UNIWERSYTET GDAŃSKI WYDZIAŁ CHEMII Pracownia studencka Zakładu Analizy Środowiska Instrukcja do ćwiczeń laboratoryjnych Ćwiczenie nr 1 i 5 Wpływ nawozów mineralnych na zawartość chlorofilu i przyrost biomasy liści wybranego gatunku rośliny dwuliściennej CHEMIA NAWOZÓW Gdańsk, 2013 1
1. CZĘŚĆ TEORETYCZNA Nawozami mineralnymi nazywa się związki chemiczne, stosowane do nawożenia roślin i gleb. Mogą to być związki syntetyczne wyprodukowane przez przemysł nawozowy, odpady przemysłowe lub uszlachetnione kopaliny. Rośliny do normalnego wzrostu i rozwoju potrzebują 6 składników pokarmowych w większych ilościach (azot, fosfor, potas, wapń, magnez i siarka), zwanych dalej makroskładnikami, i około 30 składników pokarmowych w znacznie mniejszych ilościach, zwanych dalej mikroskładnikami. Nawozy mineralne pod względem składu chemicznego możemy podzielić na: nawozy jednoskładnikowe zawierające tylko jeden z trzech podstawowych składników pokarmowych (N, P, K), nawozy wieloskładnikowe zawierające 2 lub 3 podstawowe składniki pokarmowe (N, P, K). Zarówno nawozy jednoskładnikowe jak i wieloskładnikowe w swym składzie dodatkowo mogą zawierać mikroskładniki. W Tabeli 1 przedstawiono pozytywne oraz negatywne skutki oddziaływania nawozów na środowisko i człowieka. Tabela 1 Pozytywne oraz negatywne skutki oddziaływania nawozów na środowisko i człowieka. POZYTYWNE* - utrzymanie lub zwiększenie ilości mikroi makroskładników potrzebnych roślinom - wydanie optymalnego pod względem wysokości i jakości plonu - poprawa właściwości fizykochemicznych gleb * nawozy mineralne stosowane w optymalnych ilościach SKUTKI STOSOWANIA NAWOZÓW 2 NEGATYWNE - przeżyźnienie gleb - eutrofizacja wód - niebezpieczeństwo oparzeń i alergii w wyniku bezpośredniego kontaktu ze skórą w czasie transportu, magazynowania, wysiewu lub czyszczenia siewników - naruszenie równowagi jonowej wzmagające ubytek składników - nadmierne nawożenie powoduje pogorszenie jakości plonu Przykładowe skutki stosowania nawozów dają ogólny obraz wpływu stosowania substancji należących do tej grupy. Niewątpliwie gleby zbyt ubogie w miko- i/lub makroskładniki wymagają stosowania nawozów. Należy jednak pamiętać o racjonalnym nawożeniu, które uwzględnia ilości stosowanych nawozów i odstępy czasowe. Zachowanie zasad skutkuje poprawą fizykochemicznych właściwości gleb oraz oczekiwanymi zbiorami. Chęć zyskania większych plonów i zużywanie zbyt dużych ilości nawozów prowadzi do przeżyźnienia gleb, czego następstwem jest wymywanie do wód powierzchniowych pierwiastków biogennych. Negatywnym skutkiem środowiskowym jest ostatecznie wzmożenie naturalnego procesu jakim jest eutrofizacja. Oprócz tego nadmierne nawożenie prowadzi do ubytku
biomasy, w wyniku zatrzymania procesów życiowych roślin, czego skutkiem są mniejsze zbiory i straty materialne. Chlorofile występujące w chloroplastach roślin pełniąc role syntezatorów wytwarzających materię organiczną na drodze fotosyntezy. Chlorofil jest zielonym barwnikiem występującym u organizmów zdolnych do przeprowadzenia procesu fotosyntezy. W środowisku roślin najbardziej rozpowszechniony chlorofil a i b. Pierwszy z nich jest głównym fotoreceptorem w chloroplastach u większości roślin zielonych. Jest to związek pochodny tetrapirolu; cztery atomy azotu w pierścieniach pirolowych są związane wiązaniami koordynacyjnymi z atomem magnezu. Chlorofil jest więc magnezoporfiryną. Inną charakterystyczną cechą chlorofilu jest obecność fitolu, silnie hydrofobowego 20-węglowego alkoholu, przyłączonego wiązaniem estrowym do łańcucha alifatycznego jednego z pierścieni pirolowych. Chlorofil b różni się od chlorofilu a tym, że zawiera grupę formylową zamiast metylowej w jednym z pierścieni pirolowych. Struktury chemiczne opisywanych związków przedstawiono na Rysunku 1. Rysunek 1 Struktura chemiczna chlorofilu a oraz chlorofilu b. Chlorofile są bardzo efektywnymi fotoreceptorami, ponieważ mają wiązania podwójne w układzie sprzężonym. Tego typu związki, zwane polienami, mają silne pasma absorpcji w zakresie światła widzialnego, które stanowi główną część promieniowania dochodzącego do powierzchni Ziemi. Molarne współczynniki absorpcji chlorofilu a i chlorofilu b są większe od 10 5 cm -1 M -1, co oznacza, że należą do najwyższych, jakie wyliczono dla związków organicznych. Widma absorpcyjne chlorofilu a i b są różne. Promieniowanie słabo absorbowane przez chlorofil a przy długości fali 460 nm, jest silnie pochłaniane przez chlorofil b (Rysunek 2). 3
Rysunek 2 Widmo absorpcyjne chlorofilu a i b. Dwa rodzaje chlorofilu uzupełniają się wzajemnie w pochłanianiu promieniowania słonecznego. Promieniowanie w zakresie 500-600 nm jest słabiej absorbowane przez te chlorofile, ale nie powoduje to zmniejszenia fotosyntezy u większości roślin zielonych. Metody suszenia termicznego polegają na usunięciu wody z próbki za pomocą suszenia w pokojowej lub podwyższonej temperaturze oraz pod normalnym lub zmniejszonym ciśnienieniem; przy czym parametry te (temperatura i ciśnienie) dobiera się stosownie do właściwości badanego produktu. Ponadto suszenie można prowadzić do uzyskania stałej masy lub w ciągu umownego czasu. 2. WYKONANIE ĆWICZENIA UWAGA! Ćwiczenie jest wykonywane na dwóch zajęciach, z trzytygodniową przerwą!!! 1. Przygotowanie roślin do analizy (pierwsze zajęcia) I) Cztery jednakowe, wytarowane doniczki (na jedną podgrupę) należy napełnić tą samą ilością (± 5 g) przygotowanej gleby tak, by jej lekko ubita warstwa znajdowała się około 1 cm poniżej krawędzi doniczki. Dane zapisać w Tabeli 2. Tabela 2 Masa gleby przygotowanej do eksperymentu. Masa mokrej gleby Donica I Donica II Donica III Donica IV [g] Masa suchej gleby [g] 4
II) W celu wyznaczenia suchej masy gleby odważyć około 50 g gleby na folii aluminiowej i umieścić na 1 godzinę w suszarce w temperaturze 90 C. Po ostygnięciu ponownie zważyć glebę w celu ustalenia zawartości wody. Dane zapisać w Tabeli 3. Tabela 3 Pomiary suchej masy gleby. Masa mokrej gleby Masa suchej gleby [g] Zawartość wody [%] III) Znając zawartość wody w stosowanej glebie, obliczyć suchą masę gleby w każdej doniczce. Dane zapisać w Tabeli 2. IV) W każdej doniczce umieścić jednakową ilość nasion wskazanych przez prowadzącego; nasiona powinny zostać umieszczone około 1 cm pod powierzchnią gleby, a powierzchnia lekko ubita palcami. V) Bezpośrednio po przygotowaniu przystąpić do sporządzenia po 500 mililitrów roztworów nawozów, odpowiednio: PODGRUPA I Tabela 4 Roztwory nawozu mineralnego: Polifoska 8. Rodzaj nawozu POLIFOSKA 8 Rodzaj próbki Masa nawozu [g] Objętość wody wodociągowej [ml] kontrolna 0 500 zalecana ilość 4,8 500 25 % zalecanej ilości 1,2 500 250 % zalecanej ilości 12 500 PODGRUPA II Tabela 5 Roztwory nawozu mineralnego: Siarczan potasu. Rodzaj nawozu SIARCZAN POTASU Rodzaj próbki Masa nawozu [g] Objętość wody wodociągowej [ml] kontrolna 0 500 zalecana ilość 3,2 500 25 % zalecanej ilości 0,8 500 250 % zalecanej ilości 8,0 500 5
PODGRUPA III Tabela 6 Roztwory nawozu mineralnego: Saletra z magnezem. Rodzaj nawozu SALETRA Z MAGNEZEM Rodzaj próbki Masa nawozu [g] Objętość wody wodociągowej [ml] kontrolna 0 500 zalecana ilość 3,2 500 25 % zalecanej ilości 0,8 500 250 % zalecanej ilości 8,0 500 VI) Roztworami delikatnie i w miarę równomiernie podlać przygotowaną wcześniej glebę z wysianymi nasionami; w każdej doniczce roztworem z różną ilością danego nawozu, zgodnie z Tabelą 7. Tabela 7 Donice z nasionami oraz ich przeznaczenie. Donica DONICA I DONICA II DONICA III DONICA IV Rodzaj próbki Próbka kontrolna Próbka z zalecaną ilością nawozu Próbka z 25% ilości zalecanej nawozu Próbka z 250% ilości zalecanej nawozu 2. Podział materiału roślinnego do badań (drugie zajęcia) Do każdej donicy zastosować analogiczny schemat postępowania przedstawiony na Rysunku 3. Wielkości przygotowywanych części materiału roślinnego wskaże prowadzący. Rysunek 3 Schemat podziału materiału roślinnego do badań z jednej donicy. 6
3. Pomiary suchej masy roślin (drugie zajęcia) Pomiary suchej masy roślin Część 1 odciętych liści sałaty z poszczególnych donic zważyć oraz umieścić w suszarce na dwie godziny. Po wyjęciu materiału ponownie zważyć. Wyniki zapisać w Tabeli 8. Tabela 8 Pomiar suchej masy roślin. Masa świeżych liści sałaty [g] Sucha masa [g] Zawartość wody [%] DONICA I DONICA II DONICA III DONICA IV 4. Ekstrakcja chlorofilu i oznaczenia zawartości chlorofilu spektrofotometrycznie (drugie zajęcia) Część 2 odciętych liści sałaty z poszczególnych donic zważyć. Wszystkie wyniki zamieścić w Tabeli 9. Schemat postępowania przedstawiono na Rysunku 4. Czynności wykonać analogicznie dla 4 próbek (1 próbka odpowiada 1 donicy). Rysunek 4 Schemat postępowania oznaczania chlorofilu spektrofotometrycznie. 7
Obliczenia wykonać według poniższych wzorów: 12,7 A663 2, 7 A m C a 645 22,9 A645 4, 7 A m 663 C b gdzie: m - masa próbki A 663 - absorbancja przy λ = 663 nm A 645 - absorbancja przy λ = 645 nm Tabela 9 Oznaczanie chlorofilu spektrofotemetrycznie. Masa świeżych liści Absorbancja sałaty [g] λ = 663 nm λ = 645 nm DONICA I DONICA II DONICA III DONICA IV Ilość chlorofilu a Ilość chlorofilu b 8
5. Analiza chlorofilu techniką TLC (drugie zajęcia) Część 3 odciętych liści sałaty z poszczególnych donic zważyć. Wyniki zapisać w Tabeli 10.Ekstrakcję barwników przeprowadzić zgodnie ze schematem umieszczonym na Rysunku 5. Rysunek 5 Ekstrakcja barwników do analizy TLC. Do komór chromatograficznych wprowadzić niewielką ilość fazy ruchomej: eter naftowy:aceton; 7:3; v:v; (ok. 3 mm od dna), zamknąć komory i pozostawić na kilka minut. Przygotować płytkę chromatograficzną o wymiarach 4,2 x 8 cm, na której bardzo delikatnie zaznaczyć ołówkiem linię startu (1 cm od dołu). Na linię startu nanosić przy pomocy szklanej kapilary ekstrakty barwników, jak pokazano na Rysunku 6. Po nałożeniu ekstraktów chwilę odczekać, aż miejsce nakładania podeschnie i ponownie nałożyć w to samo miejsce kolejną porcję barwnika. Czynność powtórzyć 4 razy. Pozostawić płytkę do wyschnięcia. 9
Rysunek 6 Przygotowanie płytki TLC oraz nakładanie ekstraktów. Wysuszoną płytkę wstawić do nasyconej fazą ruchomą komory chromatograficznej. Przykryć komorę. Rozdział chromatograficzny prowadzić do momentu, gdy czoło rozpuszczalnika znajdzie się przed górną krawędzią płytki. Chromatogram wyjąc i pozostawić do wysuszenia. Uwaga: Nie należy pobrudzić, ani uszkodzić płytki. Płytkę należy trzymać tylko za jedną krawędź. Nakład kolejne objętości kapilary tak, by tworzący się na płytce ślad miał średnicę nie większą niż 2 mm. Linia startu nie może dotykać powierzchni fazy ruchomej w komorze chromatograficznej. Tabela 10 Analiza chlorofilu techniką TLC. Masa świeżych liści sałaty [g] Analiza chromatogramu (zanotować ilość plamek, zinterpretować obecne barwniki, porównać kolejność elucji) DONICA I DONICA II DONICA III DONICA IV 10
6. Opracowanie wyników Sprawozdanie powinno zawierać krótki wstęp teoretyczny (max. 0,5 strony), opis wykonanych ćwiczeń wraz z uzyskanymi wynikami oraz ich interpretacja, chromatogram TLC z ekstrakcji barwników sałaty wraz z obliczonymi wartościami R f oraz wnioski. 7. Zakres wymagań 1. Chromatografia cienkowarstwowa - TLC. 2. Spektrofotometria UV/Vis. 8. Szkło i odczynniki - aceton, etanol, eter naftowy, woda dejonizowana; - komora chromatograficzna 3 sztuki; - moździerz 12 sztuk; - sączki miękkie 24 sztuk; - lejek 12 sztuk; - cylinder 500 ml 3 sztuki; - pipety 5 ml 6 sztuk; 10 ml 6 sztuk; - gruszka do pipet 3 sztuki; - zlewka 500 ml 9 sztuk; - bagietki 3 sztuki; - łopatki 3 sztuki; - kapilary 12 sztuk; - płytki TLC; - folia aluminiowa; - naczynko wagowe 3 sztuki; - probówki z korkiem 12 sztuk; - probówki bez korka 12 sztuk. 11