29P, 29R, 29S, 29T, 29V, 29W, 29Y, 296A, 296D, 296E, 296G, 296H, 296I, 236K, 296L, 296M, 296N, 296Q, 296R, 296S, 296T, 296V, 297D, 297E, 297F, 297G, 297H, 297I, 297K, 297L, 297M, 297P, 297Q, 297R, 297S, 297T, 297V, 297W, 297Y, 298A, 298D, 298E, 298F, 298H, 298I, 298K, 298M, 298N, 298Q, 298R, 298T, 298W, 298Y, 299A, 299D, 299E, 299F, 299G, 299H, 299I, 299K, 299L, 299M, 299N, 299P, 299Q, 299R, 299S, 299V, 299W, 299Y, 300A, 300D, 300E, 300G, 300H, 300K, 300M, 300N, 300P, 300Q, 300R, 300S, 300T, 300V, 300W, 301D, 301E, 301H, 301Y, 3021, 303D, 303E, 303Y, 304D, 304H, 304L, 304N, 304T, 30E, 30T, 30Y, 313F, 317E, 317Q, 318H, 318L, 318Q, 318R, 318Y, 320D, 320F, 320G, 320H, 320I, 320L, 320N, 320P, 320S, 320T, 320V, 320W, 320Y, 322D, 322F, 322G, 322H, 322I, 322P, 322S, 322T, 322V, 322W, 322Y, 3231, 324D, 324F, 324G, 324H, 324I, 324L, 324M, 324P, 324R, 324T, 324V, 324W, 324Y, 32A, 32D, 32E, 32F, 32G, 32H, 321, 32K, 32L, 32M, 32P, 32Q, 32R, 32S, 32T, 32V, 32W, 32Y, 326E, 3261, 326L, 326P, 326T, 327D, 327E, 327F, 327H, 3271, 327K, 327L, 327M, 327N, 327P, 327R, 327S, 327T, 327V, 327W, 327Y, 328A, 328D, 328E, 328F, 328G, 328H, 328I, 328K, 328M, 328N, 328P, 328Q, 328R, 328S, 328T, 328V, 328W, 328Y, 329D, 329E, 329F, 329G, 329H, 329I, 329K, 329L, 329M, 329N, 329Q, 329R, 329S, 329T, 329V, 329W, 329Y, 330E, 330F, 330G, 330H, 330I, 330L, 330M, 330N, 330P, 330R, 330, 330T, 330V, 330W, 330Y, 331D, 331F, 331H, 331I, 331L, 331M, 331Q, 331R, 331T, 331V, 331W, 331Y, 332A, 332D, 332E, 332F, 332H, 332K, 332L, 332M, 332N, 332P, 332Q, 332R, 332S, 332T, 332V, 332W, 332Y, 333A, 333F, 333H, 333I, 333L, 333M, 333P, 333T, 333Y, 334A, 334F, 334I, 334L, 334P, 334T, 33D, 33F, 33G, 33H, 331, 33L, 33M, 33N, 33P, 33R, 33S, 33V, 33W, 33Y, 336E, 336K, 336Y, 337E, 337H, oraz 337N, przy czym numeracja odbywa się zgodnie z indeksem EU. [0027] W dalszym z aspektów, modyfikacją aminokwasu jest 332E. Druga modyfikacja aminokwasu moŝe być wybrana z grupy składającej się z: 236A, 239D, 332E, 268D, 268E, 330Y, oraz 330L. W niektórych aspektach, drugą modyfikacją aminokwasu jest 239D.

13 1 20 2 30 3 [0028] W innych aspektach, modyfikacja jest modyfikacją glikoformy, która zmniejsza poziom fukozy w stosunku do macierzystego przeciwciała. W jeszcze innych aspektach, niniejszy wynalazek jest poświęcony kompozycji zawierającej wiele glikozylowanych przeciwciał takich, jak tych określonych w zastrzeŝeniach, przy czym około 80-0% glikozylowanych przeciwciał w kompozycji zawiera dojrzałą strukturę rdzenia węglowodanów pozbawioną fukozy. [0029] W kolejnym przykładzie wykonania, przeciwciało zmniejsza wiązanie do FcγRIIb w porównaniu do macierzystego przeciwciała anty-cd19. [0030] Wynalazek jest poświęcony przeciwciału, które wiąŝe CD19 i zawiera część zmienną łańcucha cięŝkiego o SEQ ID NO:40 i część zmienną łańcucha lekkiego o SEQ ID NO:8. Łańcuch cięŝki ma CDR1 zawierający sekwencję aminokwasów o SEQ ID NO: 132, CDR2 i CDR3 zawierający sekwencję aminokwasów o SEQ ID NO:116. Łańcuch lekki ma CDR1 zawierający sekwencję aminokwasów o SEQ ID NO: 120, CDR2 zawierający sekwencję aminokwasów o SEQ ID NO:129, oraz CDR3 zawierający sekwencję aminokwasów o SEQ ID NO:130. [0031] Opisane tu przeciwciało moŝe mieć sekwencję części zmiennej łańcucha cięŝkiego wybraną z grupy składającej się z SEQ ID NO: 13-16, 20-23, oraz 27-39 i 41-44, i/lub sekwencję części zmienną łańcucha lekkiego wybraną z grupy składającej się z SEQ ID NO: 17-19, 24-26, oraz 4-7 i 9-79. [0032] W jeszcze innych wariantach, przeciwciało zawiera sekwencję łańcucha cięŝkiego wybraną z grupy składającej się z SEQ ID NO: 86 i 88 do 9, i/lub sekwencję łańcucha lekkiego wybraną z grupy składającej się z SEQ ID NO: 96 do i 7 do 1. Przeciwciało według niniejszego wynalazku obejmuje łańcucha lekki zawierający SEQ ID NO:6 i łańcuch cięŝki zawierający SEQ ID NO:87. [0033] W róŝnych dodatkowych aspektach, wynalazek ten jest poświęcony sekwencji kwasu nukleinowego kodującej przeciwciało takie, jak to określone w zastrzeŝeniach. [0034] Niniejszy wynalazek dotyczy przeciwciała, jak tego określonego w zastrzeŝeniach lub kompozycji, jak tej określonej w zastrzeŝeniach, do zastosowania w leczeniu choroby wybranej z grupy składającej się z chłoniaków nieziarniczych (NHL), przewlekłej białaczki limfocytowej (CLL), ostrej białaczki limfoblastycznej/chłoniaka limfoblastycznego z komórek B (B-ALL), oraz chłoniaka z komórek płaszcza (MCL). [003] W dalszym z aspektów, niniejszy wynalazek jest poświęcony kompozycji zawierającej przeciwciało lub kompozycję, jak te określone w zastrzeŝeniach, i dopuszczalny nośnik. KRÓTKI OPIS RYSUNKÓW

14 1 20 2 30 3 [0036] PoniŜsze rysunki ilustrują aspekty niniejszego wynalazku, a ich celem nie jest ograniczanie niniejszego wynalazku do jakiegokolwiek konkretnego zastosowania lub teorii działania. Figura 1: Sekwencja aminokwasów CD19 homo sapiens, uzyskanego z klonu cd- NA MGC:12802, IMAGE:404919, GenBank Accession:BC006338. Figura 2. Sekwencje naturalnych regionów stałych przeciwciał, zawierających część stałą kappa łańcucha lekkiego, oraz część stałą gamma łańcuchów cięŝkich dla IgG1, IgG2, IgG3, oraz IgG4. Zapewniona jest równieŝ sekwencja łańcucha stałego Hybrid IgG, oraz łańcucha stałego Hybrid IgG zawierających podstawienia 239D i I332E. Figura 3. Dopasowanie sekwencji aminokwasów ludzkiej immunoglobuliny IgG1, IgG2, IgG3, oraz IgG4. Figura 3a zapewnia sekwencje CH1 (Cγ1) i domen zawiasowych, oraz Figura 3b zapewnia sekwencje domen CH2 (Cγ2) i CH3 (Cγ3). Pozycje są ponumerowane zgodnie z indeksem EU sekwencji IgG1, a róŝnice między IgG1 i innymi immunoglobulinami IgG2, IgG3, oraz IgG4 pokazane są w kolorze szarym. Allotypowe polimorfizmy istnieją w kilku pozycjach i tym samym mogą istnieć niewielkie róŝnice między zaprezentowanymi sekwencjami i sekwencjami w stanie techniki. Oznaczono moŝliwe początki regionu Fc, określone tu jako pozycja 226, albo 230. Figura 4. Wspólne haplotypy łańcucha gamma ludzkiej IgG1 (Figura 4a) i IgG2 (Figura 4b) pokazujące pozycje i odpowiednie podstawienia aminokwasowe. Figura. Korzystne przykłady wykonania profili wiązania receptora, które obejmują wzrosty, zmniejszenia, lub brak wpływu na wiązanie róŝnych receptorów, gdzie takie zmiany mogą być korzystne w określonych kontekstach. Figura 6. Sekwencje aminokwasów regionów zmiennych łańcucha cięŝkiego i łańcucha lekkiego oryginalnych przeciwciał 4G7 i HD37 (H0 i L0). Figura 6a zapewnia sekwencje domen VH i VL, oraz Figura 6b zapewnia sekwencje CDR. Granice CDR określa się zgodnie z konwencją Kabata (VH CDR1: 31-3b, VH CDR2: 0-6, VH CDR3: 9-2, VL CDR1: 24-34, VL CDR2: 0-6, oraz VL CDR3: 89-97). Figura 7. Względne powinowactwa wiązania przeciwciała 4G7 Hybrid S239D/I332E i 4G7 IgG 1 do panelu receptorów Fc. Figura 8. ADCC dla 4G7 Hybrid S239D/I332E, HD37 Hybrid S239D/I332E, 4G7 IgG1, HD37 IgG1, oraz kontrola negatywna przeciwciała na linii komórkowej Daudi (Figura 8a) i ADCC dl 4G7 Hybrid S239D/I332E, 4G7 IgG1, rytuksymab,

1 1 20 2 30 oraz kontrola negatywna przeciwciała na liniach komórkowych SUP-B1 i Raji (Figura 8b). Figura 9. Test wiązania powierzchni komórki 4G7 Hybrid S239D/1332E do komórek Raji. Figura. Figura a przedstawia testy ADCC dla 4G7 Hybrid S239D/I332E, 4G7 IgG1, oraz rytuksymabu na panelu z 14 linii komórkowych reprezentujących róŝne chłoniaki i białaczki. Oba parametry siła działania (EC0) i skuteczność (% ADCC) są normalizowane do tych dla rytuksymabu (anty-cd20). Figura b wymienia testowane linii komórkowe chłoniaka i białaczki. Figura 11. Sekwencje regionów zmiennych łańcucha cięŝkiego o obniŝonej immunogenności dla przeciwciała anty-cd19 4G7. Figura 12. Sekwencje regionów zmiennych łańcucha lekkiego o obniŝonej immunogenności dla przeciwciała anty-cd19 4G7. Figura 13. Sekwencje regionów zmiennych łańcucha cięŝkiego o obniŝonej immunogenności dla przeciwciała anty-cd19 HD37. Figura 14. Sekwencje regionów zmiennych łańcucha lekkiego o obniŝonej immunogenności dla przeciwciała anty-cd19 HD37. Figura 1. Wyniki testu wiązania na powierzchni komórki wariantów G7 o obni- Ŝonej immunogenności do komórek Raji (Figura 1a) i ADCC dla HD37_H2L1 Hybrid S239D/I332E i 4G7_H1L3 Hybrid S239D/I332E na komórkach MEC-1 (Figura 1b). Figura 16. Powinowactwo wiązania komórek na komórkach RS4;11 o dojrzałym powinowactwie 4G7 względem H1L1 mab. Figura 17. Dane wiązania komórek do RS4;11 dla wariantów 4G7 inkubowanych przez dni w 37 C, ph 9.0 w 200 mm Tris-HCL pokazuje poprawę uzyskanej stabilności. Figura 18. Sekwencje wariantów łańcucha cięŝkiego dla anty-cd19, które zwiększają powinowactwa i/lub stabilność. Figura 19. Sekwencje wariantów łańcucha lekkiego dla anty-cd19, które zwiększają powinowactwa i/lub stabilność. Figura 20. Antyproliferacyjne właściwości 4G7 Hybrid S239D/I332E na komórkach Raji. Figura 21. Antyproliferacyjne właściwości 4G7 Hybrid S239D/I332E o ulepszonych stabilności i powinowactwie na komórkach SU-DHL-6 z i bez sieciowania.

16 1 20 2 30 3 Figura 22. Fagocytoza komórek Raji i RS4;11 z 4G7 Hybrid S239D/I332E o ulepszonych stabilności i powinowactwie. Figura 23. ADCC dla 4G7 Hybrid S239D/I332E o ulepszonych stabilności i powinowactwie przeciwko wielu liniom komórkowym chłoniaka przy uŝyciu oczyszczonych komórek naturalnych zabójców (NK). Figura 24. Wiązanie 4G7 Hybrid S239D/1332E o ulepszonych stabilności i powinowactwie do komórek 293T transfekowanych ludzkim CD19. Figura 2. Reaktywność krzyŝowa 4G7 Hybrid S239D/1332E o ulepszonych stabilności i powinowactwie do CD19 zarówno cynomolgus i rezus. Figura 26. ADCC na komórkach RS4;11 i MEC-1 przy uŝyciu przeciwciała o ulepszonej funkcji efektorowej anty-cd19 (4G7 H1L1 Hybrid S239D/I332E) z niŝszą zawartością fukozy otrzymaną w wyniku ekspresji w układzie Lec13. Figura 27. Pojedyncze podstawienia, dokonane w celu zwiększenia stabilności i/lub powinowactwa. Numeracja regionu zmiennego według Kabata. Rozszerzony zestaw pozycji jest zawarty w CDR. Granice kanoniczne CDR zdefiniowane przez Kabata, wymienione na Figurze 6, są zaznaczone na szaro. Figura 28. Warianty regionów zmiennych anty-cd19 stworzone w celu optymalizacji powinowactwa i stabilności. Figura 29. Preferowane warianty i względny wzrost powinowactwa wiązania w stosunku do macierzystego H1L1 mab. Figura 30. Test proliferacji komórek B, wykazujący zdolności wariantów przeciwciał anty-cd19 do hamowania Ŝywotności pierwotnych komórek B. Figura 30a przedstawia zaleŝność dawki dla przeciwciała anty-mi na proliferację komórek B. Figura 30b przedstawia proliferację komórek B w obecności ustalonej ilości antymi (2 mg/ml) plus zmieniające się ilości wariantu anty-cd19 WT i Fc, oraz przeciwciała kontrolne wariantu anty-cd30 Fc. Anty-Anty-CD19_IgG1_WT = 4G7_H3_L1 IgG1_WT, Anty- CD19_Hybrid_S239D/I332E = 4G7_H3_L1_Hybrid_239D/332E, oraz Anty-CD30_S239D/I332E, uŝyto tutaj jako kontrolę negatywną, = AC_H3.69V2_L3.71_Hybrid_239D/332E (jak ujawniono w US 2007/0166309, Lazar G.A. i współpr., złoŝony 1. marca 2007). SZCZEGÓŁOWY OPIS NINIEJSZEGO WYNALAZKU [0037] Ujawnienie to jest poświęcone modyfikowanym przeciwciałom anty-cd19 i sposobom jego zastosowania. W róŝnych aspektach, przeciwciała mogą wykazywać posiadanie modyfikowanego region Fc, specyficznych sekwencji CDR, sekwencji zmiennych regionów, i/lub modyfikacji stałego regionu. Przeciwciała mogą być humanizowane. Niniej-

17 1 20 2 30 3 szy wynalazek jest dalej poświęcony przeciwciałom i kompozycjom, jak tym określonym w zastrzeŝeniach, do zastosowania w leczeniu wskazań choroby, jak chłoniaka nieziarniczego (NHL), ostrej białaczki limfoblastycznej B-komórkowej (ALL) dalszych chorób, jak tych określonych w zastrzeŝeniach. [0038] Aby wynalazek mógł być w pełni zrozumiały, przedstawionych jest poniŝej kilka definicji. Takie definicje obejmują gramatyczne równowaŝniki. [0039] Przez ADCC lub zaleŝną od przeciwciał cytotoksyczność komórkową w niniejszym opisie rozumie się reakcję mediowaną komórkowo, w której niespecyficzne cytotoksyczne komórki eksprymujące FcγRs rozpoznają związane przeciwciało na komórce docelowej i następnie powodują lizę komórki docelowej. W róŝnych aspektach, wzmocniona funkcja efektorowa ADCC moŝe oznaczać zwiększoną siłę działania lub lepszą skuteczność. Przez siłę działania stosowaną w kontekście doświadczalnym rozumie się stęŝenie przeciwciała, gdy obserwuje się określony efekt terapeutyczny EC0 (połowa maksymalnego skutecznego stęŝenia). Przez skuteczność stosowaną w kontekście doświadczalnym rozumie się maksymalną moŝliwą funkcję efektorową na poziomach wysycenia przeciwciała. [0040] Przez ADCP lub zaleŝną od przeciwciał fagocytozę komórkową w niniejszym opisie rozumie się reakcję mediowaną komórkowo, w której niespecyficzne cytotoksyczne komórki eksprymujące FcγRs rozpoznają związane przeciwciało na komórce docelowej i następnie powodują lizę komórki docelowej. [0041] Przez aminokwas i toŝsamość aminokwasu, stosowane w niniejszym opisie, rozumie się jeden z 20 naturalnie występujących aminokwasów lub dowolny nienaturalny analog, który moŝe być obecny w specyficznej, określonej pozycji. Zatem aminokwas w stosowanym tu kontekście oznacza zarówno naturalnie występujące, jak i syntetyczne aminokwasy. Na przykład, homofenyloalanina, cytrulina i norleucyna uwaŝane są za aminokwasy dla celów niniejszego wynalazku. Aminokwas obejmuje równieŝ reszty iminokwasów takich, jak prolina i hydroksyprolina. Łańcuch boczny moŝe być w konfiguracji (R) lub (S). W korzystnym przykładzie wykonania, aminokwasy są w konfiguracji (S) lub L. Jeśli stosuje się nienaturalnie występujące łańcuchy boczne, moŝna stosować podstawniki nieaminokwasowe, na przykład w celu zapobiegania lub opóźniania degradacji in vivo. [0042] Przez komórka B lub limfocyt B stosowane w niniejszym opisie rozumie się typ limfocytu wzrastającego w szpiku kostnym, który krąŝy we krwi i limfie, oraz zapewnia odporność humoralną. Komórki B rozpoznają wolne cząsteczki antygenu i róŝnicują lub dojrzewają do komórek plazmatycznych, które wydzielają immunoglobulinę (przeciw-

18 1 20 2 30 3 ciała), unieszkodliwiającą antygeny. Generowane są równieŝ komórki pamięci, które wytwarzają specyficzną immunoglobulinę (przeciwciało) na kolejne spotkania z takim antygen. Komórki B znane są równieŝ jako komórki Beta w wysepkach Langerhansa. [0043] Przez antygen B-komórkowy lub marker B-komórkowy stosowane w niniejszym opisie rozumie się dowolne białko, które jest eksprymowane na komórkach B. [0044] Przez CD19 w niniejszym opisie rozumie się białko o SEQ ID NO:1 (pokazane na Figurze 1). CD19 jest znane równieŝ jako antygen powierzchniowy B4 komórki B, antygen B-komórkowy CD19, antygen CD19, oraz Leu-12. Ludzki CD19 jest oznaczony GeneID:930 przez Entrez Gene, oraz HGNC:1633 przez HGNC. CD19 moŝe być kodowany przez gen oznaczony CD19. Stosownanie tu CD19 ma oznaczać ujęcie wszystkich znanych i jeszcze nieodkrytych alleli i postaci polimorficznych CD19. [004] Przez CDC lub cytotoksyczność zaleŝną od dopełniacza w niniejszym opisie rozumie się reakcję, w której jeden lub większa liczba składników białka dopełniacza rozpoznaje związane przeciwciało na komórce docelowej i następnie powoduje lizę komórki docelowej. [0046] Przez region stały w niniejszym opisie rozumie się polipeptyd zawierający przynajmniej część pierwszych trzech regionów stałych przeciwciała, mających przynajmniej jedną funkcję efektorową. Tym samym region stały dotyczy ostatnich trzech domen regionów stałych immunoglobuliny IgA, IgD, oraz IgG, oraz ostatnich czterech domen regionów stałych immunoglobuliny IgE i IgM, oraz elastycznego zawiasu N-końcowego w stosunku do tych domen. Dla IgA i IgM, Fc moŝe zawierać łańcuch J. Dla IgG, region stały zawiera domenę immunoglobuliny Cgamma 1, Cgamma2 i Cgamma3 (Cγ1, Cγ2 i Cγ3) i zawias między Cgamma1 (Cγ1) i Cgamma2 (Cγ2). Choć granice regionu stałego mogą się zmieniać, region Fc łańcucha cięŝkiego ludzkiej IgG zwykle definiuje się tak, aby zawierał swój koniec karboksylowy, przy czym numeracja odbywa się zgodnie z indeksem EU jak u Kabata. Stały łańcuch lekki typowo zawiera jedną domenę, oraz jak zdefiniowano w opisie, odnosi się do pozycji 8-214 Cκ lub Cλ, przy czym numeracja odbywa się zgodnie z indeksem EU. Dla pełnej długości Przeciwciała IgG, stały łańcuch cięŝki, jak zdefiniowany w niniejszym opisie, dotyczy N-końca domeny CH1 do C-końca domeny CH3, lub pozycji 118-447, przy czym numeracja odbywa się zgodnie z indeksem EU. Region stały moŝe odnosić się do tego obszaru, w izolacji, lub obcięciem lub fuzją obejmującą przeciwciała, fuzje Fc, izolowane Fc, oraz fragmenty Fc. W róŝnych przykładach wykonania, region stały moŝe być regionem przeciwciała, który jest kodowany przez jeden z genów regionów stałych łańcucha lekkiego lub cięŝkiego immunoglobuliny, tj. region przeciwciała kodowany przez łańcuchy lekkie kappa (Cκ) lub lambda (Cλ). W róŝnych przykładach

19 1 20 2 30 3 wykonania, stały łańcuch lekki lub region stały łańcucha cięŝkiego moŝe być regionem przeciwciała kodowanym przez geny mi, delta, gamma, alfa, lub epsilon w celu określenia izotypu przeciwciała jako odpowiednio IgM, IgD, IgG, IgA, lub IgE. [0047] Przez funkcję efektorową stosowaną w niniejszym opisie rozumie się zdarzenie biochemiczne, które wynika z oddziaływania regionu Fc przeciwciała z receptorem Fc lub ligandem. Funkcje efektorowe obejmują funkcje efektorowe mediowane FcγR takie, jak ADCC i ADCP, oraz funkcje efektorowe mediowane dopełniaczem takie, jak CDC. Przez komórkę efektorowa, stosowaną w niniejszym opisie, rozumie się komórkę układu immunologicznego, która eksprymuje jeden lub większą liczbę receptorów Fc i mediuje jedną lub większą liczbę funkcji efektorowych. Komórki efektorowe obejmują, bez ograniczania do wymienionych, monocyty, makrofagi, neutrofile, komórki dendrytyczne, eozynofile, komórki tuczne, płytki krwi, komórki B duŝe ziarniste limfocyty, komórki Langerhansa, komórki naturalnych zabójców (NK) oraz komórki δγt, oraz mogą pochodzić z dowolnego organizmu, w tym bez ograniczania do wymienionych, ludzi, myszy, szczurów, królików oraz małp. [0048] Przez Fab lub region Fab w niniejszym opisie rozumie się polipeptydy, które zawierają domeny immunoglobuliny V H, CH1, V H, oraz C L. Fab moŝe odnosić się do tego obszaru, w izolacji, lub tego regiony w kontekście pełnej długości przeciwciała lub fragmentu przeciwciała. [0049] Przez Fc lub region Fc, w niniejszym opisie rozumie się polipeptyd zawierający region stały przeciwciała z wykluczeniem pierwszej domeny regionu stałego immunoglobuliny. Zatem Fc dotyczy dwóch domen regionów stałych immunoglobuliny IgA, IgD, oraz IgG, oraz ostatnich trzech domen regionów stałych immunoglobuliny IgE i IgM, oraz elastycznego zawiasu N-końcowego do tych domen. Dla IgA i IgM, Fc moŝe zawierać łańcuch J. Dla IgG, Fc zawiera domeny immunoglobuliny Cgamma2 i Cgamma3 (Cγ2 i Cγ3) i zawias między Cgamma1 (Cγ1) i Cgamma2 (Cγ2). Choć granice regionu Fc mogą się zmieniać, region Fc łańcucha cięŝkiego ludzkiej IgG jest zwykle określony tak, aby zawierać reszty C226 lub P230 do jego końca karboksylowego, przy czym numeracja odbywa się zgodnie z indeksem EU jak u Kabata. Fc moŝe odnosić się do tego regionu, w izolacji, lub tego regionu w kontekście polipeptydu Fc, na przykład przeciwciała. Przez polipeptyd Fc stosowany w niniejszym opisie rozumie się polipeptyd, który zawiera wszystkie lub część regionu Fc. Polipeptydy Fc obejmują przeciwciała, fuzje Fc, wyizolowane Fc, oraz fragmenty Fc. [000] Przez receptor gamma Fc lub FcγR, stosowane w niniejszym opisie, rozumie się kaŝdego członka tej rodziny białek, które wiąŝą region Fc przeciwciała IgG. W róŝnych

20 1 20 2 30 przykładach wykonania, FcγR są zasadniczo kodowane przez geny FcγR. Rodzina ta u ludzi obejmuje, ale nie ogranicza się do, FcγRI (CD64), w tym izoformy FcγRIa, FcγRIb, oraz FcγRIc; FcγRII (CD32), w tym izoformy FcγRIIa (w tym allotypy H131 i R131), FcγRIIb (w tym FcγRIIb-1 i FcγRIIb-2), oraz FcγRIIc; i FcγRIII (CD16), w tym izoformy FcγRIIIa (w tym allotypy V18 i F18) i FcγRIIIb (w tym allotypy Fc-γRIIIb-NA1 i FcγRIIIb-NA2) (Jefferis i współpr., 2002, Immunol Lett 82:7-6), jak równieŝ dowolne nieodkryte ludzkie FcγRs lub izoformy lub allotypy FcγR. Mysie FcγRs obejmują, bez ograniczania do wymienionych, FcγRI (CD64), FcγRII (CD32), FcγRIII (CD 16), oraz FcγR- III-2 (CD16-2), jak równieŝ dowolne nieodkryte mysie FcγRs lub izoformy lub allotypy FcγR. FcγR moŝe pochodzić z dowolnego organizmu, w tym bez ograniczania do wymienionych, ludzi, myszy, szczurów, królików oraz małp. [001] Przez ligand Fc lub receptor Fc stosowane w niniejszym opisie rozumie się cząsteczkę, korzystnie polipeptyd, z dowolnego organizmu, który wiąŝe się z regionem Fc przeciwciała w celu utworzenia kompleksu Fc-ligand. Ligandy Fc obejmują, bez ograniczania do wymienionych, FcγRs, FcRn, Clq, C3, lektyny wiąŝące mannan, receptor mannozy, gronkowcowe białko A, gronkowcowe białko G, oraz wirusowe FcγR. Ligandy Fc równieŝ obejmują homologi receptora Fc (FcRH), które są rodziną receptorów Fc, będące homologiczne do FcγRs (Davis i współpr., 2002, Immunological Reviews 190:123-136). Ligandy Fc mogą obejmować nieodkryte cząsteczki, które wiąŝą Fc. [002] Przez IgG stosowane w niniejszym opisie rozumie się polipeptyd naleŝący do klasy przeciwciał, który jest zasadniczo kodowany przez rozpoznawany gen immunoglobuliny gamma. U ludzi klasa ta obejmuje IgG1, IgG2, IgG3, oraz IgG4. U myszy, klasa ta obejmuje IgG1, IgG2a, IgG2b, IgG3. Przez immunoglobulinę (Ig) rozumie się tu białko składające się z jednego lub większej liczby polipeptydów zasadniczo kodowanych przez geny immunoglobulin. Immunoglobuliny obejmują, bez ograniczania do wymienionych, przeciwciała. Immunoglobuliny mogą mieć kilka postaci strukturalnych, w tym bez ograniczania do wymienionych, pełnej długości przeciwciał, fragmentów przeciwciał, oraz indywidualnych domen immunoglobuliny. Przez domenę immunoglobuliny (Ig) rozumie się tu region immunoglobuliny, który istnieje jako odrębny podmiot strukturalny, stwierdzony przez znawcę w dziedzinie struktury białka. Domeny Ig wykazują zwykle charakterystyczną topologię fałdowania β-kanapki. Znanymi domenami Ig w klasie IgG przeciwciał są V H, Cγ1, Cγ2, Cγ3, V L, oraz C L. [003] Przez modyfikację rozumie się tu zmianę właściwości fizycznych, chemicznych lub sekwencji białka, polipeptydu, przeciwciała, lub immunoglobuliny. Korzystnymi mo-

21 1 20 2 30 3 dyfikacjami według niniejszego wynalazku są modyfikacje aminokwasów i modyfikacje glikoform. [004] Przez modyfikację aminokwasu rozumie się tu podstawienie, wstawienie i/lub usunięcie aminokwasu w sekwencji polipeptydu. Przez podstawienie aminokwasu lub podstawienie rozumie się tu zastąpienie aminokwasu w określonej pozycji w macierzystej sekwencji polipeptydu innym aminokwasem. Na przykład, podstawienie I332E dotyczy polipeptydu wariantowego, w tym przypadku wariantu stałego łańcucha lekkiego, w którym zastąpiono izoleucynę w pozycji 332 kwasem glutaminowym. Reszta WT moŝe być wskazana lub moŝe nie być wskazana. W poprzednim przykładzie, 332E wskazuje podstawienie pozycji 332 kwasem glutaminowym. Dla celów niniejszego opisu, wielokrotne podstawienia są zwykle oddzielone ukośnikiem. Na przykład, 239D/332E dotyczy podwójnego wariantu zawierającego podstawienia 239D i 332E. Przez wstawienie aminokwasu lub wstawienie w niniejszym opisie rozumie dodanie aminokwasu w określonej pozycji w macierzystej sekwencji polipeptydu. Na przykład, wstawienie -236 wskazuje wstawienie glicyny w pozycji 236. Przez usunięcie aminokwasu lub usunięcie w niniejszym opisie rozumie się usunięcie aminokwasu w określonej pozycji w macierzystej sekwencji polipeptydu. Na przykład, G236- wskazuje the usunięcie glicyny w pozycji 236. [00] Przez modyfikację glikoformy lub zmodyfikowana glikoforma lub glikoforma poddana inŝynierii stosowane w niniejszym opisie rozumie się skład węglowodanów, który jest kowalencyjnie przyłączony do białka, na przykład przeciwciała, przy czym skład węglowodanów róŝni się chemicznie od białka macierzystego. Zmodyfikowana glikoforma typowo dotyczy róŝnego węglowodanu lub oligosacharydu; tym samym na przykład przeciwciało moŝe zawierać zmodyfikowaną glikoformę. Alternatywnie, zmodyfikowana glikoforma moŝe dotyczyć przeciwciała, które zawiera róŝny węglowodan lub oligosacharyd. [006] Przez macierzysty polipeptyd, macierzyste białko, polipeptyd prekursorowy, lub białko prekursorowe stosowane w niniejszym opisie rozumie się niezmodyfikowany polipeptyd, który jest modyfikowany aby wygenerować następnie wariant. Wymieniony macierzysty polipeptyd moŝe być naturalnie występującym polipeptydem, lub wariantem lub wersją, wytworzoną metodami inŝynierii, naturalnie występujących polipeptydów. Macierzysty polipeptyd moŝe dotyczyć samego polipeptydu, kompozycji, które zawierają macierzysty polipeptyd, lub sekwencji aminokwasów, które go kodują. W związku z tym, przez macierzyste przeciwciało lub macierzystą immunoglobulinę, stosowane w niniejszym opisie, rozumie się przeciwciało lub immunoglobulinę, które jest modyfikowane w celu wygenerowania wariantu. Przez macierzyste przeciwciało anty-cd19 lub macierzystą immunoglobulinę anty-cd19 stosowane w niniejszym opisie rozumie się przeciw-

22 1 20 2 30 3 ciało lub immunoglobulinę, która wiąŝe CD19 i jest modyfikowana w celu wygenerowania wariantu. [007] Przez białko lub polipeptyd stosowane w niniejszym opisie rozumie się przynajmniej dwa kowalencyjnie połączone aminokwasy, co obejmuje białka, polipeptydy, oligopeptydy i peptydy. Białko moŝe być złoŝone z naturalnie występujących aminokwasów i wiązań peptydowych, lub syntetycznych struktur peptydomimetycznych, tj. analogów, takich, jak peptoidy. [008] Przez pozycję stosowaną w niniejszym opisie rozumie się miejsce w sekwencji białka. Pozycje moŝna numerować kolejno, lub zgodnie z ustalonym formatem, na przykład indeksem EU jak u Kabata. Odpowiednie pozycje są określane tak, jak tu opisano, generalnie przez dopasowanie z innymi macierzystymi sekwencjami. [009] Przez resztę stosowaną w niniejszym opisie rozumie się pozycję w białku i związaną z nią toŝsamość aminokwasową. Na przykład, Asparagina 297 (równieŝ określana jako Asn297 i N297) jest resztą w pozycji 297 w ludzkim przeciwciele IgG1. [0060] Przez docelowy antygen lub cel lub antygen w niniejszym opisie rozumie się cząsteczki, które są wiązane specyficznie przez region zmienny danego przeciwciała. Docelowy antygen moŝe być białkiem, węglowodanem, lipidem, lub innym związkiem chemicznym. Przez komórkę docelową stosowaną w niniejszym opisie rozumie się komórkę eksprymującą docelowy antygen. [0061] Przez region zmienny rozumie się region zmienny łańcucha cięŝkiego lub łańcucha lekkiego przeciwciała. Region zmienny łańcucha cięŝkiego (VH), jak zdefiniowany w niniejszym opisie, dotyczy N-końca do C-końca domeny V H, określonej resztami 1-113 zgodnie z konwencją numeracji Kabata. Region zmienny łańcucha lekkiego (VL), jak zdefiniowany w niniejszym opisie, dotyczy N-końca do C-końca domeny V L, określonej resztami 1-7 zgodnie z konwencją numeracji Kabata. Znawcy w dziedzinie rozpoznają, Ŝe konwencja numeracji regionu zmiennego według Kabata wykorzystuje litery do przypisania zmiennych długości CDR. Zatem to, Ŝe V H jest określone resztami Kabat 1-113, oraz to, Ŝe V L jest określone resztami Kabat 1-7, niekoniecznie oznacza, Ŝe domeny V H zawierają dokładnie 113 reszt, ani, Ŝe V L zawiera dokładnie 7 reszt. Raczej reszty 1-113 dla V H i 1-7 dla V L według Kabata rozumie się jako obejmujące domeny strukturalne, które zostały określone przez dopasowania sekwencji duŝego zestawu regionów zmiennych przeciwciała o zmiennej długości róŝnej długości ((Kabat i współpr., 1991, Sequences of Protein of Immunological Interest, th Ed., United States Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda). W niektórych przykładach wykonania, region zmienny moŝe zawierać jedną lub większą liczbę domen Ig zasadniczo kodowanych przez

23 1 20 2 30 3 dowolny z V κ, Vλ, i/lub geny V H, które tworzą odpowiednio loci genetyczne łańcucha cięŝkiego kappa, lambda, oraz immunoglobuliny. [0062] Przez białko wariantowe, wariant białka, polipeptyd wariantowy, lub wariant polipeptydu, stosowane w niniejszym opisie, rozumie się sekwencję polipeptydu, która róŝni się od tej dla macierzystej sekwencji polipeptydu na mocy przynajmniej jednej modyfikacji aminokwasu. Polipeptyd wariantowy moŝe dotyczyć samego polipeptydu, kompozycji zawierającej polipeptyd, lub sekwencji aminokwasowej, która go koduje. Korzystnie, polipeptyd wariantowy ma przynajmniej jedną modyfikację aminokwasu w porównaniu do macierzystego polipeptydu, np. od około jednej do około dziesięciu modyfikacji aminokwasów, oraz korzystnie od około jednej do około pięciu modyfikacji aminokwasów w porównaniu do macierzystego. Sekwencja polipeptydu wariantowego będzie tu korzystnie zawierała przynajmniej około 80% homologii z macierzystą sekwencją polipeptydu, oraz najbardziej korzystnie przynajmniej około 90% homologii, bardziej korzystnie przynajmniej około 9% homologii. W związku z tym, przez przeciwciało wariantowe lub wariant przeciwciała stosowane w niniejszym opisie rozumie się sekwencję przeciwciała, która róŝni się od tej dla macierzystej sekwencji przeciwciała na mocy przynajmniej jednej modyfikacji aminokwasu. Wariant przeciwciała moŝe dotyczyć samego polipeptydu przeciwciała, kompozycji zawierających polipeptyd przeciwciała wariantowego, lub sekwencji aminokwasów, która go koduje. W związku z tym, przez przeciwciało wariantowe lub wariant przeciwciała, stosowane w niniejszym opisie, rozumie się przeciwciało, jak zdefiniowane powyŝej, które róŝni się od sekwencji dla macierzystej sekwencji przeciwciała na mocy przynajmniej jednej modyfikacji aminokwasu. Przeciwciało wariantowe moŝe dotyczyć samego białko, kompozycji zawierających białko, lub sekwencji aminokwasów, które go kodują. W związku z tym, przez wariant stałego łańcucha cięŝkiego lub wariant stałego łańcucha lekkiego lub wariant Fc, stosowane w niniejszym opisie, rozumie się odpowiednio polipeptyd lub sekwencję stałego łańcucha cięŝkiego, stałego łańcucha lekkiego, lub regionu Fc, które róŝnią się sekwencją od tych dla macierzystej sekwencji na mocy przynajmniej jednej modyfikacji aminokwasu. [0063] Przez dziki typ lub WT rozumie się tu sekwencję aminokwasów lub sekwencję nukleotydów, która występuje w naturze, w tym wariacje alleliczne. Białko, polipeptyd, przeciwciało, immunoglobuliną, IgG, itd. WT ma sekwencję aminokwasów lub sekwencję nukleotydów, które nie zostały celowo zmodyfikowane. [0064] Dla wszystkich pozycji łańcucha cięŝkiego regionu stałego immunoglobuliny omawianych w niniejszym wynalazku, numerowanie odbywa się zgodnie z indeksem EU jak u Kabata (Kabat i współpr., 1991, Sequences of Protein of Immunological Interest, th Ed.,

24 1 20 2 30 3 United States Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda). indeks EU jak u Kabata dotyczy numerowania reszt ludzkiego przeciwciała EU IgG1, jak opisanego przez Edelman i współpr., 1969, Biochemistry 63:78-8. Przeciwciała [006] W stosowanym tu kontekście, określenie przeciwciało dotyczy monomerycznego lub multimerycznego białka zawierającego jeden lub większą liczbę łańcuchów polipeptydowych. Przeciwciało wiąŝe się specyficznie do antygenu (np. CD 19) i moŝe być zdolne do modulowania aktywności biologicznej antygenu. W stosowanym tu kontekście, określenie przeciwciało moŝe obejmować pełnej długości przeciwciało i polipeptyd Fc. [0066] Przez pełnej długości przeciwciało rozumie się tu strukturę stanowiącą formę biologiczną naturalnego przeciwciała, zawierającą regiony stałe i zmienne. Na przykład, u większości ssaków, w tym ludzi i myszy, pełnej długości przeciwciało klasy IgG jest tetramerem i składa się z dwóch identycznych par dwóch łańcuchów immunoglobulin, przy czym kaŝda z par ma jeden lekki i jeden cięŝki łańcuch, przy czym lekki łańcuch zawiera domenę immunoglobuliny V L i C L, oraz kaŝdy łańcuch cięŝki zawiera domeny immunoglobuliny V H, CH1 (Cγ1), CH2 (Cγ2), oraz CH3 (Cγ3). U niektórych ssaków, na przykład w wielbłądów lub lam, przeciwciała IgG mogą składać się jedynie z dwóch łańcuchów cięŝkich, przy czym kaŝdy łańcuch cięŝki zawiera zmienną domenę przymocowaną do regionu Fc. [0067] Określenie przeciwciało obejmuje równieŝ fragmenty przeciwciał. Specyficzne fragmenty przeciwciał obejmują, bez ograniczania do wymienionych, (i) fragment Fab składający się domen V L, V H, C L i CH1, (ii) fragment Fd składający się z domen V H i CH1, (iii) fragment Fv składający się z domen V L i V H pojedynczego przeciwciała; (iv) fragment dab (Ward i współpr., 1989, Nature 341:44-46) które składa się z pojedynczego zmiennego, (v) izolowane regiony CDR, (vi) fragmenty F(ab )2, dwuwartościowy fragment zawierający dwa połączone fragmenty Fab (vii) jednołańcuchowe cząsteczki Fv (scfv), w których domena VH i domena VL są połączone linkerem peptydowym, który pozwala tym dwóm domenom na asocjację w celu utworzenia miejsca wiąŝącego antygen (Bird i współpr., 1988, Science 242:423-426, Huston i współpr., 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 8:879-883), (viii) bispecyficzne jednołańcuchowe dimery Fv (PCT WO 1993/011161) i (ix) diaciała lub triaciała, wielowartościowe lub multispecyficzne fragmenty skonstruowane przez fuzję genów (Tomlinson et. al., 2000, Methods Enzymol. 326:461-479; WO94/13804; Holliger i współpr., 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90:6444-6448). W niektórych przykładach wykonania, przeciwciała są produkowane technikami rekombinacji DNA. Inne przykłady formatów i architektury przeciwciał opisano w

2 1 20 2 30 3 Holliger & Hudson, 2006, Nature Biotechnology 23(9):1126-1136, oraz Carter 2006, Nature Reviews Immunology 6:343-37 i przywoływanych w nich odnośnikach. W dodatkowych przykładach wykonania, przeciwciała są produkowane przez rozszczepienie enzymatyczne lub chemiczne naturalnie występujących przeciwciał. [0068] Naturalne jednostki strukturalne przeciwciała typowo zawierają tetramer. KaŜdy tetramer jest typowo złoŝony z dwóch identycznych par łańcuchów polipeptydowych, przy czym kaŝda para ma jeden łańcuch lekki (typowo o masie cząsteczkowej około 2 kda) i jeden łańcuch cięŝki (typowo o masie cząsteczkowej około 0-70 kda). KaŜdy z łańcuchów lekkich i cięŝkich składa się z dwóch odrębnych regionów, określanych jako regiony zmienne i stałe. Dla klasy IgG immunoglobuliny, cięŝki łańcuch składa się z czterech domen immunoglobuliny połączonych od N- do C-końca w porządku V H -CH1-CH2-CH3, odnoszących się odpowiednio do domeny zmiennej łańcucha cięŝkiego, domeny stałej łańcucha cięŝkiego 1, domeny stałej łańcucha cięŝkiego 2, oraz domeny stałej łańcucha cięŝkiego 3 (równieŝ określanych jako V H -Cγ1-Cγ2-Cγ3, odnoszących się odpowiednio do domeny zmiennej łańcucha cięŝkiego, domeny stałej gamma 1, domeny stałej gamma 2, oraz domeny stałej gamma 3). Łańcuch lekki IgG jest złoŝony z dwóch domen immunoglobuliny połączonych od N- do C-końca w porządku V L -C L, odnoszących się odpowiednio do domena zmienna łańcucha lekkiego i domena stała łańcucha lekkiego. Regiony stałe wykazują mniejszą róŝnorodności sekwencji, oraz są odpowiedzialne za wiązanie licznych naturalnych białek do wywoływania waŝnych zdarzeń biochemicznych. [0069] Region zmienny przeciwciała zawiera czynniki wiąŝące antygen cząsteczki, oraz tym samym określa specyfikę przeciwciała dla jego docelowego antygenu. Region zmienny jest tak nazywany, poniewaŝ jest najbardziej róŝnym w sekwencji od innych przeciwciał w tej samej klasie. W regionie zmiennym, zbierane są trzy pętle dla kaŝdej domeny V łańcucha cięŝkiego i łańcucha lekkiego tworząc miejsce wiąŝące antygen. KaŜda z pętli jest określana jako region determinujący komplementarność (poniŝej określany jako CDR ), w których zmiany w sekwencji aminokwasowej są najbardziej znaczące. Istnieje w sumie 6 CDR, kaŝde trzy na łańcuch cięŝki i lekki, oznaczone VH CDR1, VH CDR2, VH CDR3, VL CDR1, VL CDR2, oraz VL CDR3. Region zmienny na zewnątrz CDR jest określany jako region zrębowy (FR). Choć nie tak zróŝnicowane jak CDR, zmienność sekwencji dokonuje się w regionie FR między róŝnymi przeciwciałami. Ogólnie rzecz biorąc, ta cecha architektury przeciwciała zapewnia stabilne rusztowanie (region FR), na którym znaczna róŝnorodność wiązania antygenu (CDR) moŝe być badana przez układ odpornościowy w celu uzyskania specyficzności wobec szerokiego wachlarza antygenów. Szereg struktur wysokiej rozdzielczości jest dostępnych w róŝnych regionach zmiennych

26 1 20 2 30 3 fragmentów z róŝnych organizmów, niektóre niezwiązane i niektóre w kompleksie z antygenem. Sekwencja i strukturalne cechy regionu zmiennego przeciwciała są ujawnione, na przykład, w Morea i współpr., 1997, Biophys Chem 68:9-16; Morea i współpr., 2000, Methods 20:267-279, oraz konserwatywne cechy przeciwciał są ujawnione, na przykład, w Maynard i współpr., 2000, Annu Rev Biomed Eng 2:339-376. [0070] Przeciwciała są pogrupowane w klasy, równieŝ określane jako izotypy, określone genetycznie przez region stały. Ludzkie stałe łańcuchy lekkie klasyfikuje się jako łańcuchy lekkie kappa (Cκ) i lambda (Cλ). CięŜkie łańcuchy są klasyfikowane jako mi, delta, gamma, alfa, lub epsilon, oraz określają izotyp przeciwciała odpowiednio jako IgM, IgD, IgG, IgA, oraz IgE. Klada IgG najczęściej stosowana do celów terapeutycznych. U ludzi klasa ta obejmuje podklasy IgG1, IgG2, IgG3, oraz IgG4. U myszy, klasa ta obejmuje podklasy IgG1, IgG2a, IgG2b, IgG3. IgM ma podklasy, w tym, ale nie ograniczając się do wymienionych, IgM1 i IgM2. IgA ma kilka podklas, w tym bez ograniczania do wymienionych, IgA1 i IgA2. Zatem, izotyp stosowany w niniejszym opisie rozumie się jako dowolną klasę lub podklasę immunoglobuliny określonej chemiczną i antygenową charakterystyką jej regionów stałych. Znanymi ludzkimi izotypami immunoglobulin są IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, IgA2, IgM1, IgM2, IgD, oraz IgE. Figura 2 zapewnia sekwencje ludzkich łańcuchów stałych lekkiego łańcucja kappa i cięŝkiego łańcucha gamma. Figura 3 przedstawia dopasowanie ludzkich stałych łańcuchów lekkich IgG. [0071] UŜyteczne mogą być takŝe IgG, które są hybrydowymi kompozycjami naturalnych ludzkich izotypów IgG. Funkcje efektorowe takie, jak ADCC, ADCP, CDC, oraz czas półtrwania w surowicy róŝnią się zasadniczo między róŝnymi klasami przeciwciała, w tym na przykład ludzkimi IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, IgA2, IgD, IgE, IgG, oraz IgM (Michaelsen i współpr., 1992, Molecular Immunology, 29(3): 319-326). Wiele badań badało warianty IgG1, IgG2, IgG3, oraz IgG4 w celu zbadania wyznaczników róŝnic funkcji efektorowych między nimi. Patrz na przykład Canfield & Morrison, 1991, J. Exp. Med. 173: 1483-1491; Chappel i współpr., 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88(20): 9036-9040; Chappel i współpr., 1993, Journal of Biological Chemistry 268:2124-2131; Tao i współpr., 1991, J. Exp. Med. 173: 2-28; Tao i współpr., 1993, J. Exp. Med. 178: 661-667; Redpath i współpr., 1998, Human Immunology, 9, 720-727. [0072] Jak opisano w US 2006/0134, złoŝony 21 paźdz. 200, pod tytułem IgG Immunoglobulin Variants with Optimized Effector Function, moŝliwe jest poddanie inŝynierii modyfikacji aminokwasów w przeciwciele, które zawiera regiony stałe z innych klas immunoglobulin, na przykład, jak tych przedstawionych w dopasowaniach na Figurze 3. Takie poddane inŝynierii hybrydowe kompozycje IgG mogą zapewnić ulepszone właści-

27 1 20 2 30 3 wości funkcji efektorowej, w tym ulepszone ADCC, fagocytozę, CDC, oraz czas półtrwania w surowicy. Na przykład, jak przedstawiono na Figurze 3, wariant hybrydowy IgG1/IgG3 moŝna skonstruować przez podstawienie pozycji IgG1 w regionach CH2 i CH3 za pomocą aminokwasów z IgG3 w miejscach, w których dwa izotypy róŝnią się. Zatem hybrydowy wariant IgG przeciwciała moŝe być skonstruowany w taki sposób, aby zawierał jedno lub więcej podstawień wybranych z grupy składającej się z: 274Q, 276K, 300F, 339T, 36E, 38M, 384S, 392N, 397M, 422I, 43R, oraz 436F, przy czym numeracja odbywa się zgodnie z indeksem EU. Taki wariant moŝe zapewnić zmienione i/lub ulepszone właściwości funkcji efektorowych. [0073] Jako inny przykład, stosunkowo słaba funkcja efektorowa IgG2 moŝe być ulepszona przez zastąpienie kluczowych reszt wiąŝących FcγR odpowiednimi aminokwasami w IgG o lepszej funkcji efektorowej. Na przykład, kluczowe róŝnice reszt między IgG2 i IgG1 w odniesieniu do wiązania FcγR mogą być P233, V234, A23, -236 (oznacza to usunięcie w IgG2 względem IgG1), oraz G327. Zatem jedna lub większa liczba modyfikacji aminokwasów w macierzystym IgG2, przy czym jedna lub większa liczba tych reszt jest zastępowana odpowiednimi aminokwasami IgG1, P233E, V234L, A23L, -236G (oznacza wstawienie glicyny w pozycji 236), oraz G327A, moŝe zapewnić ulepszoną funkcję efektorową. Sekwencja takiej IgG, zawierającej hybrydę reszty z IgG1 i IgG2, określaną tu jako Hybrid na Przykładach i Figurach, jest przedstawiona na Figurze 2. [0074] Jak dobrze wiadomo w dziedzinie techniki, w populacji ludzkiej istnieje polimorfizm immunoglobulin. Polimorfizm Gm jest określony przez geny IGHG1, IGHG2 i IGHG3, które mają allele kodujące allotypowe determinanty antygenowe określane jako allotyp G1m, G2m, oraz G3m dla ludzkich cząsteczek IgGI, IgG2 i IgG3 (brak allotypu Gm stwierdzono na łańcuchu gamma 4). Markery mogą być sklasyfikowane jako allotypy i izoallotypy. Te róŝnią się w róŝnych serologicznych bazach zaleŝnie od silnych homologii sekwencji między izotypami. Allotypy są determinantami antygenowymi określonymi przez formy alleliczne genów Ig. Allotypy stanowią niewielkie róŝnice w sekwencji aminokwasów cięŝkich lub lekkich łańcuchów róŝnych osobników. Nawet pojedyncza róŝnica aminokwasu moŝe spowodować powstanie wyznacznika allotypicznego, choć w wielu przypadkach obecne jest kilka substytucji aminokwasowych, które wystąpiły. Allotypy są róŝnicami sekwencji między allelami subklasy, gdzie antysera rozpoznają tylko róŝnice alleliczne. Izoallotyp jest allelą w jednym izotypie, który produkuje epitop, który jest dzielony z nie-polimorficznym homologicznym regionem jednego lub większej liczby innych izotypów i w związku z tym antysera będą reagowały zarówno z odpowiednimi allotypami, jak i odpowiednimi homologicznymi izotypami (Clark, 1997, IgG effector me-

28 1 20 2 30 3 chanisms, Chem Immunol. 6:88-1; Gorman & Clark, 1990, Semin Immunol 2(6):47-66). [007] Alleliczne formy ludzkiej immunoglobuliny zostały dobrze scharakteryzowane (WHO Review of the notation for the allotypic and related markers of human immunoglobulin. J Immunogen 1976, 3: 37-362; WHO Review of the notation for the allotypic and related markers of human immunoglobulin. 1976, Eur. J. Immunol. 6, 99-601; E. van Loghem, 1986, Allotypic markers, Monogr Allergy 19: 40-1). Dodatkowo, scharakteryzowano inne polimorfizmy (Kim i współpr., 2001, J. Mol. Evol. 4:1-9). W obecnej chwili, znanymi allotypami 18 Gm są: G1m (1, 2, 3, 17) lub G1m (a, x, f, z), G2m (23) lub G2m (n), G3m (, 6,, 11, 13, 14, 1, 16, 21, 24, 26, 27, 28) lub G3m (b1, c3, b, b0, b3, b4, s, t, gl, c, u, v, g) (Lefranc, i współpr., The humigg subclasses: molecular analysis of structure, function and regulation. Pergamon, Oxford, pp. 43-78 (1990); Lefranc, G. i współpr., 1979, Hum. Genet.: 0, 199-211). Allotypy, które są dziedziczone w stałych połączeniach są nazywane haplotypami Gm. Figura 4 przedstawia typowe haplotypy łańcucha gamma ludzkiej IgG1 (Figura 4a) i IgG2 (Figura 4b) pokazujące pozycje i odpowiednie podstawienia aminokwasów. Sekwencje aminokwasów tych allotypicznych wersji IgG 1 i IgG2 są zapewnione jako SEQ ID: 80-8. Przeciwciała według niniejszego wynalazku mogą być zasadniczo kodowane przez dowolny allotyp, izoallotyp, lub haplotyp dowolnego genu immunoglobuliny. [0076] Alleliczne formy ludzkiej immunoglobuliny zostały dobrze scharakteryzowane (WHO Review of the notation for the allotypic and related markers of human immunoglobulin. J Immunogen 1976, 3: 37-362; WHO Review of the notation for the allotypic and related markers of human immunoglobulin. 1976, Eur. J. Immunol. 6, 99-601; E. van Loghem, 1986, Allotypic markers, Monogr Allergy 19: 40-1). Dodatkowo, scharakteryzowano inne polimorfizmy (Kim i współpr., 2001, J. Mol. Evol. 4:1-9). W obecnej chwili, znanymi allotypami 18 Gm są: G1m (1, 2, 3, 17) lub G1m (a, x, f, z), G2m (23) lub G2m (n), G3m (, 6,, 11, 13, 14, 1, 16, 21, 24, 26, 27, 28) lub G3m (b1, c3, b, b0, b3, b4, s, t, gl, c, u, v, g) (Lefranc, i współpr., The humigg subclasses: molecular analysis of structure, function and regulation. Pergamon, Oxford, pp. 43-78 (1990); Lefranc, G. i współpr., 1979, Hum. Genet.: 0, 199-211). Allotypy, które są dziedziczone w stałych połączeniach są nazywane haplotypami Gm. Figura 4 przedstawia typowe haplotypy łańcucha gamma ludzkiej IgG1 (Figura 4a) i IgG2 (Figura 4b) pokazujące pozycje i odpowiednie podstawienia aminokwasów. Sekwencje aminokwasów tych allotypicznych wersji IgG 1 i IgG2 są zapewnione jako SEQ ID: 80-8. Przeciwciała według niniejszego wynalazku mogą być zasadniczo kodowane przez dowolny allotyp, izoallotyp, lub haplotyp dowolne-

29 1 20 2 30 3 go genu immunoglobuliny. [0077] Przeciwciała według niniejszego wynalazku mogą być zasadniczo kodowane przez geny z dowolnego organizmu, korzystnie ssaka, w tym bez ograniczania do wymienionych, ludzi, gryzoni w tym bez ograniczania do wymienionych, myszy i szczurów, zajęczaków, w tym, bez ograniczania do wymienionych, królików i zajęcy, wielbłądowatych, w tym, bez ograniczania do wymienionych, wielbłądów, lam, oraz jednogarbnych i naczelnych poza człowiekiem, w tym bez ograniczania do wymienionych, małpiatki, małpy szerokonose (małpy Nowego Świata), makakokształtne (małpy Starego Świata), oraz człekokształtne w tym gibony i małpy niŝsze i wyŝsze. W najbardziej korzystnym przykładzie wykonania, przeciwciała według niniejszego wynalazku są zasadniczo ludzkie. Przeciwciała według niniejszego wynalazku mogą być zasadniczo kodowane przez geny immunoglobuliny naleŝące do dowolnej klasy przeciwciała. W najbardziej korzystnym przykładzie wykonania, przeciwciała według niniejszego wynalazku zawierają sekwencje naleŝące do klasy IgG przeciwciała, w tym ludzkich podklas IgG1, IgG2, IgG3, oraz IgG4. W alternatywnym przykładzie wykonania, przeciwciała według niniejszego wynalazku zawierają sekwencje naleŝące do klas IgA (w tym ludzkich podklas IgA1 i IgA2), IgD, IgE, IgG, lub IgM przeciwciała. Przeciwciała według niniejszego wynalazku moŝe zawierać więcej niŝ jedno białko łańcucha. To znaczy, niniejszy wynalazek moŝe znaleźć zastosowanie w przeciwciele, które jest monomerem lub oligomerem, w tym homo- lub heterooligomerem. [0078] W najbardziej korzystnym przykładzie wykonania, przeciwciała według niniejszego wynalazku są oparte na sekwencjach ludzkiej IgG, a w związku z tym sekwencje ludzkiej IgG są stosowane jako sekwencje bazowe, wobec których porównuje się inne sekwencje, w tym bez ograniczania do wymienionych, sekwencje z innych organizmów, na przykład sekwencje gryzoni i naczelnych, oraz sekwencje z innych klas immunoglobulin takich, jak IgA, IgE, IgGD, IgGM, i podobnych. UwaŜa się, Ŝe, choć przeciwciała według niniejszego wynalazku poddaje się inŝynierii w kontekście jednego macierzystego przeciwciała, warianty mogą być wprowadzone lub przeniesione do kontekstu innego, drugiego macierzystego przeciwciała. Odbywa się to przez określenie reszty równowaŝnej lub odpowiadającej i podstawienie między pierwszym i drugim przeciwciałem, typowo oparte o homologię sekwencji lub struktury między sekwencjami tych dwóch przeciwciał. W celu ustalenia homologii, sekwencja aminokwasów wskazanego tu pierwszego przeciwciała porównywana jest bezpośrednio z sekwencją drugiego przeciwciała. Po dopasowaniu sekwencji, przy uŝyciu jednego lub większej liczby programów do dopasowania homologii znanych w dziedzinie (na przykład uŝywając konserwatywnych reszt między gatunkami), pozwalając na potrzebne wstawienia i usunięcia w celu podtrzymania dopasowania (tj.

30 1 20 2 30 3 unikając eliminacji reszty konserwatywnej przez arbitralne usunięcie i wstawienie), określane są reszty równowaŝne określonym aminokwasów w pierwotnej sekwencji pierwszego przeciwciała. Dopasowanie konserwatywnych reszt korzystnie powinno zachować 0% takich reszt. JednakŜe, dopasowanie ponad 7% lub zaledwie 0% konserwatywnych reszt jest równieŝ wystarczające do określenia równowaŝnych reszt. Reszty równowaŝne moŝna równieŝ określić przez określenie strukturalnej homologii między pierwszym i drugim przeciwciałem, to jest na poziomie struktury trzeciorzędowej dla przeciwciała, którego strukturę oznaczono. W tym przypadku, reszty równowaŝne określa się jako te, których współrzędne atomowe dwóch lub większej liczby głównych atomów łańcucha określonej reszty aminokwasu macierzystego lub prekursorowego (N na N, CA na CA, C na C i O na O) znajdują się w 0.13 nm i korzystnie 0.1 nm po dopasowaniu. Dopasowanie osiągane jest po tym, jak zorientowano i spozycjonowano najlepszy model aby dać maksymalne nałoŝenie współrzędnych atomowych atomów białka, niebędących wodorami białka. Nie zaleŝnie od tego, jak określa się reszty równowaŝne lub odpowiadające, oraz niezaleŝnie od toŝsamości macierzystego przeciwciała, w którym przeciwciała są tworzone, to, co ma to na celu jest to, Ŝe odkryte przeciwciało przez niniejszy wynalazek moŝe być wprowadzone technikami inŝynierii do drugiego macierzystego przeciwciało, które ma znaczącą homologię sekwencji lub strukturalną z wymienionym przeciwciałem. Zatem na przykład, jeśli generowane jest przeciwciało wariantowe, w którym macierzyste przeciwciało jest ludzką IgG1, przez uŝycie metod opisanych powyŝej lub innych metod określania reszt równowaŝnych, wymienione przeciwciało wariantowe moŝe zostać wprowadzone technikami inŝynierii do macierzystego przeciwciała ludzkiej IgG2, macierzystego przeciwciała ludzkiej IgA, macierzystego przeciwciała mysiej IgG2a lub IgG2b, i podobnych. Ponownie, zgodnie z powyŝszym opisem, kontekst macierzystego przeciwciała nie wpływa na zdolność do przeniesienia przeciwciała według niniejszego wynalazku do innego macierzystego przeciwciała. Na przykład, wariant przeciwciała, który wprowadza się technikami inŝynierii do przeciwciała ludzkiej IgG1, która jest skierowana na jeden epitop antygenu, moŝna przenieść do przeciwciała ludzkiej IgG2, która jest skierowana na inny epitop antygenu i tak dalej. [0079] W klasie IgG immunoglobulin, istnieje kilka domen immunoglobuliny w łańcuchu cięŝkim. Przez domenę immunoglobuliny (Ig) rozumie się tu region immunoglobuliny o wyraźnej strukturze trzeciorzędowej. Interesujące z punktu widzenia niniejszego wynalazku są domeny stałego łańcucha cięŝkiego (w tym domeny cięŝkiego łańcucha (CH) i zawias. W kontekście przeciwciał IgG, kaŝdy z izotypów IgG ma trzy regiony CH: CH1 dotyczy pozycji 118-220, CH2 dotyczy pozycji 237-340, oraz CH3 dotyczy pozycji

31 1 20 2 30 341-447 zgodnie z indeksem EU jak u Kabata. Przez zawias lub region zawiasowy lub region zawiasowy przeciwciała lub region zawiasowy immunoglobuliny rozumie się tu elastyczny polipeptyd zawierający aminokwasy między pierwszą i druga domeną stałą przeciwciała. Strukturalnie, domeny IgG CH1 kończą się przy pozycja EU 220, a domena IgG CH2 zaczyna się przy reszcie pozycji EU 237. W związku z tym dla IgG, zawias jest tu zdefiniowany do obejmowania pozycji 221 (D221 w IgG1) do 236 (G236 in IgG1), przy czym numeracja odbywa się zgodnie z indeksem EU jak u Kabata. W niektórych przykładach wykonania, na przykład w kontekście obszaru Fc, niŝszy zawias jest zawarty, przy czym niŝszy zawias generalnie odnosi się do pozycji 226 lub 230. Stały łańcuch cięŝki jak zdefiniowany w niniejszym opisie, dotyczy the N-końca domeny CH1 do C-końca domeny CH3, zatem obejmuje pozycje 118-447, przy czym numeracja odbywa się zgodnie z indeksem EU. Stały łańcuch lekki obejmuje jedną domenę, oraz jak zdefiniowano w opisie odnosi się do pozycji 8-214 Cκ lub Cλ, przy czym numeracja odbywa się zgodnie z indeksem EU. [0080] Przeciwciała według niniejszego wynalazku mogą obejmować multispecyficzne przeciwciała, szczególnie bispecyficzne przeciwciała, określane równieŝ czasem jako diaciała. Są to przeciwciała, które wiąŝą się do dwóch (lub większej liczby) róŝnych antygenów. Diaciała mogą być wykonane w róŝny sposób znany w dziedzinie techniki, np., otrzymane chemicznie lub z hybrydowych hybrydom. W jednym przykładzie wykonania, przeciwciało jest miniciałem. Miniciała są zminimalizowanymi białkami podobnymi do przeciwciał zawierającymi scfv połączone z domeną CH3. W niektórych przypadkach, sc- Fv moŝe być połączony z regionem Fc, oraz moŝe zawierać niektóre lub wszystkie regiony zawiasowe. Dla opisu multispecyficznych przeciwciał patrz Holliger & Hudson, 2006, Nature Biotechnology 23(9) :1126-1136 i przywoływanych tam odnośnikach. [0081] Przeciwciało tu opisane moŝe być fragmentem przeciwciała. Szczególnie interesujące są przeciwciała, które zawierają regiony Fc, fuzje Fc oraz region stały łańcucha cięŝkiego (CH1-zawias -CH2-CH3). Wymienione przeciwciała mogą zawierać fragmenty Fc. Fragment Fc według niniejszego wynalazku moŝe zawierać od 1-90% regionu Fc, przy czym korzystne jest - 90%, oraz najbardziej korzystne jest 30-90%. Zatem na przykład, fragment Fc moŝe zawierać domenę IgG1 Cγ2, domenę IgG1 Cγ2 i region zawiasowy, domenę IgG1 Cγ3, i tak dalej. W jednym przykładzie wykonania, fragment Fc dodatkowo zawiera partner fuzyjny, skutecznie czyniąc go fuzją fragmentu Fc. Fragmenty Fc mogą zawierać lub mogą nie zawierać dodatkową sekwencję polipeptydu. - Chimeryczne, humanizowane oraz w pełni ludzkie przeciwciała

32 1 20 2 30 3 [0082] Immunogenność jest wynikiem złoŝonej serii reakcji na substancję, która jest postrzegana jako obca, oraz moŝe obejmować wytwarzanie neutralizujących i nieneutralizujących przeciwciał, tworzenie kompleksów immunologicznych, aktywację dopełniacza, aktywację komórek tucznych, zapalenie, reakcje nadwraŝliwości, oraz anafilaksję. Szereg czynników moŝe przyczyniać się do immunogenności białka, w tym bez ograniczania do wymienionych, sekwencja białka, sposób podawania i częstotliwość, oraz populacja pacjentów. Immunogenność moŝe ograniczać skuteczność i bezpieczeństwo terapeutyczne białka na wiele sposobów. Skuteczność moŝna zredukować bezpośrednio przez tworzenie neutralizujących przeciwciał. Skuteczność moŝe być równieŝ zmniejszona pośrednio, poniewaŝ wiązanie albo do neutralizującego, albo nieneutralizującego przeciwciała typowo prowadzi do szybkiego usunięcia z surowicy. CięŜkie działania niepoŝądane, a nawet śmierć moŝe wystąpić, gdy wywołana zostanie reakcja immunologiczna. Zatem, inŝynierię białka moŝna zastosować do zmniejszania immunogenności przeciwciała według niniejszego wynalazku. [0083] W niektórych przykładach wykonania, elementy rusztowania mogą być mieszaniną z róŝnych gatunków. Takie przeciwciało moŝe być chimerycznym przeciwciałem i/lub humanizowanym przeciwciałem. W ogólności, zarówno chimeryczne przeciwciała i humanizowane przeciwciała odnoszą się do przeciwciał, które mają połączone regiony od więcej niŝ jednego gatunku. Chimeryczne przeciwciała tradycyjnie obejmują region zmienny(regiony zmienne) od myszy (lub szczura, w niektórych przypadkach) i region stały(regiony stałe) od ludzi (Morrison i współpr., 1984, Proc Natl Acad Sci USA 81: 681-68). [0084] Przez humanizowane przeciwciało, stosowane w niniejszym opisie rozumie się przeciwciało zawierające ludzki region zrębowy (FR) i jeden lub większą liczbę regionów determinujących komplementarność (CDR) z nieludzkiego (zazwyczaj mysz lub szczur) przeciwciała. Nieludzkie przeciwciało zapewniające CDR nazywane jest donorem, a ludzka immunoglobulina zapewniająca zrąb jest nazywana akceptorem. W niektórych przykładach wykonania, humanizacja opiera się głównie na przeszczepieniu CDR donora na akceptorowe zręby (ludzkie) V L i V H (Winter US 2239). Strategia ta jest określana jako przeszczepianie CDR. Wymagana jest często mutacja wsteczna wybranej reszty akceptorowej zrębu do odpowiadającej reszty donorowej w celu ponownego zyskania powinowactwa, które ulega utraceniu w początkowym konstrukcie przeszczepionym (US 693762). Humanizowane przeciwciało optymalnie będzie równieŝ zawierać przynajmniej część regionu stałego immunoglobuliny, typowo tej z ludzkiej immunoglobuliny, oraz zatem typowo będzie zawierała ludzki region Fc. RóŜne techniki i sposoby dla humanizowa-

33 1 20 2 30 nia i zmieniania kształtu nie-ludzkiego przeciwciała są dobrze znane w dziedzinie (Patrz Tsurushita & Vasquez, 2004, Humanization of Monoclonal Antibodies, Molecular Biology of B Cells, 33-4, Elsevier Science (USA), oraz przywoływanych w nich odnośnikach). Humanizacja lub sposoby zmniejszania immunogenności regionów zmiennych nie ludzkiego przeciwciała moŝe obejmować sposoby ponownego układania powierzchni (ang. resurfacing), jak opisano na przykład w Roguska i współpr., 1994, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:969-973. Sposoby oparte na wyborze moŝna wykorzystać w celu humanizacji i/lub dojrzewania powinowactwa regionów zmiennych powinowactwa, to znaczy, w celu zwiększenia powinowactwa regionu zmiennego dla jego docelowego antygenu. Inne sposoby humanizacji mogą wykorzystywać przeszczepianie tylko części CDR, w tym bez ograniczania do wymienionych, sposoby opisane w US 2002/003476; Tan i współpr., 2002, J. Immunol. 169:1119-112; De Pascalis i współpr., 2002, J. Immunol. 169:3076-3084. Sposoby oparte na strukturze moŝna wykorzystać do humanizacji i dojrzewania powinowactwa na przykład jak opisano w US 2002/0177170 i powiązanych zgłoszeniach. [008] W niektórych wariacjach, immunogenność przeciwciała zmniejsza się za pomocą sposobu opisanego w US 2006/0008883, pod tytułem Methods of Generating Variant Protein with Increased Host String Content and Composition Thereof, złoŝony 3 grudnia 2004. [0086] Modyfikacje w celu zmniejszenia immunogenności mogą obejmować zmiany, które zmniejszają wiązanie przetworzonych peptydów pochodzących z sekwencji macierzystej do białka MHC. Na przykład, modyfikacje aminokwasów mogłyby być poddawane inŝynierii w taki sposób, Ŝe nie ma minimalnej liczby epitopów immunologicznych, które przewiduje się, Ŝe będą się wiązały, z wysokim powinowactwem, do dowolnych dominujących alleli MHC. W dziedzinie znane jest kilka sposobów identyfikacji epitopów wiąŝących MHC w strukturze białka i mogą być wykorzystane do oceny epitopów w przeciwciele według niniejszego wynalazku. Patrz na przykład US 2002/0119492, US 2004/0230380, US 2006/0148009, oraz przywoływane w nich odnośniki. [0087] W alternatywnym przykładzie wykonania, przeciwciała według niniejszego wynalazku mogą być w pełni ludzkie, oznacza to, Ŝe sekwencje przeciwciał są całkowicie lub zasadniczo ludzkie. W pełni ludzkie przeciwciało lub całkowite ludzkie przeciwciało dotyczy ludzkiego przeciwciała i sekwencji genów przeciwciała pochodzących z ludzkiego chromosomu z przedstawionymi tu modyfikacjami. Wiele metod jest znanych w tej dziedzinie techniki do generowania w pełni ludzkich przeciwciał, w tym wykorzystanie mysz transgenicznych (Bruggemann i współpr., 1997, Curr Opin Biotechnol 8:4-48,) lub bi-

34 1 20 2 30 3 blioteki ludzkich przeciwciał sprzęŝonych ze sposobami selekcji (Griffiths i współpr., 1998, Curr Opin Biotechnol 9:2-8). Przeciwciała ukierunkowane na CD19 [0088] Przeciwciała według niniejszego wynalazku jak te określone w zastrzeŝeniach wią- Ŝą się do CD19. Regiony zmienne wszelkich znanych lub nieodkrytych przeciwciał anty- CD19 mogą znaleźć zastosowanie. Przeciwciała tu ujawnione mogą prezentować selektywność dla CD 19 versus alternatywne cele, lub selektywność dla specyficznej formy celu versus alternatywne formy. Przykłady obejmują warianty pełnej długości kontra łączone, formy komórkowo powierzchniowe vs. rozpuszczalne, selektywność dla róŝnych wariantów polimorficznych, lub selektywność specyficznych konformacyjnych form celu. Przeciwciało tu ujawnione moŝe wiązać jakikolwiek epitop lub region na CD19, oraz moŝe być specyficzny dla fragmentów, form zmutowanych, form składanych, lub form anormalnych wymienionych antygenów. Odkryto wiele uŝytecznych przeciwciał ukierunkowanych na CD19, które mogą znaleźć zastosowanie. Odpowiednie przeciwciała lub immunoadhezyny obejmują przeciwciała lub immunoadhezyny CD19 w MT-3 (jednołańcuchowym bispecyficznym przeciwciele CD19/CD3; Hoffman, P. i współpr. 200. Int. J. Cancer. 11: 98-4; Schlereth, B. i współpr. 2006. Cancer Immunol. Immunother. : 03-14), diaciało CD19/CD16 (Schlenzka, J. i współpr. 2004. Anti-cancer Drugs. 1: 91-919; Kipriyanov, S.M- i współpr. 2002. J. Immunol. 169: 137-144), BU12-saporyna (Flavell, D.J. i współpr. 199. Br. J. Cancer. 72: 1373-1379), oraz anty-cd19-idarubicyna (Rowland, A.J. i współpr. 1993. Cancer Immunol. Immunother. : 03-14); Olson, Nr publ. US 2004/0136908A1, złoŝony 4 marzec 2004; US,686,072; Olson, WO 02/080987A1, zło- Ŝony 29 marzec 2002; Tedder, WO 06/13340A1, złoŝony 8 czerwiec 2006; Tedder, WO 06/12182A2, złoŝony kwiecień 2006; Tedder, WO 06/089133A2, złoŝony 1 luty 2006; Tedderm Nr publ. US 2006/280738A1, złoŝony 8czerwiec 2006; US 7,9,304; Hansen, Nr publ. US 200/070693A1, złoŝony 2 sierpień 2004; Hansen, Nr publ. US 2006/27398A1, złoŝony 1czerwiec 2006; Hansen, WO 0/012493A2, złoŝony 2 sierpień 2004; Rao-Naik, WO 07/002223A2, złoŝony 20 czerwiec 2006; Page, US Pub. 2002/182208A1, złoŝony 16 maj, 2002; US,686,072; Page, EP00481790B1, złoŝony 17 październik 1991; Hariharan, Nr publ. US 2003/3971A1, złoŝony 12 wrzesień 2002; Goldenberg, Nr publ. US 2003/133930A1, złoŝony 24. styczeń 2003; Goldenberg, Nr publ. US 2004/21916A1, złoŝony 30 grudzień 2002; Hahharan, Nr publ. US 2007/000919A1, złoŝony 21 lipiec 2006; Curd, WO 00/067796A1, złoŝony 4 maj 2000; Kipriyanov, WO 03/088998A1, złoŝony 1 kwiecień 2003; US 7,112,324, US 7,129,330, Olson, Nr publ. US 2004/013690A1, złoŝony 4. marzec 2004; Darken, Nr publ. US 2006/019382A1, zło-

3 1 20 2 30 3 Ŝony maj 2006; Amphlett, Nr publ. US 2007/000941A1, złoŝony 14 wrzesień 2006; Kersey, WO 96/36360A1, złoŝony 1 maj 199E; Kufer, WO 04/6381A1, złoŝony 26 maj 2004; Little, Nr publ. US 2007/031436A1, złoŝony październik 2006; Kufer, Nr publ. US 2007/123479A1, złoŝony 26 maj 2004; Baeuerle, WO 07/06834A1, złoŝony 29 listopad 2006; Le Gall, EP 01314741B1, złoŝony 14 listopad 2001; Pesando, WO 91/13974A1, złoŝony 12 marzec 1991; /Alien et al, Clin. Cancer. Res 200;11(9) May 1, 200; Barbin set al, J. Immunother, Vol. 29, No.2, March/April 2006; Bruenke et al, Brit. J. Haem, 130, 218-2228 (200); Callard, J. Immunol. Vol. 148, 2983-2987, No., May 1, 1992; Carter et al, Immunol. Res. 2002; 26/1-3:4-4; Carter & Barrington, Cuir. Dir. Autoimmun. Basel, Karger, 2004, viol 7, pp 4-32; WWWK Cheng et al, Biochim. Biophys. Acta 1768 (2007) 21-29; Cochlovius, Cancer Res. 60, 4336-4341, Aug. 1, 2000; LJN Cooper et al, Blood Cells, Molecules & Diseases, 33 (2004) 83-89; LJN Cooper et al, Blood, 1 Feb. 200, Vol., No. 4, pp 1622-1631; Culton et al, J. Clin. Immunol., Vol. 27, No. 1, Jan. 2007; Daniel et al, Blood, Vol. 92, No. 12 (Dec. 1), 1998: pp 470-477; Doody et al, Curr. Opin. Immun., 1996, pp 378-382; Dreier et al, Int. J. Cancer, 0, 690-697 (2002); Dreier et al, J. Immunol., 2003, pp. 4397-4402; Fearon & Carter, Annu. Rev. Immunol. 199. 13:127-149; Fearon & Carroll, Annu. Rev. Immunol. 2000. 18:393-422; Fujimoto & Sato, J. Dermatol. Sci. (2007) in press; Le Gall et al, Prot. Engr, Des. & Select., vol. 17, no. 4, pp.37-366, 2004; Ghetie et al, Blood, 1 Jul 2004, Vol. 4, No. 1, pp.178-183; Ghetie et al, Blood, Vol. 83, No. (Mar 1), 1994: pp 1329-1336; Ghetie et al, Clin. Cancer Res., Vol., 3920-2927, Dec. 1999; Ginaldi et al, J. Clin. Pathol, 1998; 1:364-369; Grossbard et al, Clin. Cancer Res., Vol., 2392-2398, Sept. 1999; Grossbard et al, Brit. J. Haematol., 1998, 2, 09-1; Grossbard et al, Blood, Vol. 80, No. 4 (Aug 1), 1992: pp 863-878; Grossbard & Fidias, Clin. Immunol. & Immunolpath., Vol. 76, No. 2, Aug., pp. 7-114, 199; M. Green, Cancer Immunol. Immunother. (2004) 3: 62-632; Harata et al, Blood, 1 Sept. 2004, Vol. 4, No., pp1442-1449; Hekman et al, Cancer Immunol. Immunother. (1991) 32: 364-372; Hoffmann et al, Int. J. Cancer: 11, 98-4 (200); Kipriyanov et al, J. Immunol. (2002), pp. 138-144; Kipriyanov et al, Int. J. Cancer: 77, 763-772 (1998); Kipriyanov et al, J. Immunol. Meth 196 (1996) 1-62; Lang et al, Blood, 1 May 2004, Vol. 3, No., pp 3982-398; Lankester et al, J. Biol. Chem., Vol, 271, No. 37, Sept. 13, pp. 22326-22330, 1996; Loeffler et al, Blood, 1 Mar 2000, Vol. 9, No. 6, pp 2098-23; Masir, et al Histopathol., 2006, 48, pps. 239-246; Bargou et al, MT3 (MEDI-38) Poster; Mitchell et al, J. Nucl. Med. 2003; 44:16-1112; Molhoj et al, Molec. Immunol., 44 (2007) 193-1943; Pietersz et al, Cancer Immunol. Immunother (199) 41: 3-60; Sapra et al, Clin. Cancer Res. Vol., 10-1111, Feb. 1, 2004; Schler-

36 1 20 2 30 eth et al, Cancer Immunol. Immunother. (2006) : 03-14; Schwemmlein et al, Leukemia (2007) 21, 140-1412; Sieber et al, Brit. J. Haematology, 2003, 121, 48-461; Stone et al, Blood, Vol, 88, No. 4 (Aug 1), 1996: 1188-1197; Sun et al, Molec. Immunolog. 41 (2004) 929-938; Tedder & Isaacs, J. Immunolog. Vol. 143, 712-717, No. 2 Jul 1, 1989; Tedder et al, Curr. Dir. Autoimmun. Basel, Karger, 200, vol 8, pp -90; Tedder et al, Springer Semin. Immun. (2006) 28: 31-364; Tiroch et al, J. Immunol., 2002, 168: 327-3282; Uckun et al, Blood, Vol 71, No 1 (Jan), 1988: pp 13-29; Uckun et al, J. Immunol., Vol 134, No 3, Mar 198, pp 20-2016; Vallera et al, Clin. Cancer Res. 200; 11() May 1, 200; Vlasveld et al, Cancer Immunol. Immunother (199) 40: 37-47; Vuist et al, Cancer Res, 49, 3783-3788, July 1, 1989; Vuis et al, Cancer Res, 0, 767-772, Sept. 1, 1990; Yan et al, Int. Immunol. Vol 17, No. 7, pp 869-877 (200); Yazawa, et la, PNAS 200; 2; 1178-1183. Cząsteczki opisane w US,686,072, WO 02/080987A1 i Nr publ. US 2004/0136908A1 i zidentyfikowane jako 4G7, korzystne są cząsteczki opisane w WO 07/002223A2 i Tedder. [0089] Przeciwciała według niniejszego wynalazku mogą znaleźć zastosowanie w wielu produktach. W jednym przykładzie wykonania przeciwciało według niniejszego wynalazku jest terapeutyczne, diagnostyczne, lub odczynnikiem do badań, korzystnie terapeutyczne. Przeciwciało według niniejszego wynalazku moŝe znaleźć zastosowanie w kompozycji przeciwciała, które jest monoklonalne. Przeciwciała według niniejszego wynalazku mogą być antagonistami, neutralizujące lub hamujące. W korzystnym przykładzie wykonania, przeciwciała według niniejszego wynalazku są stosowane do uśmiercania komórek docelowych niosących docelowy antygen, na przykład komórek rakowych. W alternatywnym przykładzie wykonania, przeciwciała według niniejszego wynalazku są stosowane do blokowania lub antagonizowania docelowego antygenu. W alternatywnie korzystnym przykładzie wykonania, przeciwciała według niniejszego wynalazku są stosowane do blokowania lub antagonizowania docelowego antygenu i zabijania komórek docelowych niosących docelowy antygen. Przeciwciała anty-cd 19 jako środki lecznicze do leczenia zaburzeń komórek B [0090] Przeciwciała są klasą białek terapeutycznych, które mogą być stosowane w leczeniu zaburzeń komórek B. Szereg korzystnych właściwości przeciwciała, w tym bez ograniczania do wymienionych, specyficzność dla celu, umiejętność mediacji w mechanizmach odporności, oraz długi czas półtrwania w surowicy, czynią przeciwciała potęŝnymi środkami terapeutycznymi. Niniejszy wynalazek opisuje przeciwciała jak te określone w zastrzeŝeniach przeciwko antygenowi B-komórkowemu CD 19.

37 1 20 2 30 3 [0091] Antygen B-komórkowy CD19 (CD19, znany równieŝ jako antygen powierzchniowy B4 komórki B, Leu-12) jest ludzkim markerem powierzchni komórki pan-b, który jest eksprymowany we wczesnych etapach rozwoju komórki pre-b przez końcowe róŝnicowanie do komórek plazmatycznych. CD19 promuje proliferację i przeŝycie dorosłej komórki B. Asocjuje w kompleksie z CD21 na powierzchni komórek. Asocjuje równieŝ z CD81 i Leu-13 i wzmacnia sygnalizację receptora komórki B (BCR). Razem z BCR, CD 19 moduluje progi sygnalizacji antygenu wewnętrzne i wywołane receptorem, krytyczne dla ekspansji klonów komórki B i odporności humoralnej. We współpracy z CD21 łączy adaptacyjny i wrodzony układ odpornościowy. Po aktywacji, ogon cytoplazmatyczny CD19 staje się fosforylowany, co prowadzi do wiązania kinaz rodziny Src i rekrutację kinazy PI-3. Jest to atrakcyjny cel immunoterapii dla nowotworów pochodzenia limfoidalnego, poniewaŝ eksprymowany jest on równieŝ na większości komórek NHL, jak równieŝ niektórych białaczkach. [0092] Wiele przeciwciał lub koniugatów przeciwciał, które są ukierunkowane na CD19, zostało ocenionych w badaniach przedklinicznych lub w badaniach klinicznych pod kątem leczenia raka. Te przeciwciała anty-cd 19 lub koniugaty przeciwciał obejmują, bez ograniczania do wymienionych, MT-3 (jednołańcuchowe bispecyficzne przeciwciało CD19/CD3; Hoffman et al, 200 Int J Cancer 11:98-4; Schlereth et al, 2006 Cancer Immunol Immunother :03-14), diaciało CD19/CD16 (Schlenzka et al, 2004 Anticancer Drugs 1:91-919; Kipriyanov et al, 2002 J Immunol 169:137-144), BU12- saporyna (Flavell et al, 199 Br J Cancer 72:1373-1379), oraz anty-cd19-idarubicyna (Rowland et al, 1993 Cancer Immunol Immunother :03-14). Optymalizacja Fc przeciwciała anty-cd19 [0093] Istnieje wiele scharakteryzowanych mechanizmów, dzięki którym przeciwciała pośredniczą efektom komórkowym, w tym antyproliferacja, poprzez zablokowanie potrzebnych ścieŝek wzrostu, wewnątrzkomórkowa sygnalizacja prowadząca do apoptozy, wzmocnienie regulacji w dół i/lub obrót receptorów, cytotoksyczność zaleŝna od dopełniacza (CDC), zaleŝna od przeciwciał cytotoksyczność komórkową (ADCC), zaleŝna od przeciwciał fagocytoza komórkową (ADCP) i promocja adaptacyjnej odpowiedzi immunologicznej (Cragg i współpr., 1999, Curr Opin Immunol 11:41-47; Glennie i współpr., 2000, Immunol Today 21:403-4). Skuteczność przeciwciało moŝe być spowodowana kombinacją tych mechanizmów, a ich względne znaczenie w terapii klinicznej dla onkologii wydaje się być zaleŝne od raka. [0094] Pokazano znaczenie funkcji efektorowych mediowanych FcγR dla aktywności niektórych przeciwciał u myszy (Clynes i współpr., 1998, Proc Natl Acad Sci U SA 9:62-

38 1 20 2 30 66; Clynes i współpr., 2000, Nat Med 6:443-446), oraz z obserwowanych korelacji między skutecznością kliniczną u ludzi i ich allotypem form polimorficznych, o wysokim (V18) lub niskim (F18) powinowactwie, FcγRIIIa (Cartron i współpr., 2002, Blood 99:74-78; Weng & Levy, 2003, Journal of Clinical Oncology, 21:3940-3947). Wszystkie te dane wskazują, Ŝe przeciwciało zoptymalizowane pod kątem wiązania do określonych FcγRs moŝe lepiej mediować funkcje efektorowe, oraz tym samym niszczyć bardziej skutecznie komórki docelowe u pacjentów. Zatem obiecujące środki do poprawy działania przeciwguzowego przeciwciała wyraŝają się przez wzmocnienie ich zdolności do mediowania cytotoksycznych funkcji efektorowych takich, jak ADCC, ADCP, oraz CDC. Dodatkowo, przeciwciała moŝe mediować mechanizm przeciwwguzowy poprzez hamowanie wzrostu lub sygnalizacji apoptotycznej, które mogą wystąpić, gdy przeciwciało wiąŝe się do swojego celu na komórkach guza. Tego rodzaju sygnalizacja moŝe się nasilać, gdy przeciwciała są prezentowane w komórkach nowotworowych związanych komórek immunologicznych przez FcγR. Zwiększone w ten sposób powinowactwo przeciwciała do FcγRs moŝe powodować zwiększenie działań antyproliferacyjnych. [009] Przeciwciało poddane inŝynierii pod kątem zoptymalizowanej funkcji efektorowej uzyskano dzięki modyfikacjom aminokwasowym (patrz na przykład US 2004/01321 i US 2006/0024298 i przywoływane w nich odnośniki), oraz glikoformom poddanym inŝynierii (patrz na przykład Umaña i współpr., 1999, Nat Biotechnol 17:176-180; Shinkawa i współpr., 2003, J Biol Chem 278:3466-3473, Yamane-Ohnuki i współpr., 2004, Biotechnology i Bioengineering 87():614-621). Modyfikacje dla optymalizacji funkcji efektorowej [0096] Ujawnione są przeciwciała zawierające modyfikacje, w których modyfikacje zmieniają powinowactwo do jednego lub większej liczby receptorów Fc i/lub zmieniają zdolność przeciwciała do mediowania jednej lub większej liczby funkcji efektorowych. Modyfikacje obejmują modyfikacje aminokwasów i modyfikacje glikoform. Modyfikacje aminokwasów [0097] Jak opisano w US 2006/0024298, złoŝony maj 200, zatytułowany Optimized Fc Variants, modyfikacje aminokwasów w pozycjach regionu stałego łańcucha cięŝkiego pozycje 221, 222, 223, 224, 22, 227, 228, 230, 231, 232, 233, 234, 23, 236, 237, 238, 239, 240, 241, 243, 244, 24, 246, 247, 249, 2, 28, 260, 262, 263, 264, 266, 266, 267, 268, 269, 270, 271, 272, 273, 274, 27, 276, 278, 280, 281, 282, 283, 284, 28, 286, 288, 290, 291, 292, 293, 294, 29, 296, 297, 298, 299, 300, 301, 302, 303, 304, 30, 313, 317, 318, 320, 322, 323, 324, 32, 326, 327, 328, 329, 330, 331, 332, 333, 334, 33, 336, oraz 337,

39 1 20 2 30 3 pozwala na modyfikacje Właściwości wiązania FcγR, funkcji efektorowej, oraz potencjalnych właściwości klinicznych przeciwciała. [0098] W szczególności, warianty, które zmieniają wiązanie do jednego lub większej liczby ludzkich receptorów Fc mogą zawierać modyfikację aminokwasu w regionie stałym łańcucha cięŝkiego, takiego, jak tu opisanego, wybraną z grupy składającej się z 221K, 221Y, 222E, 222Y, 223E, 223K, 224E, 224Y, 22E, 22K, 22W, 227E, 227G, 227K, 227Y, 228E, 228G, 228K, 228Y, 230A, 230E, 230G, 230Y, 231E, 231G, 231K, 231P, 231Y, 232E, 232G, 232K, 232Y, 233A, 233D, 233F, 233G, 233H, 233I, 233K, 233L, 233M, 233N, 233Q, 233R, 233S, 233T, 233V, 233W, 233Y, 234A, 234D, 234E, 234F, 234G, 234H, 234I, 234K, 234M, 234N, 234P, 234Q, 234R, 234S, 234T, 234V, 234W, 234Y, 23A, 23D, 23E, 23F, 23G, 23H, 23I, 23K, 23M, 23N, 23P, 23Q, 23R, 23S, 23T, 23V, 23W, 23Y, 236A, 236D, 236E, 236F, 236H, 236I, 236K, 236L, 236M, 236N, 236P, 236Q, 236R, 236S, 236T, 236V, 236W, 236Y, 237D, 237E, 237F, 237H, 237I, 237K, 237L, 237M, 237N, 237P, 237Q, 237R, 237S, 237T, 237V, 237W, 237Y, 238D, 238E, 238F, 238G, 238H, 238I, 238K, 238L, 238M, 238N, 238Q, 238R, 238S, 238T, 238V, 238W, 238Y, 239D, 239E, 239F, 239G, 239H, 239I, 239K, 239L, 239M, 239N, 239P, 239Q, 239R, 239T, 239V, 239W, 239Y, 240A, 240I, 240M, 240T, 241D, 241E, 241L, 241R, 241S, 241 W, 241 Y, 243E, 243H, 243L, 243Q, 243R, 243W, 243Y, 244H, 24A, 246D, 246E, 246H, 246Y, 247G, 247V, 249H, 249Q, 249Y, 2E, 2Y, 28H, 28S, 28Y, 260D, 260E, 260H, 260Y, 262A, 262E, 262F, 262I, 262T, 263A, 263I, 263M, 263T, 264A, 264D, 264E, 264F, 264G, 264H, 264I, 264K, 264L, 264M, 264N, 264P, 264Q, 264R, 264S, 264T, 264W, 264Y, 26F, 26G, 26H, 26I, 26K, 26L, 26M, 26N, 26P, 26Q, 26R, 26S, 26T, 26V, 26W, 26Y, 266A, 2661, 266M, 266T, 267D, 267E, 267F, 267H, 267I, 267K, 267L, 267M, 267N, 267P, 267Q, 267R, 267T, 267V, 267W, 267Y, 268D, 268E, 268F, 268G, 268I, 268K, 268L, 268M, 268P, 268Q, 268R, 268T, 268V, 268W, 269F, 269G, 269H, 269I, 269K, 269L, 269M, 269N, 269P, 269R, 269S, 269T, 269V, 269W, 269Y, 270F, 270G, 270H, 270I, 270L, 270M, 270P, 270Q, 270R, 270S, 270T, 270W, 270Y, 271A, 271D, 271E, 271F, 271G, 271H, 271I, 271K, 271L, 271M, 271N, 271Q, 271R, 271S, 271T, 271V, 271W, 271Y, 272D, 272F, 272G, 272H, 2721, 27214, 272L, 272M, 272P, 272R, 272S, 272T, 272V, 272W, 272Y, 273I, 274D, 274E, 274F, 274G, 274H, 274I, 274L, 274M, 274N, 274P, 274R, 274T, 274V, 274W, 274Y, 27L, 27W, 276D, 276E, 276F, 276G, 276H, 276I, 276L, 276M, 276P, 276R, 276S, 276T, 276V, 276W, 276Y, 278D, 278E, 278G, 278H, 2781, 278K, 278L, 278M, 278N, 278P, 278Q, 278R, 278S, 278T, 278V, 278W, 280G, 280K, 280L, 280P, 280W, 281D, 281E, 281K, 281N, 281P, 281Q, 281Y,

40 1 20 2 30 3 282E, 282G, 282K, 282P, 282Y, 283G, 283H, 283K, 283L, 283P, 283R, 283Y, 284D, 284E, 284L, 284N, 284Q, 284T, 284Y, 28D, 28E, 28K, 28Q, 28W, 28Y, 286E, 286G, 286P, 286Y, 288P, 288E, 288Y, 290D, 290H, 290L, 290N, 290W, 291D, 291E, 291G, 291H, 2911, 291Q, 291T, 292D, 292E, 292T, 292Y, 293F, 293G, 293H, 293I, 293L, 293M, 293N, 293P, 293R, 293S, 293T, 293V, 293W, 293Y, 294F, 294G, 294H, 2941, 294K, 294L, 294M, 294P, 294R, 294S, 294T, 294V, 294W, 294Y, 29D, 29E, 29F, 29G, 29H, 29I, 29M, 29N, 29P, 29R, 29S, 29T, 29V, 29W, 29Y, 296A, 296D, 296E, 296G, 296H, 296I, 296K, 296L, 296M, 296N, 296Q, 296R, 296S, 296T, 296V, 297D, 297E, 297F, 297G, 297H, 297I, 297K, 297L, 297M, 297P, 297Q, 297R, 297S, 297T, 297V, 297W, 297Y, 298A, 298D, 298E, 298F, 298H, 298I, 298K, 298M, 298N, 298Q, 298R, 298T, 298W, 298Y, 299A, 299D, 299E, 299F, 299G, 299H, 299I, 299K, 299L, 299M, 299N, 299P, 299Q, 299R, 299S, 299V, 299W, 299Y, 300A, 300D, 300E, 300G, 300H, 300K, 300M, 300N, 300P, 300Q, 300R, 300S, 300T, 300V, 300W, 301D, 301E, 301H, 301Y, 3021, 303D, 303E, 303Y, 304D, 304H, 304L, 304N, 304T, 30E, 30T, 30Y, 313F, 317E, 317Q, 318H, 318L, 318Q, 318R, 318Y, 320D, 320F, 320G, 320H, 320I, 320L, 320N, 320P, 320S, 320T, 320V, 320W, 320Y, 322D, 322F, 322G, 322H, 322I, 322P, 322S, 322T, 322V, 322W, 322Y, 323I, 324D, 324F, 324G, 324H, 324I, 324L, 324M, 324P, 324R, 324T, 324V, 324W, 324Y, 32A, 32D, 32E, 32F, 32G, 32H, 321, 32K, 32L, 32M, 32P, 32Q, 32R, 32S, 32T, 32V, 32W, 32Y, 326E, 326I, 326L, 326P, 326T, 327D, 327E, 327F, 327H, 3271, 327K, 327L, 327M, 327N, 327F, 327R, 327S, 327T, 327V, 327W, 327Y, 328A, 328D, 328E, 328F, 328G, 328H, 328I, 328K, 328M, 328N, 328P, 328Q, 328R, 328S, 328T, 328V, 328W, 328Y, 329D, 329E, 329F, 329G, 329H, 329I, 329K, 329L, 329M, 329N, 329Q, 329R, 329S, 329T, 329V, 329W, 329Y, 330E, 330F, 330G, 330H, 330I, 330L, 330M, 330N, 330P, 330R, 330S, 330T, 330V, 330W, 330Y, 331D, 331F, 331H, 331I, 331L, 331M, 331Q, 331R, 331T, 331V, 331W, 331Y, 332A, 332D, 332E, 332F, 332H, 332K, 332L, 332M, 332N, 332P, 332Q, 332R, 332S, 332T, 332V, 332W, 332Y, 333A, 333F, 333H, 3331, 333L, 333M, 333P, 333T, 333Y, 334A, 334F, 334I, 334L, 334P, 334T, 33D, 33F, 33G, 33H, 33I, 33L, 33M, 33N, 33P, 33R, 33S, 33V, 33W, 33Y, 336E, 336K, 336Y, 337E, 337H, oraz 337N, przy czym numeracja odbywa się zgodnie z indeksem EU. [0099] Jak opisano w US 200/0244403, złoŝony 24 marca 200, zatytułowany Immunoglobulin variants outside the Fc region, modyfikacje aminokwasów w pozycjach regionu stałego łańcucha cięŝkiego 118, 119, 120, 121, 122, 124, 126, 129, 131, 132, 133, 13, 136, 137, 138, 139, 147, 148,, 11, 12, 13, 1, 17, 19, 160, 161, 162, 163, 164,

41 1 20 2 30 3 16, 166, 167, 168, 169, 171, 172, 173, 174, 17, 176, 177, 178, 179, 180, 183, 187, 188, 189, 190, 191, 192, 193, 194, 19, 196, 197, 198, 199, 201, 203, 20, 206, 207, 208, 209, 2, 211, 212, 213, 214, 216, 217, 218, 219, 221, 222, 223, 224, 22, 226, 227, 228, 229, 230, 231, 232, 233, 234, 23, oraz 236, pozwalają na modyfikacje właściwości wiązania FcγR, funkcji efektorowej, oraz potencjalnych właściwości klinicznych przeciwciała. [00] Jak opisano w US 200/0244403, złoŝony 24 marca 200, zatytułowany Immunoglobulin variants outside the Fc region, modyfikacje aminokwasów w pozycjach regionu stałego łańcucha lekkiego 8, 9, 1, 111, 112, 114, 116, 121, 122, 123, 124, 12, 126, 127, 128, 129, 131, 137, 138, 140, 141, 142, 143, 14, 147, 149,, 11, 12, 13, 14, 1, 16, 17, 19, 160, 161, 162, 163, 164, 16, 166, 167, 168, 169, 170, 171, 172, 173, 174, 176, 180, 181, 182, 183, 184, 18, 187, 188, 189, 190, 191, 193, 19, 197, 199, 200, 202, 203, 204, 20, 206, 207, 208, 2, 211, 212, 213, pozwala na modyfikacje właściwości wiązania FcγR, funkcji efektorowej, oraz potencjalnych właściwości klinicznych przeciwciała. [01] W szczególności, warianty, które zmieniają wiązanie do jednego lub większej liczby ludzkich receptorów Fc mogą zawierać modyfikację aminokwasu w regionie stałym łańcucha cięŝkiego, takiego, jak tu opisanego, wybraną z grupy składającej się z 118K, 118E, 118Y, 119R, 119E, 119Y, 120R, 120E, 120I, 121 E, 121Y, 121H, 122E, 122R, 124K, 124E, 124Y, 126K, 126D, 129L, 129D, 131G, 131T, 132D, 132R, 132L, 133R, 133E, 133L, 13I, 13E, 13K, 136E, 136K, 136I, 137E, 138S, 138R, 138D, 139I, 139E, 139K, 147A, 147E, 148Y, 148K, L, K, E, 11A, 11D, 12L, 12K, 13L, 13D, 1E, 1K, 1I, 17E, 17K, 17Y, 19K, 19D, 19L, 160K, 160E, 160Y, 161D, 162D, 162K, 162Y, 163R, 164R, 164E, 164Y, 16D, 16R, 16Y, 166D, 167A, 168L, 169E, 171G, 171H, 172K, 172L, 172E, 173T, 173D, 174E, 174K, 174Y, 17D, 17L, 176D, 176R, 176L, 177R, 177E, 177Y, 178D, 179K, 179Y, 179E, 180K, 180L, 180E, 183T, 187I, 187K, 187E, 188I, 189D, 189G, 190I, 190K, 190E, 191D, 191R, 191Y, 192N, 192R, 192L, 193F, 193E, 194R, 194D, 19R, 19D, 19Y, 196K, 196D, 196L, 197R, 197E, 197Y, 198L, 199T, 199D, 199K, 201E, 201K, 201L, 203D, 203L, 203K, 20D, 20L, 206A, 206E, 207K, 207D, 208R, 208E, 208Y, 209E, 209K, 209Y, 2L, 2E, 2Y, 211R, 211E, 211Y, 212Q, 212K, 212H, 212L, 212Y, 213N, 213E, 213H, 213L, 213Y, 214N, 214E, 214H, 214L, 214Y, 216N, 216K, 216H, 216L, 216Y, 217D, 217H, 217A, 217V, 217G, 218D, 218E, 218Q, 218T, 218H, 218L, 218Y, 219D, 219E, 219Q, 219K, 219T, 219H, 219L, 219I, 2I9Y, 20A, 2A, 213A, 214A, 218A, 221K, 221Y, 221E, 221N, 221Q, 221K, 221S, 221T, 221H, 221 A, 221V, 221L, 221I, 221F, 221M, 221W, 221P, 221G, 222E, 222Y, 222D, 222N, 222Q, 222R, 222S, 222T, 222H,

42 1 20 2 30 3 222V, 222L, 222I, 222F, 222M, 222W, 222P, 222G, 222A, 223D, 223N, 223Q, 223R, 223S, 223H, 223A, 223V, 223L, 223I, 223F, 223M, 223Y, 223W, 223P, 223G, 223E, 223K, 224D, 224N, 224Q, 224K, 224R, 224S, 224T, 224V, 224L, 224I, 224F, 224M, 224W, 224P, 224G, 224E, 224Y, 224A, 22D, 22N, 22Q, 22R, 22S, 22H, 22A, 22V, 22L, 22L, 22F, 22M, 22Y, 22P, 22G, 22E, 22K, 22W, 226S, 227E, 227K, 227Y, 227G, 227D, 227N, 227Q, 227R, 227S, 227T, 227H, 227A, 227V, 227L, 227I, 227F, 227M, 227W, 228K, 228Y, 228G, 228D, 228N, 228Q, 228R, 228T, 228H, 228A, 228V, 228L, 228I, 228F, 228M, 228W, 229S, 230A, 230E, 230Y, 230G, 230D, 230N, 230Q, 230K, 230R, 230S, 230T, 230H, 230V, 230L, 230I, 230F, 230M, 230W, 231K, 231P, 231D, 231N, 231Q, 231R, 231S, 231T, 231H, 231V, 231L, 231I, 231F, 231M, 231W, 232E, 232K, 232Y, 232G, 232D, 232N, 232Q, 232R, 232S, 232T, 232H, 232A, 232V, 232L, 232I, 232F, 232M, 232W, 233D, 233N, 233Q, 233R, 233S, 233T, 233H, 233A, 233V, 233L, 233I, 233F, 233M, 233Y, 233W, 233G, 234D, 234E, 234N, 234Q, 234T, 234H, 234Y, 234I, 234V, 234F, 234K, 234R, 234S, 234A, 234M, 234G, 23D, 23S, 23N, 23Q, 23T, 23H, 23Y, 231, 23V, 23F, 23E, 23K, 23R, 23A, 23M, 23W, 23P, 23G, 236D, 236E, 236N, 236Q, 236K, 236R, 236S, 236T, 236H, 236A, 236V, 236L, 236I, 236F, 236M, 236Y, 236W, oraz 236P, przy czym numeracja odbywa się zgodnie z indeksem EU. [02] W szczególności, warianty, które zmieniają wiązanie do jednego lub większej liczby ludzkich receptorów Fc mogą zawierać modyfikację aminokwasu w regionie stałym łańcucha lekkiego, takiego, jak tu opisanego, wybraną z grupy składającej się z 8D, 8I, 8Q, 9D, 9P, 9R, 1E, 1I, 1K, 111E, 111K, 111L, 112E, 112R, 112Y, 114D, 114I, 114K, 116T, 121D, 122R, 122S, 122Y, 123L, 123R, 124E, 12E, 12K, 126D, 126L, 126Q, 127A, 127D, 127K, 128N, 129E, 129I, 129K, 131T, 137K, 137S, 138D, 138K, 138L, 140E, 140H, 140K, 141E, 141K, 142D, 142G, 142L, 143A, 143L, 143R, 14D, 14T, 14Y, 147A, 147E, 147K, 149D, 149Y, A, 11I, 11K, 12L, 12R, 12S, 13D, 13H, 13S, 14E, 14R, 14V, 1E, 1I, 1K, 16A, 16D, 16R, 17N, 18D, 18L, 18R, 19E, 19K, 19L, 160K, 160V, 161K, 161L, 162T, 163E, 163K, 163T, 164Q, 16K, 16P, 16Y, 166E, 166M, 166S, 167K, 167L, 168K, 168Q, 168Y, 169D, 169H, 169S, 170I, 170N, 170R, 171A, 171N, 171V, 172E, 172I, 172K, 173K, 173L, 173Q, 174A, 176T, 180E, 180K, 180S, 181K, 182E, 182R, 182T, 183D, 183L, 183E, 184E, 184K, 184Y, 18I, 18Q, 18R, 187K, 187Y, 188E, 188S, 188Y, 189D, 189K, 189Y, 190E, 190L, 190R, 191E, 191R, 191S, 193E, 193K, 193S, 19I, 19K, 19Q, 197E, 197K, 197L, 199E, 199K, 199Y, 200S, 202D, 202R, 202Y, 203D, 203L, 203R, 204T, 20E, 20K, 206E, 206I, 206K, 207A, 207E, 207L, 208E, 208K, 208T,

43 1 20 2 30 3 2A, 2E, 2K, 211A, 211E, 211P, 212E, 212K, 212T, 213L, 213R, przy czym numeracja odbywa się zgodnie z indeksem EU. [03] Dodatkowe podstawienia, które mogą być równieŝ uŝyte, obejmują inne podstawienia które modulują powinowactwo receptora Fc, funkcję efektorową mediowaną FcγR, i/lub funkcję efektorową mediowaną dopełniaczem, obejmują, bez ograniczania do wymienionych, 298A, 298T, 326A, 326D, 326E, 326W, 326Y, 333A, 333S, 334L, oraz 334A (US 6,737,06; Shields et al, Journal of Biological Chemistry, 2001, 276(9):691-6604; US 6,28,624; Idusogie i współpr., 2001, J. Immunology 166:271-272), 247L, 2L, 270E, 392T, 396L, oraz 421K (US 200/0037000; US 200/006414), oraz 280H, 280Q, oraz 280Y (US 2004/000287). [04] W innych przykładach wykonania, opisane tu przeciwciała moŝna kombinować z wariantami stałego łańcucha cięŝkiego, które zmieniają wiązanie FcRn. Są to zmiany, które modyfikują powinowactwo FcRn w sposób zaleŝny od ph. W szczególności, warianty, które zwiększają wiązanie Fc do FcRn obejmują, bez ograniczania do wymienionych,: 20E, 20Q, 428L, 428F, 20Q/428L (Hinton i współpr., 2004, J. Biol. Chem. 279(8): 6213-6216, Hinton i współpr. 2006 Journal of Immunology 176:346-36, US 200/0276799, PCT WO 2004/0372, PCT WO 2004/092219, US 200/0014934, US 200/0032114, PCT WO 200/037867, US 200/0226864), 26A, 272A, 286A, 30A, 307A, 311A, 312A, 376A, 378Q, 380A, 382A, 434A (Shields et al, Journal of Biological Chemistry, 2001, 276(9):691-6604, US 200/0118174, USA673706, US 2006/0194291, US 2006/019497, PCT WO 2006/031370, US 2006/0067930), 22F, 22T, 22Y, 22W, 24T, 26S, 26R, 26Q, 26E, 26D, 26T, 309P, 311S, 433R, 433S, 433I, 433P, 433Q, 434H, 434F, 434Y, 22Y/24T/26E, 433K/434F/436H, 308T/309P/311S (Dall Acqua i współpr. Journal of Immunology, 2002, 169:171-180, US7083784, PCT WO 1997/034631, PCT WO 2002/060919, US 2006/0198840), 27C, 27M, 27L, 27N, 27Y, 279E, 279Q, 279Y, wstawienie Ser po 281, 283F, 284E, 306Y, 307V, 308F, 308Y 311 V, 38H, 38N, (PCT WO 2006/03301, US 2006/0173170, US 2007/013620) 204D, 284E, 28E, 286D, oraz 290E (PCT WO 200/047327). [0] Przeciwciała mogą zawierać modyfikacje izotypowe, czyli modyfikacje w macierzystej IgG do typu aminokwasu w zmienionej IgG. Na przykład jak przedstawiono na Figurze 3, wariant hybrydowy IgG1/IgG3 moŝna skonstruować przez podstawienie pozycji IgG1w regionie CH2 i/lub CH3 aminokwasami z IgG3 w pozycjach, gdzie dwa izotypy róŝnią się. Zatem moŝna skonstruować takie hybrydowe wariantowe przeciwciało IgG, Ŝe zawiera ono jedno lub większą liczbę podstawień wybranych z grupy składającej się z: 274Q, 276K, 300F, 339T, 36E, 38M, 384S, 392N, 397M, 422I, 43R, oraz 436F. Wa-

44 1 20 2 30 3 riant hybrydowy IgG1/IgG2 moŝna skonstruować przez podstawienie pozycji IgG2 w regionie CH2 i/lub CH3 region aminokwasami z IgG1 w pozycjach, gdzie dwa izotypy się róŝnią. Zatem moŝna skonstruować takie hybrydowe wariantowe przeciwciało IgG, które zawiera jedną lub większą liczbę modyfikacji wybranych z grupy składającej się z 233E, 234L, 23L, -236G (odpowiada wstawieniu glicyny w pozycji 236), oraz 327A. Modyfikacje glikoform [06] Wiele polipeptydów, w tym przeciwciała, poddawanych jest róŝnym modyfikacjom potranslacyjnym z udziałem reszt węglowodanowych takim, jak glikozylacja oligosacharydami. Istnieje kilka czynników, które mogą wpływać na glikozylację. WaŜne okazały się rodzaj gatunków, tkanek i komórek, aby mogła nastąpić glikozylacja. Ponadto, środowisko pozakomórkowe, przez zmianę warunków hodowli takich, jak stęŝenie w surowicy, moŝe kierować działaniem glikozylacji. (Lifely i współpr., 199, Glycobiology (8): 813-822). [07] Wszystkie przeciwciała zawierają węglowodany w konserwatywnych pozycjach w regionach stałych łańcucha cięŝkiego. KaŜdy izotyp przeciwciała posiada odrębne róŝne N-połączone struktury węglowodanów. Oprócz węglowodanów dołączony do łańcucha cięŝkiego, do 30% ludzkich IgG ma glikozylowany region Fab. IgG ma pojedynczy N- połączony dwuantenarny węglowodan Asn297 domeny CH2. Dla IgG albo z surowicy, albo wytworzonej ex vivo w hybrydomach lub komórkach poddanych inŝynierii, IgG są niejednorodne w odniesieniu do węglowodany przyłączonego do Asn297 (Jefferis i współpr., 1998, Immunol. Rev. 163: 9-76; Wright i współpr., 1997, Trends Biotech 1:26-32). Dla ludzkiej IgG, rdzeń oligosacharydowy składa się zazwyczaj z GlcNAc 2 Man 3 GlcNAc, ze zróŝnicowanymi liczbami reszt zewnętrznych. [08] Reszty węglowodanowe przeciwciała według niniejszego wynalazku będą opisane w odniesieniu do powszechnie stosowanej nomenklatury dla opisu oligosacharydów. Przegląd chemii węglowodanów, które uŝywa tego nazewnictwa moŝna znaleźć w Hubbard i współpr. 1981, Ann. Rev. Biochem. 0:-83. Ta nomenklatura obejmuje, na przykład, Man, która reprezentuje mannozę; GlcNAc, która reprezentuje 2-N-acetyloglukozaminę; Gal która reprezentuje galaktozę; Fuc dla fukozy; i Glc, która reprezentuje glukozę. Kwasy sjalowe są opisane w notacji skróconej NeuNAc, dla kwasu -N-acetyloneuraminowego, oraz NeuNGc dla -glikoliloneuraminiowego. [09] Określenie glikozylacja oznacza przyłączenie oligosacharydów (węglowodanów zawierających dwa lub więcej cukrów prostych połączonych połączonych razem np. z od dwóch do około dwunastu cukrów prostych) do glikoproteiny. Oligosacharydowe łańcuchy boczne są typowo związane z łańcuchem głównym glikoproteiny przez połączenie albo N, albo O. Oligosacharydy przeciwciała według niniejszego wynalazku występujące z reguły

4 1 20 2 30 3 są przyłączone do domeny CH2 regionu Fc jako N-połączone oligosacharydy. Npołączona glikozylacja dotyczy przyłączenia reszty węglowodanu do reszty asparaginy w łańcuchu glikoproteiny. Znawcy rozpoznają, Ŝe, na przykład, kaŝda z mysich domen CH2 IgG1, IgG2a, IgG2b i IgG3, jak i ludzkich domen CH2 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA i IgD ma jedno miejsce dla N-połączonej glikozylacji przy reszcie aminokwasu 297 (Kabat i współpr. Sequences of Protein of Immunological Interest, 1991). [01] Dla celów niniejszego opisu, dojrzała węglowodanowa struktura rdzenia dotyczy obrobionej węglowodanowej struktury rdzenia przyłączonej do regiony Fc, która składa się zasadniczo z następujących struktur węglowodanów GlcNAc(Fukoza)-Glc-NAc-Man- (Man-GlcNAc) 2 typowo dwuantenarnych oligosacharydów. Dojrzała węglowodanowa struktura rdzenia jest przyłączona do regionu Fc glikoproteiny, generalnie przez N- połączenie do Asn297 domeny CH2 regionu Fc. Rozdzielający (ang. bisecting) GlcNAc jest resztą GlcNAc przyłączoną do β1,4-mannozy dojrzałej węglowodanowej struktury rdzenia. Rozdzielający GlcNAc moŝe być enzymatycznie przyłączony do dojrzałej węglowodanowej struktury rdzenia przez enzym β (1,4)-N-acetyloglukozaminylotransferazę III (GnTIII). Komórki CHO zazwyczaj nie eksprymują GnTIII (Stanley i współpr., 1984, J. Biol. Chem. 261: 13370-13378), ale mogą być tak zmienione metodami inŝynierii, aby to robić (Umana i współpr., 1999, Nature Biotech. 17:176-180). [0111] Niniejszy wynalazek przewiduje przeciwciała jak te określone w zastrzeŝeniach, które zawierają modyfikowane glikoformy lub glikoformy poddane inŝynierii. Przez modyfikowana glikoforma lub glikoforma poddana inŝynierii stosowane w niniejszym opisie rozumie się kompozycję węglowodanową, która jest kowalencyjnie przyłączona do białka, na przykład przeciwciała, przy czym wymieniona kompozycja węglowodanowa róŝni się chemicznie od tej dla macierzystego białka. Glikoformy poddane inŝynierii mogą być uŝyteczne dla róŝnych celów, w tym bez ograniczania do wymienionych, zwiększanie lub zmniejszanie funkcji efektorowej mediowanej FcγR. Przeciwciała według niniejszego wynalazku mogą być modyfikowane w celu kontrolowania poziomu fukozylowanych i/lub rozdzielających oligosacharydów, które są kowalencyjnie przyłączone do regionu Fc. [0112] Historycznie, przeciwciała wytworzone w komórkach jajnika chomika chińskiego (CHO), jednego z najczęściej stosowanych przemysłowych gospodarzy, zawierają w populacje około 2 do 6% takich nie fukozylowanych. YB2/0 (szpiczak szczurzy) i linia komórkowa Lec 13 (mutant lektyny linii CHO, mający niedobór GDP-mannozo-4,6 dehydratazy prowadzący do niedoboru GDP-fukozy lub GDP-cukrowych półproduktów, które są substratem dla α1,6-fukozylotransferaza (Ripka i współpr., 1986), jednakŝe, mogą wytwarzać przeciwciała z rodzajami niefukozylowanymi w 78% do 98%. Niestety, wydajność prze-

46 1 20 2 30 3 ciwciał z tych komórek jest bardzo słaba i w związku z tym te linie komórkowe nie są przydatne, aby wytwarzać produkty terapeutyczne przeciwciała komercyjnie. Gen FUT8 koduje enzym α1,6-fukozylotransferazę, która katalizuje tranfer reszty fukozylowej od GDP-fukozy do pozycji 6 połączonego Asn (N-połączonego) GlcNac N-glikanu (Yanagidani i współpr., 1997, J Biochem 121:626-632). Wiadomo, Ŝe α1,6 fukozylotransferaza jest jedynym enzymem odpowiedzialnym za dodanie fukozy do N-połączonego dwuantenarnego węglowodanu przy Asn297 w domenie CH2 przeciwciała IgG. [0113] RóŜne sposoby są dobrze znane w dziedzinie dla generowania modyfikowanych glikoform (Umańa i współpr., 1999, Nat Biotechnol 17:176-180; Davies i współpr., 2001, Biotechnol Bioeng 74:288-294; Shields i współpr., 2002, J Biol Chem 277: 26733-26740; Shinkawa i współpr., 2003, J Biol Chem. 278:3466-3473); (US 6,602,684; US 2003/0178; US 2003/0003097; PCT WO 00/61739A1; PCT WO 01/29246A1; PCT WO 02/31140A1; PCT WO 02/3094A1); Yamane-Ohnuki i współpr., 2004, Biotechnology i Bioengineering 87():614-621; (technologia Potelligent [Biowa, Inc., Princeton, NJ]; GlycoMAb technologia inŝynierii glikozylacji [GLYCART biotechnology AG, Zürich, Switzerland]). Techniki te kontrolują poziom fukozylowanych i/lub rozdzielających oligosacharydów, które są kowalencyjnie przyłączone do regionu Fc, na przykład przez eksprymowanie IgG w róŝnych organizmach lub liniach komórkowych, poddawane inŝynierii lub w inny sposób (na przykład komórki CHO Lec-13 lub komórki szczurzej hybrydomy YB2/0), poprzez regulację enzymów biorących udział w ścieŝce glikozylacji (na przykład FUT8 [α1,6-fukozylotranseraza] i/lub β1-4-n-acetyloglukozaminylotransferaza III [GnTIII]), lub przez modyfikowanie węglowodanu(ów) po ekspresji IgG. [0114] Inne sposoby dla modyfikacji glikoform przeciwciała według niniejszego wynalazku obejmują uŝycie glikomodyfikowanych szczepów droŝdŝy (Li i współpr., 2006, Nature Biotechnology 24(2):2-21), mchu (Nechansky i współpr., 2007, Mol Immunjol 44(7): 1826-8), oraz roślin (Cox i współpr., 2006, Nat Biotechnol 24(12):191-7). Sposoby modyfikacji glikoform obejmują, bez ograniczania do wymienionych, uŝycie szczepu droŝdŝy glikomodyfikowanych Pichia pastoris (Li i współpr., 2006, Nature Biotechnology 24(2):2-21), glikomodyfikowanego szczepu mchu Physcomitrella patens, w którym β1,2-ksylozylotransferaza i/lub α1,3-fukozylotransferaza są wyeliminowane (Nechansky i współpr., 2007, Mol Immunjol 44(7):1826-8), oraz zastosowanie interferencji RNA do hamowania alfa-1,3-fukozylotransferazy i/lub beta-1,2-ksylozylotransferazy w roślinie wodnej Lemna minor (Cox i współpr., 2006, Nat Biotechnol 24(12):191-7). [011] Modyfikowana lub poddana inŝynierii glikoforma typowo dotyczy róŝnych węglowodanów lub oligosacharydów; zatem na przykład przeciwciało moŝe zawierać glikofor-

47 1 20 2 30 mę poddaną inŝynierii. Alternatywnie, glikoforma poddana inŝynierii moŝe dotyczyć przeciwciała, które zawiera róŝne węglowodany lub oligosacharydy. Dla celów opisanych tu modyfikowanych glikoform, macierzyste przeciwciało jest przeciwciałem glikozylowanym o tej samej sekwencji aminokwasów i dojrzałej węglowodanowej strukturze rdzenia, co glikoforma poddana inŝynierii według niniejszego wynalazku z tym wyjątkiem, Ŝe fukoza jest przyłączona do dojrzałej węglowodanowej struktury rdzenia macierzystego przeciwciała. Na przykład, w kompozycji zawierającej macierzystą glikoproteinę około 0-0% lub około 70-0% macierzystej glikoproteiny zawiera dojrzałą węglowodanową strukturę rdzenia mającą przyłączoną do siebie fukozę. [0116] Niniejszy wynalazek zapewnia kompozycję zawierającą wiele glikozylowanych przeciwciał takich, jak tych określonych w zastrzeŝeniach, przy czym około 80-0% przeciwciał w kompozycji zawiera dojrzałą węglowodanową strukturę rdzenia pozbawioną fukozy i najbardziej korzystnie około 90-99% przeciwciał w kompozycji jest pozbawionych fukozy przyłączonej do dojrzałej węglowodanowej struktury rdzenia. Opisane tu przeciwciało w kompozycji moŝe zarówno zawierać dojrzałą węglowodanową strukturę rdzenia, która jest pozbawiona fukozy i dodatkowo zawierać przynajmniej jedną modyfikację aminokwasu w regionie Fc. Kombinacja glikoformy poddanej inŝynierii i modyfikacji aminokwasu zapewnia optymalne właściwości wiązania receptora Fc do przeciwciała. Zoptymalizowane właściwości przeciwciała [0117] Ujawniono tu wariant przeciwciała, który jest dostosowany do wielu odpowiednich właściwości terapeutycznych. Przeciwciało wariantowe zawiera jedną lub większą liczbę modyfikacji aminokwasów w stosunku do macierzystego przeciwciała, przy czym wymieniona modyfikacja(modyfikacje) aminokwasu zapewniają jedną lub większą liczbę zoptymalizowanych właściwości. Zatem przeciwciała mogą być przeciwciałami wariantowymi. Opisane tu przeciwciało róŝni się w sekwencji aminokwasów od tej dla macierzystego przeciwciała na mocy przynajmniej jednej modyfikacji aminokwasu. Zatem wariant przeciwciała ma przynajmniej jedną modyfikację aminokwasu w porównaniu do macierzystego. Alternatywnie, wariant przeciwciała moŝe mieć więcej niŝ jedną modyfikację aminokwasu w porównaniu do macierzystego, na przykład od około jednej to pięćdziesięciu modyfikacji aminokwasów, korzystnie od około jednej do dziesięciu modyfikacji aminokwasów, oraz najbardziej korzystnie od około jednej do około pięciu modyfikacji aminokwasów w porównaniu do macierzystego. Zatem sekwencje wariantu przeciwciała i tych macierzystego przeciwciała są zasadniczo homologiczne. Na przykład, sekwencje przeciwciała wariantowego z niniejszego opisu będą posiadały około 80% homologii z macierzystą

48 1 20 2 30 3 sekwencja przeciwciała, korzystnie przynajmniej około 90% homologii, oraz najbardziej korzystnie przynajmniej około 9% homologii. [0118] Przeciwciała mogą zawierać modyfikacje aminokwasów, które zapewniają zoptymalizowane właściwości funkcji efektorowej w stosunku do macierzystego. Najkorzystniejsze podstawienia i zoptymalizowane właściwości funkcji efektorowej są opisane w US 2004/01321, PCT WO 2004/029207, oraz US 200/004832. [0119] Właściwości, które mogą być zoptymalizowane, obejmują, bez ograniczania do wymienionych, zwiększone lub zmniejszone powinowactwo do FcγR. Przeciwciała są zoptymalizowane do posiadania zwiększonego powinowactwa do ludzkiego aktywującego FcγR, korzystnie FcγRI, FcγRIIa, FcγRIIc, FcγRIIIa, oraz FcγRIIIb, najbardziej korzystnie FcγRIIIa. Przeciwciała są zoptymalizowane do posiadania zmniejszone powinowactwo do ludzkiego inhibitorowego receptora FcγRIIb. Te korzystne przykłady wykonania są przewidziane w celu zapewnienia przeciwciała o zwiększonych właściwościach terapeutycznych u ludzi, na przykład ulepszonej funkcji efektorowej i zwiększonej sile działania przeciwrakowego. Przeciwciała są optymalizowane w celu mają zmniejszenia lub usunięcia powinowactwa do ludzkiego FcγR, w tym bez ograniczania do wymienionych, FcγRI, FcγRIIa, FcγRIIb, FcγRIIc, FcγRIIIa, oraz FcγRIIIb. Te przykłady wykonania są przewidziane w celu zapewnienia przeciwciała o zwiększonych właściwościach terapeutycznych u ludzi, na przykład zmniejszonej funkcji efektorowej i zmniejszonej toksyczności. Przeciwciała zapewniają zwiększone powinowactwo do jednej lub większej liczby FcγRs, jeszcze zmniejszone powinowactwo do jednego lub większej liczby innych FcγRs. Na przykład, przeciwciało moŝe mieć zwiększone wiązanie do FcγRIIIa, a mimio to zmniejszone wiązanie do FcγRIIb. Alternatywnie, przeciwciało moŝe mieć zwiększone wiązanie do FcγRIIa i FcγRI, a mimio to zmniejszone wiązanie do FcγRIIb. W jeszcze innym przykładzie wykonania, przeciwciało moŝe mieć zwiększone powinowactwo do FcγRIIb, a mimi to zmniejszone powinowactwo do jednego lub większej liczby aktywujących FcγR. [0120] Modyfikacja korzystnie zwiększa powinowactwo wiązania do jednego lub większej liczby FcγRs. Przez większe powinowactwo lub ulepszone powinowactwo lub zwiększone powinowactwo lub lepsze powinowactwo niŝ macierzysta immunoglobulina, stosowane w niniejszym opisie rozumie się, Ŝe wariant Fc wiąŝe się do receptora Fc ze znacznie wyŝszą stała równowagi asocjacji (KA) lub niŝszą stałą równowagi dysocjacji (KD) niŝ macierzysty polipeptyd, gdy ilości wariantowego i macierzystego polipeptydu w teście wiązania są zasadniczo takie same. Na przykład, wariant Fc o ulepszonym powinowactwie wiązania FcγR moŝe stanowić od około krotnego do około 00 krotnego, np. od około krotnego do około 00 krotnego ulepszenia powinowactwa wiązania receptora Fc w po-

49 1 20 2 30 3 równaniu do macierzystego polipeptydu, przy czym powinowactwo wiązania receptora Fc określa się, na przykład, jak ujawniono załączonych Przykładach. W związku z tym, przez zmniejszone powinowactwo w porównaniu do macierzystego polipeptydu Fc, stosowane w niniejszym opisie rozumie się, Ŝe wariant Fc wiąŝe receptor Fc ze znacznie niŝszą KA lub wyŝszą KD niŝ macierzysty polipeptyd. [0121] Dane w niniejszym badania wskazują, Ŝe ludzka WT IgG1 wiąŝe się do ludzkiego V18 FcγRIIIa z powinowactwem około 240 nm (Przykład 1). Jest to zgodne z literaturą, która wskazuje, Ŝe wiązanie to wynosi około 200-00 nm, oznaczone przez Biacore (2 nm jak pokazano w Okazaki et al, 2004, J Mol Bio 336:1239-49; 20 nm jak pokazano w Lazar et al, Proc Natl Acad Sci USA 1,03(11):400-40) i kalorymetrią (30 nm, Okazaki et al, 2004, J Mol Bio 336:1239-49). Jednak powinowactwo tak niskie, jak 70 nm zmierzono w jednym z badań (Ferrara i współpr., 2006, J Biol Chem 281 (8):032-036). ChociaŜ wiązanie do F18 FcγRIIIa było niŝsze niŝ um odcięcie stosowane w niniejszym badaniu, literatura wskazuje, Ŝe ludzki WT IgG1 wiąŝe się do ludzkiego F18 FcγRIIIa z powinowactwem około 3- um, co wskazała kalorymetria (2.7 um, w Okazaki et al, 2004, J Mol Bio 336:1239-49) i Biacore (.0 um, Ferrara i współpr., 2006, J Biol Chem 281(8):032-036). [0122] Przeciwciała mogą zawierać optymalizację wiązania Fc do ludzkiego FcγR, jednakŝe alternatywnie przeciwciała mogą posiadać zwiększone lub zmniejszone powinowactwo do FcγRs od nieludzkich organizmów, w tym bez ograniczania do wymienionych, gryzonii i naczelnych poza człowiekiem. Przeciwciała, które są zoptymalizowane do wiązania do FcγR poza człowieczym mogą znaleźć zastosowanie w doświadczeniach. Na przykład, modele mysie są dostępne dla szerokiego zakresu chorób, które umoŝliwiają badanie właściwości takich, jak skuteczność, toksyczności i farmakokinetyka dla danego kandydata leku. Jak to jest znane w dziedzinie, komórki rakowe moŝna przeszczepiać lub wstrzykiwać myszom aby naśladować ludzkiego raka, proces określany jako ksenografting. Badanie przeciwciała, które obejmuje przeciwciała zoptymalizowane do jednego lub większej liczby mysich FcγRs, moŝe dostarczyć cennych informacji w zakresie skuteczności białka, mechanizmu jego działania, oraz podobnych. Przeciwciała mogą być zoptymalizowane w celu zwiększenia funkcjonalności i/lub właściwości rozpuszczania w aglikozylowanej formie. Aglikozylowane przeciwciała wiąŝą ligand Fc z większym powinowactwem, niŝ aglikozylowana forma macierzystego przeciwciała. Wymienione ligandy Fc obejmują, bez ograniczania do wymienionych, FcγRs, C1q, FcRn, oraz białka A i G, oraz mogą pochodzić z dowolnego źródła w tym bez ograniczania do wymienionych, człowieka, myszy, szczura, królika lub małpy, korzystnie człowieka. Przeciwciała mogą być zop-

0 1 20 2 30 3 tymalizowane, aby być bardziej stabilne i/lub lepiej rozpuszczalne, niŝ aglikozylowane formy macierzystego przeciwciała. [0123] Przeciwciała mogą zawierać modyfikacje, które modulują interakcje z ligandami Fc innymi niŝ FcγRs, w tym bez ograniczania do wymienionych, białkiem dopełniacza, FcRn, oraz homologami receptora Fc (FcRHs). FcRHs obejmują, bez ograniczania do wymienionych, FcRH1, FcRH2, FcRH3, FcRH4, FcRH, oraz FcRH6 (Davis i współpr., 2002, Immunol. Reviews 190:123-136). [0124] Korzystnie, specyficzność ligandu Fc przeciwciała będzie określać jego uŝyteczność terapeutyczną. UŜyteczność danego przeciwciała do celów terapeutycznych będzie zaleŝała od epitopu lub formy docelowego antygenu i leczonej choroby lub wskazania. Dla niektórych celów i wskazań, mogą być korzystne wzmocnione funkcje efektorowe mediowane FcγR. MoŜe to być szczególnie korzystne dla przeciwciał antyrakowych. Zatem moŝna stosować przeciwciała obejmujące przeciwciała, które zapewniają zwiększone powinowactwo dla aktywujących FcγRs i/lub zmniejszone powinowactwo hamujących FcγRs. Dla niektórych celów i wskazań, moŝe być ponadto korzystne, aby wykorzystać przeciwciała, które zapewniają selektywność róŝnicową dla róŝnych aktywujących FcγRs; na przykład, w niektórych przypadkach moŝe być poŝądane zwiększone wiązanie do FcγRIIa i FcγRIIIa, ale nie do FcγRI, podczas gdy w innych przypadkach moŝe być korzystne zwiększone wiązanie do FcγRIIa. Dla określonych celów i wskazań, korzystne moŝe być, aby wykorzystać przeciwciała, które wzmacniają funkcję efektorową mediowaną FcγR i dopełniaczem, przy czym dla innych przypadków korzystne moŝe być, aby wykorzystać przeciwciała, które wzmacniają albo funkcje efektorowe mediowane FcγR, albo mediowana dopełniaczem. Dla niektórych celów lub wskazań raka, korzystne moŝe być, aby zmniejszać lub wyeliminować jedną lub większą liczbę funkcji efektorowych, na przykład przez usunięcie wiązania C1q, jednego lub większej liczby FcγR, FcRn, lub jednego lub większej liczby innych ligandów Fc. Dla innych celów i wskazań, korzystne moŝe być, aby wykorzystać przeciwciała, które zapewniają zwiększone wiązanie do hamujących FcγRIIb, a mimo to poziom WT, zmniejszał lub eliminował wiązanie do aktywujących FcγRs. MoŜe to być szczególnie uŝyteczne, na przykład, gdy celem przeciwciała jest hamowanie zapalenia lub choroby autoimmunologicznej, lub modulacji układu odpornościowego, w pewien sposób. [012] Oczywiście waŝny parametr, który określa najbardziej korzystną selektywność danego przeciwciała do leczenia danej choroby, stanowi kontekst przeciwciała, co oznacza, jaki typ przeciwciała jest uŝywany. Zatem selektywność lub specyficzność ligandu Fc danego przeciwciała zapewni róŝne właściwości zaleŝnie od tego, czy składa się on z prze-

1 1 20 2 30 3 ciwciała, czy przeciwciała ze sprzęŝonym partnerem fuzyjnym lub koniugatowym. Na przykład, koniugaty toksyn, radionuklidów lub inne koniugaty mogą być mniej toksyczne w stosunku do zdrowych komórek, jeśli przeciwciało, które je zawiera zmniejszyło lub wyeliminowało wiązanie do jednego lub większej liczby ligandów Fc. Jako inny przykład, w celu zahamowania zapalenia lub choroby autoimmunologicznej, korzystne moŝe być, aby wykorzystać przeciwciało o zwiększonym powinowactwie dla aktywujących FcγRs takim, aby wiązać te FcγRs i zapobiegać ich aktywacji. Natomiast, przeciwciało, które zawiera dwa lub więcej regionów Fc o zwiększonym powinowactwie FcγRIIb moŝe anga- Ŝować razem ten receptor na powierzchni komórki odpornościowej, tym samym hamując proliferację tych komórek. Podczas gdy w niektórych przypadkach przeciwciała mogą angaŝować swój docelowy antygen na jednym typie komórek, ponadto angaŝować FcγRs na innych komórkach z docelowego antygenu, w innych przypadkach korzystne moŝe być, aby angaŝować FcγRs na powierzchni tych samych komórek, co docelowy antygen. Na przykład, jeśli przeciwciało jest ukierunkowane na antygen na komórce, która równieŝ eksprymuje jeden lub większą liczbę FcγRs, korzystnym moŝe być, aby wykorzystać przeciwciała, które wzmacniają lub zmniejszają wiązanie do FcγRs na powierzchni tej komórki. MoŜe to mieć miejsce w przypadku, na przykład, gdy przeciwciało jest stosowane jako środek przeciwrakowy i wspólne zaangaŝowanie docelowego antygenu i FcγR na powierzchni tej samej komórki promuje zdarzenia sygnalizacyjne w tej komórce, które powodują wzrost hamowania, apoptozy, lub innego działania anty-proliferacyjnego. Alternatywnie, angaŝowane wspólnie antygenu i FcγR na tej samej komórce moŝe być korzystne gdy przeciwciało jest wykorzystywany do modulacji układu odpornościowego w jakiś sposób, przy czym wspólne angaŝowanie docelowego antygenu i FcγR zapewnia pewne działanie proliferacyjne lub antyproliferacyjne. Podobnie, przeciwciała, które zawierają dwa lub więcej regionów Fc mogą korzystać z przeciwciał, które modulują selektywność lub specyficzność FcγR do wspólnego angaŝowania FcγRs na powierzchni tej samej komórki. [0126] Opisana tu specyficzność ligandu Fc przeciwciała moŝe być modulowana do tworzenia róŝnych profilu funkcji efektorowych, które mogą być odpowiednie do poszczególnych epitopów antygenu, wskazań lub populacji pacjentów. Figura opisuje kilka korzystnych przykładów wykonania profili wiązania receptora, które obejmują ulepszenie, zmniejszenie lub brak wpływu na wiązanie róŝnych receptorów, jeŝeli zmiany te mogą być korzystne w pewnych kontekstach. Profile wiązania receptora na Figurze mogą być zmienione o stopień zwiększenia lub zmniejszenia do określonych receptorów. Ponadto, określone zmiany wiązania mogą wystąpić w kontekście dodatkowych zmian wiązania innych receptorów takich, jak C1q lub FcRn, na przykład, przez połączenie z wyeliminowa-

2 1 20 2 30 3 niem wiązania do C1q w celu wyłączenia aktywacji dopełniacza lub przez połączenie ze zwiększeniem wiązania do C1 q w celu zwiększenia aktywacji dopełniacza. Inne przykłady wykonania z innymi profilami wiązania receptora są moŝliwe, wymienione profile wiązania receptora są przykładowe. [0127] Obecność róŝnych postaci polimorficznych FcγRs stanowi kolejny parametr, który wpływa na uŝyteczność terapeutyczną opisanego tu przeciwciała. Podczas gdy specyficzność i selektywność danego przeciwciała dla róŝnych klas FcγRs znacząco wpływa na zdolność przeciwciała do ukierunkowania na dany antygen do leczenia danej choroby, specyficzność lub selektywność przeciwciała dla róŝnych postaci polimorficznych tych receptorów moŝe po części określać, które badania lub doświadczenia przedkliniczne mogą być odpowiednie do badania, oraz ostatecznie, które populacje pacjentów mogą odpowiadać lub mogą nie odpowiadać na leczenie. Zatem specyficzność lub selektywność przeciwciała do polimorfizmów ligandu Fc, w tym bez ograniczania do wymienionych, polimorfizmów FcγR, C1q, FcRn, oraz FcRH, moŝe być stosowane do kierowania wyboru prawidłowych badań i doświadczeń przedklinicznych, projektowania badań klinicznych, wyboru pacjenta, zaleŝności dawkowania, i/lub innych aspektów badań klinicznych. Inne modyfikacje [0128] Opisane tu przeciwciała mogą zawierać jedną lub większą liczbę modyfikacji, które zapewniają zoptymalizowane właściwości, które nie są szczególnie związane z funkcją efektorową per se. Wymienione modyfikacje mogą być modyfikacjami aminokwasów, lub mogą być modyfikacjami, których dokonuje się enzymatycznie lub chemicznie. Taka modyfikacja (takie modyfikacje) moŝe (mogą) zapewnić pewną poprawę w przeciwciele, na przykład zwiększenie jego stabilności, rozpuszczalności, funkcji, lub zastosowania klinicznego. MoŜliwe jest wiele ulepszeń, które mogą być wykonane przez połączenie opisanego tu przeciwciała z dodatkowymi modyfikacjami. [0129] Region zmienny przeciwciała moŝe mieć dojrzałe powinowactwo, oznacza to, Ŝe modyfikacje aminokwasów wykonano w domenach VH i/lub VL przeciwciała w celu zwiększenia wiązania przeciwciała do jego docelowego antygenu. Takie typy modyfikacji mogą polepszać kinetykę asocjacji i/lub dysocjacji dla wiązania docelowego antygenu. Inne modyfikacje obejmują te, które polepszają selektywność dla docelowego antygenu vs. alternatywne cele. Te obejmują modyfikacje, które polepszają selektywność dla antygenu eksprymowanego na celu vs. komórki niedocelowe. Inne ulepszenia dla poprawy właściwości rozpoznawania celu moŝna zapewnić przez dodatkowe modyfikacje. Takie właściwości mogą obejmować, bez ograniczania do wymienionych, specyficzne właściwości kinetyczne (tj. kinetyki asocjacji i dysocjacji), selektywność dla określonego celu versus al-

3 1 20 2 30 3 ternatywne cele, oraz selektywność dla specyficznej formy celu versus alternatywne formy. Przykłady obejmują warianty pełnej długości versus warianty łączone, formy na powierzchni komórki vs. rozpuszczalne, selektywność dla róŝnych wariantów polimorficznych, lub selektywność dla specyficznych form konformacyjnych docelowego antygenu. [0130] Opisane tu przeciwciała mogą zawierać jedną lub większą liczbę modyfikacji, które zapewniają zmniejszoną lub zwiększoną internalizację przeciwciała. Przeciwciała mogą być wykorzystywane lub łączone z dodatkowymi modyfikacjami w celu zmniejszenia internalizacji komórkowej przeciwciała, która następuje przez oddziaływanie z jednym lub większą liczbą ligandów Fc. MoŜna oczekiwać, Ŝe ta właściwość zwiększy funkcję efektorową, oraz potencjalnie zmniejszy immunogenność przeciwciała według niniejszego wynalazku. Alternatywnie, przeciwciała moŝna wykorzystywać bezpośrednio lub łączyć z dodatkowymi modyfikacje w celu zwiększenia internalizacji komórkowej przeciwciała, która następuje przez oddziaływanie z jednym lub większą liczbą ligandów Fc. Na przykład, stosowane jest przeciwciało, które zapewni zwiększone wiązanie do FcγRI, który jest eksprymowany na komórkach dendrytycznych i aktywuje wczesną odpowiedź immunologiczną. Strategia ta moŝe być wzmocniona przez połączenie z dodatkowymi modyfikacjami, albo w przeciwciele, albo w załączonej fuzji lub partnerze koniugacyjnym, które rozpoznają i prezentują fragmenty peptydu Fc przez cząsteczki MHC. Oczekuje się, Ŝe te strategie wzmocnią przetwarzanie docelowy antygen i tym samym ulepszą antygenność docelowego antygenu (Bonnerot i Amigorena, 1999, Immunol Rev. 172:279-84), promując adaptacyjną odpowiedź immunologiczną i większe uśmiercanie komórki docelowej przez ludzki układ odpornościowy. Strategie te mogą być szczególnie korzystne, gdy docelowy antygen jest uwalniany z powierzchni komórkowej. Dodatkowe zastosowanie tych pojęć wynika z immunoterapii szczepionką antyidiotypową, w której przeciwciała specyficzne dla klonu wytwarzane przez komórki chłoniaka pacjenta stosuje się do szczepienia pacjenta. [0131] Modyfikacje wykonuje się w celu poprawy właściwości biofizycznych przeciwciała, w tym bez ograniczania do wymienionych, stabilności, rozpuszczalności, oraz stanu oligomerycznego. Modyfikacje mogą obejmować, na przykład, podstawienia, które zapewniają bardziej korzystne oddziaływania wewnątrzcząsteczkowe w przeciwciele takie, jak te mające na celu zapewnienie większej stabilności, lub podstawienie wyeksponowanych niepolarnych aminokwasów polarnymi aminokwasami dla wyŝszej rozpuszczalności. Wiele celów i metod optymalizacji opisano w US 2004/01226, które mogą znaleźć zastosowanie dla inŝynierii dodatkowych modyfikacji w celu dalszej optymalizacji przeciwciała. Przeciwciała moŝna równieŝ łączyć z dodatkowymi modyfikacjami, które zmniejsza-

4 1 20 2 30 3 ją stan oligomeryczny lub rozmiar, tak, Ŝe zwiększa się penetracja guza, lub zwiększa się szybkość klirensu in vivo, jeśli jest to poŝądane. [0132] Inne modyfikacje przeciwciał obejmują te, które umoŝliwiają specyficzne tworzenie homodimerycznych lub homomultimerycznych cząsteczek. Takie modyfikacje obejmują, bez ograniczania do wymienionych, dwusiarczki wprowadzone inŝynierią, jak i modyfikacje chemiczne lub sposoby agregacji, które mogą zapewnić mechanizm dla generowania kowalencyjnych homodimerów lub homomultimerów. Na przykład, sposoby inŝynierii i kompozycje takich cząsteczek są opisane w Kan i współpr., 2001, J. Immunol., 2001, 166: 1320-1326; Stevenson i współpr., 2002, Recent Results Cancer Res. 19: 4-12; US,681,66; Caron i współpr., 1992, J. Exp. Med. 176:1191-119, oraz Shopes, 1992, J. Immunol. 148(9):2918-22. Dodatkowe modyfikacje wariantów obejmują te, które umoŝliwiają specyficzne tworzenie heterodimerycznych, heteromultimetycznych, bifunkcjonalnych, i/lub multifunkcjonalnych cząsteczek. Takie modyfikacje obejmują, bez ograniczania do wymienionych, jedno lub większą liczbę podstawień aminokwasów w domenie CH3, w której podstawienia zmniejszają tworzenie homodimeru i zwiększają tworzenie heterodimeru. Na przykład, sposoby inŝynierii i kompozycje takich cząsteczek są opisane w Atwell i współpr., 1997, J. Mol. Biol. 270(1): 26-3, oraz Carter i współpr., 2001, J. Immunol. Methods 248:7-1. Dodatkowe modyfikacje obejmują modyfikacje w zawiasie i domenie CH3, w których modyfikacje zmniejszają skłonności do tworzenia dimerów. [0133] Opisane tu przeciwciała mogą zawierać modyfikacje, które usuwają miejsca degradacji proteolitycznej. Mogą one obejmować, na przykład, miejsca proteazy, które zmniejszają wydajność produkcji, jak i miejsca proteazy, które powodują degradację podanego białka in vivo. Wykonuje się dodatkowe modyfikacje w celu usunięcia miejsc degradacji kowalencyjnej takiej, jak deamidowania (tj. deamidowania reszty glutaminylowej i asparaginylowej do odpowiedniej reszty glutamylowej i aspartylowej), utleniania, oraz miejsc degradacji proteolitycznej. Miejsca deamidowania, szczególnie uŝyteczne do usunięcia, są tymi, które mają zwiększoną skłonność do deamidowania, w tym, bez ograniczania do wymienionych, reszt asparaginylowej i gltuamylowej, po których występuje glicyna (motywy odpowiednio NG i QG). W takich przypadkach, podstawienie którejkolwiek reszty moŝe znacznie zmniejszyć tendencję deamidowania. Typowe miejsca utleniania obejmują reszty metioniny i cysteiny. Inne kowalencyjne modyfikacje, które moŝna wprowadzić bądź usunąć, obejmują hydroksylowanie proliny i lizyny, fosforylację grup hydroksylowych reszty serylowej lub treonylowej, metylowanie -grup aminowych lizyny, argininy, oraz łańcuchów bocznych histydyny (T.E. Creighton, Białka: Structure i Molecular Properties, W.H. Freeman & Co., San Francisco, pp. 79-86 (1983)), acetylowanie N-końcowej

1 20 2 30 3 aminy, oraz amidowanie C-końcowej grupy karboksylowej. Dodatkowe modyfikacje mogą równieŝ obejmować, bez ograniczania do wymienionych, modyfikacje posttranslacyjne takie, jak glikozylacja i fosforylacja N-połączona lub O-połączona. [0134] Modyfikacje mogą obejmować te, które zwiększają wydajności ekspresji i/lub oczyszczania z gospodarza lub komórek gospodarza, stosowanych do produkcji środków biologicznych. Obejmują one, bez ograniczania do wymienionych, róŝne linie komórkowe ssaków (np. CHO), linie komórek droŝdŝy, linie komórek bakteryjnych, oraz rośliny. Dodatkowe modyfikacje obejmują modyfikacje, które usuwają lub zmniejszają zdolność cięŝkiego łańcucha do tworzenia międzyłańcuchowych wiązań dwusiarczkowych. Dodatkowe modyfikacje obejmują modyfikacje, które usuwają lub zmniejszają zdolność cięŝkiego łańcucha do tworzenia wewnątrzłańcuchowych wiązań dwusiarczkowych. [013] Przeciwciała mogą zawierać modyfikacje, które obejmują zastosowanie nienaturalnych aminokwasów wprowadzonych przy uŝyciu, na przykład, technologii opracowanych przez Schultz i współpracowników, w tym bez ograniczania do wymienionych, sposoby opisane przez Cropp & Shultz, 2004, Trends Genet. 20(12):62-30, Anderson i współpr., 2004, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 1(2):766-71, Zhang i współpr., 2003, 303(66):371-3, oraz Chin i współpr., 2003, Science 301(63):964-7. Te modyfikacje umoŝliwiają manipulację róŝnych właściwości funkcjonalnych, biofizycznych, immunologicznych, lub wytwarzania omówionych powyŝej. Te modyfikacje umoŝliwiają dodatkowe modyfikacje chemiczne w innych celach. Inne modyfikacje są tu rozwaŝane. Na przykład, przeciwciało według niniejszego wynalazku moŝe być przyłączone do jednego z wielu polimerów niebiałkowych, np. glikolu polietylenowego (PEG), glikolu polipropylenowego, polioksyalkilenów, lub kopolimerów glikolu polietylenowego i glikolu polipropylenowego. MoŜna wykonać dodatkowe modyfikacje aminokwasów w celu umoŝliwienia specyficznych lub niespecyficznych chemicznych lub posttranslacyjnych modyfikacji przeciwciał. Takie modyfikacje, obejmują, bez ograniczania do wymienionych PEGowanie i glikozylację. Specyficzne podstawienia, które moŝna wykorzystać w celu umoŝliwienia PE- Gylowania obejmują, bez ograniczania do wymienionych, wprowadzenie nowej reszty cysteiny lub nienaturalnych aminokwasów w taki sposób, Ŝe moŝna wykorzystać skuteczne i specyficzne reakcje chemiczne sprzęgania do podłączenia PEG lub innej cząsteczki polimeru. Wprowadzenie miejsc specyficznej glikozylacji moŝna osiągnąć przez wprowadzanie nowych sekwencji N-X-T/S do przeciwciała. [0136] Kowalencyjne modyfikacje przeciwciała według niniejszego wynalazku mogą być dokonane po translacji. Na przykład, kilka typów modyfikacji kowalencyjnej przeciwciała wprowadza się do cząsteczki przez poddanie reakcji specyficznej reszty aminokwasu z or-

6 1 20 2 30 3 ganicznym środkiem derywatyzującym, który jest w stanie reagować z wybranymi łańcuchami bocznymi lub N- lub C-końcowymi resztami. [0137] Kowalencyjne modyfikacje przeciwciała według niniejszego wynalazku mogą obejmować dodanie jednego lub większej liczby znaczników. Określenie grupa znakująca oznacza dowolny wykrywalny znacznik. Grupa znakująca moŝe być związana do przeciwciała przez ramiona spejsera o róŝnej długości w celu zmniejszenia moŝliwej zawady sterycznej. W dziedzinie znane są róŝne sposoby znakowania białka i mogą być wykorzystane w wykonywaniu niniejszego wynalazku. Generalnie znaczniki dzielą się na róŝne klasy zaleŝnie od testu, w którym mają one być wykryte: a) znaczniki izotopowe, które mogą być izotopami radioaktywnymi lub cięŝkimi; b) znaczniki magnetyczne (np. cząstki magnetyczne); c) cząsteczki aktywne redoks; d) optyczne barwniki; grupy enzymatyczne (np. Peroksydaza chrzanowa, β-galaktozydaza, lucyferaza, fosfataza alkaliczna); e) biotynylowane grupy; i f) wcześniej określone epitopy polipeptydowe rozpoznawane przez reportera drugorzędowego (np. sekwencje par zamka leucynowego, miejsca wiązania drugorzędowego przeciwciała, domeny wiąŝące metal, tagi epitopowe, itd.). Grupa znakująca moŝe być związana do przeciwciała przez ramiona spejsera o róŝnej długości w celu zmniejszenia moŝliwej zawady sterycznej. W dziedzinie znane są róŝne sposoby znakowania białka i mogą być wykorzystane w wykonywaniu niniejszego wynalazku. Specyficzny znaczniki obejmują barwniki optyczne, w tym, bez ograniczania do wymienionych, chromofory, fosfory i fluorofory, przy czym te ostatnie są specyficzne w wielu przypadkach. Flurofory mogą być albo fluoroforami o małej cząsteczce, lub fluorofortami białkowymi. Przez znacznik fluorescencyjny oznacza dowolną cząsteczkę, która moŝe być wykryta przez jego wewnętrzne właściwości fluorescencyjne. Fuzje i koniugaty przeciwciał [0138] Przeciwciała według niniejszego wynalazku mogą być białkami fuzyjnymi przeciwciał, czasem określanymi tu jako koniugaty przeciwciał. Partner fuzji lub partner koniugatu moŝe być białkowy lub niebiałkowy; te ostatnie zazwyczaj są generowane przy uŝyciu grup funkcyjnych na przeciwciele i na partnerze koniugatu. Partnerzy koniugatu i fuzji mogą być dowolną cząsteczką, w tym związkiem chemicznym małocząsteczkowym i polipeptydem. Na przykład, róŝne koniugaty przeciwciał i sposoby są opisane w Trail i współpr., 1999, Curr. Opin. Immunol. 11:84-88. MoŜliwi partnerzy koniugatu obejmują, bez ograniczania do wymienionych, cytokiny, środki cytotoksyczne, toksyny, radioizotopy, środki chemioterapeutyczne, środki antyangiogeniczne, inhibitory kinazy tyrozynowej, oraz inne terapeutycznie aktywne środki. Partnerzy koniugatu mogą być bardziej traktowane jako ładunki, oznacza to, Ŝe celem koniugatu jest kierowane dostarczanie partnera

7 1 20 2 30 3 koniugatu do nacelowanej komórki, na przykład komórka raka lub komórka immunologiczna, przez przeciwciało. Zatem, na przykład, koniugacja toksyny do przeciwciała kieruje dostarczanie wymienionej toksyny do komórek eksprymujących docelowy antygen. Jak to będzie zrozumiałe dla znawców w tej dziedzinie techniki, w rzeczywistości pojęcia i definicje fuzji i koniugatu pokrywają się. Wskazanie przeciwciała jako fuzji lub koniugatu nie ma na celu ograniczanie jej do jakiegokolwiek określonego przykładu wykonania według niniejszego wynalazku. Przeciwnie, terminy te są uŝywane swobodnie w celu przekazania szerokiego konceptu, Ŝe jakiekolwiek przeciwciało według niniejszego wynalazku moŝe być połączone genetycznie, chemicznie, lub jakkolwkiej inaczej, do jednego lub większej liczby polipeptydów lub cząsteczek aby zapewnić pewne poŝądane właściwości. [0139] Odpowiednie koniugaty obejmują, bez ograniczania do wymienionych, znaczniki, jak opisano poniŝej, leki i środki cytotoksyczne w tym, bez ograniczania do wymienionych, leki cytotoksyczne (np. środki chemioterapeutyczne) lub toksyny lub aktywne fragmenty takich toksyn. Odpowiednie toksyny i ich odpowiadające fragmenty obejmują łańcuch A błonicy, łańcuch A egzotoksyny, łańcuch A rycyny, łańcuch A abryny, kurcyna, krotyna, fenomycyna, enomycyna i podobne. Środki cytotoksyczne równieŝ obejmuje związki radioznakowane wytworzone przez koniugację radioizotopów do przeciwciał, lub wiązanie radionuklidu do środka chelatującego, który przyłączono kowalencyjnie do przeciwciała. Dodatkowe przykłady wykonania wykorzystują kalicheamicynę, auristatyny, geldanamycynę, majtanzynę, oraz duokarmycyny i analogi; dla tych ostatnich patrz U.S. 2003/000331. [0140] Przeciwciała według niniejszego wynalazku mogą być zfuzjowane lub skoniugowane do cytokin. Przez cytokinę stosowaną w niniejszym opisie rozumie się ogólne określenie dla białek uwalnianych przez jedną populację komórek, które działają na inną komórkę jako mediatory międzykomórkowe. Na przykład, jak opisano w Penichet i współpr., 2001, J. Immunol. Methods 248:91-1, cytokiny mogą być zfuzjowane to przeciwciała aby zapewnić szereg poŝądanych właściwości. Przykładami takich cytokin są limfokiny, monokiny i tradycyjne hormony polipeptydowe. Do cytokin włączone są hormony wzrostu takie, jak ludzki hormon wzrostu, N-metionylowy ludzki hormon wzrostu oraz bydlęcy hormon wzrostu; hormon przytarczyc; tyroksyna; insulina; proinsulina; relaksyna; prorelaksyna; hormony glikoproteinowe takie, jak hormon folikulotropowy (FSH), hormon tyreotropowy (TSH), oraz hormon luteinizujący (LH); wątrobowy czynnik wzrostowy; czynnik wzrostu fibroblastów; prolaktyna; laktogen łoŝyskowy; czynnik martwicy nowotworu alfa i beta; substancja hamująca Mullera; mysi peptyd związany z gonadotropiną; inhibina; aktywina; czynnik wzrostu śródbłonka naczyniowego; integryna; trombopoetyna

8 1 20 2 30 3 (TPO); czynniki wzrostu nerwów, taki jak NGF-beta; czynnik wzrostu płytek; transformujące czynniki wzrostu (TGF), takie jak TGF-alfa i TGF-beta; insulinopodobny czynnik wzrostu I i II; erytropoetyna (EPO); czynniki indukcyjne kości; interferony takie, jak interferon-alfa, beta, oraz -gamma; czynniki pobudzające wzrost kolonii (CSF), takie jak makrofagi-csf (M-CSF); granulocyt-makrofag-csf (GM-CSF); i granulocyt-csf (G-CSF); interleukiny (ILs) takie, jak IL-1, IL-l-alfa, IL-2, IL-3, IL-4, IL-, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-, IL-11, IL-12; IL-1, czynnik martwicy nowotworu taki, jak TNF-alfa lub TNF-beta; Ca; i inne czynniki polipeptydowe w tym LIF i ligand kit (KL). W stosowanym tu kontekście, określenie cytokina obejmuje białka z naturalnych źródeł lub rekombinowanych kultur komórkowych, oraz biologicznie aktywne równowaŝniki cytokin natywnych sekwencji. [0141] Przeciwciała według niniejszego wynalazku mogą być zfuzjowane, skoniugowane, lub połączone funkcjonalnie do toksyny, w tym bez ograniczania do wymienionych, małocząsteczkowych toksyn i enzymatycznie aktywnych toksyn pochodzenia bakteryjnego, grzybowego, roślinnego lub zwierzęcego, w tym ich fragmentów i/lub wariantów. Na przykład, róŝne immunotoksyny i sposoby dla immunotoksyn są opisane w Thrush i współpr., 1996, Ann. Rev. Immunol. 14:49-71. Toksyny małocząsteczkowe obejmują, bez ograniczania do wymienionych, kalicheamicynę, majtanzynę (US,208,020), trichoten, oraz CC6. Przeciwciało według niniejszego wynalazku moŝe być skoniugowane do jednej lub większej liczby cząsteczek majtanzyny (np. około 1 do około cząsteczek majtanzyny na cząsteczkę przeciwciała). Majtanzyna moŝe, na przykład, być przekształcona w May-SS-Me, która moŝe być zredukowana do May-SH3 i poddana reakcji z modyfikowanych przeciwciałem (Chari i współpr., 1992, Cancer Research 2: 127-131) w celu wytworzenia koniugatu majtansynoid-przeciwciało. Inny koniugat będący przedmiotem zainteresowania zawiera przeciwciało skoniugowane do jednej lub większej liczby cząsteczek kalicheamicyny. Rodzina kalicheamicyn antybiotyków jest w stanie wytworzyć podziały dwuniciowego DNA w stęŝeniach sub-pikomolarnym. Strukturalne analogi kalicheamicyny, które moŝna uŝyć, obejmują, bez ograniczania do wymienionych, y 1 1, α 1 2, α 1 3, N- acetylo-γ 1 1, PSAG, oraz θ 1 1, (Hinman i współpr., 1993, Cancer Research 3:3336-3342; Lode i współpr., 1998, Cancer Research 8:292-2928) (US,714,86; US,712,374; US,264,86; US,773,001). Analogi dolastatyny takie, jak auristatyna E (AE) i monometyloauristatyna E (MMAE) mogą znaleźć zastosowanie jako koniugaty dla przeciwciał według niniejszego wynalazku (Doronina i współpr., 2003, Nat Biotechnol 21(7):778-84; Francisco i współpr., 2003 Blood 2(4):148-6). UŜyteczne enzymatycznie aktywne toksyny obejmują, bez ograniczania do wymienionych, łańcuch A błonicy, niewiąŝące ak-

9 1 20 2 30 3 tywne fragmenty toksyny błonicy, łańcuch A egzotoksyny (z Pseudomonas aeruginosa), łańcuch A rycyny, łańcuch A abryny, łańcuch A modekcyny, alfa-sarcyna, białka Aleurites fordii, białka diantynowe, białka Phytolaca americana (PAPI, PAPII, oraz PAP-S), inhibitor z balsamki ogórkowatej, kurcyna, krotyna, inhibitor z Saponaria officinalis, gelonina, mitogellina, restryktocyna, fenomycyna, enomycyna i tricoteceny. Patrz, na przykład, PCT WO 93/21232. MoŜe być równieŝ rozwaŝany koniugat między przeciwciałem według niniejszego wynalazku i związkiem o aktywności nukleolitycznej, na przykład rybonukleazą lub endonukleazą DNA taką, jak deoksyrybonukleaza (Dnase). [0142] Przeciwciało według niniejszego wynalazku moŝe być zfuzjowane, skoniugowane, lub połączone funkcjonalnie do radioizotopu tworząc radiokoniugat. Dostępnych jest wiele izotopów radioaktywnych do produkcji radiokoniugatu przeciwciał. Przykłady obejmują, bez ograniczania do wymienionych, At211, I131, I12, Y90, Re186, Re188, Sm13, Bi212, P32, oraz radioaktywne izotopy Lu. [0143] Przeciwciało według niniejszego wynalazku moŝe być skoniugowane do receptora (jak streptawidyny) do wykorzystania we wstępnym nakierowaniu guza, przy czym koniugat przeciwciało-receptor podaje się pacjentowi, a następnie usuwa się niezwiązany koniugat z układu krąŝenia stosując środek oczyszczający i następnie podaje się ligand (np. awidyną), która jest skoniugowana ze środkiem cytotoksycznym (np. radionuklidem). Przeciwciało moŝe być skoniugowane lub połączone funkcjonalnie do enzymu w celu wykorzystania terapii prolekiem z enzymem mediowanym przeciwciałem (Antibody Dependent Enzyme Mediated Prodrug Therapy, ADEPT). ADEPT moŝna stosować przez koniugację lub połączenie funkcjonalne przeciwciała do enzymu aktywującego proleki, który przekształca prolek (np. a peptydylowy środek chemioterapeutyczny, patrz PCT WO 81/0114) do aktywnego leku przeciwrakowego. Patrz, na przykład, PCT WO 88/07378 i US 4,97,278. Element enzymatyczny immunokoniugatu uŝyteczny do ADEPT obejmuje dowolny enzym zdolny do działania na proleki w taki sposób, Ŝe przekształca je do ich bardziej aktywnej, cytotoksycznej postaci. Enzymy, które są uŝyteczne w tym sposobie obejmują, bez ograniczania do wymienionych, fosfatazę alkaliczną uŝyteczną do przekształcania proleków zawierających fosforany w wolne leki; arylosulfatazę uŝyteczną do przekształcania proleków zawierających siarczan w wolne leki; deaminazę cytozyny uŝyteczną do przekształcania nietoksycznej - fluorocytozyny w lek anty-rakowy, - fluorouracyl; proteazy takie, jak proteaza Serratia, termolizyna, subtylizyna, karboksypeptidazy i katepsyny (takie, jak katepsyny B i L), które są przydatne do konwersji proleków zawierających peptydy w wolne leki; D-alanylokarboksypeptydazy, przydatne do konwersji proleków zawierających podstawniki D-aminokwasowe; enzymy rozszczepiające wę-

60 1 20 2 30 3 glowodany takie, jak beta-galaktozydaza i neuraminidaza uŝyteczne do konwersji glikozylowanych proleków do wolnych leków; beta-laktamazy przydatne do przekształcania leków derywatyzowanych a-laktamami w wolne leki; i amidazy penicyliny takie, jak amidaza penicyliny V lub amidaza penicyliny G, przydatne do przekształcania leków derywatyzowanych na ich aminowych atomach azotu odpowiednio grupami fenoksyacetylową lub fenyloacetylową w wolne leki. Alternatywnie, przeciwciała o aktywności enzymatycznej, znane w dziedzinie równieŝ jako abzymy, mogą być uŝywane do konwersji proleków w wolne leki aktywne (patrz, na przykład, Massey, 1987, Nature 328: 47-48). Koniugaty przeciwciało-abzym moŝna otrzymać dla dostarczania abzymu do populacji komórek guza. Dla przeciwciał według niniejszego wynalazku moŝna brać pod uwagę róŝne koniugaty. PoniŜej opisane są róŝne środki chemioterapeutyczne, środki antyangiogenne, inhibitory kinazy tyrozynowej, oraz inne środki lecznicze, które mogą znaleźć zastosowanie jako koniugaty przeciwciał. [0144] Jako partnerzy fuzji i koniugatu rozwaŝa się równieŝ polipeptydy Fc. Zatem przeciwciało moŝe być multimerycznym polipeptydem Fc, zawierającym dwa lub więcej regionów Fc. Zaletą takiej cząsteczki jest to, Ŝe zapewnia wiele miejsc wiązania dla receptorów Fc z pojedynczą cząsteczką białka. Regiony Fc mogą być połączone przy zastosowaniu metody inŝynierii chemicznej. Na przykład, Fab s i Fc s mogą być połączone wiązaniami tioeterowymi pochodzącymi z reszty cysteiny w zawiasach, wytwarzając cząsteczki takie, jak FabFc 2. Regiony Fc mogą być połączone za pomocą inŝynierii dwusiarczkowej i/lub chemicznego sieciowania. Regiony Fc mogą być połączone genetycznie. Regiony Fc w przeciwciele są połączone genetycznie w celu wytworzenia tandemowo połączonych regionów Fc jak opisano w US 200/0249723, złoŝony 12/21/2004, zatytułowany Polypeptides Fc with novel ligand Fc binding sites,. Tandemowo połączone polipeptydy Fc mogą zawierać dwa lub więcej regionów Fc, korzystnie jeden do trzech, najbardziej korzystnie dwa regiony Fc. Korzystne moŝe być, aby zbadać wiele konstruktów wykonanych techniką inŝynierii w celu uzyskania homo- lub heterotandemowo połączonych przeciwciał o najbardziej korzystnych właściwościach strukturalnych i funkcjonalnych. Tandemowo połączone przeciwciała mogą być homotandemowo połączonymi przeciwciałami, to znaczy przeciwciało jednego izotypu jest zfuzowane genetycznie do innego przeciwciała tego samego izotypu. Przewiduje się, Ŝe, poniewaŝ istnieje wiele miejsc wiązania FchR, C1q, i/lub FcRn na tandemowo połączonych polipeptydach Fc, moŝna zwiększyć funkcje efektorowe i/lub farmakokinetyki. W alternatywnym przykładzie wykonania, przeciwciała z róŝnych izotypów mogą być tandemowo połączone, określa się je jako hetero-tandemowo połączone przeciwciała. Na przykład, ze względu na zdolności do nakierowywania recep-

61 1 20 2 30 3 torów FcγR i FcαRI, przeciwciało, które wiąŝe zarówno FcγRs i FcαRI moŝe zapewnić znaczące poprawę kliniczną. [014] Obok przeciwciał, białkiem typu przeciwciała, które odgrywa coraz większą rolę w badaniach i terapii, jest fuzja Fc (Chamow i współpr., 1996, Trends Biotechnol 14:2-60; Ashkenazi i współpr., 1997, Curr Opin Immunol 9:19-200). Fuzja Fc w niniejszym tekście oznacza synonim określeń stosowanych w stanie techniki immunoadhezyna, fuzja Ig, chimera Ig, oraz receptor globuliny (czasami z kreseczkami) (Chamow i współpr., 1996, Trends Biotechnol 14:2-60; Ashkenazi i współpr., 1997, Curr Opin Immunol 9:19-200). fuzja Fc jest białkiem, w którym jeden lub większa liczba polipeptydów jest połączona funkcjonalnie do Fc. Fuzja Fc łączy region Fc przeciwciała, oraz tym samym jego korzystne funkcje efektorowe i farmakokinetyki z regionem wiąŝącym cel receptora, liganda lub pewnego innego białka lub domeny białka. Rolą tej ostatniej jest mediowanie w rozpoznawaniu celu oraz wobec tego jest analogiczna funkcjonalnie do regionu zmiennego przeciwciała. Ze względu na strukturalne i funkcjonalne pokrywanie się fuzji Fc z przeciwciałami, dyskusja poświęcona przeciwciałom według niniejszego wynalazku rozszerza się równieŝ do Fc. [0146] Praktycznie dowolne białko lub mała cząsteczka mogą być przyłączone do Fc w celu wytworzenia fuzji Fc. Partnerzy fuzji białkowych mogą obejmować, bez ograniczania do wymienionych, region zmienny dowolnego przeciwciała, region wiąŝący cel receptora, cząsteczkę adhezyjną, ligand, enzym, cytokinę, chemokinę, lub niektóre inne białka lub domeny białka. Małocząsteczkowi partnerzy fuzyjni mogą obejmować dowolny środek leczniczy, który kieruje fuzję Fc do celu terapeutycznego. Takie cele mogą być dowolną cząsteczką, korzystnie receptorem zewnątrzkomórkowym, który jest zaangaŝowany w chorobę. [0147] Partnerzy fuzji i koniugatu mogą być przyłączeni do dowolnego regionu przeciwciała według niniejszego wynalazku, w tym na końcach N- lub C-, lub przy pewnej reszcie pomiędzy końcami. Partner fuzyjny lub koniugatu moŝe być przyłączony przy N- lub C- końcu przeciwciała, najbardziej korzystnie N-końcu. Wiele linkerów moŝe znaleźć zastosowanie w niniejszym wynalazku w celu kowalencyjnego łączenia przeciwciała do partnera fuzyjnego lub koniugatu. Przez linker, sekwencja linkera, spejser, sekwencja wiąŝąca lub ich równowaŝniki gramatyczne, rozumie się tu cząsteczkę lub grupę cząsteczek (np. monomer lub polimer), która łączy dwie cząsteczki i często słuŝy do umieszczenia dwóch cząsteczek w korzystnej konfiguracji. Linkery są znane w dziedzinie; na przykład, homo- lub hetero-bifunkcyjne linkery, które są dobrze znane (patrz, 1994 Pierce Chemical Company catalog, rozdział techniczny dotyczący środków sieciujących, strony

62 1 20 2 30 3 1-200). Wiele strategii moŝe być wykorzystanych do łączenia kowalencyjnego cząsteczek. Obejmują one, bez ograniczania do wymienionych połączenia polipeptydowe między N- i C-końcami białka lub domenami białka, połączenie wiązaniami dwusiarczkowymi, oraz połączenie poprzez chemiczne odczynniki sieciujące. W jednym przykładzie wykonania tego aspektu, linker jest wiązanie peptydowe, wygenerowane za pomocą technik rekombinacji lub syntezy peptydów. Linker moŝe zawierać reszty aminokwasowe, które zapewniają elastyczność. Zatem, linker peptydowy moŝe przede wszystkim zawierać następujące reszty aminokwasowe: Gly, Ser, Ala, lub Thr. Peptyd łącznikowy powinien mieć długość, która jest odpowiednia do łączenia dwóch cząsteczek w taki sposób, Ŝe te zapewniają poprawną konformację względem siebie taką, Ŝe zachowają one poŝądaną aktywność. Odpowiednie długości do tego celu obejmują przynajmniej jedną i nie więcej niŝ 0 reszt aminokwasu. Korzystnie, linker ma długość około 1 do 30 aminokwasów, przy czym linkery o 1 do 20 aminokwasów długości są najkorzystniejsze. UŜyteczne linkery obejmują docenione przez znawców w dziedzinie polimery glicyna-seryna (w tym, na przykład, (GS) n, (GSGGS) n (GGGGS) n i (GGGS) n, przy czym n jest liczbą całkowitą wynoszącą przynajmniej jeden), polimery glicyno-alaninowe, polimery alanino-serynowe, oraz inne elastyczne linkery.-alternatywnie, róŝne niebiałkowe polimery, w tym bez ograniczania do wymienionych, glikol polietylenowy (PEG), glikol polipropylenowy, polioksyalkileny, lub kopolimery glikolu polietylenowego i glikolu polipropylenowego, mogą znaleźć zastosowanie jako linkery, to znaczy mogą znaleźć zastosowanie w wiązaniu przeciwciała według niniejszego wynalazku do partnera fuzyjnego lub koniugatu, lub w wiązaniu przeciwciała według niniejszego wynalazku do koniugatu. Wytwarzanie przeciwciała [0148] Opisane tu są sposoby wytwarzania i eksperymentalnego badania przeciwciała. Dostarczonego metody są przeznaczone do zilustrowania ogólnie, Ŝe jedno lub większa liczba przeciwciał moŝe być wytworzona i eksperymentalnie zbadana w celu otrzymania wariantu przeciwciała. Ogólne metody dla biologii molekularnej przeciwciał, ekspresji, oczyszczania, oraz skriningu są opisane w Antibody Engineering, pod redakcją Duebel & Kontermann, Springer-Verlag, Heidelberg, 2001; i Hayhurst & Georgiou, 2001, Curr Opin Chem Biol :683-689; Maynard & Georgiou, 2000, Annu Rev Biomed Eng 2:339-76; Antibodies: A Laboratory Manual by Harlow & Lane, New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1988. [0149] Mogą być tworzone kwasy nukleinowe kodujące przeciwciała według niniejszego wynalazku, oraz, które mogą być klonowane do komórek gospodarza, eksprymowane i testowane, jeśli jest to poŝądane. Zatem, mogą być wykonane kwasy nukleinowe, a szcze-

63 1 20 2 30 gólnie DNA, które kodują kaŝdą sekwencję białka. Czynności te są prowadzone za pomocą dobrze znanych procedur. Na przykład, róŝne sposoby, które mogą znaleźć zastosowanie, są opisane w Molecular Cloning - A Laboratory Manual, 3rd Ed. (Maniatis, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, 2001), oraz Current Protocols in Molecular Biology (John Wiley & Sons). Co jest oczywiste dla znawcy w dziedzinie, dokładne wytwarzanie sekwencji dla biblioteki zawierającej wiele sekwencji jest potencjalnie kosztowne i czasochłonne. Przez bibliotekę rozumie się tu zestaw wariantów w kaŝdej postaci, w tym bez ograniczania do wymienionych, wykaz kwasów nukleinowych lub sekwencji aminokwasów, wykaz kwasów nukleinowych lub podstawienie aminokwasów w zmiennych pozycjach, fizyczną bibliotekę zawierającą kwasy nukleinowe, które kodują sekwencje biblioteki lub fizyczną bibliotekę zawierającą warianty białka, albo w oczyszczonej, albo nieoczyszczonej postaci. W związku z tym, istnieje wiele sposobów, które mogą być uŝywane do skutecznego tworzenia bibliotek. Takie sposoby, które mogą znaleźć zastosowanie są opisane lub cytowane w US 6,403,312; US 2002/0048772; US 2002/0090648; US 2003/0130827; PCT WO 01/40091; i PCT WO 02/288. Takie sposoby obejmują, bez ograniczania do wymienionych, sposoby łączenia genów, sposoby oparte na PCR i sposoby, które uŝywają odmiany PCR, sposoby oparte na reakcji łańcuchowej ligazy, połączone sposoby oligo takie, jak te stosowane w tasowaniu syntetycznym, podatne na błędy sposoby amplifikacji i sposoby wykorzystujące oligonukleotydy z przypadkowymi mutacjami, klasyczne ukierunkowane miejscowo sposoby mutagenezy, mutageneza kasetowa, oraz inne sposoby amplifikacji i syntezy genowej. Jak wiadomo w tej dziedzinie, istnieje wiele handlowo dostępnych zestawów i sposobów łączenia genów, mutagenezy, subklonowania wektorów i podobnych i takie komercyjne produkty znajdują zastosowanie w niniejszym wynalazku dla generowania kwasów nukleinowych, które kodują przeciwciała. [0] Przeciwciała według niniejszego wynalazku mogą być wytwarzane w wyniku hodowli komórki gospodarza transformowanej kwasem nukleinowym, korzystnie wektorem ekspresyjnym, zawierającym kwas nukleinowy kodujący przeciwciała, w odpowiednich warunkach w celu wywołania lub powodowania ekspresji białka. Odpowiednie warunki dla ekspresji róŝnią się w zaleŝności od wyboru wektora ekspresyjnego i komórki gospodarza, oraz będą łatwo ustalone przez rutynowe prace eksperymentalne znawcy w dziedzinie. RóŜnorodne odpowiednie komórki gospodarza mogą być uŝyte, w tym bez ograniczania do wymienionych, komórki ssaków, bakterie, komórki owadów, i droŝdŝy. Na przykład, róŝne linie komórkowe, które mogą znaleźć zastosowanie w niniejszym wynalazku, są opisane w katalogu linii komórkowych ATCC, dostępny z American Type Culture Collection.

64 1 20 2 30 3 [011] Przeciwciała mogą być eksprymowane w układach ekspresyjnych ssaków, w tym układach, w których konstrukty ekspresyjne wprowadza się do komórek ssaków tak, jak za pomocą retrowirusa lub adenowirusa. MoŜna stosować jakiekolwiek komórki ssaków, przy czym najbardziej korzystne są komórki człowieka, myszy, szczura, chomika i naczelnych. Odpowiednie komórki obejmują równieŝ znane komórki badawcze, w tym bez ograniczania do wymienionych, komórki Jurkat T, NIH3T3, CHO, BHK, COS, HEK293, PER C.6, HeLa, Sp2/0, komórki NSO i ich warianty. Biblioteka białka moŝe być eksprymowana w komórkach bakteryjnych. Bakteryjne układy ekspresyjne są dobrze znane w dziedzinie, oraz obejmują Escherichia coli (E. coli), Bacillus subtilis, Streptococcus cremoris, oraz Streptococcus lividans. Przeciwciała mogą być wytwarzane w komórkach owadów (np. Sf21/Sf9, Trichoplusia ni Bti-Tnb1-4) lub komórkach droŝdŝy (np. S. cerevisiae, Pichia, etc). Przeciwciała mogą być eksprymowane in vitro uŝyciu bezkomórkowych układów translacyjnych. Układy translacyjne in vitro otrzymane z zarówno prokariotycznych (np. E. coli) i eukariotycznych (np. kiełki pszenicy, retikulocyty królika) komórek są dostępne i moŝe być wybrany na podstawie poziomu ekspresji i funkcjonalnych właściwości białka będącego przedmiotem zainteresowania. Na przykład, co docenia znawca w dziedzinie, translacja in vitro wymagana jest w przypadku niektórych prezentacji, na przykład prezentacji rybosomalnej (ang. ribosome display). Ponadto, przeciwciała mogą być wytwarzane metodami syntezy chemicznej. RównieŜ transgenicznymi układami ekspresyjnymi zwierzęcymi (np. mleko krowie, owcze lub kozie, zarodki kurze, całe larwy owadów, itd.), jak i roślinnymi (np. kukurydza, tytoń, rzęsa, itd.) [012] Kwasy nukleinowe, które kodują sekwencję łańcucha cięŝkiego i sekwencję łańcucha lekkiego przeciwciała według niniejszego wynalazku takich, jak tych określonych w zastrzeŝeniach, mogą być wprowadzone do wektora ekspresyjnego w celu ekspresji białka. Do ekspresji białka moŝna stosować róŝne wektory ekspresyjne. Wektory ekspresyjne mogą zawierać auto replikujące się pozachromosomalne wektory lub wektory, które łączą się z genomem gospodarza. Wektory ekspresyjne są wykonane tak, aby być zgodne z typem komórek gospodarza. Zatem wektory ekspresyjne, które znajdują zastosowanie w niniejszym wynalazku obejmują, bez ograniczania do wymienionych, te, które umoŝliwiają ekspresję białka w komórkach ssaków, bakteriach, droŝdŝach, komórkach owadów, oraz w układach in vitro. Co jest znane w dziedzinie, dostępnych, komercyjnie lub jakkolwiek inaczej, jest wiele wektorów ekspresyjnych, które mogą znaleźć zastosowanie w niniejszym wynalazku do ekspresji przeciwciała. [013] Wektory ekspresyjne typowo zawierają białko połączone funkcjonalnie z sekwencjami kontrolną lub regulatorową, markerami podlegającymi selekcji, dowolnymi partne-

6 1 20 2 30 3 rami fuzyjnymi, i/lub dodatkowymi elementami. Przez połączony funkcjonalnie rozumie się tu to, Ŝe kwas nukleinowy jest umieszczony w funkcjonalnej zaleŝności z inną sekwencją kwasu nukleinowego. Generalnie, te wektory ekspresyjne obejmują transkrypcyjnie i translacyjnie regulatorowy kwas nukleinowy przyłączony funkcjonalnie do kwasu nukleinowego kodującego przeciwciało, oraz są typowo odpowiednie w stosunku do komórki gospodarza stosowanej do ekspresji białka. W ogólności, transkrypcyjnie i translacyjnie regulatorowe sekwencje mogą obejmować sekwencje promotora, rybosomalne miejsca wiązania, sekwencje start i stop transkrypcji, sekwencja start i stop translacji, sekwencje enhencera lub aktywatora. Co jest znane równieŝ w dziedzinie, wektory ekspresyjne typowo zawierają gen lub marker selekcyjny w celu umoŝliwienia selekcji transformowanych komórek gospodarza zawierających wektor ekspresyjny. Geny selekcyjne są dobrze znane w dziedzinie i będą zmieniały się wraz z zastosowaną komórką gospodarza. [014] Przeciwciała mogą być połączone funkcjonalnie do partnera fuzyjnego aby umoŝliwić nakierowywanie eksprymowanego białka, oczyszczanie, skrining, prezentację, i podobne. Partnerzy fuzyjni mogą być przyłączeni do sekwencja przeciwciała przez sekwencje linkera. Sekwencje linkera zazwyczaj zawierają niewielką ilość aminokwasów, typowo mniej niŝ dziesięć, choć dłuŝsze linkery mogą być takŝe stosowane. Typowo, sekwencje linkera są tak dobrane, aby były elastyczne i odporne na degradację. Co jest oczywiste dla znawcy w dziedzinie, kaŝda z wielu sekwencji moŝe być uŝyta jako linker. Na przykład, powszechna sekwencja linkera zawiera sekwencję aminokwasów GGGGS. Partner fuzyjny moŝe być sekwencją nakierowującą lub sygnałową, która kieruje przeciwciało i dowolnych zasocjowanych partnerów fuzyjnych do poŝądanego miejsca komórkowego lub ośrodka pozakomórkowego. Jak wiadomo z dziedziny, określone sekwencje sygnałowe mogą celować białko, aby było albo wydzielane do poŝywki hodowlanej, albo do przestrzeni periplazmatycznej, umieszczonej między wewnętrzną i zewnętrzną błoną komórki. Partner fuzyjny moŝe równieŝ być sekwencją, która koduje peptyd lub białko, które umoŝliwia oczyszczanie i/lub skirning. Tacy partnerzy fuzyjni obejmują, bez ograniczania do wymienionych, tagi polihistydynowe (His-tags) (na przykład H 6 i H lub inne tagi stosowane z układami chromatografii powinowactwa na unieruchomionych jonach metali (IMAC) (np. kolumny powinowacta do Ni +2 )), fuzje GST, fuzje MBP, Strep-tag, sekwencja docelowa biotynylacji BSP enzymu bakteryjnego BirA, oraz tagi epitopów, które są nacelowywanie przez przeciwciała (na przykład tagi c-myc tags, flag-tagi, i podobne). Co jest oczywiste dla znawcy w dziedzinie, takie tagi mogą być uŝyteczne do oczyszczanai, do skriningu, lub obu. Na przykład, przeciwciało moŝna oczyścić stosując tag His przez jego immobilizację do kolumny powinowactwa do Ni +2, oraz następnie po oczyszczeniu ten sam tag His moŝe

66 1 20 2 30 3 być uŝyty do immobilizacji przeciwciała do płytki powleczonej Ni +2 w celu wykonania ELISA lub innego testu wiązania (jak opisanego poniŝej). Partner fuzyjny moŝe umoŝliwić stosowanie metody selekcji w celu skriningu przeciwciała (patrz poniŝej). Partnerzy fuzyjni, którzy umoŝliwiają róŝne metody selekcji są dobrze znane w dziedzinie, oraz wszyscy z nich znajdują zastosowanie w niniejszym wynalazku. Na przykład, przez fuzję elementów biblioteki przeciwciał do genu III białka, moŝna stosować prezentację fagową (Kay i współpr., Phage display of peptides and proteins: a laboratory manual, Academic Press, San Diego, CA, 1996; Lowman i współpr., 1991, Biochemistry 30:832-838; Smith, 198, Science 228:1331-1317). Partnerzy fuzyjni mogą umoŝliwić znakowanie przeciwciała. Alternatywnie, partner fuzyjny moŝe wiązać się do specyficznej sekwencji na wektorze ekspresyjnym, umoŝliwiając partnerowi fuzji i zasocjowanemu przeciwciału połączenie kowalencyjne lub niekowalencyjne z kwasem nukleinowym, który je koduje. [01] Metody wprowadzania egzogennego kwasu nukleinowego do komórek gospodarza są dobrze znane w dziedzinie, oraz zaleŝą od uŝytej komórki gospodarza. Techniki obejmują, bez ograniczania do wymienionych, transfekcję za pośrednictwem dekstranu, wytrącanie fosforanem wapnia, traktowanie chlorkiem wapnia, transfekcję za pośrednictwem polibrenu, łączenie protoplastów, elektroporację, infekcje wirusowe lub fagowe, kapsułkowanie polinukleotydu(-ów) w liposomach, oraz bezpośrednia mikroiniekcja DNA do jądra. W przypadku ssaczych komórek, transfekcja moŝe być albo przejściowa, albo stabilna. Przeciwciała mogą być oczyszczone lub wyizolowane po ekspresji. Białka mogą być izolowane lub oczyszczone na róŝne sposoby znane znawcy w dziedzinie. Standardowe metody oczyszczania obejmują techniki chromatograficzne, w tym wymiany jonowej, interakcji hydrofobowych, powinowactwa, rozmiaru lub filtracji Ŝelowej, oraz w fazach odwróconych, prowadzonej pod ciśnieniem atmosferycznym lub pod wysokim ciśnieniem przy uŝyciu układów, jak FPLC i HPLC. Metody oczyszczania obejmują równieŝ techniki elektroforetyczne, immunologiczne, wytrącanie, dializę i chromatoogniskowanie. Techniki ultrafiltracji i diafiltracji, w połączeniu z zatęŝaniem białek, są równieŝ przydatne. Co dobrze wiadomo z dziedziny, róŝne z naturalnych białek wiąŝą Fc i przeciwciała, oraz białka te mogą znaleźć zastosowanie w niniejszym wynalazku do oczyszczania przeciwciała. Na przykład, bakteryjne białka A i G wiąŝą się do regionu Fc. Podobnie, bakteryjne białko L wiąŝe się do regionu Fab niektórych przeciwciał tak, jak to oczywiście robi antygen docelowy przeciwciała. Oczyszczanie moŝe być często umoŝliwione przez określony partner fuzyjny. Na przykład, przeciwciała moŝna oczyścić za pomocą Ŝywicy glutationowej, jeśli wykorzystana jest fuzja GST, chromatografii powinowactwa Ni +2, jeśli wykorzystywany jest tag His, lub immobilizowana przeciwciało anty-flag, jeśli stosuje się tag flag. Jako

67 1 20 2 30 3 ogólne wskazówki co do odpowiednich technik oczyszczania, patrz, np. Protein Purification: Principles and Practice, 3rd Ed., Scopes, Springer-Verlag, NY, 1994. Stopień oczyszczenia będzie zróŝnicowany zaleŝnie od skriningu lub zastosowania przeciwciała. W niektórych przypadkach nie jest konieczne oczyszczanie. Na przykład w jednym przykładzie wykonania, jeśli wydzielane są przeciwciała, skrining moŝe następować bezpośrednio z poŝywki. Co dobrze wiadomo z dziedziny, niektóre sposoby selekcji nie wymagają oczyszczania białka. Zatem, na przykład, jeśli wytwarzana jest biblioteka przeciwciał do biblioteki prezentacji fagowej, oczyszczanie białka moŝe nie być wykonywane. Doświadczenia in vitro [016] Przeciwciała mogą być poddawane skriningowi stosując róŝne sposoby, w tym bez ograniczania do wymienionych, te, które wykorzystują testy in vitro, in vivo i testy oparte na komórkach, oraz technologie selekcji. Technologie zautomatyzowane i te o duŝej przepustowości skriningu moŝna wykorzystywać w procedurach skriningu. Skrining moŝe wykorzystywać uŝycie partnera fuzyjnego lub znacznika. Zastosowanie partnerów fuzyjnych zostało omówione powyŝej. Przez znakowany rozumie się tu to, Ŝe przeciwciała według niniejszego wynalazku mogą posiadać jeden lub większą liczbę elementów, izotopów lub związków chemicznych przyłączonych w celu umoŝliwienia wykrycia ich w skriningu. W ogólności znaczniki moŝna przypisać do trzech klas: a) znaczniki immunologiczne, które mogą być epitopem wprowadzonym jako partner fuzyjny, który jest rozpoznawany przez przeciwciało, b) znaczniki izotopowe, które mogą być izotopami radioaktywnymi lub cięŝkimi, oraz c) znaczniki małocząsteczkowe, które mogą obejmować barwniki fluorescencyjne i kolorymetryczne, lub cząsteczki takie, jak biotyna, które umoŝliwiają inne sposoby znakowania. Znaczniki mogą być wprowadzone do związku w dowolnej pozycji i mogą być wprowadzone in vitro lub in vivo w trakcie ekspresji białka. [017] Funkcjonalne i/lub biofizyczne właściwości przeciwciał są poddawane skriningowi w teście in vitro. Testy in vitro mogą pozwalać na szeroki zakres dynamiki skriningu właściwości będących przedmiotem zainteresowania. Właściwości przeciwciała, które moŝna poddać skriningowi, obejmują, bez ograniczania do wymienionych, stabilność, rozpuszczalność, oraz powinowactwo do ligandów Fc, na przykład FcγRs. Wiele właściwości mo- Ŝe być poddawanych skriningowi jednocześnie lub pojedynczo. Białka mogą być oczyszczone lub nieoczyszczone, zaleŝnie od wymagań testu. Skrining jest jakościowym lub ilościowym testem wiązania przeciwciała do białka lub cząsteczki niebiałkowej, o której wiadomo, Ŝe wiąŝe się z przeciwciałem lub uwaŝa się, Ŝe się wiąŝe z przeciwciałem. Skrining jest testem wiązania do pomiaru wiązania do docelowego antygenu. Skrining jest testem do wiązania przeciwciała do ligandu Fc, w tym, bez ograniczania do wymienionych, ro-

68 1 20 2 30 3 dziny FcγRs, noworodkowego receptora FcRn, białka dopełniacza C1q, oraz bakteryjnego białka A i G. Wymienione ligandy Fc mogą pochodzić od dowolnego organizmu, przy czym najkorzystniejsze są ludzie, myszy, szczury, króliku oraz małpy. Testy wiązania moŝna przeprowadzać na róŝne sposoby przy uŝyciu róŝnych sposobów znanych w dziedzinie, w tym bez ograniczania do wymienionych, testy oparte na FRET (Fluorescence Resonance Energy Transfer) i BRET (Bioluminescence Resonance Energy Transfer), Alpha- Screen (Amplified Luminescent Proximity Homogeneous Assay), Scintillation Proximity Assay, ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay), SPR (Surface Plasmon Resonance, równieŝ znany jako Biacore ), izotermalną kalorymetrią miareczkową, róŝnicowa kalorymetria skaningowa, elektroforeza w Ŝelu, oraz chromatografia, w tym filtracja Ŝelowa. Te i inne sposoby mogą wykorzystywać niektórych partnerów fuzyjnych lub znaczników przeciwciała. Testy mogą wykorzystywać wiele sposobów wykrywania w tym bez ograniczania do wymienionych, znaczniki chromogenne, fluorescencyjne, luminescencyjne lub izotopowe. [018] Biofizyczne właściwości przeciwciała, na przykład stabilność i rozpuszczalność, moŝe być poddawanych skriningowi stosując róŝne sposoby znane w dziedzinie. Stabilność białka moŝe być określona przez pomiar równowagi termodynamicznej między stanami pofałdowanym i rozfałdowanym. Na przykład, przeciwciała według niniejszego wynalazku mogą być rozfałdowane za pomocą chemicznej denaturacji alkoholem, ciepłem, lub ph, oraz przejście to moŝe być monitorowane przy uŝyciu sposobów, w tym, bez ograniczania do wymienionych, spektroskopią dichroizmu kołowego, spektroskopią fluorescencyjną, spektroskopią absorpcyjną, spektroskopią NMR, kalorymetrią i proteolizą. Co jest oczywiste dla znawcy w dziedzinie, kinetyczne parametry przejść fałdowania i rozfałdowania moŝna równieŝ monitorować stosując te i inne techniki. Rozpuszczalność i ogólna integralność strukturalna przeciwciała moŝe być określona ilościowo lub jakościowo stosując wiele sposobów, które są znane w dziedzinie. Sposoby, które mogą znaleźć zastosowanie w niniejszym wynalazku do charakteryzowania biofizycznych właściwości przeciwciała, obejmują elektroforezę Ŝelową, ogniskowanie izoelektryczne, elektroforezę kapilarną, chromatografię, jak chromatografię wykluczania, chromatografię jonowymienną, oraz wysokosprawną chromatografię cieczową z odwróconymi fazami, mapping peptydów, mapping oligosacharydów, spektrometrię mas, spektroskopię absorpcji ultrafioletu, spektroskopię dichroizmu kołowego, spektroskopię fluorescencyjną, izotermalną kalorymetrię miareczkową, róŝnicową kalorymetrię skaningową, analityczne ultrawirowanie, dynamiczne rozpraszanie światła, proteoliza, oraz sieciowanie, pomiar mętności, testy opóźnienia na filtrze, testy immunologiczne, testy wiązania barwnika fluorescencyjnego, testy

69 1 20 2 30 3 barwienia białka, mikroskopię, oraz wykrywanie agregatów za pomocą ELISA lub innego testu wiązania. Zastosowanie mogą znaleźć równieŝ analiza strukturalna wykorzystująca rentgenowskie technik krystalograficzne i spektroskopia NMR. Stabilność i/lub rozpuszczalność moŝe być mierzona przez określenie ilości roztworu białka po pewnym okresie czasu. W teście tym, białko moŝna poddać ekspozycji lub nie na pewne ekstremalne warunki, na przykład podwyŝszona temperatura, niskie ph, lub obecność denaturanta. PoniewaŜ funkcja typowo wymaga stabilnego, rozpuszczalnego, i/lub dobrze pofałdowanego /ustrukturyzowanego białka, wspomniane testy funkcjonalne i testy wiązania równieŝ zapewniają sposoby wykonywania takiego pomiaru. Na przykład, roztwór zawierający przeciwciało mógłby być testowany pod kątem jego wiązania do docelowego antygenu, a następnie poddany ekspozycji na podwyŝszoną temperaturę przez jeden lub większą liczbę określonych okresów czasu, następnie badany ponownie pod kątem wiązania antygenu. PoniewaŜ rozfałdowane i zagregowane białka nie mają być zdolne do wiązania antygenu, pozostała ilość aktywności zapewnia pomiar stabilności i rozpuszczalności przeciwciała. [019] Bibliotekę poddaje się skriningowi w jednym lub większej liczbie testów in vitro opartych na komórkach. Dla takich testów, przeciwciała, oczyszczone lub nieoczyszczone, typowo dodaje się egzogennie w taki sposób, Ŝe komórki wystawione są na działanie indywidulanych wariantów lub grup wariantów naleŝących do biblioteki. Testy te typowo, ale nie zawsze, oparte są na biologii zdolności przeciwciała do wiązania antygenu i mediowania jakimś zdarzeniom biochemicznym, na przykład funkcjom efektorowym, jak lizie komórkowej, fagocytozie, hamowaniu wiązania ligand/receptor, hamowaniu wzrostu i/lub proliferacji, apoptozie i podobnym. Takie testy obejmują często monitorowanie odpowiedzi komórek na przeciwciało, na przykład przeŝycie komórek, śmierć komórek, fagocytoza komórkowa, liza komórek, zmiany w morfologii komórki, lub aktywacja transkrypcji taka, jak ekspresja komórkowa naturalnego genu lub genu reporterowego. Na przykład takie testy mogą mierzyć zdolność przeciwciał do wywołania ADCC, ADCP, lub CDC. W przypadku niektórych testów, moŝe być konieczne dodanie dodatkowych komórek lub elementów, to znaczy poza komórkami docelowymi, na przykład uzupełnienie serum, lub komórki efektorowe takie, jak monocyty krwi obwodowej (PBMC), komórki NK, makrofagi, i podobne. Takie dodatkowe komórki mogą pochodzić z dowolnego organizmu, korzystnie ludzi, myszy, szczurów, królików, oraz małp. Sieciowane lub monomeryczne przeciwciała mogą powodować apoptozę niektórych linii komórkowych eksprymujących docelowy antygen przeciwciała, lub mogą mediować atak na komórki docelowe przez komórki immunologiczne, które dodano do testu. Sposoby monitoringu śmierci komórki lub Ŝywotności znane są w dziedzinie i obejmują stosowanie barwników, fluorofo-

70 1 20 2 30 3 rów, odczynników immunohistochemicznych, cytochemicznych i radioaktywnych. Na przykład, testy kaspazy lub fluorokoniugaty aneksyny mogą umoŝliwiać pomiar apoptozy oraz wychwyt i uwalnianie substancji radioaktywnych (np. test uwalniania chromu-1) lub metaboliczna redukcja barwników fluorescencyjnych takich, jak błękit Alamar moŝe umoŝliwić monitoring wzrostu komórek, proliferacji lub aktywacji. Stosowany jest test cytotoksyczności DELFIA oparty na EuTDA (Perkin Elmer, MA). Alternatywnie, martwe lub uszkodzone komórki docelowe moŝna monitorować przez pomiar uwalniania jednego lub większej liczby naturalnych wewnątrzkomórkowych białek, na przykład dehydrogenazy mleczanowej. Aktywacja transkrypcji moŝe równieŝ słuŝyć jako metoda oznaczania funkcji w testach opartych na komórkach. W tym przypadku, odpowiedź moŝe być monitorowane przez badanie dla naturalnych genów lub białek, które mogą być regulowane w górę lub dół, na przykład zmierzone moŝe być uwalnianie określonej interleukiny lub alternatywnie odczyt moŝe odbywać się za pomocą lucyferazy lub konstruktu GFP-reporter. Testy oparte na komórkach mogą takŝe obejmować pomiar morfologicznych zmian komórek jako odpowiedź na obecność przeciwciała. Rodzajami komórek dla takich testów mogą być prokariotyczne lub eukariotyczne, oraz wykorzystać moŝna róŝne linie komórkowe, które są znane w dziedzinie. Alternatywnie, opartych na komórkach przesiewy są wykonywane przy uŝyciu komórek, które zostały transformowane lub transfekowane kwasami nukleinowymi kodującymi przeciwciała. [0160] Testy in vitro obejmują, bez ograniczania do wymienionych, testy wiązania, ADCC, CDC, fagocytozę, cytotoksyczność, proliferację, apoptozę, nekrozę, zatrzymanie cyklu komórkowego, uwalnianie nadtlenku/ozonu, chemotaksję komórki efektorowej, hamowanie takich testów przez obniŝoną funkcję efektorową przeciwciała; zakresy aktywności takie, jak >0x ulepszenie lub >0x zmniejszenie, mieszanek wyniku aktywacji receptora i testu, których oczekuje się z takich profili receptora. Doświadczenia in vivo [0161] Biologiczne właściwości przeciwciała według niniejszego wynalazku moŝna scharakteryzować w doświadczeniach na komórkach, tkankach oraz całym organizmie. Jak jest znane w stanie techniki, leki często są badane na zwierzętach, w tym bez ograniczania do wymienionych, myszach, szczurach, królikach, psach, kotach, świniach, i małpach, w celu mierzenia skuteczności leku do leczenia choroby lub modelu choroby, lub do mierzenia farmakokinetyki leku, toksyczności, oraz innych właściwości. Wymienione zwierzęta mogą być określane jako modele chorób. W odniesieniu do przeciwciał według niniejszego wynalazku, szczególne wyzwania pojawiają się, gdy stosuje się modele zwierzęce do oceny potencjału dla skuteczności u ludzi dla polipeptydów kandydatów - jest to spowodowa-

71 1 20 2 30 3 ne, przynajmniej częściowo, faktem, Ŝe przeciwciała, które wykazują specyficzne działanie na powinowactwo do ludzkiego receptora Fc, mogą nie wykazywać podobnego efektu powinowactwa z ortologicznym receptorem zwierzęcym. Problemy te mogą być dodatkowo utrudnione przez nieuniknione niejasności związane z prawidłowym przypisaniem prawidłowych ortologów (Mechetina i współpr., Immunogenetics, 2002 4:463-468), oraz faktem, Ŝe niektóre ortologi po prostu nie istnieją u zwierząt (np. ludzie posiadają FcγRIIa, podczas gdy myszy nie). Terapeutyki są często badane u myszy, w tym bez ograniczania do wymienionych, nagich myszy, myszy SCID, myszy ksenograftowych oraz myszy transgenicznym (w tym z knockinami i knockoutami). Na przykład, przeciwciało według niniejszego wynalazku, które jest przeznaczone jako terapeutyk przeciwrakowy, moŝe być badane na mysim modelu raka, na przykład myszy ksenograftowej. W sposobie tym, guz lub linia komórkowa jest wszczepiana lub wstrzykiwana do myszy, oraz następnie mysz traktuje się terapeutykiem w celu określenia zdolności przeciwciała do zmniejszenia lub zahamowania wzrostu nowotworu i przerzutów. Alternatywnym podejściem jest zastosowanie modelu mysiego SCID, w którym myszom z niedoborem immunologicznym wstrzykuje się ludzkie limfocyty krwi obwodowej (PBL), nadające wpół funkcjonalny i ludzki system odpornościowy - z odpowiednim szeregiem ludzkich FcR - do myszy, której następnie wstrzyknięto przeciwciała lub polipeptydy Fc, które są ukierunkowane na wstrzyknięte ludzkie komórki guza. W takim modelu, polipeptydy Fc, które są ukierunkowane na poŝądany antygen (taki, jak her2/neu na komórkach rakowych jajnika SkOV3), oddziałują z ludzkimi PBL w myszy w celu angaŝowania guzobójczych funkcji efektorowych. Takie eksperymenty mogą dostarczyć odpowiednich danych w celu określenia siły działania wymienionego przeciwciała, które ma być zastosowane jako terapeutyk. Do badania moŝna uŝyć dowolny organizm ssaka. Na przykład ze względu na ich genetyczne podobieństwo do ludzi, małpy mogą być odpowiednimi modelami terapeutycznymi, oraz zatem mogą być stosowane do badania skuteczności, toksyczności, farmakokinetyki, lub innych właściwości przeciwciała według niniejszego wynalazku. Badania przeciwciała według niniejszego wynalazku u ludzi ostatecznie są wymagane do zatwierdzenia ich jako leków, oraz tym samym te eksperymenty są oczywiście rozwaŝane. Zatem przeciwciała według niniejszego wynalazku mogą być testowane u ludzi w celu określenia ich skuteczności terapeutycznej, toksyczności, farmakokinetyki, i/lub innych właściwości klinicznych. [0162] Przeciwciała według niniejszego wynalazku mogą nadawać wyŝszą wydajność w odniesieniu do terapii zawierających Fc w modelach zwierzęcych lub u ludzi. Profile wiązania receptora takiego przeciwciała, jak opisano w tym opisie, mogą, na przykład, być wybierane w celu zwiększenia siły działania leków cytotoksycznych lub w celu celowania

72 1 20 2 30 3 w specyficzne funkcje efektorowe lub komórki efektorowe celu poprawy selektywności działania leku. Dalej, moŝna wybrać profile wiązania receptora, które mogą zmniejszyć niektóre lub wszystkie funkcje efektorowe, tym samym zmniejszając efekty uboczne lub toksyczność leków zawierających taki Fc. Na przykład, moŝna wybrać przeciwciało o zmniejszonym wiązaniu do FcγRIIIa, FcγRI i FcγRIIa, aby wyeliminować większość mediowanych komórkowo funkcji efektorowych, lub moŝna wybrać przeciwciało ze zmniejszonym wiązaniem do C1q w celu ograniczenia mediowanych dopełniaczem funkcji efektorowych. W niektórych kontekstach wiadomo, Ŝe takie funkcje efektorowe są potencjalnie toksyczne, związku z czym, ich wyeliminowanie moŝe zwiększyć bezpieczeństwo leku zawierającego Fc, a takie ulepszone bezpieczeństwo moŝe być scharakteryzowane w modelach zwierzęcych. W niektórych kontekstach wiadomo, Ŝe takie funkcje efektorowe pośredniczą poŝądanej aktywności terapeutycznej, tym samym wzmacniając je, moŝna zwiększyć aktywność lub siłę działania leku zawierającego Fc i taka ulepszona aktywność lub siła działania moŝe być scharakteryzowana w modelach zwierzęcych. [0163] Zoptymalizowane przeciwciała mogą być badane w róŝnych ortotopowych modelach raka. Te klinicznie istotne modele zwierzęce są waŝne w badaniach patofizjologii i terapii agresywnych nowotworów takich, jak raka trzustki, prostaty i raka piersi. Myszy pozbawione odporności w tym, bez ograniczania do wymienionych, nagie myszy z brakiem grasicy lub myszy SCID są często uŝywane do oceny lokalnego i układowego rozprzestrzeniania się guza z miejsca wewnątrzorganowego (np. trzustki, prostaty lub gruczołu sutkowego) wstrzyknięcia ludzkich komórek lub fragmentów guza pacjentów donorowych. [0164] Przeciwciała według niniejszego wynalazku mogą być ocenione pod kątem skuteczności w klinicznie odpowiednich modelach zwierzęcych róŝnych chorób ludzkich. W wielu przypadkach, róŝne modele obejmują odpowiednie zwierzęta transgeniczne dla specyficznych antygenów guza. [016] Odpowiednie transgeniczne modele takie, jak te, które eksprymują ludzkie receptory Fc (np. CD16 zawierający łańcuch gamma, FcγR1, RIIa/b, oraz inne), mogą być stosowane do badania i oceny przeciwciała i fuzji Fc w ich skuteczności. Ocena przeciwciała przez wprowadzenie ludzkich genów, które bezpośrednio lub pośrednio mediują funkcje efektorowe u myszy lub innych gryzoni, które mogą umoŝliwić fizjologiczne badania skuteczności w toksyczności guza lub innych chorób takich, jak zaburzenia autoimmunologiczne i RA. Ludzkie receptory Fc takie, jak FcγRIIIa mogą posiadać polimorfizm taki, jak ten w pozycji 18 V lub F, który dalej umoŝliwi wprowadzenie specyficzności i kombinacji ludzkich polimorfizmów do gryzoni. JednakŜe róŝne badania z udziałem FcR specyficznych pod kątem polimorfizmu nie są ograniczone do tej części, oraz obejmują wszyst-

73 1 20 2 30 3 kie dyskusje i zastosowania FcRs w ogólności, jak określono w niniejszym opisie, przeciwciała według niniejszego wynalazku mogą nadawać wyŝszą aktywność lekom zawierającym Fc w takich transgenicznych modelach, w szczególności warianty z zoptymalizowanymi profilami wiązania dla aktywności mediowanej ludzkim FcγRIIIa, mogą wykazywać wysoką aktywność w transgenicznych myszach CD 16. Podobnie, poprawę skuteczności na myszach transgenicznych dla innych ludzkich receptorów Fc, np. FcγRIIa, FcγRI, itd, moŝna zaobserwować dla przeciwciał z profilami wiązania zoptymalizowanymi dla odpowiednich receptorów. Myszy transgeniczne dla wielu ludzkich receptorów powinny wykazywać lepszą aktywność dla przeciwciał o profilach wiązania zoptymalizowanych dla odpowiednich wielu receptorów, na przykład jak wskazano na Figurze. [0166] Ze względu na trudności i niejasności związane z wykorzystaniem modeli zwierzęcych do scharakteryzowania potencjalnej skuteczność kandydata terapeutycznego przeciwciała u pacjenta, którym jest człowiek, niektóre wariantowe polipeptydy według niniejszego wynalazku mogą znaleźć zastosowanie jako zastępcy do ustalenia potencjalnej skuteczności u ludzi. Takie cząsteczki zastępcze powinny korzystnie naśladować - w układzie zwierząt - biologię FcR i/lub dopełniacza odpowiedniego kandydującego ludzkiego przeciwciała. To naśladowanie najbardziej prawdopodobne przejawia się przez względne pokrewieństwo asocjacji między specyficznymi przeciwciałami i zwierzęcymi vs. ludzkimi receptorami. Na przykład, jeśli jeden wykorzystywałby model mysi do ustalenia potencjalnej skuteczności u ludzi przeciwciała, które ma zwiększone powinowactwo do ludzkiego FcγRIIIa, odpowiedni zastępca powinien mieć zwiększone powinowactwo do mysiego FcγRIII-2 (mysi CD16-2). Alternatywnie jeśli jeden wykorzystywałby model mysi do ustalenia potencjalnej skuteczności u ludzi przeciwciała, które ma zmniejszone powinowactwo do inhibitorowego ludzkiego FcγRIIb, odpowiedni wariant zastępujący powinien mieć zmniejszone powinowactwo do mysiego FcγRII. NaleŜy równieŝ zauwaŝyć, Ŝe zastępujące przeciwciała powinny być wytworzone w kontekście ludzkiego przeciwciało, zwierzęcego przeciwciała, lub obu. [0167] Badanie przeciwciała moŝe obejmować badanie skuteczności u naczelnych (np. modelu małpy cynomolgus) dla ułatwienia oceny zmniejszania się ilości specyficznych komórek docelowych niosących docelowy antygen. Dodatkowe modele naczelnych obejmują, ale nie ogranicza się do wymienionych, małpy rezus oraz polipeptydy Fc w badaniach terapeutycznych autoimmunologicznych, transplantacji i raka. [0168] Wykonywane są badania toksyczności w celu określenia działania przeciwciała lub działań związanych z fuzją Fc, które nie sposób ocenić w standardowych profilach farmakologicznych lub występują dopiero przy powtarzającym się podawaniu środka. Więk-

74 1 20 2 30 szość testów toksyczności wykonuje się w dwóch gatunkach gryzoń i nie gryzoń w celu zapewnienia, Ŝe nie przeoczy się Ŝadnego działania niepoŝądanego, zanim indywiduum terapeutyczne wprowadzi się do człowieka. Generalnie, modele te mogą mierzyć róŝne toksyczności, w tym genotoksyczność, toksyczność przewlekłą, immunogenność, toksyczność wobec rozrodczości/rozwoju i rakotwórczość. Uwzględnione w wyŝej wymienionych parametrach są standardowe pomiary spoŝycia Ŝywności, masy ciała, powstawanie przeciwciał, chemii klinicznej, oraz badanie makro- i mikroskopowe standardowych narządów/tkanek (np. kardiotoksyczność). Dodatkowymi parametrami pomiaru są urazy w miejscu wstrzyknięcia i pomiar neutralizujących przeciwciał, jeśli takie występują. Tradycyjnie, monoklonalne przeciwciało terapeutyczne, nagie lub skoniugowane ocenia się pod kątem reaktywności krzyŝowej z prawidłowymi tkankami, immunogenności/produkcji przeciwciał, toksyczności koniugatu lub linkera i toksyczności typu bystander form radioznakowaych. Niemniej jednak, takie badania mogą być zindywidualizowane w celu rozwiązania konkretnych problemów i prowadzone pod kierunkiem wyznaczonym przez ICH S6 (Badania dotyczące bezpieczeństwa produktów biotechnologicznych, które podano powyŝej). Jako takie, ogólne zasady mówią, Ŝe produkty te powinny być wystarczająco dobrze charakteryzowane i powinny być usunięte dla nich zanieczyszczenia/nieczystości tak, Ŝe badany materiał jest porównywalny przez opracowywanie i zgodny z GLP. [0169] Farmakokinetyki (PK) przeciwciała według niniejszego wynalazku mogą być badane w róŝnych układach zwierzęcych, przy czym najbardziej odpowiedni są naczelne, poza człowiekiem, takie, jak małpy cynomolgus, rezus. Pojedyncze lub wielokrotne podawanie i.v./s.c. w zakresie dawek 6000-krotności (0.0-300 mg/kg) moŝna ocenić dla czasu półtrwania (dni do tygodni) stosując stęŝenie w osoczu i klirens, jak i moŝna zmierzyć objętość dystrybucji w stanie stacjonarnym i poziom absorpcji układowej. Przykłady takich parametrów pomiarowych ogólnie obejmują maksymalne obserwowane stęŝenie w osoczu (Cmax), czas do osiągnięcia Cmax (Tmax), powierzchnia pod krzywą stęŝenia w osoczu od czasu od 0 do nieskończoności [AUC(0-inf] i pozorny czas półtrwania w fazie eliminacji (T1/2). Dodatkowe mierzone parametry mogą obejmować analizę kompartmentową danych w stęŝenia czasie uzyskaną po podaniu i.v. i biodostępność. Przykłady farmakologiczne / toksykologiczne badaniach wykorzystujących cynomolgus zostały ustalone dla Rituxan i, w których przeciwciała monoklonalne CD20 mają charakter reaktywny. Biodystrybucję, dozymetrię (dla radioznakowanego przeciwciała) i badania PK mogą być równieŝ wykonane w modelach gryzoni. Takie badania będą oceniać tolerancję przy wszystkich podawanych dawkach, toksyczność dla miejscowych tkanek, preferencyjną lo-

7 1 20 2 30 kalizację dla modelu zwierzęcego ksenograftu u gryzoni, zuboŝenia komórek docelowych (np. CD20 dodatnich komórek) [0170] Przeciwciała według niniejszego wynalazku mogą nadawać lepszą farmakokinetykę terapeutykom zawierającym Fc w układach zwierzęcych lub u ludzi. Na przykład, zwiększone wiązanie FcRn moŝe zwiększać czas półtrwania i ekspozycję leku zawierającego Fc. Alternatywnie, zmniejszone wiązanie FcRn moŝe zmniejszać czas półtrwania i ekspozycję leku zawierającego Fc w przypadkach, gdy zmniejszona ekspozycja jest korzystna, gdy lek wykazuje działania niepoŝądane. [0171] Znane jest w dziedzinie, Ŝe szereg receptorów Fc jest eksprymowanych w zróŝnicowany sposób na róŝnych typach komórek immunologicznych, jak i w róŝnych tkankach. RóŜnicowe rozmieszczenie w tkankach receptorów Fc ostatecznie moŝe mieć wpływ na właściwości farmakodynamiczne (PD) i właściwości farmakokinetyczne (PK) przeciwciała według niniejszego wynalazku. PoniewaŜ przeciwciała prezentacji mają róŝne powinowactwo do szeregu receptorów Fc, dalszy skining polipeptydów pod kątem właściwości PD i/lub PK moŝe być ekstremalnie uŝyteczny dla określenia optymalnej równowagi PD, PK, oraz skuteczności terapeutycznej nadanej przez kaŝdy kandydujący polipeptyd. [0172] Badania farmakodynamiczne mogą obejmować, bez ograniczania do wymienionych, nakierowywanie specyficznych komórek guza lub blokowanie mechanizmów sygnalizacji, pomiar ubytku komórek eksprymujących docelowy antygen lub sygnałów, itd. Przeciwciała według niniejszego wynalazku mogą być skierowane na określone populacje komórek efektorowych i tym samym kierować leki zawierające Fc w celu zwerbowania określonych aktywności dla poprawienia siły działania lub zwiększenia penetracji do określonego korzystnego fizjologicznego przedziału. Na przykład, aktywność i umiejscowienie neutrofili moŝe być nakierowane przez przeciwciało, które korzystnie nakierowuje FcγR- IIIb. Takie efekty farmakodynamiczne moŝna wykazać w modelach zwierzęcych lub u ludzi. Zastosowanie kliniczne [0173] Przeciwciała według niniejszego wynalazku mogą być stosowane do róŝnych celów leczniczych jak tych określonych w zastrzeŝeniach. Co jest oczywiste dla znawcy w dziedzinie, przeciwciała według niniejszego wynalazku mogą być stosowane w dowolnych celach terapeutycznych, które wykorzystują przeciwciała i podobne. W korzystnym przykładzie wykonania, przeciwciała mogą być podawane pacjentowi w celu leczenia zaburzeń, w tym bez ograniczania do wymienionych, raka, chorób zapalnych i autoimmunizacyjnych, oraz chorób zakaźnych.

76 1 20 2 30 3 [0174] Pacjent dla celów według niniejszego wynalazku obejmuje zarówno ludzi, jak i inne zwierzęta, korzystnie ssaka i najbardziej korzystnie ludzi. Zatem przeciwciała według niniejszego wynalazku mają zastosowanie zarówno w leczeniu ludzi, jak i w weterynarii. Określenie leczyć lub leczenie w kontekście według niniejszego wynalazku ma obejmować leczenie terapeutycznego, jak i profilaktyczne, lub środki słuŝące do wygaszania choroby lub zaburzenia. Zatem, na przykład, skuteczne podawanie przeciwciała przed wystąpieniem choroby skutkuje wyleczeniem choroby. Jako inny przykład, skuteczne podawanie zoptymalizowanego przeciwciała po manifestacji klinicznej choroby do zwalczania objawów choroby obejmuje leczenie choroby. Leczenie i leczyć obejmuje takŝe podawanie zoptymalizowanego przeciwciała po pojawieniu się choroby w celu zwalczenia choroby. Skuteczne podania środka po rozpoczęciu i po tym jak doszło do rozwoju objawów klinicznych, z moŝliwością redukcji objawów klinicznych i prawdopodobnym złagodzeniem choroby, obejmuje leczenie choroby. Ci wymagający leczenia obejmują ssaki juŝ mające chorobę lub zaburzenie, jak i tych mających skłonność do choroby lub zaburzenia, w tym tych, u których naleŝy zapobiegać tej chorobie lub zaburzeniu. [017] Przeciwciało według niniejszego wynalazku moŝe być podawane pacjentowi mającemu chorobę obejmującą niewłaściwą ekspresję białka lub innej cząsteczki. Ma to obejmować choroby i zaburzenia cechujące się nieprawidłowym białkiem, na przykład z powodu do zmian w ilości białka obecnego, lokalizacji białka, posttranslacyjnych modyfikacji, stanu konformacyjnego, obecność białka zmutowanego lub patogenu, itd. Podobnie, choroby lub zaburzenia mogą cechować zmiany cząsteczek w tym bez ograniczania do wymienionych, polisacharydów i gangliozydów. Nadmiar moŝe wynikać z jakiejkolwiek przyczyny, w tym bez ograniczania do wymienionych, nadekspresji na poziomie molekularnym, przedłuŝonego lub nagromadzonego występowania w miejscu działania, lub zwiększonej aktywności białka względem normalnego. W zakres tej definicji są choroby i zaburzenia cechujące się zmniejszeniem białka. Zmniejszenie to moŝe wynikać z jakiejkolwiek przyczyny, w tym bez ograniczania do wymienionych, zmniejszenie ekspresji na poziomie molekularnym, skrócony lub zmniejszony występowanie w miejscu działania, zmutowane postacie białka, lub zmniejszenie aktywności białka względem normalnego. Taki nadmiar lub zmniejszenie białka moŝna mierzyć w stosunku do normalnej ekspresji, występowania, lub aktywności białka, oraz wymieniony pomiar moŝe odgrywać waŝną rolę w rozwoju i/lub klinicznym badaniu przeciwciała według niniejszego wynalazku. [0176] Rak i rakowy odnosi się tu do lub opisuje stan fizjologiczny u ssaka, który typowo jest charakteryzowany przez nieregulowany wzrost komórki. Przykłady raka obejmują, bez ograniczania do wymienionych, raka, chłoniaka, blastomę, mięsaka (w tym

77 1 20 2 30 3 tłuszczakomięsaka), guzy neuroendokrynne, międzybłoniaka, schwannomę, oponiaka, gruczolakoraka, czerniak, oraz białaczki lub nowotwory złośliwe tkanki limfatycznej. [0177] Bardziej szczegółowe przykłady takich raków obejmują nowotwory układu krwiotwórczego, takie, jak chłoniaki nieziarnicze (NHL). Raki NHL obejmują, bez ograniczania do wymienionych, chłoniaka Burkitta (BL), chłoniaka limfocytowego/przewlekłą białaczkę limfocytową (SLL/CLL), chłoniaka z komórek płaszcza (MCL), chłoniaka grudkowego (FL), chłoniaka rozlanego z duŝych komórek B (DLCL), chłoniaka strefy brzeŝnej (MZL), białaczki włochatokomórkowej (HCL) i białaczki limfoplazmatycznej (LPL), pozawęzłowego chłoniaka strefy brzeŝnej systemu (MALT), węzłowego chłoniaka strefy brzeŝnej z komórek B, chłoniaka śródpiersia z duŝych komórek, wewnątrznaczyniowego chłoniaka z duŝych komórek, pierwotnego chłoniaka wysiękowego, precursorowego chłoniaka/białaczki limfoblastycznej z komórek B, precursorowego chłoniaka z komórek T i NK (prekursorowy chłoniak limfobalstyczny z komórek T, chłoniak blastyczny z komórek NK), nowotwory dojrzałych T i komórek NK, w tym obwodowy chłoniak i białaczka z komórek T (PTL), białaczkę/chłoniaki z dorosłych komórek T i białaczkę z duŝych ziarnistych limfocytów, przewlekłą białaczkę limfocytową z komórek T/białaczkę prolimfocytową, białaczkę z duŝych ziarnistych limfocytów T, agresywną białaczkę z komórek NK, chłoniaka z komórek NK/T, jelitowego chłoniaka z komórek T, związanego z enteropatią, wątrobowo-śledzionowego chłoniaka z komórek T, chłoniaka anaplastycznego z duŝych komórek (ALCL), angiocentrycznego i angioimmunoblastyczego chłoniaka T- komórkowego, ziarniniaka grzybiastego/zespół Sézary, oraz skórnego chłoniaka T- komórkowego (CTCL). Inne nowotwory, które mogą być leczone przeciwciałami według niniejszego wynalazku obejmują, bez ograniczania do wymienionych, chłoniaka Hodgkina, guzy z komórek prekursorowych limfocytowych, w tym ostrą białaczkę limfoblastyczną/chłoniaka limfoblastycznego z komórek B (B-ALL), oraz ostrą białaczką limfoblastyczną /chłoniaka limfoblastycznego z komórek (T-ALL), grasiczaka, histocytozę komórek Langerhansa, szpiczaka mnogiego, nowotwory białaczkowe takie, jak ostrą białaczkę szpikową (AML), w tym AML z dojrzewaniem, AML bez róŝnicowania, ostrą białaczkę promielocytową, ostrą białaczkę mielomonocytową, oraz ostre białaczki monocytarne, zespoły mielodysplastyczne, oraz przewlekłe zaburzenia mieloproliferacyjne (MDS), w tym przewlekłą białaczkę szpikową (CML). Inne raki, które mogą być leczone przez przeciwciała według niniejszego wynalazku obejmują, bez ograniczania do wymienionych, guzy ośrodkowego układu nerwowego, takie jak glejaki, nerwiaki, glejaki (glioblastomy), gwiaździaki, rdzeniaki, wyściółczaki, i retinoblastomy; lite nowotwory głowy i szyi (np. rak nosogardzieli, rak gruczołów ślinowych, oraz raka przełyku), płuc (np. drobnokomór-

78 1 20 2 30 3 kowy rak płuca, niedrobnokomórkowy rak płuca, gruczolakorak płuc i raka płaskokomórkowego płuca), układu pokarmowego (np. rak Ŝołądka w tym rak przewodu pokarmowego, rak przewodu Ŝółciowego lub przewodów Ŝółciowych, rak jelita grubego, rak odbytnicy, rak jelita grubego, i rak odbytu), układu rozrodczego (np. jąder, penisa, raka prostaty lub macicy, pochwy, sromu, raka szyjki macicy, raka jajnika, i raka endometrium), skóry (np. czerniak, rak podstawnokomórkowy, rak płaskonabłonkowy, rogowacenie słoneczne), wątroby (np. nowotwór wątroby, rak wątroby, rak wątrobowokomórkowy i wątrobiak), kości (np. osteoklastoma, oraz osteolityczne nowotwory kości) dodatkowe tkanki i narządy (np. rak trzustki, rak pęcherza, rak nerki, rak tarczycy, rak piersi, rak otrzewnej, oraz mięsak Kaposiego), oraz nowotworów układu krwionośnego (np. angiosarkomy i hemagiopericytomy). [0178] Korzystne wskazania onkologiczne, które mogą być leczone przeciwciałami anty- CD19 według niniejszego wynalazku obejmują, bez ograniczania do wymienionych, wszystkie chłoniaki nieziarnicze (NHL), szczególnie oporny/odporny NHL, przewlekłą białaczkę limfocytową (CLL), ostrą białaczkę limfoblastyczną/chłoniaka limfoblastycznego z komórek B (B-ALL), oraz chłoniaka z komórek płaszcza (MCL). [0179] Autoimmunizacja wynika z przełamania własnej tolerancji wykorzystującej humoralne i/lub mediowane komórkami mechanizmy immunologiczne w. Wśród konsekwencji niewydolności tolerancji centralnej i/lub obwodowej, znajdują się przeŝycie i aktywacja samoreaktywnych komórek B i komórek T. Kilka chorób autoimmunologicznych określa się nadmierną aktywacją limfocytów B i/lub T. Aktywacja tych komórek wymaga współpracy, zaangaŝowania antygenu i kostymulujących sygnałów z oddziałujących limfocytów. Zmniejszenie mediowane przeciwciałem, hamowanie, anty-proliferacja, i/lub blokada komórki B są podejściami terapeutycznymi do leczenia chorób autoimmunologicznych. [0180] Choroby autoimmunologiczne obejmują tu odrzucenie przeszczepu wysepek allogenicznych, łysienie plackowate, zesztywniające zapalenie stawów kręgosłupa, zespół antyfosfolipidowy, autoimmunologiczna chorobę Addisona, przeciwciała przeciw cytoplazmie neutrofilów (ANCA), choroby autoimmunologiczne nadnerczy, autoimmunologiczną niedokrwistość hemolityczną, autoimmunologiczne zapalenie wątroby, autoimmunologiczne zapalenie mięśnia sercowego, autoimmunologiczną neutropenię, autoimmunologiczne zapalenie jajnika i zapalenie jądra, autoimmunologiczną małopłytkowość, autoimmunologiczną pokrzywkę, chorobę Behceta, pemfigoid pęcherzowy, kardiomiopatię, zespół Castlemana, celiaklia sprue-zapalenie skóry, zespół chronicznego zmęczenia i dysfunkcji odporności, przewlekłą zapalną polineuropatię demielinizacyjną, zespół Churga- Straussa, pemfigoid bliznowaciejący, zespół CREST, chorobę zimnych aglutynin, chorobę

79 1 20 2 30 Leśniowskiego-Crohna, zapalenie skórno-mięśniowe, liszaj rumieniowaty, mieszaną krioglobulinemii, niedobór czynnika VIII, fibromyalgia-fibromyositis, kłębuszkowe zapalenie nerek, chorobę Gravesa, Guillain-Barre, zespół Goodpasture, chorobę przeszczep przeciwko gospodarzowi (GVHD), chorobę Hashimoto, hemofilię A, idiopatyczne zwłóknienie płuc, idiopatyczną plamicę małopłytkową (ITP), neuropatię IgA, polineuropatie IgM, małopłytkowość immunologiczną zaleŝną, młodzieńcze zapalenie stawów, chorobę Kawasaki, liszaj płaski, toczeń rumieniowaty, Choroba Meniere'a, mieszaną chorobę tkanki łącznej, stwardnienie rozsiane (MS), cukrzycę typu 1, miastenię, pęcherzycę pospolitą, anemię złośliwą, guzkowe zapalenie tętnic, zapalenie chrząstek, zespoły wielogruczołowe, polimialgię reumatyczna, zapalenie wielomięśniowe i zapalenie skórno-mięśniowe, pierwotną agammaglobinulinemia, pierwotną marskość Ŝółciową wątroby, łuszczycę, łuszczycowe zapalenia stawów, objaw Reynauda, zespół Reitera, reumatoidalne zapalenie stawów (RA), sarkoidozę, twardzinę skóry, zespół Sjogren'a, odrzucenie przeszczepu litego narządu, zespół sztywności uogólnionej, toczeń rumieniowaty układowy (SLE), chorobę Takayasu, zapalenie tętnicy skroniowej/olbrzymiokomórkowe zapalenie tętnic, zakrzepowa plamica małopłytkowość, wrzodziejące zapalenie jelita grubego, zapalenie błony naczyniowej oka, zapalenie naczyń takie, jak opryszczkowe zapalenie naczyń skóry, bielactwo, oraz ziarniniak Wegenera. [0181] Wskazania autoimmunologiczne, które moŝna leczyć przez przeciwciała anty- CD19 według niniejszego wynalazku obejmują, bez ograniczania do wymienionych, reumatoidalne zapalenie stawów (RA), układowy toczeń rumieniowaty (SLE lub toczeń), stwardnienie rozsiane, zespół Sjogrena, oraz idiopatyczna plamica małopłytkowa (ITP). [0182] Zaburzenia zapalne obejmują tu zespół ostrej niewydolności oddechowej (ARDS), ostre septyczne zapalenie stawów, adiuwantowe zapalenie stawów, młodzieńcze idiopatyczne zapalenie stawów, alergiczne zapalenie mózgu i rdzenia, alergiczny nieŝyt nosa, alergiczne zapalenie naczyń, alergia, astma, miaŝdŝyca, przewlekłe zapalenie wyniku przewlekłych infekcji wirusowych i bakteryjnych, przewlekłą obturacyjną chorobę płuc (COPD), chorobę wieńcowa, zapalenie mózgu, zapalenie jelit, zapalną osteolizę, zapalenie związane z ostrymi i opóźnionymi reakcjami nadwraŝliwości, zapalenie związane z nowotworami, urazy nerwów obwodowych lub choroby demielinizacyjne, zapalenia związane z urazem tkanek takie, jak oparzenia i niedokrwienie, zapalenie ze względu na zapalenie opon mózgowych, zespół uszkodzenia wielonarządowego, zwłóknienie płuc, sepsa i wstrząs septyczny, zespół Stevens-Johnsona, niezróŝnicowana artropia, oraz niezróŝnicowana spondyloartropatia.

80 1 20 2 30 3 [0183] Choroby zakaźne obejmują tu choroby spowodowane przez patogeny takie, jak wirusy, bakterie, grzyby, pierwotniaki, oraz pasoŝyty. Choroby zakaźne mogą być spowodowane przez wirusy w tym adenowirus, wirus cytomegalii, dengi, Epstein-Barra, Hanta, zapalenie wątroby A, zapalenie wątroby typu B, zapalenia wątroby typu C, opryszczki typu I, opryszczki typu II, ludzkiego wirusa niedoboru odporności, (HIV), ludzkiego wirusa brodawczaka (HPV), grypy, odry, świnki, wirusów papova, polio, wirusa RSV, księgosuszu, rinowirusów, rotawirusów, róŝyczki, wirusa SARS, ospy, wirusowego zapalenie opon mózgowych, i podobnych. ZakaŜenia choroby mogą być równieŝ spowodowane przez bakterie, w tym Bacillus antracis, Borrelia burgdorferi, Campylobacter jejuni, Chlamydia trachomatis, Clostridium botulinum, Clostridium tetani, Diptheria, E. coli, Legionella, Helicobacter pylori, Mycobacterium rickettsia, Mycoplasma neisseria, Pertussis, Pseudomonas aeruginosa, S. Pneumonia, Streptococcus, Staphylococcus, Vibria cholerae, Yersinia pestis, i podobne. Choroby zakaźne mogą być takŝe spowodowane przez grzyby takie, jak Aspergillus fumigatus, Blastomyces dermatitidis, Candida albicans, Coccidioides immitis, Cryptococcus neoformans, Histoplasma capsulatum, Penicillium marneffei, i podobne. Choroby zakaźne mogą być równieŝ spowodowane przez pierwotniaki i pasoŝyty, takie jak chlamydia, kokzidioa, Leishmania, malaria, Rickettsia, Trypanosoma, i podobne. [0184] Ponadto, przeciwciała według niniejszego wynalazku mogą być stosowane w zapobieganiu lub leczeniu innych stanów, w tym bez ograniczania do wymienionych, chorób serca, takich jak niewydolność serca (CHF), zapalenia mięśnia sercowego i innych stanów mięśnia sercowego; choroby skóry, takie jak trądzik róŝowaty, trądzik i wyprysk; stanów kości i zębów, takie jak utrata kości, osteoporoza, choroba Pageta, histiocytoza komórek Langerhansa, chorób przyzębia, osteopenii z nieuŝywania, osteomalacji, dysplazji włóknistej pojedynczej kości, dysplazji włóknistej wielu kości, przerzutów do kości, leczenia bólu kości, humoralnej hiperkalcemii nowotworowej, odbudowy przyzębia, rdzenia kręgowego i złamania kości; stany metaboliczne, takie jak choroba Gauchera; stanów endokrynologicznych takie, jak zespół Cushinga; i stanów neurologicznych. [018] Wiele receptorów, które mogą wchodzić w interakcje z przeciwciałami według niniejszego wynalazku jest polimorficznych w populacji ludzi. Dla danego pacjenta lub populacji pacjentów, na skuteczność przeciwciała według niniejszego wynalazku, moŝe wpływać obecność lub nieobecność specyficznego polimorfizmu w białku. Na przykład, FcγRIIIA jest polimorficzny w pozycji 18, która jest zazwyczaj albo V (wysokie powinowactwo), albo F (niskie powinowactwo). Obserwuje się, Ŝe pacjenci z homozygotycznym genotypem V/V wykazują lepszą odpowiedź kliniczną na leczenie przeciwciałem anty-cd20 Rituxan (rytuksymabem), prawdopodobne, poniewaŝ ci pacjenci ustawiają sil-

81 1 20 2 30 3 niejszą odpowiedź NK (Dall Ozzo i współpr. (2004) Cancer Res. 64:4664-9). Dodatkowe polimorfizmy obejmują, bez ograniczania do wymienionych, FcγRIIA R131 lub H131, a o takich polimorfizmach wiadomo, Ŝe albo zwiększają, albo zmniejszają wiązanie Fc i późniejszą aktywność biologiczna, zaleŝnie od polimorfizmu przeciwciała według niniejszego wynalazku mogą wiązać się preferencyjnie do określonej formy polimorficznej receptora, na przykład FcγRIIIA 18 V, lub wiązać się z równowaŝnym powinowactwem do wszystkich polimorfizmów w określonej pozycji w receptorze, na przykład obu polimorfizmów 18V i 18F dla FcγRIIIA. W korzystnym przykładzie wykonania, przeciwciała według niniejszego wynalazku, mogące wykazywać równowaŝne wiązanie do polimorfizmów, moŝna wykorzystać w przeciwciele w celu wyeliminowania róŝnicy skuteczności obserwowanej u pacjentów z róŝnymi polimorfizmami. Taka właściwość moŝe dać większą spójność odpowiedzi terapeutycznej i zmniejszyć populację pacjentów nieodpowiadających. Taki wariant z Fc identycznym wiązaniem do polimorfizmów receptora mógł zwiększyć aktywność biologiczną taką, jak ADCC, CDC lub czas półtrwania w krąŝeniu, lub alternatywnie zmniejszyć aktywność, za pomocą modulacji wiązania do odpowiednich receptorów Fc. Przeciwciała według niniejszego wynalazku mogą wiązać się z wyŝszym lub niŝszym powinowactwem do jednego z polimorfizmów receptora, albo podkreślając istniejące róŝnice w wiązaniu, albo odwracając róŝnicę. Taka właściwość moŝe umoŝliwić stworzenie terapii szczególnie dostosowanych do skuteczności w populacji pacjentów posiadających taki polimorfizm. Na przykład, populacja pacjentów posiadających polimorfizm o wyŝszym powinowactwie do receptora hamującego takiego, jak FcγRIIB moŝe otrzymać lek zawierający przeciwciało ze zmniejszonym wiązaniem do takiej formy polimorficznej receptora, tworząc bardziej skuteczny lek. [0186] Pacjenci mogą być poddawani skriningowi w odniesieniu do jednej lub większej liczby polimorfizmów aby przewidzieć skuteczność przeciwciała według niniejszego wynalazku. Informacje te mogą być wykorzystane, na przykład, do wybrania pacjentów, których naleŝy włączyć lub wyłączyć z badań klinicznych lub, po dopuszczeniu, aby zapewnić wytyczne dla lekarzy i pacjentów w zakresie odpowiednich dawek i moŝliwości leczenia. Na przykład, u pacjentów którzy są homozygotyczni lub heterozygotyczni w odniesieniu do FcγRIIIA 18F leki przeciwciała takie, jak anty-cd20 mab, Rytuksymab są mało skuteczne (Carton 2002 Blood 99: 74-78; Weng 2003 J. Clin. Oncol. 21: 3940-3947); tacy pacjenci mogą wykazywać znacznie lepszą odpowiedź kliniczną na przeciwciała według niniejszego wynalazku. Pacjenci mogą być wybrani w celu włączenia ich do badań klinicznych dla przeciwciał według niniejszego wynalazku, jeŝeli ich genotyp wskazuje, Ŝe mogą oni wykazywać znacznie lepsze odpowiedzi na przeciwciało według niniejszego

82 1 20 2 30 3 wynalazku w porównaniu do jednego lub większej liczby obecnie stosowanych terapeutycznych przeciwciał. Odpowiednie dawkowanie i schematy leczenia są określane za pomocą takich informacji genotypu. Pacjentów wybiera się pod kątem włączenia ich do badania klinicznego lub pod kątem otrzymania leczenia po dopuszczeniu na podstawie ich genotypu polimorfizmu, przy czym takie leczenie zawiera przeciwciało specyficznie zaprojektowane aby było skuteczne dla takiej populacji, albo alternatywnie, gdy takie leczenie zawiera przeciwciała, które nie wykazują aktywności róŝnicowej w stosunku do róŝnych form polimorfizmu. [0187] Ujawnione są tu badania diagnostyczne w celu identyfikacji pacjentów, którzy mogą pokazać pozytywną odpowiedź kliniczną na przeciwciało według niniejszego wynalazku, lub którzy mogą wykazywać znacznie lepszą odpowiedź podczas leczenia przeciwciałem według niniejszego wynalazku versus jeden lub większa liczba obecnie stosowanych terapeutyków przeciwciał. MoŜe być uŝyta dowolna, znane w dziedzinie, ilość sposobów określania polimorfizmów FcγR u ludzi. [0188] Ponadto moŝna przeprowadzić prognostyczne badania na próbkach klinicznych takich, jak próbki krwi i tkanek. Takie testy mogą być oznaczeniem aktywności funkcji efektorowej, w tym bez ograniczania do wymienionych, ADCC, CDC, fagocytozy, oraz opsonizacji, lub uśmiercania, bez względu na mechanizm, mechanizm nowotworowy lub inne komórki patogenne. [0189] Testy ADCC, takie jak opisane powyŝej, mogą być zastosowane do przewidywania skuteczności danego przeciwciała według niniejszego wynalazku dla konkretnego pacjenta. Takie informacje mogą być stosowane w celu identyfikacji pacjentów pod kątem ich włączenia lub wyłączenia z badań klinicznych lub w celu informacji odnośnie odpowiednich dawkowań oraz schematów leczenia. Takie informacje mogą równieŝ być stosowane w celu wybrania leku, który zawiera określone przeciwciało, które wykazuje najwyŝszą aktywność w takim teście. Formulacja [0190] RozwaŜa się kompozycje farmaceutyczne, w których formułuje się przeciwciało według niniejszego wynalazku, takie, jak to określone w zastrzeŝeniach, i farmaceutycznie dopuszczalny nośnik. Formulacje przeciwciała według niniejszego wynalazku mogą być otrzymane w celu przechowania, przez zmieszanie wymienionego przeciwciała, posiadającego poŝądany stopień czystości, z opcjonalnymi farmaceutycznie dopuszczalnymi nośnikami, substancjami pomocniczymi lub stabilizatorami (Remington s Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed., 1980), w postaci liofilizowanych formulacji lub wodnych roztworów. Dopuszczalne nośniki, substancje pomocnicze, lub stabilizatory są nie-

83 1 20 2 30 3 toksyczne dla biorców w stosowanych dawkach i stosowanych stęŝeniach, oraz obejmują bufory takie, jak fosforanu, cytrynianu, octanu, i innych kwasów organicznych; przeciwutleniacze obejmują kwas askorbinowy i metioninę; konserwanty (takie, jak chlorek oktadecylodimetylobenzyloamoniowy; chlorku heksametoniowy; chlorek benzalkonium, chlorek benzethoniowy; fenol, alkohol butylowy lub benzylowy; parabeny alkilowe, takie jak metylo lub propyloparaben; katechol; rezorcynol; cykloheksanol; 3-pentanol; i m- krezol); polipeptydy o niskiej masie cząsteczkowej (mniej niŝ około reszt); białka takie, jak albumina surowicy, Ŝelatyna, lub immunoglobuliny; hydrofilowe polimery takie, jak poliwinylopirolidon; aminokwasy takie, jak glicyna, glutamina, asparagina, histydina, arginina, lub lizyba; monosacharydy, disacharydy, oraz inne węglowodany, w tym glukoza, mannoza lub dekstryna; środki chelatujące takie, jak EDTA; cukry takie, jak sacharoza, mannitol, trehaloza lub sorbitol; środki słodzące i inne środki smakowo-zapachowe; wypełniacze takie, jak celuloza mikrokrystaliczna, laktoza, skrobia kukurydziana i inne; środki wiąŝące; dodatki; barwniki; tworzące sole przeciwjony, takie jak sód; kompleksy metali (np. kompleksy Zn-białko); i/lub niejonowe środki powierzchniowo czynne takie, jak TWEEN, PLURONICS lub glikol polietylenowy (PEG). W korzystnym przykładzie wykonania, kompozycja farmaceutyczna, która zawiera przeciwciało według niniejszego wynalazku moŝe być w postaci rozpuszczalnej w wodzie takiej, jak są obecne w farmaceutycznie dopuszczalnych solach, co ma obejmować zarówno sole addycyjne z kwasami i z zasadami. Farmaceutycznie dopuszczalna sól addycyjna z kwasem dotyczy tych soli, które zachowują biologiczną skuteczność wolnych zasad i które nie są biologicznie lub w inny sposób niepoŝądane, utworzone z kwasami nieorganicznymi, takimi jak kwas solny, kwas bromowodorowy, kwas siarkowy, kwas azotowy, kwas fosforowy i podobne, oraz kwasami organicznymi takimi, jak kwas octowy, kwas propionowy, kwas glikolowy, kwas pirogronowy, kwas szczawiowy, kwas maleinowy, kwas malonowy, kwas bursztynowy, kwas fumarowy, kwas winowy, kwas cytrynowy, kwas benzoesowy, kwas cynamonowy, kwas migdałowy, kwas metanosulfonowy, kwas etanosulfonowy, kwas p- toluenosulfonowy, kwas salicylowy, i podobne. Farmaceutycznie dopuszczalne sole addycyjne z zasadami obejmują te pochodzące z zasad nieorganicznych takie, jak sole sodu, potasu, litu, amonu, wapnia, magnezu, Ŝelaza, cynku, miedzi, manganu, glinu i podobne. Szczególnie korzystne są sole amoniowe, potasu, sodu, wapnia i magnezu. Sole pochodzące od farmaceutycznie dopuszczalnych zasad organicznych obejmują nietoksyczne sole amin pierwszorzędowych, drugorzędowych i trzeciorzędowych amin, podstawionych amin, w tym naturalnie występujących podstawionych amin, cyklicznych amin i zasadowych Ŝywic jonowymiennych takich, jak izopropyloamina, trimetyloamina, dietyloamina,

84 1 20 2 30 3 trietyloamina, tripropyloamina i etanoloamina. Formulacje do zastosowania do podawania in vivo są korzystnie sterylne. Wykonuje się to w prosty sposób przez sączenie przez membrany do filtracji sterylizacyjnej lub inne sposoby. [0191] Przeciwciała tu ujawnione mogą być równieŝ formulowane w postaci immunoliposomów. Liposom jest małym pęcherzykiem zawierającym róŝnego rodzaju lipidy, fosfolipidy i/lub surfaktanty, który jest przydatny do dostarczania środka terapeutycznego ssakowi. Liposomy zawierające przeciwciało wytwarza się metodami znanymi w dziedzinie, takimi, jak opisano w Epstein i współpr., 198, Proc Natl Acad Sci USA, 82:3688; Hwang i współpr., 1980, Proc Natl Acad Sci USA, 77:4030; US 4,48,04; US 4,44,4; i PCT WO 97/38731. Liposomy o wydłuŝonym czasie krąŝenia są ujawnione w US,013,6. Składniki liposomu są zazwyczaj ułoŝone dwuwarstwowo, podobnie do ułoŝenia lipidów w błonach biologicznych. Szczególnie uŝyteczne liposomy moŝna wytwarzać metody odparowywania odwrotnej fazy z kompozycją lipidową zawierającą fosfatydylocholinę, cholesterol i fosfatydyloetanoloaminy w postaci pochodnej PEG (PEG-PE). Liposomy wytłacza się przez sączki o określonej wielkości porów dla uzyskania liposomów o poŝądanej średnicy. Środek chemioterapeutyczny lub inne terapeutycznie aktywna substancja jest ewentualnie zawarta w liposomach (Gabizon i współpr., 1989, J National Cancer Inst 81:1484). [0192] Przeciwciało i inne terapeutycznie czynne mogą być równieŝ uwięzione w mikrokapsułkach, wytwarzanych sposobami, w tym bez ograniczania do wymienionych, techniki koacerwacji, polimeryzacji międzyfazowej (na przykład stosując hydroksymetylocelulozę lub mikrokapsułki Ŝelatynowe, lub mikrokapsułki z poli(metakrylan metylu),), koloidalnych układach dostarczania leków (na przykład, liposomy, mikrokuleczki albuminy, mikroemulsje, nanocząstki i nanokapsułki), oraz makroemulsje. Takie techniki ujawniono w Remington s Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed., 1980. MoŜna wytwarzać preparaty o przedłuŝonym uwalnianiu. Odpowiednie przykłady preparatów o przedłuŝonym uwalnianiu obejmują półprzepuszczalne matryce stałego polimeru hydrofobowego, które to matryce są w postaci ukształtowanych artykułów, np. filmów, lub mikrokapsułek. Przykłady macierzy o przedłuŝonym uwalnianiu obejmują poliestry, hydroŝele (na przykład poli(2-hydroksyetylo-metakrylan)), lub poli(alkohol winylowy)), polilaktydy (US 3,773,919), kopolimery kwasu L-glutaminowego i gamma-etylo-l glutaminianu, nie ulegający rozkładowi etylen-octan winylu, degradowalne kopolimery kwasu mlekowego i kwasu glikolowego takie, jak Lupron Depot (które są wstrzykiwalnymi mikrokuleczkami z kopolimeru kwasu mlekowego i kwasu glikolowego oraz octanu leuprolidu), kwas poli- D-(-)-3-hydroksymasłowy, oraz ProLease (dostępny w handlu z Alkermes), który jest

8 1 20 2 30 układem dostarczania opartym na mikrokuleczkach złoŝonym z poŝądanej bioaktywnej cząsteczki wprowadzonej do macierzy poli-dl-laktydu-ko-glikolidu (PLG). Podawanie [0193] Podawanie kompozycji farmaceutycznej zawierającej przeciwciało według niniejszego wynalazku, korzystnie w postaci jałowego roztworu wodnego, moŝe odbywać się w róŝny sposób, w tym, bez ograniczania do wymienionych, doustnie, podskórnie, doŝylnie, donosowo, do ucha, przezskórnie, miejscowo (np. Ŝele, maści, kremy, lotiony, itd.), dootrzewnowo, domięśniowo, do płuc, do pochwy, pozajelitowo, doodbytniczo, lub doocznie. W niektórych przypadkach, na przykład do leczenia ran, zapalenia, itd., przeciwciało moŝe być stosowane bezpośrednio jako roztwór lub sprej. Jak wiadomo z dziedziny, kompozycja farmaceutyczna moŝe być formulowana w związku z tym zaleŝnie od sposobu wprowadzenia. [0194] Podskórne podawanie moŝe być korzystne w pewnych okolicznościach poniewaŝ pacjent moŝe samodzielnie podać sobie kompozycję farmaceutyczną. Wiele terapeutyków białkowych nie są wystarczająco silne, aby umoŝliwić formulacji terapeutycznie skuteczną dawkę w maksymalnej dopuszczalnej ilości do podawania podskórnego. Ten problem mo- Ŝe być rozwiązany w części za pomocą formulacji białka zawierającej argininę-hcl, histydynę, oraz polisorbat (patrz WO 0409168). Przeciwciała według niniejszego wynalazku mogą być bardziej nadawać się do podskórnego podawania ze względu na, na przykład, zwiększoną siłę działania, ulepszony czas półtrwania w surowicy, lub zwiększoną rozpuszczalność. [019] Jak wiadomo z dziedziny, terapeutyki białkowe są często dostarczane przez wlew IV lub bolus. Przeciwciała według niniejszego wynalazku mogą być równieŝ dostarczane przy uŝyciu takich metod. Na przykład, podawanie moŝe być doŝylne przez wlew doŝylny z 0.9% chlorkiem sodu jako płynem infuzyjnym. [0196] Dostarczanie do płuc moŝna przeprowadzić przy uŝyciu inhalatora albo nebulizera i formulacji zawierającej środek aerozolujący. Na przykład moŝna wykorzystać technologię inhalacyjną AERx dostępną w handlu z Aradigm, lub płucny system dostarczania Inhance dostępny w handlu z Nektar Therapeutics. Przeciwciała według niniejszego wynalazku mogą być bardziej odpowiednie do dostarczania dopłucnego. FcRn występuje w płucach, oraz moŝe promować transport z płuc do krwiobiegu (np. Syntonix WO 04004798, Bitonti i współpr. (2004) Proc. Nat. Acad. Sci. 1:9763-8). W związku z tym, przeciwciała, które wiąŝą FcRn skuteczniej w płucach lub, które są uwalniane skuteczniej do krwiobiegu, mogą poprawić biodostępność po podaniu dopłucnym. Przeciwciała według niniej-

86 1 20 2 30 3 szego wynalazku mogą bardziej nadawać się do podawania dopłucnego z powodu, na przykład, zwiększonej rozpuszczalności lub zmienionego punktu izoelektrycznego. [0197] Ponadto, przeciwciała według niniejszego wynalazku mogą się bardziej nadawać do doustnego dostarczania ze względu na, na przykład, ulepszoną stabilność w Ŝołądkowym ph i zwiększoną odporność na proteolizę. Ponadto, FcRn wydaje się być eksprymowane w nabłonku jelita dorosłych (Dickinson i współpr. (1999) J. Clin. Invest. 4:903-11), a więc przeciwciała o ulepszonych profilach interakcji FcRn mogą wykazywać zwiększoną biodostępność po podaniu doustnym. Transport przeciwciała mediowany FcRn moŝe równieŝ występować w innych błonach śluzowych takich, jak tych, które występują w przewodzie pokarmowym, drogach oddechowych, oraz drogach rodnych (Yoshida i współpr. (2004) Immunity 20:769-83). [0198] Ponadto, znana jest w dziedzinie dowolna liczba układów dostarczania i mogą one być stosowana do podawania przeciwciała według niniejszego wynalazku. Przykłady obejmują, bez ograniczania do wymienionych, enkapsulację w lipozomach, mikrocząstkach, mikrokulkach (np. mikrokulki PLA/PGA), i podobnych. Alternatywnie, moŝna stosować implant z porowatego, nieporowatego materiału, lub Ŝelatyny, w tym włókien lub błon. Układy o przedłuŝonym uwalnianiu mogą zawierać materiał polimerowy lub macierz taką, jak poliestry, hydroŝele, poli(alkohol winylowy), polilaktydy, kopolimery kwasu L- glutamowego i L-gutaminianu etylu, etylen-octan winylu, kopolimery kwasu mlekowykwas glikolowy takie, jak Lupron Depot, oraz kwas poli-d-(-)-3-hydroksymasłowy. MoŜliwe jest równieŝ podanie kwasu nukleinowego kodującego przeciwciało według obecnego wynalazku, na przykład przez zakaŝenie retrowirusowe, bezpośrednie wstrzyknięcie, lub powlekanie lipidami, powierzchniowe receptory komórki, lub inne środki transfekcji. We wszystkich przypadkach, moŝna stosować kontrolowane układy uwalniania do uwalniania przeciwciała w miejscu lub blisko poŝądanego miejsca działania. Dawkowanie [0199] Ilości dawkowania i częstotliwości podawania są wybrane tak, aby były terapeutycznie lub profilaktycznie skuteczne. Jak wiadomo z dziedziny, dostosowania dotyczące degradacji białek, dostarczanie układowe versus miejscowe, oraz szybkość syntezy nowej proteazy, jak i wiek, masa ciała, ogólny stan zdrowia, płeć, dieta, czas podawania, interakcje z lekami i stopień zaawansowania stanu mogą być niezbędne, oraz zostaną ustalone rutynowymi eksperymentami przez znawcę w dziedzinie. [0200] StęŜenie terapeutycznie aktywnego przeciwciała w formulacji moŝe się zmieniać od około 0.1 do 0 % wagowych. W korzystnym przykładzie wykonania, stęŝenie przeciwciała mieści się w zakresie 0.003 do 1.0 molowym. W celu leczenia pacjentów, moŝna po-

87 1 20 2 30 3 dać terapeutycznie skuteczną dawkę przeciwciała według niniejszego wynalazku. Przez terapeutycznie skuteczną dawkę rozumie się tu dawki, które wytwarzają efekty, dla których się je podaje. Dokładna dawka zaleŝeć będzie od celu leczenia, oraz będzie ustalona przez znawcę w dziedzinie z zastosowaniem znanych technik. Dawkowania mogą mieścić się w zakresie od 0.0001 do 0 mg/kg masy ciała lub więcej, na przykład 0.1, 1,, lub 0 mg/kg masy ciała, przy czym 1 do mg/kg jest korzystne. [0201] MoŜna stosować tylko pojedyncze dawki przeciwciała. MoŜna podawać wielokrotne dawki przeciwciała. Czas, który upłynął między podaniami moŝe być mniejszy niŝ 1 godzina, około 1 godzina, około 1-2 godziny, około 2-3 godziny, około 3-4 godziny, około 6 godzin, około 12 godzin, około 24 godziny, około 48 godzin, około 2-4 dni, około 4-6 dni, około 1 tydzień, około 2 tygodnie, lub więcej niŝ 2 tygodnie. [0202] Przeciwciała według niniejszego wynalazku mogą być podawane w metronomicznych systemach dawkowania, albo w postaci ciągłego wlewu, albo częstego podawania bez dłuŝszych okresów przerw. Takie metronomiczne podawanie moŝe obejmować dawkowania w stałych odstępach czasu, bez przerw. Typowo takie schematy obejmują chroniczny nisko dawkowy lub ciągły wlew przez dłuŝszy okres czasu, na przykład 1-2 dni, 1-2 tygodni, 1-2 miesięcy, lub do 6 miesięcy lub więcej. Zastosowanie niŝszych dawek moŝe zmniejszyć efekty uboczne i potrzeba okresów przerw. [0203] Przeciwciało według niniejszego wynalazku i jeden lub większa liczba innych środków profilaktycznych lub terapeutycznych mogą być cyklicznie podawane pacjentowi. Cykliczna terapia wykorzystuje podawanie pierwszego środka o jednym czasie, drugiego środka o drugim czasie, ewentualnie dodatkowych środków w dodatkowych czasach, opcjonalnie okres przerwy, oraz następnie powtórzenie tej sekwencji podawania jeden lub większą liczbę razy. Liczba cykli wynosi typowo od 2 -. Cykliczne leczenie moŝe zmniejszyć rozwój odporności na jeden lub większą liczbę środków, moŝe zminimalizować skutki uboczne, lub moŝe polepszać skuteczność leczenia. Terapie kombinowane [0204] Przeciwciała według niniejszego wynalazku mogą być podawane jednocześnie z jednym lub większą liczbą innych schematów lub środków terapeutycznych. Dodatkowe schematy lub środki terapeutyczne mogą być stosowane w celu poprawy skuteczności lub bezpieczeństwa przeciwciała. RównieŜ, dodatkowe schematy lub środki terapeutyczne mogą być stosowane w leczeniu tej samej choroby lub ich współwystępowania, niŝ zmiany działania przeciwciała Na przykład, przeciwciało według niniejszego wynalazku moŝe być podawane pacjentowi wraz z chemioterapią, radioterapią, lub zarówno chemoterapią, jak i terapią radiacyjną. Przeciwciało według niniejszego wynalazku moŝe być podawane w

88 1 20 2 30 3 kombinacji z jednym lub większą liczbą innych środków profilaktycznych lub terapeutycznych, w tym bez ograniczania do wymienionych, środków cytotoksycznych, środków chemioterapeutycznych, cytokin, środków hamujących wzrost, środków antyhormonalnych, inhibitorów kinaz, środków antyangiogennych, środków ochronnych dla serca, środków immunostymulujących, środków immunosupresyjnych, środków promujących proliferację komórek hematologicznych, inhibitorów angiogenezy, inhibitorów białek kinazy tyrozynowej (PTK), dodatkowych przeciwciała, inhibitorów FcγRIIb lub innych receptorów Fc, lub innych środków terapeutycznych. [020] Określenia w kombinacji z i wspólne podawanie nie są ograniczone do podawania wymienionych środków profilaktycznych lub terapeutycznych w dokładnie tym samym czasie. Zamiast tego, naleŝy rozumieć, Ŝe przeciwciało według niniejszego wynalazku i inny środek lub środki mogą być podawane w sekwencji i w przedziale czasu tak, Ŝe mogą one ze sobą działać w celu zapewnienia korzyści, która jest większa w porównaniu z leczeniem tylko albo samym przeciwciałem według niniejszego wynalazku, albo innym środkiem lub środkami. Korzystne jest, Ŝe przeciwciało i inny środek lub środki działają addytywnie, oraz szczególnie korzystnie działają synergicznie. Takie cząsteczki są odpowiednio obecne w kombinacji w ilościach, które są skuteczne pod względem zamierzonego celu. Specjalista lekarz moŝe odpowiednią dawkę lub dawki kaŝdego czynnika terapeutycznego określić doświadczalnie, lub przez rozwaŝenie farmakokinetyki i trybów działania środków, jak i odpowiednie czasy i sposoby podawania. [0206] Przeciwciała według niniejszego wynalazku mogą być podawane z jedną lub większą liczbą dodatkowych cząsteczek zawierających przeciwciała lub Fc. Przeciwciała według niniejszego wynalazku mogą być podawane razem z jednym lub większą liczbą innych przeciwciał, które wykazują skuteczność w leczeniu tej samej choroby lub dodatkowych chorób współistniejących; na przykład mogą być podawane dwa przeciwciała, które rozpoznają dwa antygeny, nadeksprymowane w danym rodzaju raka, lub dwa antygeny, które pośredniczą w patogenezie choroby autoimmunologicznej lub zakaźnej. [0207] Przykłady przeciwciał antyrakowych, które mogą być podawane razem obejmują, bez ograniczania do wymienionych, przeciwciała antygenu powierzchniowego komórki anty-17-1a taki, jak Panorex (edrekolomab); przeciwciała anty-4-1bb; przeciwciała anty-4dc; przeciwciała anty-a33 takie, jak A33 i CDP-833; przeciwciała przeciwko integrynie anty-α4β1 takie, jak natalizumab; przeciwciała przeciwko integrynie anty-α4β7 takie, jak LDP-02; przeciwciała przeciwko integrynie anty-αvβ1 takie, jak F-200, M-200, oraz SJ-749; przeciwciała przeciwko integrynie anty-αvβ3 takie, jak abciksimab, CNTO-9, Mab-17E6, oraz Vitaxin ; przeciwciała przeciko czynnikowi dopełniacza (C) takie,

89 1 20 2 30 3 jak G1.1; przeciwciała anty-ca12 takie, jak OvaRex (oregowomab); przeciwciała anty-cd3 takie, jak Nuvion (wisilizumab) i Rexomab; przeciwciała anty-cd4 takie, jak IDEC-11, MDX-CD4, OKT4A; przeciwciała anty-cd6 takie, jak Oncolysin B i Oncolysin CD6; przeciwciała anty-cd7 takie, jak HB2; przeciwciała anty-cd19 takie, jak B43, MT-3, oraz Oncolysin B; przeciwciała anty-cd20 takie, jak 2H7, 2H7.v16, 2H7.v114, 2H7.v11, Bexxar (tositumomab, anty-cd20 znakowany I-131), Rituxan (rytuksymab), oraz Zevalin ) (ibrytumomab tiuksetanu, anty-cd20 znakowany Y-90); przeciwciała anty-cd22 takie, jak Lymphocide (epratuzumab, anty-cd22 znakowany Y-90); przeciwciała anty-cd23 takie, jak IDEC-12; przeciwciała anty-cd2 takie, jak basiliksimab i Zenapax (daclizumab); przeciwciała anty-cd30 takie, jak AC, MDX-060, oraz SGN- 30; przeciwciała anty-cd33 takie, jak Mylotarg (gemtuzumab ozogamicm), Oncolysin M, oraz Smart M19; przeciwciała anty-cd38; przeciwciała anty-cd40 takie, jak SGN-40 i toralizumab; przeciwciała anty-cd40l takie, jak c8, Antova, oraz IDEC-131; przeciwciała anty-cd44 takie, jak biwatuzumab; przeciwciała anty-cd46; przeciwciała anty- CD2 takie, jak Campath (alemtuzumab); przeciwciała anty-cd takie, jak SC-1; przeciwciała anty-cd6 takie, jak hun901-dm1; przeciwciała anty-cd64 takie, jak MDX-33; przeciwciała anty-cd66e takie, jak XR-303; przeciwciała anty-cd74 takie, jak IMMU- 1; przeciwciała anty-cd80 takie, jak galiximab i IDEC-114; przeciwciała anty-cd89 takie, jak MDX-214; przeciwciała anty-cd123; przeciwciała anty-cd138 takie, jak B-B4- DM1; przeciwciała anty-cd 146 takie, jak AA-98; przeciwciała anty-cd148; przeciwciała anty-cea takie, jak ct84.66, labetuzumab, oraz Pentacea ; przeciwciała anty-ctla-4 takie, jak MDX-1; przeciwciała anty-cxcr4; przeciwciała anty-egfr takie, jak ABXEGF, Erbitux (cetuximab), IMC-C22, oraz Merck Mab 42; przeciwciała anty- EpCAM takie, jak Crucell s anty-epcam, ING-1, oraz IS-IL-2; przeciwciała przeciwko efrynie B2/EphB4; przeciwciała anty-her2 Herceptin, MDX-2; przeciwciała anty-fap (białko aktywacja fibroblastów) takie, jak sibrotuzumab; przeciwciała anty-ferrytyna takie, jak NXT-211; przeciwciała anty-fgf-1; przeciwciała anty-fgf-3; przeciwciała anty-fgf- 8; przeciwciała anty-fgfr, przeciwciała anty-fibryna; przeciwciała anty-g20 takie, jak WX-G20 i Rencarex ; przeciwciała przeciwko gangliozydowi GD2 takie, jak EMD- 273063 i TriGem; przeciwciała anty-gangliozyd GD3 takie, jak BEC2, KW-2871, oraz mitumomab; przeciwciała anty-gpiib/iiia takie, jak ReoPro; przeciwciała antyheparynaza; przeciwciała anty-her2/erbb2 takie, jak Herceptin (trastuzumab), MDX-2, oraz pertuzumab; przeciwciała anty-hla takie, jak Oncolyn, Smart 1D; przeciwciała anty- HM1.24; przeciwciała anty-icam takie, jak ICM3; przeciwciała anty-receptor IgA; przeciwciała anty-receptor IGr-1 takie, jak CP-71871 i EM-164; przeciwciała anty-igf-1r

90 1 20 2 30 3 takie, jak IMC-A12; przeciwciała anty-il-6 takie, jak CNTO-328 i elsilimomab; przeciwciała anty-il-1 takie, jak HuMax -IL1; przeciwciała anty-kdr; przeciwciała przeciwko laminie ; przeciwciała anty-anmtygen Lewis Y takie, jak Hu3S193 i IGN-311; przeciwciała anty-mcam; przeciwciała anty-mic1 takie, jak BravaRex i TriAb; przeciwciała anty-ncam takie, jak ERJC-1 i ICRT; przeciwciała anty-pem takie, jak Theragyn i Therex; przeciwciała anty-psa; przeciwciała anty-psca takie, jak IG8; przeciwciała anty-ptk; przeciwciała anty-ptn; przeciwciała anty-rankl takie, jak AMG-162; przeciwciała anty-rlip76; przeciwciała anty-antygen SK-1 takie, jak Monopharm C; przeciwciała anty- STEAP; przeciwciała anty-tag72 takie, jak CC49-SCA i MDX-220; przeciwciała anty- TGFβ takie, jak CAT-12; przeciwciała anty-tnf-α takie, jak CDP71, CDP870, D2E7, Humira (adalimumab), oraz Remicade (infliximab); przeciwciała anty-trail-r1 i TRAIL-R2; przeciwciała anty-ve-cadheryna-2; i przeciwciała anty-vla-4 takie, jak Antegren. Ponadto, moŝna wykorzystać anty-idiotypowe przeciwciała w tym bez ograniczania do wymienionych, przeciwciało z epitopem GD3 BEC2 i przeciwciało z epitopem gp72 AD7. Ponadto moŝna uŝyć bispecyficzne przeciwciała, w tym bez ograniczania do wymienionych, przeciwciało Bi20 anty-gd3/cd20. [0208] Przykłady przeciwciał, które mogą być podawane razem w leczeniu choroby autoimmunologicznej lub zapalnej, odrzucenia przeszczepu, GVHD, i podobnych obejmują, bez ograniczania do wymienionych, przeciwciała przeciwko integrynie α4β7 takie, jak LDPch-02, przeciwciała przeciwko integrynie beta2 takie, jak LDP-01, przeciwciała antydopełniacz (C) takie, jak G1.1, przeciwciała anty-cd2 takie, jak BTI- 322, MEDI-07, przeciwciała anty-cd3 takie, jak OKT3, SMART anty-cd3, przeciwciała anty-cd4 takie, jak IDEC-11, MDXCD4, OKT4A, przeciwciała anty-cd11a, przeciwciała anty-cd14 takie, jak IC14, przeciwciała anty-cd18, przeciwciała anty-cd23 takie, jak IDEC 12, przeciwciała anty-cd2 takie, jak Zenapax, przeciwciała anty-cd40l takie, jak c8, Antova, IDEC-131, przeciwciała anty-cd64 takie, jak MDX-33, przeciwciała anty-cd80 takie, jak IDEC-114, przeciwciała anty-cd147 takie, jak ABX-CBL, przeciwciała anty-e-selektyna takie, jak CDP80, przeciwciała anty-gpiib/iiia takie, jak ReoPro/Abcixima, przeciwciała anty-icam-3 takie, jak ICM3, przeciwciała anty-ice takie, jak VX-740, przeciwciała anty-fcγr1 takie, jak MDX-33, przeciwciała anty-ige takie, jak rhumab-e2, przeciwciała anty-il-4 takie, jak SB-240683, przeciwciała anty-il- takie, jak SB-24063, SCH700, przeciwciała anty-il- 8 takie, jak ABX-IL8, przeciwciała anty-interferon gamma, oraz przeciwciała anty-tnfa takie, jak CDP71, CDP870, D2E7, Infliksimab, MAK-19F, przeciwciała anty-vla-4 takie, jak Antegren. Przykłady innych cząsteczek zawierających Fc, które mogą być podawane razem w leczeniu choroby autoimmunologicznej lub zapal-

91 1 20 2 30 3 nej, odrzucenia przeszczepu, GVHD, i podobnych obejmują, bez ograniczania do wymienionych, p7 TNF receptor/fuzja Fc Enbrel (etanercept) i pułapka IL-1 Regenerona. [0209] Przykady przeciwciał, które mogą być podawane razem w leczeniu chorób zakaźnych, obejmują, bez ograniczania do wymienionych, przeciwciała przeciwko wąglikowi takie, jak ABthrax, przeciwciała anty-cmv takie, jak CytoGam i sevirumab, przeciwciała anty-kryptosporidium takie, jak CryptoGAM, Sporidin-G, przeciwciała anty-helicobacter takie, jak Pyloran, przeciwciała przeciwko zapaleniu wątroby typu B takie, jak HepeX-B, Nabi-HB, przeciwciała anty-hiv takie, jak HRG-214, przeciwciała anty-rsv takie, jak felvizumab, HNK-20, palivizumab, RespiGam, oraz przeciwciała przeciwko gronkowcom takie, jak Aurexis, Aurograb, BSYX-A1, oraz SE-Mab. [02] Alternatywnie, przeciwciała według niniejszego wynalazku mogą być podawane razem lub z jedną lub większą liczbą innych cząsteczek, które konkurują o wiązanie do jednej lub większej liczby receptorów Fc. Na przykład, podawanie razem inhibitorów receptora hamującego FcγRIIb moŝe powodować zwiększenie funkcji efektorowej. Podobnie, podawanie razem inhibitorów aktywacji receptorów takich, jak FcγRIIIa moŝe zminimalizować niepoŝądaną funkcję efektorową. Inhibitory receptora Fc obejmują, bez ograniczania do wymienionych, cząsteczki Fc, które zostały zaprojektowane do działania jako konkurencyjne inhibitory wiązania do FcγRIIb, FcγRIIIa lub innych receptorów Fc, jak i inne immunoglobuliny, a konkretnie leczenie zwane IVIg (doŝylna immunoglobulina). Inhibitor moŝe być podawany i pozostawiany do działania przed podaniem przeciwciała. Alternatywnym sposobem osiągnięcia efektu sekwencyjnego dawkowania byłoby to, aby zapewnić natychmiastowe uwalnianie dawki inhibitora receptora Fc i następnie przedłuŝone uwalnianie formulacji przeciwciała według niniejszego wynalazku. Formulacje natychmiastowego uwalniania i kontrolowanego uwalniania mogą być podawane oddzielnie lub być połączone w jednej jednostkowej postaci dawkowania. Podawanie inhibitora FcγRIIb mo- Ŝe być równieŝ stosowane w celu ograniczenia niepoŝądanych reakcji odpornościowych, na przykład odpowiedzi przeciwciała anty-czynnik VIII po podaniu Czynnika VIII chorym na hemofilię. [0211] Przeciwciała według niniejszego wynalazku mogą być podawane ze środkiem chemioterapeutycznym. Przez środek chemioterapeutyczny stosowany w niniejszym opisie rozumie się związek chemiczny uŝyteczny do leczenia raka. Przykłady środków chemioterapeutycznych obejmują, bez ograniczania do wymienionych, środki alkilujące takie, jak tiotepa i cyklofosfamid (CYTOXAN ); alkilosulfoniany takie, jak busulfan, improsulfan i piposulfan; androgeny takie, jak kialusteron, propionian dromostanolonu, epitiostanol, mepitiostan, testolakton; środki przeciwnadnerczowe takie, jak aminoglutetymid, mitotan,

92 1 20 2 30 3 trilostan; antyandrogeny takie, jak flutamid, nilutamid, bikalutamid, leuprolid, oraz goserelina; antybiotyki takie, jak aclacynomycyny, aktynomycyna, autramycyna, azaseryna, bleomycyna, cactinomycyna, kalicheamicyna, karabicyna, kaminomycyna, karzynofilina, chromomycyny, daktynomycyna, daunorubicyna, detorubicyna, 6-diazo--okso-Lnorleucyna, doksorubicyna, epirubicyna, esorubicyna, idarubicyna, marcellomycyna, mitomycyny, kwas mykofenolowy, nogalamycyna, oliwomycyny, peplomycyna, potfiromycyna, puromycyna, kwelamycyna, rodorubicyna, streptonigryna, streptozocyna, tubercydyna, ubenimeks, zinostatyna, zorubicyna; antyestrogeny, w tym na przykład tamoksyfen, raloksyfen, 4()-imidazole hamujące aromatazę, 4-hydroksytamoksyfen, trioksyfen, keoksyfen, LY 117018, onapriston i toremifen (Fareston); anty-metabolity takie, jak metotreksat i -fluorouracyl (-FU); analogi kwasu foliowego, takie jak denopteryna, metotreksat, pteropteryna, trimetreksat; azyrydyny takie, jak benzodopa, karbokwon, meturedopa i uredopa; etylenoiminy i metyloameloaminy, w tym altretaminę, trietylenomelaminę, trietylenofosforoamid, trietylenotiofosforoamid i trimetylolomelaminę; substancje uzupełniające niedobory kwasu foliowego, takie jak kwas frolinowy; iperyty azotowe, takie jak chlorambucyl, chlomafazyna, cholofosfamid, estramustyna, ifosfamid, mechloretamina, chlorowodorek tlenku mechloretaminy, melfalan, nowembichina, fenesteryna, prednimustyna, trofosfamid, iperyt uracylowy; nitrozomoczniki, takie jak karmustyna, chlorozotocyna, fotemustyna, lomustyna, nimustyna, ranimustyna; analogi platyny, takie jak cisplatyna i karboplatyna; winblastynę; platynę; białka takie, jak deiminaza argininowa i asparaginaza; analogi puryn, takie jak fludarabina, 6-merkaptopuryna, tiamipryna, tioguanina; analogi pirymidyn, takie jak ancytabina, azacytydyna, 6-azaurydyna, karmofur, cytarabina, dideoksyurydyna, doksyflurydyna, enocytabina, floksurydyna, -FU; taksany, np. paklitaksel (TAXOL., Bristol-Myers Squibb Oncology, Princeton, N.J.) i docetaksel (TAXOTE- RE., Rhone-Poulenc Rorer, Antony, Francja); inhibitor topoizomerazy RFS 2000; inhibitor syntazy tymidylanowej (taki, jak Tomudex); dodatkowe chemioterapeutyki takie, jak aceglaton; a glikozyd aldofosfamidu; kwas aminolewulinowy; amsakrynę; bestrabucyl; bisantren; edatraksat; defofaminę; demekolcynę; diazykwon; difluorometylomitynę (DM- FO); elfornitynę; octan eliptynium; etoglucyd; azotan galu; hydroksymocznik; lentinan; lonidaminę; mitoguazon; mitoksantron; mopidamol; nitrakrynę; pentostatynę; fenamet; pirarubicynę; kwas podofilinowy; 2-etylohydrazyd; prokarbazynę; PSK ; razoksan; sizofiran; spirogerman; kwas tenuazonowy; triazykwon; 2,2,2"-trichlorotrietyloaminę; uretan; windezynę; dakarbazynę; mannomustynę; mitobronitol; mitolaktol; pipobroman; gacytozynę; arabinozyd ( Ara-C ); cyklofosfamid; tiotepę; chlorambucyl; gemcytabinę; 6- tioguaninę; merkaptopurynę; metotreksat; etopozyd (VP-16); ifosfamid; mitomycynę C;

93 1 20 2 30 3 mitoksantron; winkrystynę; winorelbinę; nawelbinę; nowantron; tenipozyd; daunomycynę; aminopterynę; kselodę; ibandronian; CT-11; kwas retinowy; esperamycyny; kapecytabinę. Mogą być stosowane farmaceutycznie dopuszczalne sole, kwasy i pochodne któregokolwiek z powyŝszych. [0212] Chemioterapeutyk lub inny środek cytotoksyczny moŝe być podawany w postaci proleku. Przez prolek stosowany w niniejszym opisie rozumie się formę prekursora lub pochodną substancji aktywnej farmaceutycznie, która jest mniej cytotoksyczna dla komórek nowotworowych w porównaniu do macierzystego leku i jest zdolna do bycia enzymatycznie aktywowaną lub przekształconą w bardziej aktywną postać macierzystą. Patrz, na przykład Wilman, 1986, Biochemical Society Transactions, 61th Meeting Belfast, 14:37-382; Stella i współpr., Prodrugs: A Chemical Approach to Targeted Drug Delivery, Directed Drug Delivery; i Borchardt i współpr., (ed.):247-267, Humana Press, 198. Proleki mogą prolekami zawierającymi fosforan, prolekami zawierającymi tiofosforan, prolekami zawierającymi siarczan, prolekami zawierającymi peptyd, prolekami modyfikowanymi D-aminokwasami, glikozylowanymi prolekami, prolekami zawierającymi betalaktam, prolekami zawierającymi opcjonalnie podstawiony fenoksyacetamid lub prolekami zawierającymi opcjonalnie podstawiony fenyloacetamid, -fluorocytozyną i innymi prolekami -fluorourydynowymi, które mogą być przekształcone do bardziej aktywnych postaci wolnego leku cytotoksycznego. Przykłady leków cytotoksycznych, które mogą być przekształcone w postać proleku do zastosowania z przeciwciałami według niniejszego wynalazku obejmują, bez ograniczania do wymienionych, dowolne wymienione powyŝej środki chemioterapeutyczne. [0213] Wiele innych środków terapeutycznych moŝe znaleźć zastosowanie do podawania z przeciwciałem według niniejszego wynalazku. Przeciwciało moŝe być podawane ze środkiem antyangiogennym. Przez środek antyangiogenny stosowany w niniejszym opisie rozumie się związek, który blokuje, lub w pewnym stopniu zakłóca, rozwój naczyń krwionośnych. Antyangiogennym czynnikiem moŝe być, na przykład, mała cząsteczka lub białko, na przykład przeciwciało, fuzja Fc, lub cytokina, które wiąŝą się z czynnikiem wzrostu lub receptorem czynnika wzrostu zaangaŝowanymi w promowanie angiogenezy. Korzystnym antyangiogennym czynnikiem jest tu przeciwciało, które wiąŝe się z czynnikiem wzrostu śródbłonka naczyń (VEGF). MoŜna zastosować równieŝ inne środki, które hamują sygnałowanie przez VEGF, na przykład terapeutyki oparte na RNA zmniejszające poziom ekspresji VEGF lub VEGF-R, fuzje VEGF-toksyny, pułapka Regenerona VEGF, oraz przeciwciała, które wiąŝą VEGF-R. W alternatywnym przykładzie wykonania, przeciwciało podaje się ze środkiem terapeutycznym, który indukuje lub wzmacnia adaptacyjną od-

94 1 20 2 30 3 powiedź immunologiczną, na przykład przeciwciało ukierunkowane na CTLA-4. Dodatkowe środki antyangiogenne obejmują, bez ograniczania do wymienionych, angiostatynę (fragment plazminogenowy), antytrombinę III, angiozym, ABT-627, Bay 12-966, benefin, bewacizumab, bisfosfoniany, BMS-27291, inhibitory pochodzące z chrząstki (CDI), CAI, fragment dopełniacza CD9, CEP-70, Col 3, kombretastatyna A-4, endostatyna (fragment kolagenu XVIII), inhibitory transferazy farnezylowej, fragment fibronektyny, gro-beta, halofuginon, hepatynazy, sześciosacharydowy fragment heparyny, HMV833, ludzka gonadotropina kosmówkowa (hcg), IM-862, interferon alfa, interferon beta, interferon gamma, białko indukowane interferonem (IP-), interleukina-12, kringle (fragment plazminogenowy), marimastat, inhibitory metaloproteinaz (np. TIMPs), 2- metodyestradiol, MMI 270 (CGS 27023A), inhibitor aktywatora plazminogenu (PAI), czynnik płytkowy 4 (PF4), prinomastat, prolaktyna 16kDa fragment, białko związane z proliferyną (PRP), PTK 787/ZK 22294, retinoidy, solimastat, skwalamina, SS3304, SU416, SU6668, SU11248, tetrahydrokortyzol-s, tetratiomolibdenian, talidomid, trombospondyna-1 (TSP-1), TNP-470, transformujący czynnik wzrostu beta (TGF-(3), waskulostatyna, wazostatyna (fragment kalretikuliny), ZS6126 i ZD6474. [0214] Przeciwciało moŝe być podawane z inhibitorem kinazy tyrozynowej. Przez inhibitor kinazy tyrozynowej stosowany w niniejszym opisie rozumie się cząsteczkę, która hamuje w pewnym stopniu aktywność kinazy tyrozynowej dla kinazy tyrozynowej. Przykłady takich inhibitorów obejmują, bez ograniczania do wymienionych, chinazoliny, takie, jak PD 1303, 4-(3-chloroanilino)chinazolinę; pirydopirymidyny; pirymidopirymidyny; pirolopirymidyny, takie, jak CGP 9326, CGP 60261 i CGP 62706; pirazolopirymidyny, 4- (fenyloamino)-7h-pirolo(2,3-d)pirymidyny; kurkuminę (diferuloilometan, 4,-bis (4- fluoroanilino)ftalimid); tyrfostyny zawierające reszty nitrotiofenu; PD-018380 (Warner- Lambert); cząsteczki antysensowne (np. te, które wiąŝą się z kwasem nukleinowym kodującym ErbB); chinoksaliny (US,804,396); tryfostyny (US,804,396); ZD6474 (Astra Zeneca); PTK-787 (Novartis/Schering A G); inhibitory pan-erbb takie, jak C1-33 (Pfizer); Affinitac (ISIS 321; Isis/Lilly); mesylan imatinibu (STI71,Gleevec ; Novartis); PKI 166 (Novartis); GW2016 (Glaxo SmithKline); C1-33 (Pfizer); EKB-69 (Wyeth); Semaxinib (Sugen); ZD6474 (AstraZeneca); PTK-787 (Novartis/Schering AG); INC-1C11 (Imclone); lub jak opisano w dowolnej z następujących publikacji patentowych: US,804,396; PCT WO 99/09016 (American Cyanimid); PCT WO 98/43960 (American Cyanamid); PCT WO 97/38983 (Warner-Lambert); PCT WO 99/06378 (Warner-Lambert); PCT WO 99/06396 (Warner-Lambert); PCT WO 96/30347 (Pfizer, Inc); PCT WO 96/33978 (AstraZeneca); PCT WO96/3397 (AstraZeneca); PCT WO 96/33980 (AstraZe-

9 1 20 2 30 3 neca), gefitinib (IRESSA, ZD1839, AstraZeneca), oraz OSI-774 (Tarceva, OSI Pharmaceuticals/Genentech). [021] Przeciwciało moŝe być podawane z jedną lub większą liczbą środków immunomodulacyjnych. Takie środki mogą zwiększać lub zmniejszać produkcję jednej albo więcej cytokin, regulować w górę lub w dół prezentację własnego antygenu, maskować antygenu MHC lub promować proliferację, róŝnicowanie, migrację lub stan aktywacji jednej lub większa liczby typów komórek immunologicznych. Środki immunomodulacyjne obejmują, ale nie ograniczają się do: niesteroidowe leki przeciwzapalne (NSAID) takie, jak aspiryna, ibuprofen, celekoksyb, diklofenak, etodolak, fenoprofen, indometacyna, ketoralak, oksaprozyna, nabumenton, sulindak, tolmentyna, rofekoksyb, naproksen, ketoprofen, oraz nabumeton; steroidy (np. glikokortykosteroidy, deksametazon, kortyzon, hydroksykortyzon, metyloprednisolon, prednizon, prednizolon, trimcinolon, azulfidynoikozanoidy takie, jak prostaglandyny, tromboksany i leukotrieny; jak i miejscowe steroidy takie, jak antralina, kalcipotrien, klobetazol, oraz tazaroten); cytokiny takie, jak TGFb, IFNa, IFNb, IFNg, IL- 2, IL-4, IL-; antagoniści cytokin, chemokin, lub receptora w tym przeciwciała, rozpuszczalne receptory, oraz fuzje receptora Fc przeciwko BAFF, B7, CCR2, CCR, CD2, CD3, CD4, CD6, CD7, CD8, CD11, CD14, CD1, CD17, CD18, CD20, CD23, CD28, CD40, CD40L, CD44, CD4, CD2, CD64, CD80, CD86, CD147, CD12, czynniki dopełniacza (C, D) CTLA4, eotaksyna, Fas, ICAM, ICOS, IFNα, IFNβ, IFNγ, IFNAR, IgE, IL-1, IL- 2, IL-2R, IL-4, IL-R, IL-6, IL-8, IL-9 IL-12, IL-13, IL-13R1, IL-1, IL-18R, IL-23, integryny, LFA-1, LFA-3, MHC, selektyny, TGFβ, TNFα, TNFβ, TNF-R1, receptor komórek T, w tym Enbrel (etanercept), Humira (adalimumab), oraz Remicade (infliksimab); heterologiczna antylimfocytowa globulina; inne cząsteczki immunomodulacyjne takie, jak 2-amino-6-arylo--podstawione pirymidyny, anty-idiotypowe przeciwciała dla peptydów wiąŝących MHC i fragmenty MHC, azatiopryna, brechinar, bromokryptyna, cyklofosfamid, cyklosporyna A, D- penicylamina, dezoksyspergualina, FK06, glutaraldehyd, złoto, hydroksychlorochina, leflunomid, malononitryloamidy (np. leflunomid), metotreksat, minocyklina, mizorybina, mykofenolan mofetilu, rapamycyna i sulfasasazyna. [0216] Przeciwciała według niniejszego wynalazku mogą być podawane z cytokiną. Przez cytokinę stosowaną w niniejszym opisie rozumie się ogólne określenie dla białka uwalnianego przez populację jednej komórki, które działają na inną komórkę jako mediatory międzykomórkowe. Przykładami takich cytokin są limfokiny, monokiny i tradycyjne hormony polipeptydowe. Do cytokin włączone są hormony wzrostu takie, jak ludzki hormon wzrostu, N-metionylowy ludzki hormon wzrostu oraz bydlęcy hormon wzrostu; hormon przytarczyc; tyroksyna; insulina; proinsulina; relaksyna; prorelaksyna; hormony glikopro-

96 1 20 2 30 3 teinowe takie, jak hormon folikulotropowy (FSH), hormon tyreotropowy (TSH), oraz hormon luteinizujący (LH); wątrobowy czynnik wzrostowy; czynnik wzrostu fibroblastów; prolaktyna; laktogen łoŝyskowy; czynnik martwicy guza-alfa i -beta; substancja hamująca Mullera; mysi peptyd związany z gonadotropiną; inhibina; aktywina; czynnik wzrostu śródbłonka naczyniowego; integryna; trombopoetyna (TPO); czynniki wzrostu nerwów, taki jak NGF-beta; czynnik wzrostu płytek; transformujące czynniki wzrostu (TGF), takie jak TGF-alfa i TGF-beta; insulinopodobny czynnik wzrostu I i II; erytropoetyna (EPO); czynniki indukcyjne kości; interferony takie, jak interferon-alfa, beta, oraz - gamma; czynniki pobudzające wzrost kolonii (CSF), takie jak makrofagi-csf (M-CSF); granulocytomakrofag-csf (GM-CSF); i granulocyt-csf (G-CSF); interleukiny (IL) takie, jak IL-1, IL-1alfa, IL-2, IL-3, IL-4, IL-, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-, IL-11, IL-12; IL-1, czynnik martwicy nowotworu taki, jak TNF-alfa lub TNF-beta; i inne czynniki polipeptydowe w tym LIF i ligand kit (KL) (KL). W stosowanym tu kontekście, określenie cytokina obejmuje białka z naturalnych źródeł lub rekombinowanych kultur komórkowych, oraz biologicznie aktywne równowaŝniki cytokin natywnych sekwencji. [0217] Cytokiny i inne środki, które stymulują komórki układu immunologicznego mogą być podawane razem z przeciwciałem według niniejszego wynalazku. Taki sposób leczenia moŝe poprawić poŝądaną funkcję efektorową. Na przykład, mogą być podawane razem środki, które pobudzają komórki NK, w tym bez ograniczania do wymienionych, IL-2. W innym przykładzie wykonania, środki, które stymulują makrofagi, w tym bez ograniczania do wymienionych, Ca, formylo peptydy takie, jak N-formylo-metionylo-leucylofenyloalanina (Beigier- Bompadre i współpr. (2003) Scand. J. Immunol. 7: 221-8), mogą być podawane razem. Ponadto, środki, które stymulują neutrofile, w tym bez ograniczania do wymienionych, G-CSF, GM-CSF, i podobne moŝe być podawane. Ponadto mogą być stosowane środki, które promują migrację takich cytokin immunostymulujących. RównieŜ dodatkowe środki, w tym bez ograniczania do wymienionych, interferon gamma, IL-3 i IL- 7 mogą promować jedną lub większą liczbę funkcji efektorowych. [0218] Cytokiny i inne środki, które hamują funkcję efektorową komórki, mogą być podawane razem z przeciwciałem według niniejszego wynalazku. Taki tryb leczenia moŝe ograniczyć niepoŝądaną funkcję efektorową. [0219] Przeciwciało moŝe być podawane z jedną lub większą liczbą antybiotyków, w tym bez ograniczania do wymienionych: antybiotykami aminoglikozydowymi (np. apramycyna, arbekacyna, bambermycyny, butirosyna, dibekacyna, gentamycyna, kanamycyna, neomycyna, netilmycyna, paromomycyna, ribostamycyna, sysomycyna, spectrinomycyna), aminocyklitole (np. sprctinomycyna), antybiotyki amfenikolowe (np. azidamfenikol, chlo-

97 1 20 2 30 3 ramfenikol, florfrnikol, oraz tiamfemikol), antybiotyki ansamycynowe (np. ryfamid i ryfampina), karbapenemy (np. imipenem, meropenem, panipenem); cefalosporyny (np. cefaklor, cefadroksyl, cefamandol, cefatrizyna, cefazedon, cefozopran, cefpimizol, cefpiramid, cefpirom, cefprozil, cefuroksyna, cefiksym, cefaleksyna, cefradyna), cefamycyny (cefbuperazon, cefoksitin, cefminoks, cefmetazol, oraz cefotetan); lincozamidy (np. klindamycyna, linkomycyna); makrolid (np. azytromycyna, brefeldina A, klarytromycyna, erytromycyna, roksytromycyna, tobramycyna), monobaktamy (np. aztreonam, carumonam, oraz tigemonam); mupirocyna; oksacefemy (np. flomoksef, latamoksef, oraz moksalaktam); penicyliny (np. amdinocylina, amdinocylina piwoksylu, amoksycylina, bacampicylina, kwas benzylopenicylinowy, benzylopenicylina sodowa, epicylina, fenbenicylina, floksacylina, penamecylina, jodowodorek penetamatu, penicylina o-benetamina, penicylina O, penicylina V, benzoesan penicyliny V, hydrabamina penicyliny V, penimepicyclina, oraz fencihicylina potasowa); polipeptydy (np. bacytracyny, kolistyna, polymiksyna B, teikoplanina, wankomycyna); chinolony (amifloksacyna, cinoksacyna, ciprofloksacyna, enoksacyna, enrofloksacyna, feroksacyna, flumechina, gatifloksacyna, gemifloksacyna, grepafloksacyna, lomefloksacyna, moksifloksacyna, kwas nalidyksowy, norfloksacyna, ofloksacyna, kwas oksolinowy, pefloksacyna, kwas pipemidynowy, rosoksacyna, rufloksacyna, sparfloksacyna, temafloksacyna, tosufloksacyna, trowafloksacyna); ryfampicyna; streptograminy (np. chinuprystyna, dalfoprystyna); sulfonamidy (sulfanilamid, sulfametoksazol); tetracykleny (chlorotetracykliny, chlorowodorek demeclocykliny, demetylochlorotetracyklina, doksycyklina, duramycyna, minocyklina, neomycyna, oksytetracyklina, streptomycyna, tetracyklina, wankomycyna). [0220] MoŜna zastosować równieŝ środki przeciwgrzybicze takie, jak amfoterycyna B, cyklopiroks, klotrimazol, ekonazol, flukonazol, flucytozyna, itrakonazol, ketokonazol, nikonazol, nystatyna, terbinafina, terkonazol, oraz tiokonazol. [0221] Mogą być równieŝ stosowane środki przeciwwirusowe, w tym inhibitory proteazy, inhibitory odwrotnej transkryptazy, oraz inne, w tym interferony typu I, wirusowe inhibitory fuzji, oraz inhibitory neuramidazy. Przykłady środków przeciwwirusowych obejmują, bez ograniczania do wymienionych, acyklowir, adefowir, amantadyna, amprenawir, klewadyna, enfuwirtyd, entekawir, foskarnet, gangcyklowir, idoksurydyna, indynawir, lopinawir, pleconaril, rybawiryna, rimantadyna, rytonawir, sakwinawir, trifluridyna, widarabina, oraz zydowudyna, mogą być uŝyte. [0222] Przeciwciała według niniejszego wynalazku moŝna kombinować z innymi schematami terapeutycznymi. Na przykład, pacjent leczony przeciwciałem według niniejszego wynalazku moŝe równieŝ otrzymywać radioterapię. Radioterapia moŝe być przeprowadza-

98 1 20 2 30 na zgodnie z protokołami powszechnie stosowanymi w tej dziedzinie, i znanymi znawcy. Leczenie takie obejmuje, lecz nie ogranicza się do, promieniowania irydu, cezu, jodu, lub kobaltu. Radioterapia moŝe być naświetlaniem całego ciała, lub moŝe być skierowana miejscowo do konkretnego miejsca lub tkanki w lub na ciele, takiego, jak płuco, pęcherz moczowy lub prostata. Typowo, radioterapia podawana jest pulsowo w okresie czasu od około 1 do 2 tygodni. Radioterapia moŝe jednak być podawana przez dłuŝsze okresy czasu. Na przykład, radioterapia moŝe być podawana pacjentom mającym raka głowy i szyi przez około 6 do około 7 tygodni. Opcjonalnie, radioterapia moŝe być podawane w pojedynczej dawce lub jako wiele, kolejnych dawek. Specjalista lekarz moŝe określić doświadczalnie odpowiednią, przydatną tutaj dawkę lub dawki terapii promieniowaniem. Przeciwciało według niniejszego wynalazku i jedna lub większa liczba innych terapii przeciwnowotworowych moŝe być wykorzystana do leczenia komórek rakowych ex vivo. UwaŜa się, Ŝe taka terapia moŝe być przydatna ex vivo w przeszczepieniu szpiku kostnego i szczególnie, autologicznym przeszczepieniu szpiku. Na przykład, traktowanie komórek lub tkanki (tkanek) zawierających komórki rakowe przeciwciałem i jedną lub większą liczbą innych terapii przeciwrakowych, takich, jak opisanych powyŝej, mogą być zastosowane w celu zmniejszenia ilości lub zasadniczego zmniejszenia ilości komórek rakowych przed przeszczepieniem u pacjenta przyjmującego. [0223] Oczywiście uwaŝa się, Ŝe przeciwciała według niniejszego wynalazku moŝna wykorzystać w kombinacji z jeszcze innymi technikami terapeutycznymi takimi, jak chirurgia czy fototerapia. PRZYKŁADY [0224] Przykłady podane poniŝej ilustrują niniejszy wynalazek. Celem tych przykładów nie jest ograniczanie niniejszego wynalazku do jakiegokolwiek konkretnego zastosowania lub teorii działania. [022] W przypadku odniesień do regionów zmiennych immunoglobulin, pozycje są ponumerowane zgodnie z numeracją Kabata. W przypadku odniesień do regionów stałych immunoglobulin, pozycje są ponumerowane zgodnie z indeksem EU jak u Kabata (Kabat i współpr., 1991, Sequences of Protein of Immunological Interest, th Ed., United States Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda). Przykład 1. Przeciwciała anty-cd19 z modyfikacjami aminokwasów, które wzmacniają funkcję efektorową [0226] Przeciwciała anty-cd19 według niniejszego wynalazku są przeznaczone jako kandydaci kliniczni dla terapeutyków przeciwrakowych. W celu zbadania moŝliwości popra-

99 1 20 2 30 wy funkcji efektorowej przeciwciała, które jest skierowane przeciwko CD19, wytworzono technikami inŝynierii wersje wariantów przeciwciała anty-cd19. [0227] Figura 6 zapewnia niektóre sekwencje regionów zmiennych łańcucha lekkiego i cięŝkiego przeciwciała anty-cd19 4G7 (Meeker, T.C. i współpr. 1984. Hybridoma. 3: 30-320) i HD37 (Pezzuto, A. i współpr. 1987. J. Immunol. 138: 2793-2799) stosowane w niniejszym badaniu. Mysie, macierzyste chimeryczne łańcuchy cięŝki i lekki są oznaczone odpowiednio H0 4G7, H0 HD37, L0 4G7, oraz L0 HD37. Warianty według niniejszego wynalazku mogą być równieŝ wykonane w ramach przeciwciała anty-cd19 B43 (Uckun, F.M. i współpr. 1998. Blood. 71: 13-29), które ma podobne właściwości do HD37 i ma identyczne CDR oraz ogólną zgodność sekwencji 97% w stosunku do sekwencji HD37 H0 i L0 pokazanych na Figurze 6. Geny mysiego WT 4G7 i HD37 VH i VL, oznaczone odpowiednio H0 i L0, skonstruowano stosując techniki syntezy genów i klonowano do wektora ekspresyjnego ssaka, pcdna3.1zeo (Invitrogen), zawierającego pełnej długości łańcuch lekki kappa (Cκ) i regiony stałe cięŝkiego łańcucha IgG1. Wariant S239D/I332E (anty-gd19 o wzmocnionej funkcji efektorowej) został zbudowany w regionie Fc hybrydowego przeciwciała IgG1/IgG2 (określane jako Hybrid, Figura 2) w wektorze pcd- NA3.1Zeo stosując techniki mutagenezy QuikChange (Stratagene). Wszystkie sekwencje sekwencjonowano, aby potwierdzić wierność sekwencji. Plazmidy zawierające gen cięŝkiego łańcucha (VH-CH1-CH2-CH3) (dzikiego typu lub warianty) kotransfekowano plazmidem zawierającym gen łańcucha lekkiego (VL-CLκ) do komórek 293T. PoŜywki zebrano dni po transfekcji, a przeciwciała oczyszczono z supernatantu za pomocą chromatografii powinowactwa białka A (Pierce, Numer Katalogowy 20334) [0228] Względne powinowactwa wiązania przeciwciała 4G7 Hybrid S239D/I332E i 4G7 IgG1 obliczono określając parametry wiązania na Biacore stosując panel receptorów Fc (Figura 7). W skrócie, białko A/G sprzęga się do celi przepływowej czipa CM. IgG rozcieńcza wpierw do 2 nm i unieruchamia na kanale białko A/G do ~ 00 RU. FcγR-His rozcieńcza się seryjnie i wstrzykuje przy 30 ml/min przez 2 min, po czym następuje dysocjacja przez 3 min. Aby ustalić KD uzyskane sensorgramy są "dopasowywane grupowo" uŝywając modelu interakcji 1:1 dostępnego w oprogramowaniu BIAevaluation. Wartości KD, którą są wyŝsze niŝ x -6 M oznacza się jako ND (nie oznaczone) na Figurze 7. Dane wskazują, Ŝe przeciwciało WT IgG1 wiąŝe V18 FcγRIIIa z powinowactwem około 240 nm, zgodnym z literaturą (Okazaki et al, 2004, J Mol Biol 336:1239-49; Lazar et al, Proc Natl Acad Sci USA 3(11):400-40). wersja wariantu Fc wiąŝe się z powinowactwem do V18 FcγRIIIa około 4.7 nm, wskazując ulepszenie powinowactwa około 0-

0 1 20 2 30 3 krotne w stosunku do WT. Wiązanie wariantu anty-cd19 do F18 FcγRIIIa wynosi około 16.7 nm. [0229] W celu ustalenia zdolności wariantów przeciwciała do mediowania funkcji efektorowej przeciwko komórkom eksprymującym CD19, anty-cd19 o wzmocnionej funkcji efektorowej zbadano w teście komórkowym ADCC. [0230] Ludzkie monocyty krwi obwodowej (PBMC) wyizolowano z leukopaka i uŝyto jako komórki efektorowe, a jako komórki docelowe uŝyto CD19 pozytywne komórki rakowe. Komórki docelowe wysiano przy,000 (Raji i MEC-1) i 20,000 (SUP-B1) komórek/dołek w 96 dołkowych płytkach i traktowano oznaczonym przeciwciałem w tryplilkacie. PBMC wyizolowane przy uŝyciu gradientu Ficoll dodano w nadmiarze do komórek docelowych i hodowano razem przez 4 godziny przed obróbką dla aktywności LDH przy uŝyciu Cytotoxicity Detection Kit zgodnie z instrukcjami producenta. Figura 8a przedstawia wyniki testu ADCC porównującego przeciwciała 4G7 IgG1 i 4G7 Hybrid S239D/I332E, oraz HD37 IgG1 i HD37 Hybrid S239D/I332E na linii komórkowej Daudi (BL). Figura 8b przedstawia wyniki testu ADCC porównującego przeciwciała 4G7 IgG1 i 4G7 Hybrid S239D/I332E, oraz anty-cd20 rytuksymab na liniach komórkowych SUP- B1 (ALL) i Raji (Chłoniaka Burkitta). Wykresy pokazują, Ŝe przeciwciała róŝnią się nie tylko w ich EC0, odzwierciedlającym ich względną siłę działania, ale równieŝ maksymalnym poziomem ADCC osiągalnym przez przeciwciała w stęŝeniach wysycenia, odzwierciedlając ich względną skuteczność. Znaczne ulepszenia siły działania i skuteczności obserwuje się dla przeciwciała wariantu Fc w porównaniu do przeciwciała z regionem Fc WT. Chimeryczne przeciwciało IgG1 ma bardzo małą skuteczność lub siłę działania. [0231] EC0 z krzywej odpowiedzi na dawkę takiej, jak ta na Figurze 8 oznacza stęŝenie związku, przy którym obserwuje się 0% jego maksymalnego efektu. W warunkach klinicznych, siła działania odzwierciedla stęŝenie przeciwciała potrzebne do przeprowadzenia działania terapeutycznego. Zatem dane na Figurze 8 pokazują, Ŝe zoptymalizowane Fc przeciwciała anty-cd19 działają in vivo w stęŝeniu lub dawce niŝszej niŝ tej dla przeciwciała WT anty-cd19 lub anty-cd20. Na Figurze 8b, podczas gdy WT IgG21 anty-cd19 w stęŝeniu wysycenia mediuje w przybliŝeniu % maksymalnego ADCC, wariant Fc anty- CD19 poddaje lizie w przybliŝeniu 60% komórek docelowych. W warunkach klinicznych, skuteczność odzwierciedla maksymalną korzyść terapeutyczną z podawanego leku. Przykład 2. Wiązanie przeciwciała anty-cd19 o wzmocnionych funkcjach efektorowych do linii komórkowej guza pochodzącego z komórek B [0232] Zmierzono wiązanie względne 4G7 Hybrid S239D/I332E do linii komórek Raji. powinowactwa wariantów anty-cd19 o ulepszonej funkcji efektorowej oznaczono syste-

1 1 20 2 30 3 mem DELFIA (PerkinElmer Life Sciences), który jest oparty fluorometrii rozdzielonej w czasie (TRF). Anty-CD19 (H0L0) znakuje się europem stosując zestaw do znakowania Eu dostępny z PerkinElmer Biosciences. Nieznakowany typ dziki (WT) lub warianty (zimne) rozcieńcza się seryjnie (typowo zaczynając od 1 um) w krokach ½ log i zmiesza z ustalonym stęŝeniem znakowanego (lub gorącego) anty-cd19. Mieszaninę gorącego i zimnego przeciwciała dodaje się następnie do 0,000 komórek Raji (mających duŝą gęstość powierzchniową eksprymowanego antygenu CD-19) i inkubuje na lodzie przez 30 min. Test ten jest zasadniczo stosowany jako test konkurencyjny do skriningu przeciwciała anty-cd19 o róŝnych powinowactwach. W nieobecności konkurujących wariantów powinowactwa, Eu-anty-CD19 i powierzchnia CD19 oddziałują i wytwarzają sygnał przy 613 nm, gdy europ jest wzbudzany przy 340 nm. Dodanie dzikiego typu lub wariantu konkuruje z oddziaływaniem Eu-anty-CD19-CD19, zmniejszając fluorescencję ilościowo umoŝliwiając określenie względnych powinowactw wiązania. Figura 9 pokazuje wyniki wiązania na powierzchni komórki anty-cd19 o ulepszonej funkcji efektorowej w stosunku do komórek Raji. Jak moŝna zauwaŝyć, obliczona wartość EC0 wynosi 1.2 nm. Przykład 3. ADCC przeciwciała anty-cd19 o zwiększonej cytotoksyczności przeciwko wielu liniom komórkowym chłoniaka. [0233] W celu oceny cytotoksycznych właściwości anty-cd19 o zwiększonej funkcji efektorowej, Wykonano testy ADCC na panelu 14 linii komórkowych reprezentujących róŝne chłoniaki i białaczki (Figura a). Badanymi liniami komórkowymi były linia komórkowa chłoniaka grudkowatego (FL) DoHH-2 i SC1; linia komórkowa chłoniaka z komórek płaszcza (MCL) Jeko-1; linia komórkowa chłoniaka Burkitta (BL) Daudi i Raji; linie komórkowe przewlekłej białaczki limfocytowej (CLL) MEC1 i WaC3CD; linia komórkowa białaczki włochatokomórkowej (HCL) Bonna-12; linia komórkowa przewlekłej białaczki szpikowej (CML) BV-1.73; i linie komórkowe ostra białaczki limfoblastycznej (ALL) VAL, SUP-B1, NALM-6, RS4;11, oraz 697. Ludzkie monocyty krwi obwodowej (PBMC) wyizolowano z leukopaka i uŝyto jako komórki efektorowe, a jako komórki docelowe uŝyto CD19 pozytywne komórki rakowe. Komórki docelowe wysiano przy,000 (Raji i MEC-1) i 20,000 (SUP-B1) komórek/dołek w 96 dołkowych płytkach i traktowano oznaczonym przeciwciałem w tryplilkacie. PBMC wyizolowane przy uŝyciu gradientu Ficoll dodano w nadmiarze do komórek docelowych i hodowano razem przez 4 godziny przed obróbką dla aktywności LDH przy uŝyciu Cytotoxicity Detection Kit zgodnie z instrukcjami producenta. Oba parametry, siłę działania (EC0) i skuteczność (% ADCC) znormalizowano dla tych dla rytuksymabu (anty-cd20). To badanie pokazało wyŝszość cytotoksyczności in vitro anty-cd 19 o wzmocnionej funkcji efektorowej na szerokiej ga-

2 1 20 2 30 3 mie linii komórkowych, zwłaszcza reprezentujących limfoproliferacyjne choroby, które wywodzą się ze wczesnych etapów rozwoju komórki B. Figura b wypisuje zastosowane linie komórkowe i odpowiadający im typ raka. Przykład 4. Przeciwciała anty-cd19 o ograniczonej moŝliwości immunogenności. [0234] Ze względu na szerokie stosowanie technologii hybrydoma, znaczna liczba przeciwciał pochodzi ze źródeł innych niŝ człowiek. JednakŜe, białka inne niŝ człowieka są często immunogenne przy podawaniu ich ludziom, co znacznie zmniejsza ich uŝyteczność terapeutyczną. Immunogenność jest wynikiem złoŝonej serii reakcji na substancję, która jest postrzegana jako obca, oraz mogą obejmować wytwarzanie neutralizujących i nieneutralizujących przeciwciał, tworzenie kompleksów immunologicznych, aktywację dopełniacza, aktywację komórek tucznych, zapalenie, reakcje nadwraŝliwości, oraz anafilaksję. Szereg czynników moŝe przyczyniać się do immunogenności białka, w tym bez ograniczania do wymienionych, sekwencja białka, sposób i częstotliwość podawania, oraz populacja pacjentów. Immunogenność moŝe ograniczać skuteczność i bezpieczeństwo białkowego terapeutyku na wiele sposobów. Skuteczność moŝe być zmniejszona bezpośrednio przez tworzenie przeciwciał neutralizujących. Skuteczność moŝe być takŝe zmniejszona pośrednio, poniewaŝ wiązanie albo do przeciwciała neutralizującego, albo nieneutralizującego zazwyczaj prowadzi do szybkiego usuwania leku z surowicy. Mogą wystąpić cięŝkie działania niepoŝądane, a nawet śmierć, gdy wywołana zostaje reakcja immunologiczna. Zatem w korzystnym przykładzie wykonania, inŝynieria białek jest stosowana do zmniejszenia immunogenności białka skierowanego przeciwko CD19 według niniejszego wynalazku. [023] W celu zmniejszenia potencjału immunogenności białka anty-cd19 według niniejszego wynalazku, immunogenność przeciwciała anty-cd 19 4G7 i HD37 zmniejszono stosując sposób opisany w US 2006/0008883, zatytułowany Methods of Generating Variant Protein with Increased Host String Content and Composition Thereof, złoŝony 6 grudnia 2004. Sposób ten ogranicza potencjał immunogenności przez zwiększenie zawartości ludzkiego łańcucha przeciwciała przez mutacje. Łańcuchy cięŝki i lekki ze zmniejszonym potencjałem immunogenności są nazwane H1, H2, H3, H4, itd. i L1, L2, L3, itd i są pokazane na Figurach 11 do 14. Łańcuchy cięŝki i lekki oryginalnego przeciwciała, 4G7 i HD37, są określane odpowiednio jako H0 i L0. Wyeksprymowano kombinacje róŝnych łańcuchów cięŝkich i lekkich, a uzyskane przeciwciała, o nazwach takich, jak H3L3, H3/L3 lub H3_L3, oczyszczono i zbadano. Przeciwciała anty-cd19 eksprymowano przez przejściową transfekcję wektorów kodujących łańcuchy cięŝki i lekki do komórek 293T hodowanych w % surowicy płodu bydlęcego o ultra niskiej zawartości IgG z 1mM pirogronianu sodu i 1X aminokwasy nieegzogenne (Gibco, Invitrogen Hayward CA). Pięć

3 1 20 2 30 3 dni po transfekcji, poŝywki hodowlane usunięto i przepuszczano przez kolumnę z białkiem A (Pierce Biotechnology Inc, Rockford MD.) CięŜkie łańcuchy mogą być wykonane z dowolnego rodzaju stałej domeny w tym, u ludzi, IgG1, IgG2 i hybryd zawierających IgG1 i IgG2, jak i mysich stałych domen takich, jak IgG1 i IgG2a, które moŝna oznaczyć jako migg1 i migg2a. Sekwencje ludzkich cięŝkich łańcuchów moŝna znaleźć na Figurze 2. Zmierzono wiązanie względne wariantów anty-cd19 o obniŝonej immunogenności linii komórkowej Raji. Powinowactwo zmniejszonej immunogenności wariantów anty-cd19 oznaczono przy zastosowaniu układu DELFIA (PerkinElmer Life Sciences), który jest oparty na fluorometri z rozdziałem w czasie (TRF). Anty-CD19 znakuje się europem stosując zestaw do znakowania Eu dostępny z PerkinElmer Biosciences. Nieznakowany typ dziki (WT) lub warianty (zimne) rozcieńcza się seryjnie (typowo zaczynając od 1 um) w krokach ½ log i miesza z ustalonym stęŝeniem znakowanego (lub gorącego) anty-cd19. Mieszaninę gorącego i zimnego przeciwciała dodaje się następnie do 0,000 komórek Raji (mających duŝą gęstość powierzchniową eksprymowanego antygenu CD-19) i inkubuje na lodzie przez 30 min. Test ten jest zasadniczo stosowany jako test konkurencyjny do skriningu przeciwciała anty-cd19 o róŝnych powinowactwach. W nieobecności konkurujących wariantów powinowactwa, Eu-anty-CD19 i powierzchnia CD19 oddziałują i wytwarzają sygnał przy 613 nm, gdy europ jest wzbudzany przy 340 nm. Dodanie typu dzikiego lub wariantu konkuruje z oddziaływaniem Eu-anty-CD19 - CD 19, zmniejszając fluorescencję ilościowo, aby umoŝliwić określenie względnego powinowactwa wiązania. Figura 1a pokazuje wyniki wiązania na powierzchni komórki o zmniejszonej immunogenności wariantów 4G7 do komórek Raji. W oparciu o powinowactwo i stabilność do dalszego rozwoju został wybrany region zmienny 4G7 H1L1. Figura 1b przedstawia wyniki testu ADCC na templatach o obniŝonej immunogenności HD37_H2L1 Hybrid S239D/I332E i 4G7_H1L3 Hybrid S239D/I332E na linii komórkowej MEC-1 (CLL). Ten test ADCC przeprowadzono tak jak w poprzednich próbach. Oba przeciwciała są aktywne w tej linii komórkowej i dlatego mogą stanowić potencjale terapie dla CLL. Przykład. Powinowactwo i stabilność wzmocnienia anty-cd19 o zwiększonej funkcji efektorowej. [0236] Dojrzewanie powinowactwa 4G7 mab H1L1 przeprowadzono w celu dalszego zwiększenia powinowactwa wiązania CD19, jak i siły działania ADCC. Dojrzewanie powinowactwa przeprowadzono w trzech etapach przy uŝyciu podejścia obliczeniowego/ in- Ŝynierii białka. Po pierwsze, działając przy załoŝeniu, Ŝe specyfika określającej reszty (SDR) (Padlan, E.A. i współpr. 199. FASEB J. 9: 133-139) w CDR przeciwciała juŝ została zoptymalizowana przez komórki B, w procesie somatycznej hipermutacji in vivo, za-

4 1 20 2 30 3 projektowano bibliotekę 94 wariantów w celu określenia tych reszt CDR, które są kluczowe dla wiązania antygenu, oraz zatem nie powinny być zmieniane podczas inŝynierii. Ta biblioteka składała się z jednej lub dwóch sondujących mutacji wykonanych w pozycjach w CDR z miejscami wybranymi za pomocą modelowania strukturalnego, jak i prawdopodobieństwa, Ŝe pozycją jest często SDR, który zostały przygotowany na podstawie analizy dostępnych struktur kompleksu antygen-przeciwciało w Protein Data Bank (PDB) (MacCallum, R.M. i współpr. 1996. JMB 262: 732-74; Almagro, J.C. 2004. J. Mol. Recognit. 17:132-143). [0237] Mutacje wariantu wprowadzono stosując zestaw QuikChange do mutagenezy w formacie Fab templatu H1L1 i zawierał 6X-His. Warianty Fab eksprymowano w komórkach 293T stosując płytki 24-dołkowe i analizowano AlphaScreen lub cytometrią przepływową stosując komórki Raji lub RS4;11, oraz z określonym stęŝeniem kaŝdego wariantu przy uŝyciu czipu wiąŝącego His z Biacore. Z 0 pozycji, 17 pozycji zidentyfikowano jako te kluczowe dla wiązania antygenu, umoŝliwiając zmniejszenie rozmiaru biblioteki w następnej rundzie dojrzewania powinowactwa i dając nam cenne informacje strukturalne, które pozycje leŝą blisko granicy antygenu i stanowiłyby dobre cele dla znalezienia wariantów o zwiększonym powinowactwie. 17 SDR zidentyfikowanych w analizie są w doskonałej zgodność ze średniej liczbą SDR obecną w przeciwciele, którego kompleks antygen-przeciwciało został rozwiązany (Almagro, J.C. 2004. J. Mol. Recognit. 17:132-143). Oprócz zebranych cennych strukturalnych informacji z tej biblioteki, otrzymano pewne warianty, które miały zwiększone powinowactwo. [0238] Pozostałe 33 CDR pozycje zostały uszeregowane w kolejności ich znaczenia na podstawie analizy wyników pierwszej biblioteki i mapowania SDR na modelu strukturalnym templatu H1L1. Dzięki tej analizy stwierdzono, Ŝe prawie cała granica fazowa antygen-przeciwciało moŝe być zbadana za pomocą całkowitej częstotliwości 12.2 aminokwasów na pozycję (~9.3 nowych wariantów na pozycję) z rozmiarem biblioteki w drugiej rundzie liczącej 279 warianty. Library Design Automation (LDA ) (US 2006/0234303, złoŝony 3 marca 2006) uŝyto do zaprojektowania zoptymalizowanej biblioteki wariantów, która została dostrojona dla zarówno dopasowania, jak i pokrycia w oparciu o liczbę poŝądanych wariantów. Ostateczna biblioteka drugiej rundy po dopasowaniu do formatu wysokiej wydajności zawierała 26 warianty w 30 pozycjach. Biblioteka ta dała kilka wariantów wykazujących zwiększone powinowactwo wiązania. Warianty anty-cd19 Fab poddano skriningowi cytometrią przepływową w celu określenia powinowactwa. Linię komórkową RS4;11, o której wiadomo, Ŝe eksprymuje CD19, zawieszono w PBS i wysiano przy 200,000 komórkach/dołek w 96-dołkowej płytce o okrągłym dnie. Dodano seryjne roz-

1 20 2 30 3 cieńczenia przeciwciała CD19 do komórek RS4;11 o nieznanym stęŝeniu. Komórki inkubowano na lodzie przez 30 minut i następnie przemyto 4 razy w PBS. Anty-Fab PEznakowany F(ab ) 2 rozcieńczono 1/0 w PBS, który został następnie wykorzystany do ponownego zawieszenia RS4,11 powleczonych anty-cd 19 Fab. Komórki inkubowano przez 30 minut i przemyto dwa razy. Komórki następnie utrwalono i test wiązania oceniono na cytometrze przepływowym FACS Canto II. Do pomiaru szczelności wiązania wykorzystano MFI. Z obu bibliotek jeden i dwa, uzyskano w sumie 30 pojedynczych wariantów o zwiększonym powinowactwie w 11 pozycjach. [0239] Analiza danych wiązania z pierwszych dwóch bibliotek, jak i dalsza analizy strukturalna pozwoliły nam zaprojektować trzecią i ostateczną bibliotekę zawierającą kombinacje 2-8 pojedynczych wariantów. Ta biblioteka składała się z 149 wariantów w 8 pozycjach. Z nich, 20 wariantów wykazało znaczny wzrost powinowactwa i wybrano je do konwersji do formatu pełnej długości do jednoczesnego pomiaru powinowactwa wiązania i ADCC. Aby ocenić właściwości rozwiązań, wykonano testy stabilności na tych wariantach. Ostatnim zestawem mutacji zawartym w końcowych 20 były warianty łańcucha cięŝkiego T7P, K8E, S0cT, R0dS, oraz warianty łańcucha lekkiego L27cQ, S27eV, AN, F961, oraz F96N. Badania przyspieszonej stabilności ujawniły, Ŝe przynajmniej jedna z mutacji zwiększających powinowactwo generowała niestabilność w białku i powodowała utratę siły działania tych wariantów juŝ zaledwie po 8 godzinach w 37 C. Biorąc pod uwagę dane dotyczące wiązania i stabilności, moŝna było wybrać ostateczny kandydat mab z dojrzałym powinowactwem, który prezentował ~-krotny wzrost powinowactwa wiązania do komórek RS4;11 względem H1L1 mab (Figura 16). Warianty zaprojektowane w celu zwiększenia długoterminowej stabilności cząsteczki anty-cd19 równieŝ zostały zaprojektowane i poddane skriningowi. Figura 17 pokazuje dane wiązania dla wariantów inkubowanych przez dni w 37 C, ph 9.0 w 200 mm Tris-HCl, wykazując poprawę stabilności uzyskanej z wariantu anty-cd19. [0240] Wszystkie pojedyncze podstawienia wykonane dla zwiększonej stabilności i/lub powinowactwa pokazano na Figurze 27. Figura 28 wypisuje wszystkie warianty regionów zmiennych anty-cd19 skonstruowane w celu optymalizacji powinowactwa i stabilności. Figura 29 wypisuje korzystne warianty i względny wzrost powinowactwa wiązania versus macierzyste H1L1 mab. Sekwencje dla korzystnych wariantów łańcucha cięŝkiego o zwiększonym powinowactwie i/lub stabilności pokazano na Figurze 18. Sekwencje dla korzystnych wariantów łańcucha lekkiego o zwiększonym powinowactwie i/lub stabilności pokazano na Figurze 19. Sekwencje aminokwasów pełnej długości wariantów hybrydowych S239D/I332E zawierających regiony zmienne o ulepszonym powinowactwie i sta-

6 1 20 2 30 bilności przedstawiono na SEQ ID NO: 86-1. CDR o ulepszonym powinowactwie i stabilności CDR przedstawiono na SEQ ID NO: 111-131. Przykład 6. Antyproliferacyjne właściwości 4G7 Hybrid S239D/I332 na komórkach Raji. [0241] Aby zaobserwować efekt antyproliferacyjny w warunkach in vitro, wiele przeciwciał wymaga sieciowania, zazwyczaj przez drugorzędowe przeciwciało. Zaproponowano, Ŝe odpowiednie działania in vivo dla tych przeciwciał mogą zaleŝeć od sieciowania mediowanego receptorami Fc eksprymowanymi na powierzchni komórek efektorowych. W tym eksperymencie komórki Raji hodowano przez 3 dni w obecności 0 ng/ml 4G7 Hybrid S239D/I332E, 4G7 IgG1, lub anty-cd20 (rytuksymab) lub kontrolnego przeciwciała (region zmienny wiąŝący nie-cd19 z Hybrid S239D/I332E wariantami Fc) w róŝnych stę- Ŝeniach z -krotnym nadmiarem molowym przeciwciała sieciującego. Wzrost komórek zmierzono stosując test luminescencji zaleŝnej od ATP. Wyniki dla testu antyproliferacji przedstawiono na Figurze 20. Zarówno 4G7 Hybrid S239D/I332E, jak i 4G7 IgG1 wykazują silniejsze działanie antyproliferacyjne niŝ rytuksymab. Przykład 7. Antyproliferacyjne właściwości 4G7 Hybrid S239D/I332E o ulepszonej stabilności i powinowactwie na komórkach SU-DHL-6. [0242] W tym eksperymencie komórki SU-DHL-6 były albo hodowane przez 3 dni w obecności humanizowanego 4G7 Hybrid S239D/I332E o ulepszonych stabilności i powinowactwie i kontrolnego przeciwciała w róŝnych stęŝeniach z -krotnym nadmiarem molowym przeciwciała sieciującego i 6000 komórek/dołek, albo hodowano w obecności ustalonego stęŝenia przeciwciała przy 3000 komórek/dołek i Ŝywotności mierzonej w określonych punktach czasowych przez w sumie 72 godziny. Wyniki tego testu antyproliferacyjnego są pokazane na Figurze 21. 4G7 Hybrid S239D/I332E o ulepszonych stabilności i powinowactwie wykazywał silniejsze działanie antyproliferacyjne, niŝ rytuksymab. 4G7 Hybrid S239D/I332E o ulepszonych stabilności i powinowactwie równieŝ wykazywał działanie antyproliferacyjne nawet w nieobecności przeciwciała sieciującego. Przykład 8. Fagocytoza komórek Raji i RS4; 11 za pomocą 4G7 Hybrid S239D/I332E o ulepszonych stabilności i powinowactwie. [0243] W przeciwieństwie do komórek NK, które eksprymują tylko FcγRIIIa i czasem FcγRIIc, monocyty i komórki efektorowe pochodzące z monocytów eksprymują szereg FcγRs, w tym FcγRI, FcγRIIa, FcγRIIb, oraz FcγRIIIa. Zatem aktywacja i funkcjonowanie komórek efektorowych pochodzących z monocytów, w tym na przykład makrofagów, mo- Ŝe zaleŝeć od zaangaŝowania kompleksów immunologicznych przeciwciała z receptorami innymi niŝ wyłącznie FcγRIIIa. Faktycznie, jak opisano w PCT WO 2007/04163, Desjar-

7 1 20 2 30 3 lais J.R. i współpr., złoŝony 3 października 2006, fagocytoza spowodowana makrofagami jest mediowana po części przez zaangaŝowanie przeciwciała z FcγRIIa. [0244] W celu dokonania oceny zdolności 4G7 Hybrid S239D/I332E o ulepszonych stabilności i powinowactwie do mediowania fagocytozy wykonano cytometrię przepływową opartą na oznaczeniu fagocytozy. Oczyszczone CD14 + monocyty hodowano w czynniku stymulującym kolonie makrofagów (0ng/ml) przez dni w nawilŝonym inkubatorze w celu zróŝnicowania makrofagów. Jako cele wykorzystano komórki RS4;11 lub Raji. Komórki docelowe znakowano PKH67 (Sigma) zgodnie z instrukcjami producenta. Komórki dodano do 96-dołkowiej płytki, po czym dodano seryjne rozcieńczenia WT i przeciwciała anty-cd19 ze modyfikowanym Fc. Pochodzące z monocytów makrofagi następnie dodaje się do dołków w stosunku komórki efektorowe do celu 4:1. Testy te były wykonywane w obecności ludzkiej surowicy. Kokulturę komórek wirowano krótko i następnie inkubowano w nawilŝanym inkubatorze przez 4 godziny. Komórki zebrano, oraz makrofagi wybarwiono drugim kolorem fluorescencyjnym dla odróŝnienia od celu. Komórki utrwalano w 1% PFA i fagocytoza oceniono na cytometrze przepływowym FACS Canto II. Odczyt fagocytozy określono przez wiele podwójnie pozytywnych komórek podzielonych przez całkowitą liczbę komórek guza. Wyniki fagocytozy pokazane są na Figurze 22. 4G7 Hybrid S239D/I332E o ulepszonych stabilności i powinowactwie wykazuje zwiększony poziom fagocytozy na obu liniach komórkowych w porównaniu do przeciwciała IgG1 anty-cd19. [024] Makrofagi są fagocytami, które działają jako padlinoŝercy pochłaniający martwe komórki, obce substancje, oraz inne zanieczyszczenia. Co waŝne, makrofagi są profesjonalnymi komórkami prezentującymi antygen (APC), pochłaniając patogeny i obce struktury w tkankach obwodowych, następnie migrując do wtórnych narządów limfatycznych w celu inicjowania adaptacyjnej odpowiedzi immunologicznej poprzez aktywację naiwnych limfocytów T. W związku z tym, wyniki poprzedniego doświadczenia wskazują, Ŝe modyfikacja przeciwciała anty-cd19 moŝe umoŝliwić mechanizmy działania, które obejmują zarówno wrodzone cytotoksyczne funkcje efektorowe, jak i funkcje efektorowe, które mogą potencjalnie prowadzić do długoterminowej adaptacyjnej odpowiedzi immunologicznej. Przykład 9. ADCC dla 4G7 Hybrid S239D/I332E o ulepszonych stabilności i powinowactwie przeciwko wielu liniom komórkowym chłoniaka stosując oczyszczone komórki naturalnych zabójców (NK) [0246] W celu oceny cytotoksycznych właściwości 4G7 Hybrid S239D/I332E o ulepszonych stabilności i powinowactwie, wykonano testy ADCC z oczyszczonymi komórkami NK na panelu 6 linii komórkowych reprezentujących róŝne chłoniaki i białaczki (Figura 23). ADCC z oczyszczonymi komórkami NK wykonuje się w 96-płytkach do mikromia-

8 1 20 2 30 3 reczkowania. Komórki NK oczyszczono z ludzkich PBMC stosując zestaw z Miltenyi Biotec (Nr Kat. 130-091-12) i inkubowano w %FBS/RPMI1640 przez noc z ng/ml IL- 2. Następnego dnia,,000 (WaC3CD, Namalwa, Bonna-12, Ramos) lub 20,000 (RS4;11, BV-173) komórek docelowych raka opsonizuje się róŝnymi stęŝeniami przeciwciała i stosuje się 0k komórek NK dla kaŝdego stęŝenia przeciwciała w tryplilkacie. Komórki docelowe przemywa się trzy razy, zaś komórki NK przemywa się dwukrotnie RPMI1640 i obie ponownie zawiesza w 1%FBS/RPMI1640 i dodaje do roztworów przeciwciała. Po 4 godzinach inkubacji w 37 C w nawilŝanym inkubatorze z % CO 2, test określono ilościowo stosując zaleŝny od LDH CytoTox-One układ detekcyjny zaleŝny od fluorescencji z Promega (#PAG7891). Całkowity sygnał LDH określa się z komórek docelowych poddanych lizie Triton-X0 (Całkowity Docelowy LDH) i uŝywana do normalizacji wartości eksperymentalnych dostosowanych dla spontanicznego tła LDH (Tło Spontaniczne). Zatem %ADCC = ((Wartość Eksperymentalna -Spontaniczne Tło)/(Całkowity Docelowy LDH - Docelowy LDH))* 0. Spontaniczne tło jest wartością otrzymaną z komórek docelowych i NK inkubowanych razem w nieobecności przeciwciała. Docelowy LDH jest wartością z docelowych komórek rakowych samodzielnie uwalniających LDH w trakcie inkubacji. Figura 23 przedstawia wyniki ADCC, testu dla 6 linii komórkowych przy uŝyciu 4G7 Hybrid S239D/I332E o ulepszonych stabilności i powinowactwie, 4G7 IgG1 (z regionem zmiennym zoptymalizowanym pod kątem powinowactwa/stabilności), rytuksymabu (anty-cd20), oraz izotypowego przeciwciała kontrolnego. Dla wszystkich przebadanych linii komórkowych, 4G7 Hybrid S239D/I332E o ulepszonych stabilności i powinowactwie dawał lepsze wyniki siły działania i skuteczności w porównaniu do 4G7 IgG1 i rytuksymabu. Przykład. 4G7 Hybrid S239D/I332E o ulepszonych stabilności i powinowactwie wiąŝące się do komórek 293T transfekowanych CD19 [0247] Ludzki klon CD19 zamówiono z Origene (Nr Kat. SC127938) i transfekowano do komórek 293T. Komórki zawieszono w PBS i wysiano przy 0 000 komórkach/dołek. Dodano seryjne rozcieńczenia 4G7 Hybrid S239D/I3332E o ulepszonych stabilności i powinowactwie do komórek, a następnie komórki inkubowano na lodzie przez 30 minut i później przemyto 4 razy PBS. Anty-Fab znakowane PE F(ab ) 2 rozcieńczono 1/0 w PBS, który następnie stosuje się do zawieszenia komórek 239T pokrytych 4G7 Hybrid S239D/I332E o ulepszonych stabilności i powinowactwie. Komórki inkubowano przez 30 minut i przemyto dwa razy. Następnie komórki utrwalono, a wiązanie oceniono na cytometrze przepływowym FACS Canto II. Figura 24 przedstawia wyniki tego testu. Wyniki pokazują, Ŝe 4G7 Hybrid S239D/I332E o ulepszonych stabilności i powinowactwie wiąŝe się

9 1 20 2 30 3 do komórek 293T transfekowanych CD19 i nie wiąŝe się do komórek kontrolnych (normalnych komórek 293T). Przykład 11. 4G7 Hybrid S239D/1332E o ulepszonych stabilności i powinowactwie jest reaktywny krzyŝowo z CD19 od małp cynomolgus i rezus. [0248] Przedkliniczne badanie leków na małpach jest zazwyczaj waŝnym krokiem w opracowywaniu leków w celu oceny ich potencjalnej toksyczności. Uzyskano próbki krwi od pięciu małp cynomolgus (Macaca fascicularis; gatunek = Macaco (Latin) lub Makak (English); gatunek = fascicularis) i pięciu małp rezus (Macaca mulatta). Anty-CD19 o ulepszonej stabilności + powinowactwie 4G7 Hybrid S239D/I332E, anty-cd19 IgG1 (zmniejszona immunogenność, ale bez regionów zmiennych z zoptymalizowanymi powinowactwem/stabilnością), rytuksymab (anty-cd20), oraz kontrolę negatywną (wzmocnione Fc, region zmienny niewiąŝący) wyznakowano bezpośrednio FITC. Rytuksymab wyznakowano równieŝ APC w celu zidentyfikowania frakcji komórek B komórek. Ludzkie PBMC zastosowano w całości jako kontrolę pozytywną. Próbki krwi i PBMC inkubowano wstępnie z 2 mg/ml izotypowego przeciwciała kontrolnego ze wzmocnionym Fc do zablokowania potencjalnego wiązania FcγR. W kaŝdym eksperymencie do testu włączono rytuksymab- APC i jeden z badanych wariantów. Detekcję wykonuje się cytometrem przepływowym FACS Canto II z bramką frakcji limfocytów opartą na przednim i bocznym rozpraszaniu. Wyniki przedstawione są na Figurze 2. Anty-CD19 bez dojrzałego powinowactwa/stabilności (jak równieŝ jego macierzyste mysie przeciwciało) nie reaguje krzyŝowo z CD19 cynomolgus lub rezusa. Warianty, które zwiększały wiązanie i stabilność cząsteczki anty-cd19 uruchamiały reaktywność krzyŝowa 4G7 Hybrid S239D/I332E o ulepszonych stabilności i powinowactwie do CD19zarówno cynomolgus, jak i rezus. Przykłady 12. ADCC dla przeciwciała anty-cd19 o ulepszonej funkcji efektorowa ze zmniejszoną zawartością fukozy [0249] Oceniono przeciwciała anty-cd19 o ulepszonej funkcji efektorowej (4G7 H1L1 Hybrid S239D/1332E) ze zmniejszoną zawartością fukozy. Linię komórkową Lec13 (Ripka i współpr. Arch. Biochem. Biophys. 49:33-4 (1986)) wykorzystano do ekspresji przeciwciała anty-cd19 ze zmniejszoną zawartością fukozy. Lec13 dotyczy zmutowanej linii komórkowej jajnika chomika chińskiego opornej na lektynę, która wykazuje upośledzony metabolizm fukozy i tym samym zmniejszoną zdolność do przyłączania fukozy do kompleksu węglowodanów. Ta linia komórkowa jest opisana w Ripka & Stanley, 1986, Somatic Cell & Molec. Gen. 12(1):1-62; i Ripka i współpr., 1986, Arch. Biochem. Biophys. 249(2):33-4. UwaŜa się, Ŝe komórki Lec13 są pozbawione transkryptu dla GDPD-mannozo-4,6-dehydratazy, kluczowego enzymu dla metabolizmu fukozy. Ohyama

1 1 20 2 30 3 i współpr., 1988, J. Biol. Chem. 273(23): 1482-1487. GDP-D-mannozo-4,6-dehydrataza generuje GDP-mannozo-4-keto-6-D-deoksymannozę z GDP-mannozy, która jest następnie przekształcana przez białko FX w GDP-L-fukozę. Ekspresja fukozylowanych oligosacharydów zaleŝy od substratów donorowych GDP-L-fukozy i fukozylotransferaz(-y). Linia komórkowa CHO Lec13 jest pozbawiona zdolności dodawania fukozy, ale dostarcza IgG z oligosacharydem, który jest poza tym podobny do tego występującego w normalnej linii komórkowej CHO i z ludzkiej surowicy (Jefferis, R. i współpr., 1990, Biochem. J. 268, 29-37; Raju, S. i współpr., 2000, Glycobiology, 477-486; Routier, F. H., i współpr., 1997, Glycoconj. J. 14, 201-207). Normalne komórki CHO i HEK293 dodają fukozy do oligosacharydu IgG do wysokiego stopnia, typowo od 80-98%, a IgG z surowic są równieŝ wysoko fukozylowane (Jefferis, R. i współpr., 1990, Biochem J. 268, 29-37; Raju, S. i współpr., 2000, Glycobiology, 477-486; Routier, F. H., i współpr., 1997, Glycoconj. J. 14, 201-207; Shields i współpr., 2002, J Biol Chem 277(90):26733-26740). Jest dobrze udokumentowane, Ŝe przeciwciała eksprymowane w transfekowanych komórkach Lec13 niezmiennie wytwarzają około % fukozylowanego węglowodanu (Shields i współpr., 2002, J Biol Chem 277(90):26733-26740). [020] Wykonano testy ADCC na komórkach RS4;11 i MEC-1 stosując przeciwciała anty- CD19 z i bez wariantów ulepszonej funkcji efektorowej oraz z i bez zmniejszonej fukozylacji. Figura 26 przedstawia wyniki tych testów ADCC. Zarówno siła działania i skuteczność w ADCC są podobne dla przeciwciała anty-cd19 z modyfikacjami aminokwasów (4G7_H1L1_Hybrid_239D/1332E + fukoza) i anty-cd19 IgG1 ze zmniejszoną zawartością fukozy (4G7_H1L1_IgG1_WT - fukoza). Siła działania ADCC jest dalej zwiększana przez połączenie modyfikacji aminokwasu ze zmniejszoną zawartością fukozy (4G7_H1L1_Hybrid_239D/332E-fukoza). (Figura 26). Eksperyment ten ilustruje zatem, Ŝe kombinacje modyfikacji aminokwasów i modyfikowanych glikoform mogą być uŝyte w celu optymalizacji przeciwciała anty-cd19 pod kątem właściwości funkcji efektorowych. [021] Zastosowanie linii komórkowej Lec13 nie ma na celu ograniczanie niniejszego wynalazku do tego określonego trybu zmniejszania zawartości fukozy. RóŜne inne sposoby są znane w dziedzinie dla kontrolowania poziomu fukozylowanych i/lub rozdzielających oligosacharydów, które są kowalencyjnie przyłączone do regionu Fc, w tym bez ograniczania do wymienionych, ekspresja w róŝnych organizmach lub liniach komórkowych, inŝynieria lub inne (na przykład komórki Lec13 CHO lub komórki szczurzej hybrydomy YB2/0), regulacja enzymów uczestniczących w szlaku glikozylacji (na przykład FUT8 [α1,6- fukozylotranseraza] i/lub β1-4-n-acetyloglukozaminylotransferaza III [Gn TIII]), oraz modyfikacje węglowodanu(-ów) modyfikujących po tym, jak IgG została wyeksprymowa-

111 1 20 2 30 3 na (Umańa i współpr., 1999, Nat Biotechnol 17:176-180; Davies i współpr., 2001, Biotechnol Bioeng 74:288-294; Shields i współpr., 2002, J Biol Chem 277:26733-26740; Shinkawa i współpr., 2003, J Biol Chem 278:3466-3473; Yamane-Ohnuki i współpr., 2004, Biotechnology i Bioengineering 87():614-621); (US 6,602,684; US 2003/0178; US 2003/0003097; PCT WO 00/61739A1; PCT WO 01/29246A1; PCT WO 02/31140A1; PCT WO 02/3094A1). [022] Wykorzystanie poszczególnych modyfikacji do zwiększenia funkcji efektorowej, na przykład podstawienie 239D i 332E i zmniejszenie poziomu fukozy, ma nie ograniczać przeciwciał anty-cd 19 do tych określonych modyfikacji. Jak opisano powyŝej w sekcji zatytułowanej Modyfikacje dla zoptymalizowanej funkcji efektorowej, dla przeciwciała anty-cd19 w celu poprawy jego właściwości funkcji efektorowych, rozwaŝa się duŝą liczbę modyfikacji, w tym modyfikacji aminokwasów i modyfikacji glikoform. Przykład 13. Przeciwciała anty-cd19 hamują proliferację pierwotnej komórki B zastosowanie przeciwciał anty-cd19 do leczenia chorób autoimmunologicznych [023] Zdolność przeciwciała anty-cd19 według tego wynalazku do zmniejszania liczby komórek B przez funkcję efektorową ADCC widać na przykładzie ich zdolność do lizy róŝnych reprezentatywnych liniach komórkowych wielu linii komórkowych B, jak pokazano w poprzednich przykładach. Funkcja ta jest mediowana komórkami efektorowymi takimi, jak komórki NK i makrofagi, eksprymujące FcγRs, których uwolnienie wywołuje lizę komórek docelowych pokrytych CD19. Dodatkowy mechanizm działania moŝe równieŝ być mediowany przeciwko komórkom B z aktywowanym antygenem. Aktywacja antygenu komórki B moŝe być naśladowana przez zastosowanie przeciwciała w stosunku do receptora komórek B (BCR). To prowadzi do ich proliferacji w hodowlach, ogólnego wymiaru aktywacji. [024] Wiązanie antygenu moŝe być naśladowane in vitro przez sieciowanie BCR (mi lub IgM) z przeciwciałem anty-mi (anty-4, anty-igm). W celu wykazania tej aktywności, Komórki jednojądrzaste krwi obwodowej (PBMC) otrzymano z Leukophoresis Pack za pomocą gradientu gęstości Ficoll, a pierwotne ludzkie komórki B oczyszczono z PBMC stosując zestaw do magnetycznej negatywnej selekcji z Miltenyi Biotec. Test proliferacji przeprowadzono w poŝywce %FBS/RPMI1640 w całkowitej objętości 0 ul w 96 dołkowych płytkach do mikromiareczkowania w tryplilkacie. Aktywację komórki B wywołano stosując fragment F(ab )2 fragment koziego przeciwciała anty-mi (Jackson Immunoresearch, Inc.). W 0 ul poŝywki, wytworzono alikwoty seryjnych rozcieńczeń przeciwciała anty-mi w 96 dołkowej płytce, do których dodano 83,000 oczyszczonych komórek VB w 0 ul objętości. Następnie płytkę do mikromiareczkowania inkubowano w 37 C przez 3

112 1 20 2 30 3 dni, po których wykorzystano format testy luminescencji z ATP (Cell TiterGlo Kit from Promega) w celu wykrycia Ŝywych komórek za pomocą luminometru. Figura 30a pokazuje, Ŝe istnieje zaleŝność od dawki proliferacji komórki B na stęŝeniach przeciwciała antymi. [02] W celu oceny zdolności przeciwciała anty-cd19 WT (4G7_H3_L1 IgG1_WT) i wariantu (4G7_H3_L1_Hybrid_239D/332E) do modulowania proliferacji komórek B, przeprowadzono test w celu monitorowania Ŝywotności pierwotnych ludzkich komórek B w obecności przeciwciała anty-cd19 i ko-stymular anty-mi. Jak opisano powyŝej, PBMC wytworzono z Leukophoresis Pack przez gradient gęstości Ficoll, a pierwotne ludzkie komórki B oczyszczono z PBMC magnetyczną selekcję ujemną. Test proliferacji przeprowadzono w poŝywce %FBS/RPMI1640 w całkowitej objętości 0 ul w 96 dołkowych płytkach do mikromiareczkowania w tryplilkacie. Aby wywołać aktywację komórki B, stosuje się fragment F(ab )2 koziego przeciwciała anty-mi. W 0 ul poŝywki, wykonano ustalone stęŝenie (2 mg/ml) anty-mi z pięciokrotnymi seryjnymi rozcieńczeniami przeciwciała w 96-studzienkowej płytce mikromiareczkowania, do których dodano 0,000 oczyszczonych komórek B w objętości 0 ul. Następnie płytkę do mikromiareczkowania inkubowano w 37 C przez 3 dni, po których, stosuje się format testu luminescencyjnego ATP do wykrycia Ŝywych komórek za pomocą luminometru. [026] Wyniki, zamieszczone na Figurze 30b, pokazują, Ŝe przeciwciało anty-cd 19 WT nie ma wpływu na podstawową proliferację komórek B, podobnie do kontroli negatywnej przeciwciała anty-cd30 (CD30 nie jest eksprymowane na komórkach B). Z drugiej strony, przeciwciało anty-cd19 zawierające modyfikacje Fc posiada znaczącą aktywność hamującą wobec Ŝywotności komórek B. Szczególnie, sygnalizacja in vivo jako wynik sieciowania przeciwciała anty-mi naśladuje angaŝowanie antygenu BCR, oraz jest zastępcą dla angaŝowania BCR przez autoantygen w autoimmunologicznych warunkach klinicznych. [027] Patogeneza większości chorób autoimmunologicznych jest połączona z produkcją autoprzeciwciał przeciwko własnym antygenom, co prowadzi do róŝnych związanych z tym patologii. Na przykład, SLE charakteryzuje się produkcją auto- lub własnych przeciwciał wobec dwuniciowego DNA. W związku z tym, w opisanym powyŝej doświadczeniu zaangaŝowanie BCR in vitro przez przeciwciało anty-mi naśladuje stymulację komórki B u pacjentów z toczniem in vivo przez przeciwciała przeciwko dwuniciowemu DNA. Autoprzeciwciała są wytwarzane przez końcowo zróŝnicowane komórki plazmatyczne, które pochodzą z komórki B naiwnej lub pamięci. Ponadto, komórki B mogą mieć wpływ na inne autoimmunologiczne patologie, jako komórki prezentujące antygen (APC), które mogą oddziaływać i stymulować pomocnicze limfocyty T, dalszej stymulując cykl przeciw wła-

113 1 snej odpowiedzi immunologicznej. Biorąc pod uwagę ekspresję CD19 na większości linii komórek B, począwszy od komórek pre-b do komórek plazmatycznych, przeciwciała według tego wynalazku mogą mieć szeroką uŝyteczność do leczenia chorób autoimmunologicznych. Przykłady takich chorób autoimmunologicznych obejmują, bez ograniczania do wymienionych, reumatoidalne zapalenie stawów (RA), toczeń rumieniowaty układowy (SLE lub toczeń), stwardnienie rozsiane, zespół Sjogrena, oraz małopłytkowość samoistna (ITP). [028] Obecny przykład pokazuje, Ŝe przeciwciała anty-cd19 według niniejszego wynalazku mogą zasadniczo hamować proliferację komórek B w sposób zaleŝny od dawki, co wskazuje, Ŝe mogą one hamować aktywację komórki B stymulowaną antygenem. Aktywacja komórek B przez antygen moŝe uruchomić proces zmiany klasy i ostatecznego końcowego zróŝnicowania do komórek plazmatycznych wydzielających przeciwciało. Przeciwciała według tego wynalazku są tym samym zdolne do hamowania tych procesów poprzez dodatkowy mechanizm działania, który nie wymaga komórek efektorowych. Oczekuje się, Ŝe wynalazek ten będzie miał korzystny wpływ na chorobę autoimmunologiczną przez zapobieganie końcowemu róŝnicowaniu naiwnych i pamięciowych populacji komórek B, a zatem zapobieganie róŝnicowaniu komórek plazmatycznych wydzielających autoprzeciwciało. MoŜliwe jest równieŝ, Ŝe przeciwciała anty-cd19 będą wpływać na dodatkowe aspekty biologii komórek B takie, jak prezentacja antygenu. 20 >IgG1m(a,x,z) allotyp (SEQ ID NO:81)

114

11

116

117

118

119

120 > 4G7 VH CDR2 DA (SEQ ID) NO:111)

121 1 20 2 30 3 YINPYNAGTKYNEKFKG > 4G7 VH CDR2 T7P (SEQ ID NO:112) YINPYNDGPKYNEKFKG > 4G7 VH CDR2 K8E (SEQ ID NO:113) YINPYNDGTEYNEKFKG > 4G7 VH CDR2 DS (SEQ ID NO:114) YINPYNSGTKYNEKFKG > 4G7 VH CDR2 DE (SEQ ID NO:11) YINPYNEGTKYNEKFKG > 4G7 VH CDR3 S0T (SEQ ID NO:116) GTYYYGTRVFDY > 4G7 VH CDR13 R0dS (SEQ ID NO:117) GTYYYGSSVFDY > 4G7 VH CDR3 S0cT/R0ds (SEQ ID NO:118) GTYYYGTSVFDY > 4G7 VL CDR1 L27cQ (SEQ ID NO:119) RSSKSLQNSNGNTYLY > 4G7 VL CDR1 L27cQ/S27eV (SEQ ID NO:120) RSSKSLQNVNGNTYLY > 4G7 VL CDR1 S27cV (SEQ ID NO:121) RSSKSLLNVNGNTYLY > 4G7 VL CDR1G29A (SEQ ID NO: 122) RSSKSLLNSNANTYLY > 4G7 VL CDR1 L27cQ/S27eV/G29A (SEQ ID NO:123) RSSKSLQNVNANTYLY > 4G7 VL CDR1 S27eA (SEQ ID NO:124) RSSKSLLNANGNTYLY > 4G7 VL CDR1 L27cQ/S27eA/G29A (SEQ ID NO:12) RSSKSLQNANANTYLY > 4G7 VL CDR1 G29S (SEQ ID NO:126) RSSKSLLNSNSNTYLY > 4G7 VL CDR1 L27cQ/S27eA/G29S(SEQ ID NO:127) RSSKSLQNANSNTYLY > 4G7 VL CDR1 L27cQ/S27eA (SEQ ID NO:128) RSSKSLQNANGNTYLY

122 1 20 2 30 3 > 4G7 VL CDR2 AN (SEQ ID NO:129) RMSNLNS > 4G7 VL CDR3 F96I (SEQ ID NO:130) MQHLEYPIT > 4G7 VL CDR3 F96N (SEQ ID NO:131) MQHLEYPNT > 4G7 VH CDR1 (SEQ ID NO:132): SYVMH > 4G7 VH CDR2 (SEQ ID NO:133): YINPYNDGTKYNEKFKG > 4G7 VH CDR3 (SEQ ID NO:134): GTYYYGSRVFDY > 4G7 VL CDR1 (SEQ ID NO:13): RSSKSLLNSNGNTYLY > 4G7 VL CDR2 (SEQ ID NO:136): RMSNLAS > 4G7 VL CDR3 (SEQ ID NO:137): MQHLEYPFT > HD37 VH CDR1 (SEQ ID NO:138): SYWMN > HD37 VH CDR2 (SEQ ID NO:139): QIWPGDGDTNYNGKFKG > HD37 VH CDR3 (SEQ ID NO:140): RETTTVGRYYYAMDY > HD37 VL CDR1 (SEQ ID NO:141): KASQSVDYDGDSYLN > HD37 VL CDR2 (SEQ ID NO:142): DASNLVS > HD37 VL CDR3 (SEQ ID NO:143): QQSTEDPWT [029] Ponadto, niniejszy opis odnosi się do następujących pozycji: 1. Przeciwciało, które wiąŝe CD19, przy czym wymienione przeciwciało zawiera łańcuch cięŝki i/lub łańcuch lekki, przy czym wymieniony łańcuch cięŝki ma CDR1 zawierający sekwencję aminokwasów wybraną z grupy składającej się z SEQ ID NO: 132 i 138, CDR2 zawiera sekwencję aminokwasów wybraną z grupy składającej się z SEQ ID NO:111-11 i CDR3 zawiera sekwencję aminokwasów wybraną z grupy składającej się z SEQ ID NO:116-118; i przy czym wymieniony łańcuch lekki CDR1 zawiera sekwencję aminokwasów wybraną z grupy składającej się z SEQ ID NO: 119-128, CDR2 zawierająca sekwencję aminokwasów o SEQ ID NO:129, oraz CDR3 zawiera sekwencję aminokwasów wybraną z grupy składającej się z SEQ ID NO:130-131. 2. Przeciwciało według punktu 1, w którym wymienione przeciwciało zawiera sekwencję części zmiennej łańcucha cięŝkiego wybraną z grupy składającej się z SEQ ID NO: 13-16, 20-23, oraz 27-44, i/lub sekwencję części zmiennej łańcucha lekkiego wybraną z grupy składającej się z SEQ ID NO: 17-19, 24-26, oraz 4-79. 3. Przeciwciało według punktu 2, w którym wymienione przeciwciało zawiera sekwencję części zmiennej łańcucha cięŝkiego wybraną z grupy składającej się z

123 1 20 2 30 3 SEQ ID NO: 86-9, i/lub sekwencję części zmiennej łańcucha lekkiego wybraną z grupy składającej się z SEQ ID NO: 96-1. 4. Przeciwciało według punktu 1, w którym wymienione przeciwciało wiąŝe się ze zwiększonym powinowactwem do receptora FcγRIIIa lub wzmacnia funkcję efektorową ADCC w porównaniu do macierzystego przeciwciała.. Przeciwciało według punktu 4, w którym wymieniona modyfikacja jest aminokwasem. 6. Przeciwciało według punktu, w którym wymieniona modyfikacja aminokwasu znajduje się w pozycji wybranej z grupy składającej się z 221, 222, 223, 224, 22, 227, 228, 230, 231, 232, 233, 234, 23, 236, 237, 238, 239, 240, 241, 243,244, 24, 246, 247, 249, 2, 28, 260, 262, 263, 264, 26, 266, 267, 268, 269, 270, 271, 272, 273, 274, 27, 276,278, 280, 281, 282, 283, 284, 28, 286, 288, 290, 291, 292, 293, 294, 29, 296, 297, 298, 299, 300, 301, 302, 303, 304, 30, 313, 317, 318, 320, 322, 323, 324, 32, 326, 327, 328, 329, 330, 331, 332, 333, 334, 33, 336, oraz 337, przy czym numeracja odbywa się zgodnie z indeksem EU. 7. Przeciwciało według punktu, w którym wymieniona modyfikacja aminokwasu jest podstawieniem wybranym z grupy składającej się z 221 K, 221 Y, 222E, 222Y, 223E, 223K, 224E, 224Y, 22E, 22K, 22W, 227E, 227G, 227K, 227Y, 228E, 228G, 228K, 228Y, 230A, 230E, 230G, 230Y, 231E, 231G, 231K, 231P, 231Y, 232E, 232G, 232K, 232Y, 233A, 233D, 233F, 233G, 233H, 2331, 233K, 233L, 233M, 233N, 233Q, 233R, 233S, 233T, 233V, 233W, 233Y, 234A, 234D, 234E, 234F, 234G, 234H, 2341, 234K, 234M, 234N, 234P, 234Q, 234R, 234S, 234T, 234V, 234W, 234Y, 23A, 23D, 23E, 23F, 23G, 23H, 23L 23K, 23M, 23N, 23P, 23Q, 23R, 23S, 23T, 23V, 23W, 23Y, 236A, 236D, 236E, 236F, 236H, 236I, 236K, 236L, 236M, 236N, 236P, 236Q, 236R, 236S, 236T, 236V, 236W, 236Y, 237D, 237E, 237F, 237H, 237I, 237K, 237L, 237M, 237N, 237P, 237Q, 237R, 237S, 237T, 237V, 237W, 237Y, 238D, 238E, 238F, 238G, 238H, 238I, 238K, 238L, 238M, 238N, 238Q, 238R, 238S, 238T, 238V, 238W, 238Y, 239D, 239E, 239F, 239G, 239H, 239I, 239K, 239L, 239M, 239N, 239P, 239Q, 239R, 239T, 239V, 239W, 239Y, 240A, 240I, 240M, 240T, 241D, 241E, 241L, 241R, 241S, 241W, 241Y, 243E, 243H, 243L, 243Q, 243R, 243W, 243Y, 244H, 24A, 246D, 246E, 246H, 246Y, 247G, 247V, 249H, 249Q, 249Y, 2E, 2Y, 28H, 28S, 28Y, 260D, 260E, 260H, 260Y, 262A, 262E, 262F, 262I, 262T, 263A, 263I, 263M, 263T, 264A, 264D, 264E, 264F, 264G, 264H, 264I, 264K, 264L, 264M, 264N, 264P, 264Q, 264R, 264S, 264T, 264W, 264Y, 26F,

124 1 20 2 30 3 26G, 26H, 26I, 26K, 26L, 26M, 26N, 26P, 26Q, 26R, 26S, 26T, 26V, 26W, 26Y, 266A, 2661, 266M, 266T, 267D, 267E, 267F, 267H, 267I, 267K, 267L, 267M, 267N, 267P, 267Q, 267R, 267T, 267V, 267W, 267Y, 268D, 268E, 268F, 268G, 268I, 268K, 268L, 268M, 268P, 268Q, 268R, 268T, 268V, 268W, 269F, 269G, 269H, 269I, 269K, 269L, 269M, 269N, 269P, 269R, 269S, 269T, 269V, 269W, 269Y, 270F, 270G, 270H, 270I, 270L, 270M, 270P, 270Q, 270R, 270S, 270T, 270W, 270Y, 271A, 271D, 271E, 271F, 271G, 271H, 271I, 271K, 271L, 271M, 271N, 271Q, 271R, 271S, 271T, 271V, 271W, 271Y, 272D, 272F, 272G, 272H, 272I, 272K, 272L, 272M, 272P, 272R, 272S, 272T, 272V, 272W, 272Y, 273I, 274D, 274E, 274F, 274G, 274H, 274I, 274L, 274M, 274N, 274P, 274R, 274T, 274V, 274W, 274Y, 27L, 27W, 276D, 276E, 276F, 276G, 276H, 276I, 276L, 276M, 276P, 276R, 276S, 276T, 276V, 276W, 276Y, 278D, 278E, 278G, 278H, 278I, 278K, 278L, 278M, 278N, 278P, 278Q, 278R, 278S, 278T, 278V, 278W, 280G, 280K, 280L, 280P, 280W, 281D, 281 E, 281K, 281N, 281P, 281Q, 281 Y, 282E, 282G, 282K, 282P, 282Y, 283G, 283H, 283K, 283L, 283P, 283R, 283Y, 284D, 284E, 284L, 284N, 284Q, 284T, 284Y, 28D, 28E, 28K, 28Q, 28W, 28Y, 286E, 286G, 286P, 286Y, 288D, 288E, 288Y, 290D, 290H, 290L, 290N, 290W, 291D, 291E, 291G, 291H, 291I, 291Q, 291T, 292D, 292E, 292T, 292Y, 293F, 293G, 293H, 293I, 293L, 293M, 293N, 293P, 293R, 293S, 293T, 293V, 293W, 293Y, 294F, 294G, 294H, 294I, 294K, 294L, 294M, 294P, 294R, 294S, 294T, 294V, 294W, 294Y, 29D, 29E, 29F, 29G, 29H, 29I, 29M, 29N, 29P, 29R, 29S, 29T, 29V, 29W, 29Y, 296A, 296D, 296E, 296G, 296H, 2961, 296K, 296L, 296M, 296N, 296Q, 296R, 296S, 296T, 296V, 297D, 297E, 297F, 297G, 297H, 297I, 297K, 297L, 297M, 297P, 297Q, 297R, 297S, 297T, 297V, 297W, 297Y, 298A, 298D, 298E, 298F, 298H, 298I, 298K, 298M, 298N, 298Q, 298R, 298T, 298W, 298Y, 299A, 299D, 299E, 299F, 299G, 299H, 299I, 299K, 299L, 299M, 299N, 299P, 299Q, 299K, 299S, 299V, 299W, 299Y, 300A, 300D, 300E, 300G, 300H, 300K, 300M, 300N, 300P, 300Q, 300R, 300S, 300T, 300V, 300W, 301D, 301E, 301H, 301Y, 302I, 303D, 303E, 303Y, 304D, 304H, 304L, 304N, 304T, 30E, 30T, 30Y, 313F, 317E, 317Q, 318H, 318L, 318Q, 318R, 318Y, 320D, 320F, 320G, 320H, 320I, 320L, 320N, 320P, 320S, 320T, 320V, 320W, 320Y, 322D, 322F, 322G, 322H, 322I, 322P, 322S, 322T, 322V, 322W, 322Y, 323I, 324D, 324F, 324G, 324H, 324I, 324L, 324M, 324P, 324R, 324T, 324V, 324W, 324Y, 32A, 32D, 32E, 32F, 32G, 32H, 32I, 32K, 32L, 32M, 32P, 32Q, 32R, 32S, 32T, 32V, 32W,

12 1 20 2 30 3 32Y, 326E, 326I, 326L, 326P, 326T, 327D, 327E, 327F, 327H, 327I, 327K, 327L, 327M, 327N, 327P, 327R, 327S, 327T, 327V, 327W, 327Y, 328A, 328D, 328E, 328F, 328G, 328H, 328I, 328K, 328M, 328N, 328P, 328Q, 328R, 328S, 328T, 328V, 328W, 328Y, 329D, 329E, 329F, 329G, 329H, 3291, 329K, 329L, 329M, 329N, 329Q, 329R, 329S, 329T, 329V, 329W, 329Y, 330E, 330F, 330G, 330H, 330I, 330L, 330M, 330N, 330P, 330R, 330S, 330T, 330V, 330W, 330Y, 331D, 331F, 331H, 331I, 331L, 331M, 331Q, 331R, 331T, 331V, 331W, 331Y, 332A, 332D, 332E, 332F, 332H, 332K, 332L, 332M, 332N, 332P, 332Q, 332R, 332S, 332T, 332V, 332W, 332Y, 333A, 333F, 333H, 333I, 333L, 333M, 333P, 333T, 333Y, 334A, 334F, 334I, 334L, 334P, 334T, 33D, 33F, 33G, 33H, 331, 33L, 33M, 33N, 33P, 33R, 33S, 33V, 33W, 33Y, 336E, 336K, 336Y, 337E, 337H, oraz 337N, przy czym numeracja odbywa się zgodnie z indeksem EU. 8. Przeciwciało według punktu, w którym wymieniona modyfikacja aminokwasu znajduje się w pozycji wybranej z grupy składającej się z 221, 222, 223, 224, 22, 227, 228, 230, 231, 232, 233, 234, 23, 236, 237, 238, 239, 240, 241, 243, 24, 246, 247, 249, 2, 28, 260, 262, 263, 264, 26, 266, 267, 268, 269, 270, 271, 272, 274, 27, 276, 278, 280, 281, 282, 283, 284, 28, 286, 288, 290, 291, 292, 293, 294, 29, 296, 297, 298, 299, 300, 301, 302, 303, 304, 30, 313, 317, 318, 320, 322, 324, 32, 326, 327, 328, 329, 330, 331, 332, 333, 334, 33, 336, oraz 337. 9. Przeciwciało według punktu, w którym wymieniona modyfikacja aminokwasu jest podstawieniem wybranym z grupy składającej się z 221K, 222Y, 223E, 223K, 224E, 224Y, 22E, 22W, 227E, 227G, 227K, 227Y, 228E, 228G, 228K, 228Y, 230A, 230E, 230G, 230Y, 231E, 231G, 231K, 231P, 231Y, 232E, 232G, 232K, 232Y, 233A, 233F, 233H, 233I, 233K, 233L, 233M, 233N, 233Q, 233R, 233S, 233T, 233V, 233W, 233Y, 234D, 234E, 234F, 234G, 234H, 234I, 234K, 234M, 234N, 234P, 234Q, 234R, 234S, 234T, 234W, 234Y, 23D, 23F, 23G, 23H, 23I, 23K, 23M, 23N, 23Q, 23R, 23S, 23T, 23V, 23W, 23Y, 236D, 236F, 236F, 236H, 236I, 236K, 236L, 236M, 236N, 236P, 236Q, 236R, 236S, 236T, 236V, 236W, 236Y, 237D, 237E, 237F, 237H, 237I, 237K, 237L, 237M, 237N, 237P, 237Q, 237R, 237S, 237T, 237V, 237W, 237Y, 238D, 238E, 238F, 238G, 238H, 238I, 238K, 238L, 238M, 238N, 238Q, 238R, 238S, 238T, 238V, 238W, 238Y, 239D, 239E, 239F, 239G, 239H, 239I, 239K, 239L, 239M, 239N, 239P, 239Q, 239R, 239T, 239V, 239W, 239Y, 240M, 240T, 241D, 241E, 241R, 241S, 241W, 241Y, 243E, 243H, 243Q, 243R, 243W, 243Y, 24A, 246D, 246H,

126 1 20 2 30 3 24Y, 247G, 247V, 249H, 249Q, 249Y, 2E, 2Y, 28H, 28S, 28Y, 260D, 260E, 260H, 260Y, 262A, 262E, 262F, 262I, 262T, 263A, 263I, 263M, 263T, 264D, 264E, 264F, 264G, 264H, 2641, 264K, 264L, 264M, 264N, 264P, 264Q, 264R, 264S, 264T, 264W, 264Y, 26F, 26G, 26H, 26I, 26K, 26L, 26M, 26P, 26Q, 26R, 26S, 26T, 26V, 26W, 26Y, 266A, 266I, 266M, 266T, 267D, 267E, 267F, 267H, 267I, 267K, 267L, 267M, 267N, 267P, 267Q, 267R, 267V, 267W, 267Y, 268F, 268G, 268I; 268M, 268P, 268T, 268V, 268W, 269F, 269G, 269H, 269I, 269L, 269M, 269N, 269P, 269R, 269S, 269T, 269V, 269W, 269Y, 270F, 270G, 270H, 270I, 270L, 270M, 270P, 270Q, 270R, 270S, 270T, 270W, 270Y, 271A, 271D, 271E, 271F, 271G, 271H, 271I, 271K, 271L, 271M, 271N, 271Q, 271R, 271 S, 277T, 271V, 271W, 271Y, 272F, 272G, 272H, 272I, 272K, 272L, 272M, 272P, 272R, 272S, 272T, 272V, 272W, 272Y, 274D, 274E, 274F, 274G, 274H, 274I, 274L, 274M, 274P, 274R, 274T, 274V, 274W, 274Y, 27W, 276D, 276E, 276F, 276G, 276H, 276I, 276L, 276M, 276P, 276R, 276S, 276T, 276V, 276W, 278D, 278E, 278G, 278H, 278I, 278K, 278L, 278M, 278N, 278P, 278Q, 278R, 278S, 278T, 278V, 278W, 280G, 280P, 280W, 281E, 281K, 281N, 281P, 281Y, 282G, 282P, 282Y, 283G, 283H, 283K, 283L, 283P, 283R, 283Y, 284L, 284N, 284Q, 284T, 284Y, 28K, 28Q, 28W, 28Y, 286G, 286P, 286Y, 288Y, 290H, 290L, 290W, 291D, 291E, 291G, 291H, 291T, 291Q, 291T, 292D, 292E, 292T, 292Y, 293F, 293G, 293H, 293I, 293L, 293M, 293N, 293P, 293R, 293S, 293T, 293W, 293Y, 294F, 294G, 294H, 294I, 294K, 294L, 294M, 294P, 294R, 294S, 294T, 294V, 294W, 294Y, 29D, 29F, 29G, 29H, 291, 29M, 29N, 29P, 29R, 29S, 29T, 29V, 29W, 29Y, 296A, 296D, 296E, 296G, 296I, 296K, 296L, 296M, 296N, 296Q, 296R, 296S, 296T, 296V, 297D, 297E, 297F, 297G, 297H, 297I, 297K, 297L, 297M, 297P, 297R, 297S, 297T, 297V, 297W, 297Y, 298E, 298F, 298H, 298I, 298K, 298M, 298Q, 298R, 298W, 298Y, 299A, 299D, 299E, 299F, 299G, 299H, 299I, 299K, 299L, 299M, 299N, 299P, 299Q, 299R, 299S, 299V, 299W, 299Y, 300A, 300D, 300E, 300G, 300H, 300K, 300M, 300N, 300P, 300Q, 300R, 300S, 300T, 300V, 300W, 301D, 301E, 301Y, 302I, 303D, 303E, 303Y, 304H, 304L, 304N, 304T, 30E, 30T, 30Y, 313F, 317E, 317Q, 318H, 318L, 318Q, 318R, 318Y, 320D, 320F, 320G, 320H, 320I, 320L, 320N, 320P, 320S, 320T, 320V, 320W, 320Y, 322D, 322F, 322G, 322H, 322I, 322P, 322S, 322T, 322V, 322W, 322Y, 324D, 324F, 324G, 324H, 324I, 324L, 324M, 324P, 324R, 324T, 324V, 324W, 324Y, 32A, 32D, 32E, 32F, 32G, 32H, 321, 32K, 32L, 32M, 32P, 32Q, 32R, 32S, 32T,

127 1 20 2 30 3 32V, 32W, 32Y, 326L, 326P, 326T, 327D, 327E, 327F, 327H, 327I, 327Y, 327L, 327M, 327P, 327R, 327V, 327W, 327Y, 328A, 328D, 328E, 328F, 328G, 328H, 328K, 328M, 328N, 328P, 328Q, 328R, 328S, 328T, 328V, 328W, 328Y, 329D, 329E, 329F, 329G, 329H, 3291, 329K, 329L, 329M, 329N, 329Q, 329R, 329S, 329T, 329V, 329W, 329Y, 330E, 330F, 330H, 3301, 330L, 330M, 330N, 330P, 330W, 330Y, 331D, 331F, 331H, 331I, 331L, 331M, 331Q, 331R, 331T, 331V, 331W, 331Y, 332A, 332F, 332H, 332L, 332M, 332N, 332P, 332Q, 332S, 332T, 332V, 332W, 332Y, 333F, 333H, 333I, 333L, 333M, 333P, 333T, 333Y, 334F, 334P, 334T, 33D, 33F, 33G, 33H, 33I, 33L, 33M, 33P, 33R, 33S, 33V, 33W, 33Y, 336E, 336K, 336Y, 337H, oraz 337N.. Przeciwciało według punktu, w którym wymieniona modyfikacja znajduje się w pozycji wybranej z grupy składającej się z 221, 222, 223, 224, 22, 228, 230, 231, 232, 240, 244, 24, 247, 262, 263, 266, 271, 273, 27, 281, 284, 291, 299, 302, 304, 313, 323, 32, 328, 332, 336, przy czym numeracja pozycji odbywa się zgodnie z indeksem EU. 11. Przeciwciało według punktu, w którym wymieniona modyfikacja jest wybrana z grupy składającej się z 221K, 221Y, 222E, 222Y, 223E, 223K, 224E, 224Y, 22E, 22K, 22W, 228E, 228G, 228K, 228Y, 230A, 230E, 230G, 230Y, 231E, 231G, 231K, 231P, 231Y, 232E, 232G, 232K, 232Y, 240A, 240I, 240M, 240T, 244H, 24A, 247G, 247V, 262A, 262E, 262F, 262I, 262T, 263A, 2631, 263M, 263T, 266A, 266I, 266M, 266T, 271A, 271D, 271E, 271F, 271G, 271H, 271I, 271K, 271L, 271M, 271N, 271Q, 271R, 271S, 271T, 271V, 271W, 271Y, 273I, 27L, 27W, 281D, 281E, 281K, 281N, 281P, 281Q, 281Y, 284D, 284E, 284L, 284N, 284Q, 284T, 284Y, 291D, 293E, 291G, 291H, 2911, 291Q, 291T, 299A, 299D, 299E, 299F, 299G, 299H, 299I, 299K, 299L, 299M, 299N, 299P, 299Q, 299R, 299S, 299V, 299W, 299Y, 304D, 304H, 304L, 304N, 304T, 313F, 323I, 32A, 32D, 32E, 32F, 32G, 32H, 32I, 32K, 32L, 32M, 32P, 32Q, 32R, 32S, 32T, 32V, 32W, 32Y, 328A, 328D, 328E, 328F, 328G, 328H, 328I, 328K, 328M, 328N, 328P, 328Q, 328R, 328S, 328T, 328V, 328W, 328Y, 332A, 332D, 332E, 332F, 332H, 332K, 332L, 332M, 332N, 332P, 332Q, 332R, 332S, 332T, 332V, 332W, 332Y, 336E, 336K, oraz 336Y. 12. Przeciwciało według punktu, zawierające dalej modyfikację drugiego aminokwasu znajdującą się w pozycji wybranej z grupy składającej się z 221, 222, 223, 224, 22, 227, 228, 230, 231, 232, 233, 234, 23, 236, 237; 238. 239, 240, 241, 243, 244, 24, 246, 247, 249, 2, 28, 260, 262, 263, 264, 26, 266, 267,268, 269;

128 1 20 2 30 3 270, 271, 272, 273, 274, 27, 276, 278, 280, 281, 282, 283, 284, 28, 286, 288, 290, 291, 292, 293, 294, 29, 296, 297, 298, 299, 300, 301, 302, 303, 304, 30, 313, 317, 318, 320, 322, 323, 324, 32, 326, 327, 328, 329, 330, 33!, 332, 333, 334, 33, 36, oraz 337, przy czym numeracja odbywa się zgodnie z indeksem EU. 13. Przeciwciało według punktu, w którym wspomniana druga modyfikacja aminokwasu jest podstawieniem wybranym z grupy składającej się z 221K, 221Y, 222E, 222Y, 223E, 223K, 224E, 224Y, 22E, 22K, 22W, 227E, 227G, 227K, 227Y, 228E, 228G, 228K, 228Y, 230A, 230E, 230G, 230Y, 231E, 231G, 231K, 231P, 231Y, 232E, 232G, 232K, 232Y, 233A, 233D, 233F, 233G, 233H, 2331, 233K, 233L, 233M, 233N, 233Q, 233R, 233S, 233T, 233V, 233W, 233Y, 234A, 234D, 234E, 234F, 234G, 234H, 2341, 234K, 234M, 234N, 234P, 234Q, 234R, 234S, 234T, 234V, 234W, 234Y, 23A, 23D, 23E, 23F, 23G, 23H, 23I, 23K, 23M, 23N, 23P, 23Q, 23R, 23S, 23T, 23V, 23W, 23Y, 236A, 236D, 236E, 236F, 236H, 236I, 236K, 236L, 236M, 236N, 236P, 236Q, 236R, 236S, 236T, 236V, 236W, 236Y, 237D, 237E, 237F, 237H, 237I, 237K, 237L, 237M, 237N, 237P, 237Q, 237R, 237S, 237T, 237V, 237W, 237Y, 238D, 238E, 238F, 238G, 238H, 238I, 238K, 238L, 238M, 238N, 238Q, 238R, 238S, 238T, 238V, 238W, 238Y, 239D, 239E, 239F, 239G, 239H, 239I, 239K, 239L, 239M, 239N, 239P, 239Q, 239R, 239T, 239V, 239W, 239Y, 240A, 240I, 240M, 240T, 241D, 241E, 241L, 241R, 241S, 241W, 241Y, 243E, 243H, 243L, 243Q, 243R, 243W, 243Y, 244H, 24A, 246D, 246E, 246H, 246Y, 247G, 247V, 249H, 249Q, 249Y, 2E, 2Y, 28H, 28S, 28Y, 260D, 2601E, 260H, 260Y, 262A, 262E, 262F, 262I, 262T, 263 A, 263I, 263M, 263T, 264A, 264D, 264E, 264F, 264G, 264H, 2641, 264K, 264L, 264M, 264N, 264P, 264Q, 264R, 264S, 264T, 264W, 264Y, 26F, 26G, 26H, 26I, 26K, 26L, 26M, 26N, 26P, 26Q, 26R, 26S, 26T, 26V, 26W, 26Y, 266A, 266I, 266M, 266T, 267D, 267E, 267F, 267H, 267I, 267K, 267L, 267M, 267N, 267P, 267Q, 267R, 267T, 267V, 267W, 267Y, 268D, 268E, 268F, 268G, 268I, 268K, 268L, 268M, 268P, 268Q, 268R, 268T, 268V, 268W, 269F, 269G, 269H, 2691, 269K, 269L, 269M, 269N, 269P, 269R, 269S, 269T, 269V, 269W, 269Y, 270F, 270G, 270H, 270I, 270L, 270M, 270P, 270Q, 270R, 270S, 270T, 270W, 270Y, 271A, 271D, 271E, 271F, 271G, 271H, 271I, 271K, 271L, 271M, 271N, 271Q, 271R, 271S, 271T, 271V, 271W, 271Y, 272D, 272F, 272G, 272H, 272I, 272K, 272L, 272M, 272P, 272R, 272S, 272T, 272V, 272W, 272Y, 273I, 274D, 274E, 274F, 274G, 274H, 274T, 274L, 274M, 274N, 274P, 274R, 274T, 274V, 274W, 274Y, 27L, 27W, 276D, 276E,

129 1 20 2 30 3 276F, 276G, 276H, 276I, 276L, 276M, 276P, 276R, 276S, 276T, 276V, 276W, 276Y, 278D, 278E, 278G, 278H, 2781, 278K, 278L, 278M, 278N, 278P, 278Q, 278R, 278S, 278T, 278V, 278W, 280G, 280K, 280L, 280P, 280W, 281D, 281E, 281K, 281N, 281P, 281Q, 281Y, 282E, 282G, 282K, 282P, 282Y, 283G, 283H, 283K, 283L, 283P, 283R, 283Y, 284D, 284E, 284L, 284N, 284Q, 284T, 284Y, 28D, 28E, 28K, 28SQ, 28W, 28Y, 286E, 286G, 286P, 286Y, 288D, 288E, 288Y, 290D, 290H, 290L, 290N, 290W, 291D, 291E, 291G, 291H, 291I, 291Q, 291T, 292D, 292E, 292T, 292Y, 293F, 293G, 293H, 293I, 293L, 293M, 293N, 293P, 293R, 293S, 293T, 293V, 293W, 293Y, 294F, 294G, 294H, 294I, 294K, 294L, 294M, 294P, 294R, 294S, 294T, 294V, 294W, 294Y, 29D, 29E, 29F, 29G, 29H, 29I, 29M, 29N, 29P, 29R, 29S, 29T, 29V, 29W, 29Y, 296A, 296D, 296E, 296G, 296H, 2961, 296K, 296L, 296M, 296N, 296Q, 296R, 296S, 296T, 296V, 297D, 297E, 297F, 297G, 297H, 297I, 297K, 297L, 297M, 297P, 297Q, 297R, 297S, 297T, 297V, 297W, 297Y, 298A, 298D, 298E, 298F, 298H, 298I, 298K, 298M, 298N, 298Q, 298R, 298T, 298W, 298Y, 299A, 299D, 299E, 299F, 299G, 299H, 2991, 299K, 299L, 299M, 299N, 299P, 299Q, 299R, 299, 299V, 299W, 299Y, 300A, 300D, 300E, 300G, 300H, 300K, 300M, 300N, 300P, 300Q, 300R, 300S, 300T, 300V, 300W, 301D, 301 E, 301H, 301Y, 302I, 303D, 303E, 303Y, 304D, 304H, 304L, 304N, 304T, 30E, 30T, 30Y, 313F, 317E, 317Q, 318H, 318L, 318Q, 318R, 318Y, 320D, 320F, 320G, 320H, 320I, 320L, 320N, 320P, 320S, 320T, 320V, 320W, 320Y, 322D, 322F, 322G, 322H, 322I, 322P, 322S, 322T, 322V, 322W, 322Y, 323I, 324D, 324F, 324G, 324H, 324I, 324L, 324M, 324P, 324R, 324T, 324V, 324W, 324Y, 32A, 32D, 32E, 32F, 32G, 32H, 32I, 32K, 32L, 32M, 32P, 32Q, 32R, 32S, 32T, 32V, 32W, 32Y, 326E, 326I, 326L, 326P, 326T, 327D, 327E, 327F, 327H, 327I, 327K, 327L, 327M, 327N, 327P, 327R, 327S, 327T, 327V, 327W, 327Y, 328A, 328D, 328E, 328F, 328G, 328H, 328I, 328K, 328M, 328N, 328P, 328Q, 328R, 328S, 328T, 328V, 328W, 328Y, 329D, 329E, 329F, 329G, 329H, 329I, 329K, 329L, 329M, 329N, 329Q, 329R, 329S, 329T, 329V, 329W, 329Y, 330E, 330F, 330G, 330H, 330I, 330L, 330M, 330N, 330P, 330R, 330S, 330T, 330V, 330W, 330Y, 331D, 331F, 331H, 331I, 331L, 331M, 331Q, 331R, 331T, 331V, 331W, 331Y, 332A, 332D, 332E, 332F, 332H, 332K, 332L, 332M, 332N, 332P, 332Q, 332R, 332S, 332T, 332V, 332W, 332Y, 333A, 333F, 333H, 333I, 333L, 333M, 333P, 333T, 333Y, 334A, 334F, 334I, 334L, 334P, 334T, 33D, 33F, 33G, 33H, 33I, 33L, 33M, 33N, 33P, 33R, 33S, 33V, 33W, 33Y, 336E,

130 1 20 2 30 336K, 336Y, 337E, 337H, oraz 337N, przy czym numeracja odbywa się zgodnie z indeksem EU. 14. Przeciwciało według punktu, w którym modyfikacja aminokwasu jest 332E. 1. Przeciwciało według punktu 14, zawierające dalej modyfikację drugiego aminokwasu wybraną z grupy składającej się z: 236A, 239D, 332E, 268D, 268E, 330Y, oraz 330L. 16. Przeciwciało według punktu 1, w którym druga modyfikacja aminokwasu jest 239D. 17. Przeciwciało według punktu 4, w którym wymieniona modyfikacja jest modyfikacją glikoformy, która zmniejsza poziom fukozy w stosunku do macierzystego przeciwciała. 18. Kompozycja zawierająca wiele glikozylowanych przeciwciał, przy czym około 80-0% glikozylowanego przeciwciała w kompozycji zawiera dojrzałą węglowodanową strukturę rdzenia pozbawioną fukozy. 19. Przeciwciało według punktu 1, w którym wymienione przeciwciało dalej zmniejsza wiązanie do FcγRIIb w porównaniu do wymienionego macierzystego przeciwciała anty-cd 19. 20. Sekwencja kwasu nukleinowego kodująca przeciwciało określone dowolnym punktem 1-17. 21. Sposób leczenia choroby związanej z komórkami B, w którym wymieniony sposób obejmuje podawanie przeciwciała określonego punktem 1. 22. Sposób według punktu 21, w którym wymieniona choroba jest wybrana z grupy składającej się z: chłoniaków nieziarniczych (NHL), przewlekłej białaczki limfocytowej (CLL), ostra białaczka limfoblastyczna/chłoniaka limfoblastycznego z komórek B (B-ALL), oraz chłoniaka z komórek płaszcza (MCL). 23. Sposób według punktu 21, w którym wymieniona choroba jest chorobą autoimmunologiczną. 24. Sposób według punktu 23, w którym wymieniona choroba jest wybrana z grupy składającej się z: reumatoidalnego zapalenia stawów (RA), układowego tocznia rumieniowatego (SLE lub toczeń), stwardnienia rozsianego, zespołu Sjogrena, oraz małopłytkowości samoistnej (ITP). 2. Kompozycja farmaceutyczna zawierająca przeciwciało określone punktem 1 i farmaceutycznie dopuszczalny nośnik.

131 LISTY SEKWENCJI [0260] <1> XENCOR, INC. <120> OPTIMIZED ANTIBODIES, które są ukierunkowane na CD19 <130> T2329 EP/1 S3 <140> PCT/US2007/07932 <141> 2007-08-14 <> US 60/822,362 <11> 2006-08-14 <160> 146 <170> PatentIn version 3. 1 <2> 1 <211> 6 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1

132

133 <2> 2 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2

134 <2> 3 <211> 330 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 3

13

136 <2> 4 <211> 326 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 4

137

138 <2> <211> 377 <212> PRT <213> Homo sapiens <400>

139 <2> 6 <211> 327 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 6

140

141 <2> 7 <211> 330 <212> PRT <213> Sztuczna Sekwencja <220> <223> Hybrydowy stały łańcuch lekki (CH) <400> 7

142 <2> 8 <211> 330 <212> PRT

143 <213> Sztuczna Sekwencja <220> <223> Hybrydowy stały łańcuch lekki (CH) z podstawieniami 239D i 332E <400> 8

144 <2> 9 <211> 121 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 9 <2>

14 <211> 112 <212> PRT <213> Mus musculus <400> <2> 11 <211> 124 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 11

146 <2> 12 <211> 111 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 12

147 <2> 13 <211> 121 <212> PRT <213> Sztuczna Sekwencja <220> <223> H1 4G7 <400> 13 1 <2> 14 <211> 121 <212> PRT <213> Sztuczna Sekwencja <220> <223> H2 4G7 <400> 14

148 <2> 1 <211> 121 <212> PRT <213> Sztuczna Sekwencja <220> <223> H3 4G7 <400> 1

149 <2> 16 <211> 121 <212> PRT <213> Sztuczna Sekwencja <220> <223> H4 4G7 <400> 16 <2> 17 <211> 112 <212> PRT

<213> Sztuczna Sekwencja <220> <223> L1 4G7 <400> 17 <2> 18 <211> 112 <212> PRT <213> Sztuczna Sekwencja <220> <223> L2 4G7 <400> 18

11 <2> 19 <211> 112 <212> PRT <213> Sztuczna Sekwencja <220> <223> L3 4G7 <400> 19

12 <2> 20 <211> 124 <212> PRT <213> Sztuczna Sekwencja <220> <223> H1 HD37 <400> 20

13 <2> 21 <211> 124 <212> PRT <213> Sztuczna Sekwencja <220> <223> H2 HD37 <400> 21 <2> 22 <211> 124 <212> PRT

14 <213> Sztuczna Sekwencja <220> <223> H3 HD37 <400> 22 <2> 23 <211> 124 <212> PRT <213> Sztuczna Sekwencja <220> <223> H4 HD37 <400> 23

1 <2> 24 <211> 111 <212> PRT <213> Sztuczna Sekwencja <220> <223> L1 HD37 <400> 24 <2> 2 <211> 111 <212> PRT

16 <213> Sztuczna Sekwencja <220> <223> L2 HD37 <400> 2 <2> 26 <211> 111 <212> PRT <213> Sztuczna Sekwencja <220> <223> L3 HD37 <400> 26

17 <2> 27 <211> 121 <212> PRT <213> Sztuczna Sekwencja <220> <223> 4G7 H1.9 <400> 27 1 <2> 28 <211> 121 <212> PRT <213> Sztuczna Sekwencja <220>

18 <223> 4G7 H1.113 <400> 28 <2> 29 <211> 121 <212> PRT <213> Sztuczna Sekwencja <220> <223> 4G7 H1.144 <400> 29

19 <2> 30 <211> 121 <212> PRT <213> Sztuczna Sekwencja <220> <223> 4G7 H1.146 <400> 30 <2> 31 <211> 121 <212> PRT

160 <213> Sztuczna Sekwencja <220> <223> 4G7 H1.147 <400> 31 <2> 32 <211> 121 <212> PRT <213> Sztuczna Sekwencja <220> <223> 4G7 H1.191 <400> 32 1

161 <2> 33 <211> 121 <212> PRT <213> Sztuczna Sekwencja <220> <223> 4G7 H1.192 <400> 33 <2> 34 <211> 121

162 <212> PRT <213> Sztuczna Sekwencja <220> <223> 4G7 H1.196 <400> 34 <2> 3 <211> 121 <212> PRT <213> Sztuczna Sekwencja <220> <223> 4G7 H1.199 <400> 3

163 <2> 36 <211> 121 <212> PRT <213> Sztuczna Sekwencja <220> <223> 4G7 H1.201 <400> 36

164 <2> 37 <211> 121 <212> PRT <213> Sztuczna Sekwencja <220> <223> 4G7 H1.202 <400> 37 1 <2> 38 <211> 121 <212> PRT <213> Sztuczna Sekwencja <220> <223> 4G7 H1.203 <400> 38

16 <2> 39 <211> 121 <212> PRT <213> Sztuczna Sekwencja <220> <223> 4G7 H1.204 <400> 39

166 <2> 40 <211> 121 <212> PRT <213> Sztuczna Sekwencja <220> <223> 4G7 H1.2 <400> 40 1 <2> 41 <211> 121 <212> PRT <213> Sztuczna Sekwencja <220>

167 <223> 4G7 H1.60 <400> 41 <2> 42 <211> 121 <212> PRT <213> Sztuczna Sekwencja <220> <223> 4G7 H1.62 <400> 42

168 <2> 43 <211> 121 <212> PRT <213> Sztuczna Sekwencja <220> <223> 4G7 H1.6 <400> 43

169 <2> 44 <211> 121 <212> PRT <213> Sztuczna Sekwencja <220> <223> 4G7 H1.78 <400> 44 1 <2> 4 <211> 112 <212> PRT <213> Sztuczna Sekwencja <220>

170 <223> 4G7 L1.11 <400> 4 <2> 46 <211> 112 <212> PRT <213> Sztuczna Sekwencja <220> <223> 4G7 L1.124 <400> 46

171 <2> 47 <211> 112 <212> PRT <213> Sztuczna Sekwencja <220> <223> 4G7 L1.138 <400> 47 1 <2> 48 <211> 112 <212> PRT <213> Sztuczna Sekwencja <220> <223> 4G7 L1.139

172 <400> 48 <2> 49 <211> 112 <212> PRT <213> Sztuczna Sekwencja <220> <223> 4G7 L1.141 <400> 49

173 <2> 0 <211> 112 <212> PRT <213> Sztuczna Sekwencja <220> <223> 4G7 L1.143 <400> 0 1 <2> 1 <211> 112 <212> PRT <213> Sztuczna Sekwencja <220> <223> 4G7 L1.144

174 <400> 1 <2> 2 <211> 112 <212> PRT <213> Sztuczna Sekwencja <220> <223> 4G7 L1.14 <400> 2 1 <2> 3 <211> 112 <212> PRT <213> Sztuczna Sekwencja <220> <223> 4G7 L1.146 <400> 3

17 <2> 4 <211> 112 <212> PRT <213> Sztuczna Sekwencja <220> <223> 4G7 L1.148 <400> 4

176 <2> <211> 112 <212> PRT <213> Sztuczna Sekwencja <220> <223> 4G7 L1.149 <400>

177 <2> 6 <211> 112 <212> PRT <213> Sztuczna Sekwencja <220> <223> 4G7 L1.12 <400> 6 1 <2> 7 <211> 112 <212> PRT <213> Sztuczna Sekwencja <220> <223> 4G7 L1.14 <400> 7

178 <2> 8 <211> 112 <212> PRT <213> Sztuczna Sekwencja <220> <223> 4G7 L1.1 <400> 8

179 <2> 9 <211> 112 <212> PRT <213> Sztuczna Sekwencja <220> <223> 4G7 L1.160 <400> 9 1 <2> 60 <211> 112 <212> PRT <213> Sztuczna Sekwencja <220> <223> 4G7 L1.161 <400> 60

180 <2> 61 <211> 112 <212> PRT <213> Sztuczna Sekwencja <220> <223> 4G7 L1.162 <400> 61

181 <2> 62 <211> 112 <212> PRT <213> Sztuczna Sekwencja <220> <223> 4G7 L1.163 <400> 62 1 <2> 63 <211> 112 <212> PRT <213> Sztuczna Sekwencja <220>

182 <223> 4G7 L1.164 <400> 63 <2> 64 <211> 112 <212> PRT <213> Sztuczna Sekwencja <220> <223> 4G7 L1.17 <400> 64

183 <2> 6 <211> 112 <212> PRT <213> Sztuczna Sekwencja <220> <223> 4G7 L1.19 <400> 6

184 <2> 66 <211> 112 <212> PRT <213> Sztuczna Sekwencja <220> <223> 4G7 L1.26 <400> 66 1 <2> 67 <211> 112 <212> PRT <213> Sztuczna Sekwencja <220> <223> 4G7 L1.3 <400> 67

18 <2> 68 <211> 112 <212> PRT <213> Sztuczna Sekwencja <220> <223> 4G7 L1.32 <400> 68

186 <2> 69 <211> 112 <212> PRT <213> Sztuczna Sekwencja <220> <223> 4G7 L1.46 <400> 69 1 <2> 70 <211> 112 <212> PRT <213> Sztuczna Sekwencja <220> <223> 4G7 L1.4 <400> 70

187 <2> 71 <211> 112 <212> PRT <213> Sztuczna Sekwencja <220> <223> 4G7 L1. <400> 71

188 <2> 72 <211> 112 <212> PRT <213> Sztuczna Sekwencja <220> <223> 4G7 L1.64 <400> 72 1 <2> 73 <211> 112 <212> PRT <213> Sztuczna Sekwencja <220> <223> 4G7 L1.67 <400> 73

189 <2> 74 <211> 112 <212> PRT <213> Sztuczna Sekwencja <220> <223> 4G7 L1.68 <400> 74

190 <2> 7 <211> 112 <212> PRT <213> Sztuczna Sekwencja <220> <223> 4G7 L1.8 <400> 7 1 <2> 76 <211> 112 <212> PRT <213> Sztuczna Sekwencja <220> <223> 4G7 L1.80 <400> 76

191 <2> 77 <211> 112 <212> PRT <213> Sztuczna Sekwencja <220> <223> 4G7 L1.9 <400> 77

192 <2> 78 <211> 112 <212> PRT <213> Sztuczna Sekwencja <220> <223> 4G7 L1.92 <400> 78 1 <2> 79 <211> 112 <212> PRT <213> Sztuczna Sekwencja <220> <223> 4G7 L1.96 <400> 79

193 <2> 80 <211> 330 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 80

194 <2> 81 <211> 330 <212> PRT <213> Homo sapiens

<400> 81 19

196 <2> 82 <211> 330 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 82

197 <2> 83 <211> 330 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 83

198

199 <2> 84 <211> 326 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 84

200 <2> 8 <211> 326 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 8

201

202 <2> 86 <211> 41 <212> PRT <213> Sztuczna Sekwencja <220> <223> 4G7 H1 Hybrid S239D/I332E <400> 86

203

204 <2> 87 <211> 41 <212> PRT <213> Sztuczna Sekwencja <220> <223> 4G7 H1.2 Hybrid S239D/I332E <400> 87

20

206

207 <2> 88 <211> 41 <212> PRT <213> Sztuczna Sekwencja <220> <223> 4G7 H1.78 Hybrid S239D/I332E <400> 88

208

209 <2> 89 <211> 41 <212> PRT <213> Sztuczna Sekwencja <220> <223> 4G7 H1.191 Hybrid S239D/I332E <400> 89

2

211 <2> 90 <211> 41 <212> PRT <213> Sztuczna Sekwencja <220> <223> 4G7 H1.192 Hybrid S239D/I332E <400> 90

212

213 <2> 91 <211> 41 <212> PRT <213> Sztuczna Sekwencja <220> <223> 4G7 H1.196 Hybrid S239D/I332E <400> 91

214

21 <2> 92 <211> 41 <212> PRT <213> Sztuczna Sekwencja <220> <223> 4G7 H1.201 Hybrid S239D/I332E <400> 92

216

217 <2> 93 <211> 41 <212> PRT <213> Sztuczna Sekwencja <220> <223> 4G7 H1.202 Hybrid S239D/I332E <400> 93

218

219 <2> 94 <211> 41 <212> PRT <213> Sztuczna Sekwencja <220> <223> 4G7 H1.203 Hybrid S239D/I332E <400> 94

220

221 <2> 9 <211> 41 <212> PRT <213> Sztuczna Sekwencja <220> <223> 4G7 H1.204 Hybrid S239D/I332E

<400> 9 222

223 <2> 96 <211> 219 <212> PRT <213> Sztuczna Sekwencja <220>

224 <223> 4G7 L1 <400> 96 <2> 97 <211> 219 <212> PRT <213> Sztuczna Sekwencja <220>

22 <223> 4G7 L1.26 <400> 97 <2> 98 <211> 219 <212> PRT <213> Sztuczna Sekwencja

226 <220> <223> 4G7 L1.32 <400> 98 <2> 99

227 <211> 219 <212> PRT <213> Sztuczna Sekwencja <220> <223> 4G7 L1.64 <400> 99

228 <2> 0 <211> 219 <212> PRT <213> Sztuczna Sekwencja <220> <223> 4G7 L1.68 <400> 0

229 <2> 1 <211> 219 <212> PRT <213> Sztuczna Sekwencja <220>

230 <223> 4G7 L1.96 <400> 1 <2> 2 <211> 219 <212> PRT <213> Sztuczna Sekwencja

231 <220> <223> 4G7 L1.14 <400> 2 <2> 3 <211> 219

232 <212> PRT <213> Sztuczna Sekwencja <220> <223> 4G7 L1.148 <400> 3 <2> 4

233 <211> 219 <212> PRT <213> Sztuczna Sekwencja <220> <223> 4G7 L1.149 <400> 4

234 <2> <211> 219 <212> PRT <213> Sztuczna Sekwencja <220> <223> 4G7 L1.14 <400>

23 <2> 6 <211> 219 <212> PRT <213> Sztuczna Sekwencja <220> <223> 4G7 L1.1

236 <400> 6 <2> 7 <211> 219 <212> PRT <213> Sztuczna Sekwencja

237 <220> <223> 4G7 L1.160 <400> 7 <2> 8 <211> 219 <212> PRT

238 <213> Sztuczna Sekwencja <220> <223> 4G7 L1.162 <400> 8 <2> 9 <211> 219 <212> PRT

239 <213> Sztuczna Sekwencja <220> <223> 4G7 L1.163 <400> 9 <2> 1 <211> 219

240 <212> PRT <213> Sztuczna Sekwencja <220> <223> 4G7 L1.164 <400> 1 <2> 111 <211> 17

241 <212> PRT <213> Sztuczna Sekwencja <220> <223> 4G7 VH CDR2 DA <400> 111 <2> 112 <211> 17 <212> PRT <213> Sztuczna Sekwencja <220> <223> 4G7 VH CDR2 T7P <400> 112 1 20 <2> 113 <211> 17 <212> PRT <213> Sztuczna Sekwencja <220> <223> 4G7 VH CDR2 K8E <400> 113 2 <2> 114 <211> 17 <212> PRT <213> Sztuczna Sekwencja

242 <220> <223> 4G7 VH CDR2 DS <400> 114 <2> 11 <211> 17 <212> PRT <213> Sztuczna Sekwencja <220> <223> 4G7 VH CDR2 DE <400> 11 1 <2> 116 <211> 12 <212> PRT <213> Sztuczna Sekwencja <220> <223> 4G7 VH CDR3 S0T <400> 116 20 2 <2> 117 <211> 12 <212> PRT <213> Sztuczna Sekwencja <220> <223> 4G7 VH CDR3 R0dS <400> 117

243 <2> 118 <211> 12 <212> PRT <213> Sztuczna Sekwencja <220> <223> 4G7 VH CDR3 S0cT/R0dS <400> 118 1 <2> 119 <211> 16 <212> PRT <213> Sztuczna Sekwencja <220> <223> 4G7 VL CDR1 L27cQ <400> 119 20 <2> 120 <211> 16 <212> PRT <213> Sztuczna Sekwencja <220> <223> 4G7 VL CDR1 L27cQ/S27eV <400> 120 2 30 <2> 121 <211> 16 <212> PRT <213> Sztuczna Sekwencja <220> <223> 4G7 VL CDR1 S27eV <400> 121

244 <2> 122 <211> 16 <212> PRT <213> Sztuczna Sekwencja <220> <223> 4G7 VL CDR1 G29A <400> 122 1 <2> 123 <211> 16 <212> PRT <213> Sztuczna Sekwencja <220> <223> 4G7 VL CDR1 L27cQ/S27eV/G29A <400> 123 20 <2> 124 <211> 16 <212> PRT <213> Sztuczna Sekwencja <220> <223> 4G7 VL CDR1 S27eA <400> 124 2 30 <2> 12 <211> 16 <212> PRT <213> Sztuczna Sekwencja <220> <223> 4G7 VL CDR1 L27cQ/S27eA/G29A <400> 12

24 <2> 126 <211> 16 <212> PRT <213> Sztuczna Sekwencja <220> <223> 4G7 VL CDR1 G29S <400> 126 1 <2> 127 <211> 16 <212> PRT <213> Sztuczna Sekwencja <220> <223> 4G7 VL CDR1 L27cQ/S27eA/G29S <400> 127 20 <2> 128 <211> 16 <212> PRT <213> Sztuczna Sekwencja <220> <223> 4G7 VL CDR1 L27cQ/S27eA <400> 128 2 30 <2> 129 <211> 7 <212> PRT <213> Sztuczna Sekwencja <220> <223> 4G7 VL CDR2 AN <400> 129

246 <2> 130 <211> 9 <212> PRT <213> Sztuczna Sekwencja <220> <223> 4G7 VL CDR3 F96I <400> 130 1 <2> 131 <211> 9 <212> PRT <213> Sztuczna Sekwencja <220> <223> 4G7 VL CDR3 F96N <400> 131 20 <2> 132 <211> <212> PRT <213> Mus musculus <400> 132 2 <2> 133 <211> 17 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 133 30 <2> 134 <211> 12 <212> PRT

247 <213> Mus musculus <400> 134 <2> 13 <211> 16 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 13 <2> 136 <211> 7 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 136 1 20 <2> 137 <211> 9 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 137 2 <2> 138 <211> <212> PRT <213> Mus musculus <400> 138 30 <2> 139 <211> 17 <212> PRT <213> Mus musculus

248 <400> 139 <2> 140 <211> 1 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 140 <2> 141 <211> 1 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 141 1 <2> 142 <211> 7 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 142 20 2 <2> 143 <211> 9 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 143 30 <2> 144 <211> <212> PRT <213> Sztuczna Sekwencja

249 <220> <223> Linker Peptydowy <400> 144 <2> 14 <211> <212> PRT <213> Sztuczna Sekwencja <220> <223> Linker Peptydowy <400> 14 1 <2> 146 <211> 4 <212> PRT <213> Sztuczna Sekwencja <220> <223> Linker Peptydowy <400> 146 20

20 ZastrzeŜenia patentowe 1 1. Przeciwciało które wiąŝe CDR19, w którym wymienione przeciwciało zawiera łańcuch lekki zawierający SEQ ID NO: 6, oraz łańcuch cięŝki zawierający SEQ ID NO: 87. 2. Kompozycja zawierająca wiele glikozylowanych przeciwciał określonych zastrzeŝeniem 1,w której około 80-0% glikozylowanego przeciwciała w kompozycji zawiera dojrzałą węglowodanową strukturę rdzenia pozbawioną fukozy. 3. Kompozycja farmaceutyczna zawierająca przeciwciało określone zastrzeŝeniem 1 albo kompozycję określoną zastrzeŝeniem 2, oraz farmaceutycznie dopuszczalny nośnik. 4. Kwas nukleinowy kodujący sekwencję łańcucha cięŝkiego i sekwencję łańcucha lekkiego określone zastrzeŝeniem 1.. Przeciwciało według zastrz. 1 lub kompozycja według dowolnego z zastrzeŝeń 2-3 do zastosowania w leczeniu choroby wybranej z grupy składającej się z chłoniaków nieziarniczych (NHL), przewlekłej białaczki limfocytowej (CLL), ostrej białaczki limfoblastycznej/chłoniaka limfoblastycznego z komórek B (B-ALL), oraz chłoniaka z komórek płaszcza (MCL). Uprawniony: Xencor Inc. Pełnomocnik: mgr Katarzyna Rudnicka Rzecznik patentowy

21

22

23

24

2

26

27

28

29

260

261

262

263

264

26

266

267

268

269

270

271

272

273

274

27

276

277

278

279

280

281

282

283

284

28

286

287

288

289

290

291

292

293

294

29

296

297

298

299