Porównanie enzymatycznych metod redukcji z metodami redukcji klasycznej chemii organicznej Instrukcja do zajęć laboratoryjnych z przedmiotu Chemia Bioorganiczna i Bionieorganiczna Dla studentów kierunku Chemia specjalność Chemia Bioorganiczna Opracowanie: mgr inż. Roman Komor Materiały zostały wykonane w ramach realizowanego na Politechnice Śląskiej projektu nr UDA-POKL.04.01.01-00-114/09-01 pt.: Unowocześnienie i rozszerzenie oferty edukacyjnej na kierunku Chemia na Wydziale Chemicznym Politechniki Śląskiej otwarcie specjalności Chemia Bioorganiczna współfinansowanego ze środków Unii Europejskiej w ramach Europejskiego Funduszu Społecznego.
CEL ĆWICZENIA Wykonanie ćwiczenia będzie polegało na przeprowadzeniu redukcji grupy karbonylowej w 2-metyloacetylooctanie etylu, redukcji podwójnego wiązania węgiel-węgiel w α-metylo-β- (2-furylo)akroleinie oraz redukcji grupy nitrowej w 1,2-dinitrobenzenie z zastosowaniem drożdży piekarniczych oraz innych odpowiednich chemicznych metod redukcji. Po wydzieleniu i analizie otrzymanych produktów zostanie dokonane porównanie tych metod. PODSTAWY TEORETYCZNE Drożdże piekarnicze to powszechna nazwa szczepów drożdży używanych jako spulchniacze w przemyśle piekarniczym. Należą one do gatunku Saccharomyces cerevisiae, podobnie jak gatunki używane do przeprowadzania fermentacji alkoholowej w przemyśle browarniczym i gorzelnianym. Pierwsze transformacje z udziałem mikroorganizmów (w tym drożdży) były przeprowadzane już w starożytnym Egipcie przy wyrobie chleba, produktów mlecznych i alkoholu. Ich wykorzystanie w syntezie organicznej miało miejsce już ponad sto lat temu w 1874 roku Dumas zaobserwował wydzielanie się siarkowodoru po dodaniu siarki do zawiesiny drożdży w roztworze cukru. Redukcja furfuralu do alkoholu furfurylowego była pierwszą opisaną reakcją cząsteczki organicznej. Na przestrzeni kolejnych lat drożdże zyskały coraz większe znaczenie w syntezie głównie ze względu na ich powszechną dostępność, niską cenę i łatwość zastosowania. Reakcje z ich udziałem dają zwykle produkty enancjomerycznie czyste. Dużą ich zaletą jest również fakt, że do przeprowadzenia reakcji z ich użyciem nie jest wymagana znajomość mikrobiologii. Drożdży piekarniczych używa się przede wszystkim jako całych komórek. Niestety, nie do pominięcia są w takim przypadku efekty związane ze stopniem penetracji i dyfuzji substratów do wnętrza komórek oraz produktów z wnętrza komórek do otaczającego je środowiska. Również mnogość enzymów występujących w komórkach drożdży powoduje powstawanie ubocznych produktów, które jednak zwykle powstają w niewielkich ilościach jeśli zachowane są odpowiednie warunki fermentacji. Wpływ na aktywność poszczególnych enzymów, a co za tym idzie kierunek reakcji oraz jej chemo- i enancjoselektywność mają następujące czynniki: poziom ph, temperatura, skład i postać pożywki, czas reakcji, stężenie substratu, stosunek biomasa/substrat, immobilizacja enzymu (komórek), obecność inhibitorów i stymulatorów, warunki wzrostu, przygotowanie mieszaniny. Najlepszym rozwiązaniem byłoby zastosowanie oczyszczonych enzymów, jednak ze względu na niekiedy bardzo wysoką cenę ich użycie ogranicza się jedynie do zastosowań laboratoryjnych. Najczęściej napotykane problemy podczas przeprowadzania biotransformacji z udziałem drożdży zostały przedstawione na Schemacie 1. Podane rozwiązania nie ograniczają się jedynie do reakcji prowadzonych w małej skali. Są stosowane z powodzeniem w skali przemysłowej. Obecnie biotransformacje przy użyciu mikroorganizmów stosuje się (lub próbuje się zastosować) wszędzie tam, gdzie dany etap reakcji jest trudny do pokonania przy 1
zastosowaniu metod klasycznej chemii organicznej. Drożdże piekarnicze można zastosować m.in. w procesach rozdzielania racematów, selektywnego przekształcania jednej spośród wielu grup funkcyjnych cząsteczki związku chemicznego o podobnej reaktywności, wprowadzania centrum asymetrii i funkcjonalizacji łańcucha węglowego. Schemat 1 W chemii organicznej drożdże piekarnicze stosuje się najczęściej w czterech typach reakcji: 1. Tworzenia wiązania węgiel-węgiel. 2. Utleniania. 3. Hydrolizy estrów. 4. Redukcji. W tej grupie możemy wyróżnić reakcje redukcji β-ketoestrów i innych pochodnych ketokwasów, β-diketonów, α-hydroksyaldehydów i α,βhydroksyketonów do α,β-dioli, związków zawierających wiązanie C=C, aromatycznych i nienasyconych ketonów oraz związków nitrowych. 2
Reakcje redukcji z użyciem drożdży wymagają obecności węglowodanów (niekiedy dodaje się etanolu i przedmuchuje tlenem) oraz wydajnego mieszania. W takich warunkach mikroorganizmy zużywają cukier jako źródło energii potrzebne do regeneracji koenzymu. Redukcja przez reduktazy jest ściśle związana z systemami odnawiania NADPH z jego postaci utlenionej (NADP + ) (Schemat 2). W związku z tym nie jest konieczne dodawanie kofaktora do środowiska reakcji, ponieważ znajduje się on we wnętrzu komórek drożdżowych. Schemat 2 Gdy zamiast cukru użyje się alkoholu, regeneracja następuje przez utlenianie go do aldehydu i następnie kwasu. Otrzymuje się wtedy protonowaną postać koenzymu, która może być zawrócona do reakcji redukcji. Badania wykazały, że zmiana węglowodanu na alkohol etylowy nie ma znaczącego wpływu na wydajność i czystość optyczną produktów. Redukcja związków karbonylowych W klasycznej chemii organicznej, podobnie jak w chemii nieorganicznej, pojęcie redukcja oznacza proces, w którym substrat zostaje obdarzony elektronami. Reakcje redukcji ketonów do alkoholi można przeprowadzić na kilka sposobów, a najpopularniejsze odczynniki stosowane w tym procesie to: Wodorki metali. Najczęściej używanymi związkami są glinowodorek litu (LiAlH 4 ) oraz borowodorek sodu (NaBH 4 ). Reakcja z użyciem LiAlH 4 jest mało selektywna - poza grupą karbonylową redukowane są także inne grupy obecne w substracie np. NO 2, CN, COOR itd. Borowodorek sodu wykazuje większą selektywność i nie redukuje grup takich jak nitrowa czy halogenowa. Dodatkową jego zaletą jest możliwość stosowania w roztworach wodnych. Wodorki metali nie uwodorniają podwójnych ani potrójnych wiązań węgiel węgiel (za wyjątkiem wiązań C=C sprzężonych z grupą COOR). 3
Reagent NaBH 4 LiAlH 4 Preferowany rozpuszczalnik Etanol i jego wodne roztwory, roztwory NaOH, należy unikać mocnych kwasów Eter dietylowy, THF, należy unikać mocnych kwasów, fluorowców, alkoholi i amin Substrat produkt Aldehyd 1 o alkohol Keton 2 o alkohol Obojętny dla większości grup funkcyjnych Aldehyd 1 o alkohol Keton 2 o alkohol Kwas 1 o alkohol Ester alkohol Epoksyd -> alkohol Przerób mieszaniny reakcyjnej Łatwa neutralizacja Łatwa ekstrakcja produktu Ostrożnie dodawać wodę Należy usunąć sole glinu Wodór gazowy i katalizator metaliczny (platyna, ruten, pallad, nikiel itp.). To rozwiązanie obciążone jest najmniejszą selektywnością w tych warunkach zredukowane zostają także wiązania wielokrotne. Etanolan sodu w alkoholu etylowym. Stosowana zanim odkryto LiAlH 4, częściej używana do redukcji estrów niż ketonów. Diborowodór (B 2 H 6 ). Sam odczynnik jest bardzo reaktywny. Najczęściej syntezuje się go bezpośrednio przed dodaniem do środowiska reakcji. Redukuje również wiązania wielokrotne obecne w cząsteczce Opisane układy przez lata zyskały wiele modyfikacji. Ich najczęstszym celem było uzyskanie chemoselektywności reakcji. Uzyskuje się ją dzięki stosowaniu różnych warunków: kombinacji metal - jon wodorkowy, różnym katalizatorom i rozpuszczalnikom. Jednakże stosowane wodorki metali, jak i katalizatory metaliczne są drogim i nierzadko niewygodnym w pracy surowcem. Także praca z wodorem niesie za sobą niebezpieczeństwo wybuchu. Redukcja wiązania podwójnego węgiel-węgiel Redukcję wiązania podwójnego węgiel-węgiel najczęściej i najłatwiej przeprowadza się używając do tego celu gazowego wodoru i katalizatora heterogenicznego (Rh/C, Pd/C, nikiel Raney a) lub tlenków metali (PtO 2 ) w kombinacji z różnymi rozpuszczalnikami (acetonitryl,woda, THF, metanol, octan etylu). Niestety, nie można ich stosować jeśli w cząsteczce obecne są grupy zabezpieczające (benzylowa, benzoilowa, alliloksykarbonylowa). Redukują one także grupę nitrową, ketony benzylowe i arylowe pochodne fluorowców. Redukcja grupy nitrowej W reakcjach redukcji grupy nitrowej najczęściej stosowane są: Katalizator metaliczny (Zn, Sn, Fe i inne) w obecności kwasu. Siarczki (NaHS, (NH 4 ) 2 S). Hydrazyna w obecności katalizatora. Glinowodorek litu LiAlH 4. Powstają zanieczyszczenia w postaci oksymów i hydroksyloamin. 4
W reakcjach redukcji grupy nitrowej w związkach aromatycznych oprócz wyżej wymienionych reagentów stosuje się również: Siarczek sodu Na 2 S. Selektywnie redukuje grupy nitrowe przy pierścieniu aromatycznym nie redukując przy tym grup nitrowych przyłączonych do łańcucha węglowego związku. Nikiel elektrochemiczny. Elektrochemicznie generowany nikiel selektywnie redukuje aromatyczne grupy nitrowe, nie redukując obecnych w związku ugrupowań alkenylowych, alkinylowych, cyjanowych, formylowych, halogenowych i benzoksylowych. Związki samaru. Selektywne w stosunku do grup nitrowych. Ditionian sodu Na 2 S 2 O 4. Chlorek tytanu TiCl 3 5
PRZEBIEG ĆWICZENIA Redukcja grupy karbonylowej Część A: Redukcja 2-metyloacetylooctanu etylu przy użyciu drożdży piekarniczych Ta część ćwiczenia obejmuje reakcję redukcji 2-metyloacetylooctanu etylu przy użyciu drożdży piekarniczych prowadzącą do mieszaniny (2R,3S) i (2S,3S)-3-hydroksy-2- metylomaślanu etylu w stosunku izomerów 3:1 (Schemat 3). Odczynniki: 2-metyloacetylooctan etylu (0,50 g; 3,85 mmol) drożdże piekarnicze Saccharomyces cerevisiae (30 g * ) sacharoza (7,5 g) woda destylowana (100 cm 3 ) Celite etanol (1 cm 3 ) octan etylu 2 M wodny roztwór wodorotlenku sodu chlorek sodu bezwodny siarczan(vi) magnezu eter naftowy eter dietylowy * Jeżeli używane są drożdże z pożywką należy doliczyć 50% masy Schemat 3 Szkło i inne materiały oraz potrzebny sprzęt laboratoryjny: łaźnia wodna cieplarka wyparka rotacyjna kolba stożkowa 500 cm 3 zlewka 25 cm 3 kolba okrągłodenna 250 cm 3 lejek Büchnera kolba ssawkowa 250 cm 3 cylinder 100 cm 3 rozdzielacz 500 cm 3 lejek pipeta płytki TLC komora chromatograficzna łyżka bagietka bibuła filtracyjna wata papierek uniwersalny Wykonanie ćwiczenia: 1. Drożdże, sacharozę oraz wodę umieszcza się w kolbie stożkowej (500 ml) i zatyka wylot kolby watą, a następnie umieszcza w łaźni wodnej (30 C) na około 20 minut w celu zapoczątkowania fermentacji. Co jakiś czas energicznie miesza się zawartość kolby. 6
2. 2-Metyloacetylooctan etylu rozpuszcza się w 1 cm 3 etanolu i dodaje jednorazowo do kolby z fermentującymi drożdżami. Mieszaninę reakcyjną pozostawia się w cieplarce na 48h w temperaturze 30 C. 3. Zakładając odpowiedni stopień przereagowania, reakcję przerywa się doprowadzając mieszaninę do temperatury pokojowej. Następnie dodaje się 2 łyżki celitu i dokładnie miesza. Tak przygotowaną mieszaninę pozostawia się na ok. 30 minut od czasu do czasu mieszając. 4. Zawiesinę drożdży odsącza się na lejku Büchnera przez 3 mm złoże celitu. Operację powtarza się, jeśli w przesączu stwierdzi się obecność drożdży. Przesącz zobojętnia się przy użyciu 2 M wodnego roztworu NaOH. Tak powstały żółty filtrat poddaje się ekstrakcji octanem etylu (4x60 ml). W przypadku trudności z rozdzielaniem warstw, mieszaninę wysala się lub/oraz odwirowuje w wirówce laboratoryjnej. 5. Zlane ekstrakty organiczne suszy się nad bezwodnym siarczanem(vi) magnezu, który odsącza się na lejku z sączkiem karbowanym, a przesącz odparowuje w wytarowanej kolbie okrągłodennej na wyparce rotacyjnej do uzyskania żółtej pozostałości. 6. Przebieg reakcji sprawdza się metodą TLC. W tym celu pobiera się próbkę mieszaniny reakcyjnej i rozcieńcza ją w octanie etylu (ok. 25 mg/ml). Jako układ rozwijający stosuje się mieszaninę eter naftowy - eter dietylowy 3:1 (v/v). Jako wzorzec stosuje się roztwór substratu. Płytki obserwuje się pod lampą UV. 7. Surowy produkt można oczyścić metodą chromatografii kolumnowej. Jako wypełnienie kolumny stosuje się żel krzemionkowy, a jako eluent układ eter naftowy - eter dietylowy 3:1 (v/v). Część B: Redukcja 2-metyloacetyooctanu etylu przy użyciu borowodorku sodu w metanolu Ta część ćwiczenia obejmuje redukcję 2-metyloacetylooctanu etylu przy użyciu borowodorku sodu w metanolu prowadzącą do mieszaniny 2-metylobutano-1,3-diolu oraz 3- hydroksy-2-metylomaślanu etylu (Schemat 4). Odczynniki: 2-metyloacetylooctan etylu (0,50 g; 3,85 mmol) metanol (20 cm 3 ) borowodorek sodu (0,43 g; 11,5 mmol) 5 M wodny roztwór kwasu solnego żel krzemionkowy metanol chloroform solanka Schemat 4 Szkło i inne materiały oraz potrzebny sprzęt laboratoryjny: mieszadło magnetyczne wyparka rotacyjna kolba okrągłodenna 50 cm 3 cylinder 50 cm 3 rozdzielacz pipeta płytki TLC komora chromatograficzna łyżka papierek uniwersalny 7
Wykonanie ćwiczenia: 1. W kolbie okrągłodennej umieszcza się metanol oraz 2-metyloacetylooctan etylu i miesza na mieszadle magnetycznym. Do kolby dodaje się borowodorku sodu w trzech równych porcjach co 1 minutę. 2. Po 5, 10, 20 i 30 minutach reakcji pobiera się próbkę mieszaniny reakcyjnej, rozcieńcza w niewielkiej ilości octanu etylu i nakłada na płytkę TLC wraz z wzorcem substratu. Jako układ rozwijający stosuje się mieszaninę eter naftowy - eter dietylowy 3:1 (v/v). 3. Po stwierdzeniu całkowitego przereagowania substratu, mieszaninę doprowadza się do ph 6 przy użyciu 5 M kwasu solnego. 4. Rozpuszczalnik odparowuje się na wyparce rotacyjnej do uzyskania jasnobrązowej pozostałości, którą rozpuszcza się w niewielkiej ilości metanolu i przepuszcza przez 3 cm warstwę żelu krzemionkowego. Produkt wymywa się układem metanol - chloroform 1:4 (v/v). 5. Surowy produkt można oczyścić metodą chromatografii kolumnowej. Jako wypełnienie kolumny stosuje się żel krzemionkowy, a jako eluent układ heksan -octan etylu. Redukcja podwójnego wiązania węgiel-węgiel Część A: Redukcja α-metylo-β-(2-furylo)akroleiny przy użyciu drożdży piekarniczych Ta część ćwiczenia obejmuje reakcję redukcji α-metylo-β-(2-furylo)akroleiny przy użyciu drożdży piekarniczych prowadzącą do nasyconego alkoholu (Schemat 5). Schemat 5 Mechanizm tej reakcji jest trójetapowy: redukcja utlenianie redukcja. Wyjściowy aldehyd pozostaje w równowadze z pochodną alkoholu allilowego, przy czym równowaga jest przesunięta w stronę alkoholu. Jednakże już małe (równowagowe) ilości α-metylo-β-(2- furylo)akroleiny ulegają powolnej trans-addycji wodoru w poprzek wiązania podwójnego, do nasyconego aldehydu. Nasycony aldehyd jest wówczas szybko redukowany do nasyconego alkoholu. 8
Odczynniki: α-metylo-β-(2-furylo)akroleina (0,45 g; 3,30 mmol) drożdże piekarnicze Saccharomyces cerevisiae (12 g * ) glukoza (4 g) woda destylowana (80 cm 3 ) Celite etanol (2 cm 3 ) octan etylu nasycony roztwór węglanu sodu chlorek sodu bezwodny siarczan(vi) magnezu 2 M wodny roztwór kwasu solnego chlorek metylenu * Jeżeli używane są drożdże z pożywką należy doliczyć 50% masy Szkło i inne materiały oraz potrzebny sprzęt laboratoryjny: łaźnia wodna cieplarka wyparka rotacyjna kolba stożkowa 500 cm 3 zlewka 25 cm 3 kolba okrągłodenna 250 cm 3 lejek Büchnera kolba ssawkowa 250 cm 3 cylinder 100 cm 3 rozdzielacz 500 cm 3 lejek pipeta płytki TLC komora chromatograficzna łyżka bagietka bibuła filtracyjna wata papierek uniwersalny Wykonanie ćwiczenia: 1. Drożdże, glukozę oraz wodę umieszcza się w kolbie stożkowej (500 ml) i zatyka wylot kolby watą, a następnie umieszcza w łaźni wodnej (30 C) na około 45 minut w celu zapoczątkowania fermentacji. Co jakiś czas energicznie miesza się zawartość kolby. 2. ph fermentującej mieszaniny podnosi się następnie do wartości ok. 5,5 przez dodanie nasyconego roztworu węglanu sodu. 3. α-metylo-β-(2-furylo)akroleinę rozpuszcza się w 2 cm 3 etanolu i dodaje jednorazowo do kolby z fermentującymi drożdżami delikatnie mieszając zawartość kolby. Mieszaninę reakcyjną pozostawia się w cieplarce na 48h w temperaturze 30 C. Co 12 15 godzin sprawdza się ph mieszaniny i utrzymuje je na poziomie ok. 5 przez dodatek 5 M roztworu kwasu solnego. 4. Zakładając odpowiedni stopień przereagowania, reakcję przerywa się doprowadzając mieszaninę do temperatury pokojowej. Następnie dodaje się 2 łyżki celitu i dokładnie miesza. Tak przygotowaną mieszaninę pozostawia się na ok. 30 minut od czasu do czasu mieszając. 5. Zawiesinę drożdży odsącza się na lejku Büchnera przez 3 mm złoże celitu. Operację powtarza się, jeśli w przesączu stwierdzi się obecność drożdży. Klarowny, jasnobrązowy filtrat poddaje się ekstrakcji octanem etylu (4x60 ml). W przypadku trudności z rozdzielaniem warstw, mieszaninę wysala się lub/oraz odwirowuje w wirówce laboratoryjnej. 6. Zlane ekstrakty organiczne suszy się nad bezwodnym siarczanem magnezu, który odsącza się na lejku z sączkiem karbowanym, a przesącz odparowuje w wytarowanej kolbie okrągłodennej na wyparce rotacyjnej do uzyskania żółtej, oleistej pozostałości. 9
7. Przebieg reakcji sprawdza się metodą TLC. W tym celu pobiera się próbkę mieszaniny reakcyjnej i rozcieńcza ją w octanie etylu (ok. 25 mg/ml). Jako układ rozwijający stosuje się chlorek metylenu. Jako wzorzec stosuje się roztwór substratu. Płytki obserwuje się pod lampą UV. Ponieważ aldehyd szybko przechodzi w nienasycony alkohol, na płytce przy Rf=0,38 mogą być widoczne 2 plamy w kształcie ósemki (nasycony i nienasycony alkohol). Świadczy to o niecałkowitym przereagowaniu substratu. Jeżeli obecna jest tylko 1 plamka przy Rf=0.34 pochodząca od produktu, można uznać całkowite przereagowanie substratu. 8. Surowy produkt można oczyścić metodą chromatografii kolumnowej. Jako wypełnienie kolumny stosuje się żel krzemionkowy, a jako eluent układ eter naftowy - eter dietylowy 3:1 (v/v). Część B: Redukcja α-metylo-β-(2-furylo)akroleiny przy użyciu katalizatora metalicznego Ta część ćwiczenia obejmuje redukcję α-metylo-β-(2-furylo)akroleiny przy użyciu katalizatora platynowego na węglu aktywnym (Schemat 6). Odczynniki: α-metylo-β-(2-furylo)akroleina (0,90 g; 6,60 mmol) metanol (5 cm 3 ) katalizator platynowy na węglu aktywnym wodór gazowy bezwodny siarczan(vi) magnezu Schemat 6 Szkło i inne materiały oraz potrzebny sprzęt laboratoryjny: mieszadło magnetyczne wyparka rotacyjna kolba okrągłodenna 25 cm 3 cylinder 25 cm 3 rozdzielacz 50 cm 3 kolba stożkowa 100 cm 3 balon z wężem gumowym i zaworem korek gumowy igła lejek pipeta płytki TLC komora chromatograficzna łyżka bagietka bibuła filtracyjna Wykonanie ćwiczenia: 1. W kolbie okrągłodennej umieszcza się metanol oraz 2 α-metylo-β-(2-furylo)akroleinę i miesza na mieszadle magnetycznym. Do kolby dodaje się niewielką ilość katalizatora platynowego i zaopatruje kolbę w gumowy korek z igłą. 10
2. Kolbę zaopatruje się następnie w balon z wężem gumowym i zaworem wypełniony wodorem. Przepływ wodoru powinien powodować pojawianie się niewielkiej ilości pęcherzyków na powierzchni roztworu. 3. Po 1, 2 i 3 godzinach reakcji pobiera się próbkę mieszaniny reakcyjnej, rozcieńcza w niewielkiej ilości octanu etylu i nakłada na płytkę TLC wraz z wzorcem substratu. Jako układ rozwijający stosuje się chlorek metylenu. 4. Po stwierdzeniu całkowitego przereagowania substratu katalizator odsącza się, a przesącz zatęża na wyparce rotacyjnej. Pozostałość rozpuszcza się w niewielkiej ilości eteru dietylowego i oczyszcza się metodą chromatografii kolumnowej. Jako wypełnienie kolumny stosuje się żel krzemionkowy, a jako eluent eter dietylowy. Redukcja grupy nitrowej Część A: Redukcja 1,2-dinitrobenzenu przy użyciu drożdży piekarniczych Ta część ćwiczenia obejmuje redukcję grupy nitrowej 1,2-dinitrobenzenu przy użyciu drożdży piekarniczych prowadzącą do 2-nitroaniliny (Schemat 7). Schemat 7 Badania wykazały, że przebieg redukcji monopodstawionych nitrobenzenów silnie zależy od charakteru podstawnika. Jeśli związek zawiera grupę elektronodonorową (np.: NH 2, OH, SH, OCH 3, CH 3, Br) to wydajność reakcji redukcji jest niska lub reakcja nie zachodzi wogóle. Jeżeli podstawnik ma charakter elektronoakceptorowy (np.: NO 2, CN, CF 3, COOEt) redukcja nitrobenzenów zachodzi łatwo z dobrymi wydajnościami. Przykładem tego jest katalizowana drożdżami redukcja 1,2-dinitrobenzenu, w rezultacie której powstaje 2- nitoranilina z wysoką wydajnością, porównywalną z otrzymywanymi w redukcji metodami chemicznymi Odczynniki: 1,2-dinitrobenzen (0,25 g; 1,49 mmol) drożdże piekarnicze Saccharomyces cerevisiae (25 g * ) sacharoza (7,5 g) woda destylowana (100 cm 3 ) Celite etanol (2,5-3 cm 3 ) octan etylu 2 M wodny roztwór wodorotlenku sodu chlorek sodu bezwodny siarczan(vi) magnezu Szkło i inne materiały oraz potrzebny sprzęt laboratoryjny: łaźnia wodna cieplarka wyparka rotacyjna kolba stożkowa 500 cm 3 zlewka 25 cm 3 kolba okrągłodenna 250 cm 3 lejek Büchnera kolba ssawkowa 250 cm 3 cylinder 100 cm 3 rozdzielacz 500 cm 3 11
eter naftowy * Jeżeli używane są drożdże z pożywką należy doliczyć 50% masy lejek pipeta probówka płytki TLC komora chromatograficzna łyżka bagietka bibuła filtracyjna wata papierek uniwersalny Wykonanie ćwiczenia: 1. Drożdże, sacharozę i wodę umieszcza się w kolbie stożkowej (500ml) i zatyka wylot kolby watą, a następnie umieszcza w łaźni wodnej (30 C) na około 1 godzinę w celu zapoczątkowania fermentacji. Co jakiś czas energicznie miesza się zawartość kolby. 2. 1,2-Dinitrobenzen rozpuszcza się w jak najmniejszej objętości etanolu (ok. 2,5 3 cm 3 ) i dodaje jednorazowo do kolby z fermentującymi drożdżami. Mieszaninę reakcyjną pozostawia się w cieplarce na 24h w temperaturze 30 C. 3. Zakładając odpowiedni stopień przereagowania, reakcję przerywa się doprowadzając mieszaninę do temperatury pokojowej. Następnie dodaje się 2 łyżki celitu i dokładnie miesza. Tak przygotowaną mieszaninę pozostawia się na ok. 30 minut od czasu do czasu mieszając. 4. Zawiesinę drożdży odsącza się na lejku Büchnera przez 3 mm złoże celitu. Operację powtarza się, jeśli w przesączu stwierdzi się obecność drożdży. Przesącz zobojętnia się przy użyciu 2 M wodnego roztworu NaOH. Tak powstały żółty filtrat poddaje się ekstrakcji octanem etylu (4x60 ml). W przypadku trudności z rozdzielaniem warstw, mieszaninę wysala się lub/oraz odwirowuje w wirówce laboratoryjnej. 5. Zlane ekstrakty organiczne suszy się nad bezwodnym siarczanem(vi) magnezu, który odsącza się na lejku z sączkiem karbowanym, a przesącz odparowuje w wytarowanej kolbie okrągłodennej na wyparce rotacyjnej do uzyskania bladożółtej pozostałości. 6. Przebieg reakcji sprawdza się metodą TLC. W tym celu pobiera się próbkę mieszaniny reakcyjnej i rozcieńcza ją w octanie etylu (ok. 25 mg/ml). Jako układ rozwijający stosuje się mieszaninę eter naftowy octan etylu 1:1 (v/v). Jako wzorzec stosuje się roztwór substratu (R f 1,2-dinitrobenzenu wynosi 0,4, a R f 2-nitroaniliny 0,55). Płytki obserwuje się pod lampą UV. 7. Surowy produkt można oczyścić metodą chromatografii kolumnowej. Jako wypełnienie kolumny stosuje się żel krzemionkowy, a jako eluent układ eter naftowy octan etylu 10:1 4:1 (v/v). 12
Część B: Redukcja 1,2-dinitrobenzenu przy użyciu chlorku amonu i glinu Ta część ćwiczenia obejmuje redukcję grupy nitrowej 1,2-dinitrobenzenu przy użyciu chlorku amonu w obecności glinu prowadzącą do mieszaniny 2-nitroaniliny i 1,2- diaminobenzenu (Schemat 8). Schemat 8 Odczynniki: 1,2-dinitrobenzen (0,25 g; 1,49 mmol) chlorek amonu (0,40 g; 7,5 mmol) glin (0,25 g) metanol (30 cm 3 ) eter dietylowy woda destylowana aceton heksan bezwodny siarczan(vi) magnezu * Jeżeli używane są drożdże z pożywką należy doliczyć 50% masy Szkło i inne materiały oraz potrzebny sprzęt laboratoryjny: mieszadło magnetyczne łaźnia ultradźwiękowa kolba okrągłodenna 100 cm 3 lejek cylinder 50 cm 3 rozdzielacz 250 cm 3 pipeta probówka płytki TLC komora chromatograficzna łyżka bagietka bibuła filtracyjna wata papierek uniwersalny Wykonanie ćwiczenia: 1. W kolbie okrągłodennej umieszcza się metanol oraz 1,2-dinitrobenzen i miesza na mieszadle magnetycznym. Do kolby dodaje się chlorku amonu oraz drobno pociętej folii aluminiowej. Następnie kolbę umieszcza w łaźni ultradźwiękowej w temperaturze pokojowej. 2. Po 15, 30 i 60 minutach reakcji pobiera się próbkę mieszaniny reakcyjnej, rozcieńcza w niewielkiej ilości octanu etylu i nakłada na płytkę TLC wraz z wzorcem substratu. Jako układ rozwijający stosuje się mieszaninę aceton heksan 1:20 (v/v). 3. Po stwierdzeniu całkowitego przereagowania substratu, mieszaninę sączy się na sączku karbowanym wprost do kolby okrągłodennej. 4. Rozpuszczalnik odparowuje się na wyparce rotacyjnej do uzyskania jasnobrązowej pozostałości, którą rozpuszcza się w eterze dietylowym i przemywa wodą destylowaną. 13
5. Zlane ekstrakty organiczne suszy się nad bezwodnym siarczanem(vi) magnezu, który odsącza się na lejku z sączkiem karbowanym, a przesącz odparowuje w wytarowanej kolbie okrągłodennej na wyparce rotacyjnej do uzyskania żółtej pozostałości. 6. Surowy produkt można oczyścić metodą chromatografii kolumnowej. Jako wypełnienie kolumny stosuje się żel krzemionkowy, a jako eluent układ heksan - aceton. PRZYGOTOWANIE DO ZAJĘĆ Przed przystąpieniem do ćwiczenia student powinien zapoznać się z niniejszą instrukcją oraz sposobem wykonania ćwiczenia. Powinien również zapoznać się z podstawami teoretycznymi technik laboratoryjnych wykorzystywanych ćwiczeniu oraz z zagrożeniami mogącymi wystąpić podczas ich wykonywania. Student powinien zaznajomić się również następującymi zagadnieniami i pojęciami: współczynnik retencji Rf, stereoselektywność, stereospecyficzność, regioselektywność, regiospecyficzność, nadmiar enancjomeryczny (wraz ze sposobem jego obliczania), enancjomer, diastereoizomer, katalizator, enzym, koenzym, kataliza enzymatyczna, utlenienie, redukcja, wady i zalety katalizy enzymatycznej. Ponadto powinien znać i przestrzegać ogólne zasady BHP. Powinien znać i wiedzieć jak zapobiegać zagrożeniom wynikającym z pracy z odczynnikami chemicznymi oraz aparaturą wykorzystywaną w ćwiczeniu. OPRACOWANIE WYNIKÓW Po zakończeniu ćwiczenia każda grupa laboratoryjna sporządza sprawozdanie, które oddaje prowadzącemu do dwóch tygodni od daty zajęć. W sprawozdaniu powinny znaleźć się: opis wykonywanych czynności, obliczenia (ilości, masy, objętości odczynników, wydajności otrzymanych produktów), obserwacje, wnioski. Warunkiem zaliczenia ćwiczenia jest obecność na zajęciach, zaliczenie kartkówki (tzw. wejściówki), czynny udział w ćwiczeniu (aktywność będzie oceniana przez prowadzącego) oraz poprawne sporządzenie sprawozdania i oddanie go w terminie. 14
LITERATURA R. Csuk; Chem. Rev., 91 (1991) 49-97 S. Servi; Synthesis, (1990) 1-25 S. D. Burke, R. L. Danheiser Handbook of Reagents for Organic Synthesis, Oxidizing and Reducing Agents, John Wiley and Sons Ltd., (1999) C. Smit, M. W. Fraaije, A. J. Minnaard; J. Org. Chem., 73 (2008) 9482 9485 C. F. Lane; Chemical Reviews, 76 (1976) 6 R. Bruckner, M. Harmata; Organic Mechanisms Reactions, Stereochemistry and Synthesis, Springer-Verlag Berlin Heidelberg, (2010) C. Fuganti; Pure & Appl. Chern., 62 7 (1990) 1449-1452 S. M. Roberts, G. Poignant; Catalysts for Fine Chemical Synthesis: Hydrolysis, Oxidation and Reduction. Volume 1, John Wiley & Sons, Ltd, (2002) M. C. Flickinger, S. W. Drew; Encyclopedia of Bioprocess Technology: Fermentation, Biocatalysis, and Bioseparation, John Wiley & Sons, Inc., (1999) N. Ono; The Nitro Group in Organic Synthesis, John Wiley-VCH, (2001) G. Fràter, U. Müller, W. Günter, S.M. Roberts; Preparative Biotransformations. Whole Cells and Isolated enzymes in Organic Synthesis, Wiley, London, (1992) J. Kim et al.; Tetrahedron, 66 (2010) 3995-4001 C. Ravia; Tetrahedron: Asymmetry, 20 (2009) 1393 1397 G. D. Gamalevich, A. V. Ignatenko, E. P. Serebryakov, N. E. Voishvillo; Russian Chemical Bulletin, 44 4 (1995) 743 D. Nagaraja, M. A. Pasha; Tetrahedron letters, 40 (1999) 7855-7856 15