BIOMONITORING MUTAGENNOŚCI POWIETRZA ATMOSFERYCZNEGO I WODY

BIOMONITORING MUTAGENNOŚCI POWIETRZA ATMOSFERYCZNEGO I WODY Dr Anicenta Bubak Instytut Medycyny Pracy i Zdrowia Środowiskowego, Sosnowiec Wszystkie dotychczas prowadzone badania nad narażeniem populacji ludzkich na występujące w powietrzu atmosferycznym substancje o działaniu mutagennym i rakotwórczym wskazują na konieczność uzupełnienia rutynowych badań jakości powietrza atmosferycznego o monitoring działania biologicznego. Biorąc pod uwagę fakt, że dorosły człowiek wdycha codziennie od 12 do 15 m 3 powietrza badania aktywności genotoksycznej prób pyłowych zanieczyszczeń powietrza mogą stanowić podstawę do szacowania ryzyka zachorowalności na choroby nowotworowe oraz do wprowadzenia działań profilaktycznych. Uniwersalność DNA jako materiału genetycznego różnych organizmów pozwala na badanie mutagenności powietrza dzięki zastosowaniu różnych systemów badawczych: bakterii, drożdży, owadów, zwierząt doświadczalnych i kultur komórek ssaków oraz ekstrapolowanie ich na organizm człowieka. Badanie mutagenności prób powietrza przy pomocy testu Salmonella Testem bakteryjnym o najszerszym zastosowaniu, odznaczającym się znaczną czułością, jest test Salmonella opracowany przez Amesa i współpracowników. Test Salmonella oparty jest na wykorzystaniu zdolności bakterii do rewersji mutacji, pod wpływem czynników wywołujących mutację powrotną. Histydyno-zależne auksotroficzne mutanty bakterii Salmonella typhimurium ulegają rewersji do form prototroficznych, które posiadają zdolność do wzrostu na podłożu minimalnym, pozbawionym aminokwasu L-histydyny. W teście można stosować różne szczepy testowe Salmonella typhimurium, które powstały po wprowadzeniu mutacji do operonu histydyny szczepu wyjściowego LT2. Szczepy S. typhimurium oprócz mutacji w genach D (hisd3052 - szczepów TA1538 i TA98) oraz G (hisg46 - i szczepów TA1535 i TA100) operonu histydynowego posiadają dodatkowe mutacje zwiększające ich wrażliwość. Mutacja rfa powoduje zwiększenie przepuszczalności ściany komórkowej bakterii i umożliwia penetrację związków chemicznych o dużych cząstkach (np. B(a)P). Delecja uvrb powoduje zmniejszenie zdolności naprawy uszkodzeń DNA poprzez wycinanie, z przyczyn technicznych oprócz genu B wycięto również dwa gen kodujący syntezę biotyny. Do szczepów TA 98 i TA 100 wprowadzono także plazmidy pkm101 (czynnik R), który warunkuje mutagenezę zależną od systemu błędnej naprawy DNA oraz oporność bakterii na ampicylinę. Na bazie tych szczepów skonstruowano wiele ich pochodnych wykorzystywanych do bardziej selektywnego wykrywania określonych typów związków mutagennych. 127

Przemiany metaboliczne związków promutagennych do mutagenów zachodzą przy pomocy występujących u kręgowców enzymów z rodziny cytochromu P-450, które są związane z retikulum endoplazmatycznym. W związku z tym testy bakteryjne przeprowadza się w obecności enzymów oksydacyjnych, zawartych w homogenatach tkankowych. Najczęściej stosuje się homogenaty z wątroby szczurów określane jako frakcja mikrosomalna S9. Test Salmonella wykazuje znaczną zgodność wyników z innymi testami w badaniu mutagenności pyłowych zanieczyszczeń atmosfery. Stwierdzono również korelację pomiędzy stężeniami związków z grupy WWA w powietrzu atmosferycznym a efektem mutagennym badanym przy pomocy różnych szczepów testowych. Występuje również zależność między wynikami badania mutagenności powietrza testem Salmonella a zachorowalnością i śmiertelnością szczurów z powodu nowotworów płuc. Badanie mutagenności prób powietrza z wykorzystaniem szczepu Salmonella typhimurium TM 677 W teście stosuje się szczep Salmonella typhimurium TM 677 niezdolny do wzrostu w obecności 8-azaguaniny (8-AG). Pod wpływem mutagenów dochodzi do mutacji postępowej w genie transferazy fosforybozylo-ksantynoguaninowej, dzięki czemu szczep staje się odporny na działanie 8-AG i może rosnąć w obecności tego związku. Próbę uznaje się za mutagenną, jeśli liczba kolonii rosnących na podłożu z badaną próbą i 8-AG jest statystycznie istotnie wyższa od liczby kolonii mutantów spontanicznych. Pomimo, że wykazano, iż ten test może być przydatny do badania efektu mutagennego pyłów zanieczyszczających powietrze atmosferyczne nie jest powszechnie stosowany w tym celu. Badanie mutagenności prób powietrza przy użyciu SOS chromotestu Test opiera się na indukcji procesu naprawy DNA nazywanego systemem SOS uruchamianym w przypadku błędów w replikacji bakteryjnego DNA. Organizmami testowymi są komórki bakterii Escherichia coli K12 PQ37, w których połączono gen operatora systemu SOS (sfi A) z genem kodującym β-galaktozydazę. Dzięki temu do pomiaru genotoksyczności próby wykorzystuje się nie sam system naprawczy, a aktywność enzymatyczną genu, który równocześnie ulega ekspresji. Badając aktywność fosfatazy alkalicznej enzymu nie związanego z naprawą DNA, określa się toksyczność próby. Wadą tego testu jest to, że wykrywa tylko związki zaburzające proces replikacji. Badanie mutagenności prób powietrza z zastosowaniem testu umu Test umu jest odmianą SOS chromotestu, w którym najczęściej stosuje się szczep Salmonella typhimurium TA1535/pSK1002. Podobnie jak w poprzednim teście aktywność β- galaktozydazy - enzymu nie związanego z systemem SOS, decyduje o toksyczności badanej próby. Czynniki, które mogą uszkodzić DNA, czyli potencjalnie mogą być kancerogenami, włączają w tym teście operon Umu. 128

Badanie mutagenności prób powietrza przy pomocy testu drożdżowego Drożdże to najczęściej wykorzystywane komórki eukariotyczne w badaniach genotoksyczności substancji chemicznych. W teście drożdżowym stosuje się szczepy Saccharomyces cerevisiae i Schizosaccharomyces pombe, które w formie niezmutowanej do wzrostu potrzebują aminokwasów. Dużą popularnością cieszą się szczepy Saccharomyces cerevisiae XV185-14C oraz D7. Pierwszy z nich stosuje się do badania mutacji genowych u drożdży, a drugi umożliwia badanie mitotycznego crossing-over, konwersji genowej i mutacji punktowych. Badanie mutagenności prób powietrza z wykorzystaniem roślin Do oceny mutagennej aktywności zanieczyszczeń atmosfery in situ stosuje się badania polegające na indukcji mikrojąder w komórkach macierzystych pyłku (wykrywanie aberracji w chromosomach mejotycznych) i wykrywaniu mutacji genu odpowiedzialnego za barwę włosków pręcików trzykrotki Tradescantia paludosa BNL 4430 (wykrywanie somatycznych mutacji genowych) oraz powstawanie mutacji letalnych pyłków roślin rosnących na badanym obszarze. Dwa pierwsze testy mogą być wykonywane również w warunkach in vitro w komorach hodowlanych, dzięki czemu można ominąć ograniczenia, jakie niesie ze sobą test w warunkach naturalnych związanych z cyklem życiowym trzykrotki (roślina ciepłolubna). Wyniki badań porównawczych z zastosowaniem testów na trzykrotce i innych testów roślinnych wykazały, że jest ona idealną rośliną do monitorowania mutagenności zanieczyszczeń atmosfery. Testy roślinne mają jednak szereg ograniczeń i prawdopodobnie, dlatego nie znajdują szerszego zastosowania. Na podstawie ich wyników można z większą dokładnością wnioskować o wpływie zanieczyszczeń na lokalną florę niż zdrowie ludzkie. Testy te pozwalają jedynie na ocenę przestrzennego zróżnicowania mutagenności, np. w zależności od odległości od punktowych źródeł emisji np. wysypisk i spalarni śmieci, parkingów, garaży, tuneli samochodowych i dróg, elektrowni jądrowych. Badanie mutagenności prób powietrza przy pomocy testu SMART Test SMART pozwala na badanie mutacji somatycznej i rekombinacji na muszkach owocowych Drosophila melanogaster. Objawiają się one deformacjami włosków na skrzydłach. Test ten był wykorzystywany do badania mutagenności WWA i ich nitrowych pochodnych oraz ekstraktów prób pyłów zanieczyszczających powietrze atmosferyczne. Jego zaletą jest to, że przy kosztach porównywalnych do testów bakteryjnych, pozwala oceniać działanie mutagenne substancji przy użyciu organizmów eukariotycznych, wadą stosunkowo duża ilość badanej próby podawana larwom nienaturalną (w przypadku zanieczyszczeń atmosfery) drogą pokarmową. Analiza mikroskopowa zdeformowanych włosków jest bardzo praco- i czasochłonna. Z tych powodów test ten jest mało rozpowszechniony. 129

Badanie mutagenności prób powietrza przy użyciu testu mikrojądrowego z wykorzystaniem zwierząt doświadczalnych in vivo Test mikrojądrowy służy do wykrywania związków klastogennych, czyli takich, które wywołują zmiany strukturalne w chromosomach. Mikrojądra powstają w wyniku uszkodzenia wrzeciona podziałowego, co prowadzi do wyodrębnienia jednego lub kilku mniejszych jąder zawierających głównie acentryczne fragmenty chromosomów, a czasem nawet całe chromosomy. Najłatwiej mikrojądra wykrywane są w erytrocytach - komórkach nie posiadających jądra głównego. Ekstrakty powietrza atmosferycznego powodowały wzrost częstości mikrojąder w szpiku kostnym myszy BALB/c in vivo. Metoda ta nie ma jednak szerszego zastosowania w rutynowym biomonitoringu. Badanie mutagenności prób powietrza przy pomocy testu mikrojądrowego w limfocytach krwi obwodowej in vitro Test mikrojądrowy w hodowanych limfocytach krwi obwodowej człowieka przeprowadzono do tej pory tylko dla ekstraktów spalin z silników wysokoprężnych. Wyniki badań pozwoliły na stwierdzenie, iż ekstrakty z silników wysokoprężnych o małej mocy częściej wywoływały aneupoloidalność, czyli utratę całego chromosomu, niż ich złamania. Badanie mutagenności prób powietrza przy pomocy testu na aneuploidalność Do wykonania testu wykorzystywano komórki V79 - fibroblasty płuc chomika chińskiego. Statystycznie istotny wzrost komórek aneuploidalnych zawierających 24-33 chromosomy zaobserwowano dla frakcji zawierającej monofenole, natomiast ekstrakt całkowity indukował wzrost liczby komórek poliploidalnych posiadających powyżej 33 chromosomów. Badanie mutagenności prób powietrza przy pomocy testu SCE W teście wymiany chromatyd siostrzanych (sister chromatid exchange (SCE)) obserwuje się wzajemne, symetryczne wymiany fragmentów pomiędzy identycznymi sekwencjami DNA obu chromatyd w chromosomie. Zastosowanie do hodowli bromodezoksyurydyny (BrdU) wbudowującej się zamiast tymidyny do nowosyntetyzowanej nici DNA oraz przeprowadzenie odpowiedniego barwienia umożliwia obserwowanie SCE pod mikroskopem. Do wykonania testu wykorzystuje się linie komórkowe pochodzące najczęściej z różnych części układu oddechowego ssaków i człowieka oraz świeże limfocyty krwi obwodowej, a jeszcze rzadziej spotyka się prace z zastosowaniem roślin (bobu Vicia faba) i komórek jajowych chomika chińskiego (CHO). Komórki nabłonka tchawicy lub oskrzeli uznane zostały za najlepszą tkankę do stosowania w teście SCE jako miejsce docelowe powstawania raka przy inhalacyjnym wchłanianiu zanieczyszczeń gazowych i pyłowych. Za najlepsze do testowania zanieczyszczeń powietrza uznano kultury ludzkich linii komórkowych z nabłonka oskrzelowego (BEAS-2B). 130

Badanie mutagenności prób powietrza przy pomocy testu na aberracje chromosomowe Aberracje chromosomowe są wynikiem uszkodzeń DNA, które prowadzą do przerw w podwójnych niciach DNA i obejmują co najmniej jedno złamanie podwójnej nici. Czynniki genotoksyczne indukują aberracje tylko wtedy gdy w komórce następuje replikacja DNA. Do wykonania testu stosuje się najczęściej komórki jajowe chomika chińskiego (CHO), limfocyty krwi obwodowej człowieka oraz fibroblasty płuc chomika (komórki V79). Po wybarwieniu preparatów obserwuje się chromosomy w pierwszym podziale metafazowym. Aberracje są klasyfikowane na ogół jako chromatydowe obejmujące jedną chromatydę i chromosomowe obejmujące obydwie chromatydy. W innym systemie translokacje chromosomowe są dzielone na trwałe (np. translokacje) i nietrwałe (np. dicentryki), w zależności od tego czy mogą utrzymywać się przez kolejny cykl komórkowy. Test na aberracje nie jest często stosowany w badaniach mutagenności powietrza. Badanie mutagenności prób powietrza z wykorzystaniem testu na HPRT i TK Metoda polega na hodowaniu komórek w podłożach selekcjonujących, zawierających czynnik działający toksycznie na wszystkie komórki nie będące mutantami. W tych warunkach tylko zmutowane komórki przeżywają i tworzą kolonie. Zasada metody polega na tym, że efekt genetyczny jest następstwem mutacji w specyficznym locus genu. Dwa najczęściej wykorzystywane geny to gen kodujący enzym fosforybozylo-transferazę hipoksantyny (hypoksantine quanine phosphoribosyl-transpherase HPRT) oraz kodujący kinazę tymidynową (TK). HPRT jest jednym z enzymów ratujących, którego funkcją jest ochrona produktów syntezy kwasów nukleinowych przed degradacją. Podstawę selekcji mutantów stanowi dodanie do podłoża analogów puryn (6-tioguaniny, 8-azoguaniny), które nie są wbudowywane do DNA mutantów. TK umożliwia wbudowywanie tymidyny i jej toksycznych analogów ze źródeł egzogennych do komórki. Selekcję mutantów homo- i heterozygotycznych umożliwia dodanie 5-bromodezoksyurydyny lub trójfluorotymidyny. Do badań substancji chemicznych in vitro najczęściej stosuje się trzy linie komórek ssaków: V79, CHO i chłoniaka myszy L 41784 lub L 55178Y TK + /TK -. Produkty reakcji atmosferycznych naftalenu i fenantrenu należących do niegenotoksycznych WWA poddano ocenie z wykorzystaniem ludzkich komórek linii B-limfoblastoidalnych MCL-5, o podwyższonej ekspresji genów P450 i hydrolazy epoksydowej. Nitrowe pochodne tych związków miały większy potencjał mutagenny od związków macierzystych, indukując większą częstość mutacji TK, natomiast wzrost HPRT nie był statystycznie istotny. Badanie mutagenności prób powietrza z zastosowaniem testu na indukowanie adduktów DNA in vitro W teście hoduje się DNA z grasicy cielęcej z ekstraktem frakcji zanieczyszczeń powietrza w warunkach tlenowych po dodaniu i bez mieszaniny S9 oraz w warunkach beztlenowych (w atmosferze azotu), w obecności systemu redukcyjnego zależnego od oksydazy ksantynowej (XO). Do oznaczenia adduktów DNA i ich ilości wykorzystuje się techniki chromatograficzne: chromatografię cienkowarstwową (TLC), autoradiografię, radiografię oraz analizę adduktów metodą 32 P-postlabellingową przy pomocy HPLC lub GC-MS. Zaobserwowano addukty następujących związków: 9-hydroksybenzo(a)pirenu, benzo(a)piren-r- 7, t-8dihydrodiol-t-9,10epoksydu(±), benzo(b,j,k)fluorantenów, chryzenu, benz(a) antrace- 131

nu i indeno(cd)pirenu. 1-nitropiren, 9-nitroantracen i 3-nitrofluorantenu wykrywano przy użyciu GC-MS w słabo polarnej frakcji. Testy wykorzystywane do badania mutagenności prób wody Do wstępnej oceny zanieczyszczenia wody związkami mutagennymi i rakotwórczymi najczęściej stosowane w praktyce są szybkie testy bakteryjne. Wynika to z faktu, iż w wyniku obserwacji zmian w genomie komórek prokariotycznych można wykazać większość indukowanych związkami chemicznymi uszkodzeń DNA. Te proste i w miarę tanie systemy wykazują znaczną korelację z badaniami na zwierzętach. Najczęściej stosowanym w badaniach wody jest test Salmonella. Został on wprowadzony bardzo szeroko w połowie lat siedemdziesiątych, stąd testem tym przebadano największą pulę związków chemicznych. Test ten proponowany jest w Standard Methods for Examination of Water and Wastwater US EPA do oceny jakości zdrowotnej wody do picia. Innym testem bakteryjnym stosowanymi do oceny właściwości mutagennych wody jest SOS chromotest. Ponadto wykorzystuje się testy z użyciem komórek eukariotycznych: testu drożdżowego, wymiany chromatyd siostrzanych (SCE), aberracji chromosomów(ca), oraz test mikrojądrowy. Testy te wykonywane są bezpośrednio na zwierzętach (ssakach) lub na różnych typach izolowanych i hodowanych komórek takich jak szpik kostny, komórki nabłonkowe, komórki płciowe, limfocyty krwi obwodowej, fibroblasty i linie komórkowe CHO, V79, L5178Y itd. Przeprowadzone przez Pracownię Mutagenezy Środowiskowej Instytutu Medycyny Pracy i Zdrowia Środowiskowego w Sosnowcu w bardzo szerokim zakresie, na terenie województwa katowickiego, badania mutagenności prób powietrza z użyciem szczepów podstawowych TA98 i 100 oraz pochodnych YG... największe badania tego typu na świecie, umożliwiły opracowanie systemu monitorowania jakości powietrza atmosferycznego w odniesieniu do substancji rakotwórczych i teratogennych. W przypadku pozytywnej odpowiedzi w teście bakteryjnym, proponuje się badanie aktywności genotoksycznej prób przy pomocy testu SCE. Spośród różnych komórek używanych w teście SCE polecamy stosowanie komórek płuc chomika V79 lub ludzkich linii komórkowych z nabłonka oskrzelowego (BEAS-2B), jako tkanki docelowej przy narażeniu na pyłowe zanieczyszczenia powietrza. Poniżej przestawiono propozycję systemu monitorowania zanieczyszczeń pyłowych powietrza atmosferycznego. 132

Algorytm skriningu efektu mutagennego pyłowych zanieczyszczeń powietrza w sezonie zimowym Test Amesa badanie I TA 98 TA 100 bez S9 z S9 bez S9 z S9 aktywność mutagenna <2 2 <2 2 <2 2 <2 2 ocena próby + + + + badanie przy pomocy szczepów YG1026, YG1029 i YG1042 badanie II YG 1021 YG 1024 YG 1041 bez S9 z S9 bez S9 z S9 bez S9 z S9 aktywność mutagenna <2 2 <2 2 <2 2 <2 2 <4 4 <4 4 ocena próby + + + + + + Co najmniej jeden wynik dodatni dla szczepów YG upoważnia do przeprowadzenia Testu SCE komórki V79 bez S9 z S9 aktywność genotoksyczna <2 2 <2 2 ocena próby + + 133

Algorytm skriningu efektu mutagennego pyłowych zanieczyszczeń powietrza w sezonie letnim Test Amesa TA 98 YG 1021 YG 1024 YG 1041 bez S9 z S9 S9 z S9 bez S9 z S9 bez S9 z S9 aktywność mutagenna <1 1 <1 1 <2 2 <2 2 <2 2 <2 2 <2 2 <2 2 ocena próby + + + + + + + + Co najmniej jeden wynik dodatni upoważnia do przeprowadzenia Testu SCE komórki V79 bez S9 z S9 aktywność genotoksyczna <2 2 <2 2 ocena próby + + 134

Legenda: Test Amesa test bakteryjny wykorzystujący zdolność histydyno-zależnych mutantów Salmonella typhimurium do rewersji mutacji pod wpływem czynników wywołujących mutację powrotną, która przejawia się wzrostem na podłożu minimalnym, pozbawionym aminokwasu L-histydyny. Szczepy testowe TA98 YG1021 YG1024 YG1041 TA100 YG1026 YG1029 YG1042 Opis szczepów i plazmidów niosących zwielokrotnione kopie enzymów biorących udział w metabolizmie nitroarenów i amin aromatycznych (w nawiasach) wykrywa mutageny zmiany fazy odczytu TA98 (pyg216): nadprodukcja nitroreduktazy TA98 (pyg219): nadprodukcja O-acetylotransferazy TA98 (pyg233): nadprodukcja nitroreduktazy i O-acetylotransferazy wykrywa mutageny podstawienia pary zasad TA100 (pyg216): nadprodukcja nitroreduktazy TA100 (pyg219): nadprodukcja O-acetylotransferazy TA100 (pyg233): nadprodukcja nitroreduktazy i O-acetylotransferazy S9 mieszanina enzymatyczna zawierająca homogenat z wątroby szczura określany jako frakcja mikrosomalna S9, Test SCE test wykonywany przy użyciu komórek ssaków: limfocytów lub fibroblastów, w którym można stwierdzić czy dochodzi do uszkodzeń DNA polegających na złamaniach i ponownych łączeniach fragmentów chromatyd w chromosomie dzięki zastosowaniu bromodezoksyurydyny (analog tymidyny). V79 - fibroblasty płuc chomika. Aktywność mutagenna względna miara efektu mutagennego AM = NR KR NR netto rewertanty - różnica pomiędzy liczbą rewertantów indukowanych przez ekstrakt próby, obliczona z krzywej dawka-odpowiedź dla 1m 3 powietrza, a liczbą rewertantów w odpowiedniej kontroli negatywnej, KR - liczba rewertantów w odpowiedniej kontroli negatywnej. Próbę uznaje się za mutagenną w zależności od przyjętej wartości granicznej 1, 2 lub 4. Aktywność genotoksyczna względna miara efektu genotoksycznego, obliczana zgodnie ze wzorem na AM, próbę uznaje się za genotoksyczną, jeśli wynik jest równy lub wyższy od 2. Ocena próby wynik ujemny (niższy) lub dodatni (równy lub wyższy) od granicznej wartości aktywności mutagennej i genotoksycznej badanej próby. Ocena końcowa: próba mutagenna w odniesieniu do organizmów bakteryjnych i genotoksyczna dla komórek ssaków stanowi zagrożenie dla zdrowia i życia ludzi. Na podstawie danych literaturowych sformułowano założenia teoretyczne, które w przybliżonym zakresie pozwalają na zidentyfikowanie substancji odpowiedzialnych za efekt mutagenny na przykładzie badań prób pyłowych zanieczyszczeń powietrza przeprowadzonych przy pomocy szczepu TA98 i jego pochodnych YG: 1. większe wartości AM po zastosowaniu aktywacji metabolicznej w porównaniu z wariantem bez mieszaniny S9 sugeruje występowanie w próbach powietrza związków mutagennych typu wielopierścieniowych węglowodorów aromatycznych, 2. większe wartości AM dla szczepów YG1021, YG1024 i YG1041 niż dla TA98 w wariancie bez aktywacji metabolicznej przemawiają za obecnością nitroarenów, 3. o występowaniu w ekstraktach nitroarenów świadczą również dużo niższe odpowiedzi ze strony szczepów YG1021, YG1024 i YG1041 po zastosowaniu S9, 135

4. podwyższenie wartości AM dla szczepu YG1021+S9 może wskazywać na obecność nitroarenów, które wymagają zastosowania aktywacji metabolicznej, np. 6- nitrobenzo(a)piren, 5. wyższe wartości AM dla szczepów YG1024 i YG1041 po dodaniu S9 w porównaniu z wartościami AM dla szczepu TA98+S9 świadczą o obecności amin aromatycznych i hydroksyloamin, 6. potwierdzenie obecności amin aromatycznych i hydroksyloamin dają również większe wartości AM dla szczepów YG1024 i YG1041 w wariancie z mieszaniną S9 w porównaniu do wariantu bez mieszaniny. W odniesieniu do wody do picia, Zakład Biologii i Ekologii Instytutu Inżynierii Środowiska, Politechniki Wrocławskiej zaproponował następujący system badania efektu mutagennego. Algorytm skriningu efektu mutagennego wody do picia Test Amesa TA 98 TA 100 bez S9 z S9 bez S9 z S9 aktywność mutagenna <2 2 <2 2 <2 2 <2 2 ocena próby + + + + Ocena próby wynik ujemny (niższy) lub dodatni (równy lub wyższy) od granicznej wartości (2) aktywności mutagennej badanej próby. Ocena końcowa: próba mutagenna w odniesieniu do organizmów bakteryjnych - stanowi zagrożenie dla zdrowia konsumentów w rezultacie picia wody. Poniżej podano założenia teoretyczne, które w przybliżonym zakresie pozwalają na zidentyfikowanie substancji odpowiedzialnych za efekt mutagenny na podstawie badań prób wody przeprowadzonych przy pomocy szczepów TA98 i TA100: 1. Jeżeli wartości AM są wyższe po dodaniu S9 dowodzi to obecności w wodzie związków o charakterze promutagenów, w tym wielopierścieniowych węglowodorów aromatycznych. 2. Jeżeli wartości AM są wyższe w wariancie bez aktywacji enzymatycznej, to najprawdopodobniej za efekt mutagenny badanej wody odpowiedzialne są nielotne produkty uboczne procesu dezynfekcji. 3. Jeżeli wartości AM 2 w obu wariantach to woda zawiera zanieczyszczenia o charakterze mutagenów działających bezpośrednio i pośrednio. Równolegle z testem Salmonella proponuje się monitorowanie w powietrzu i wodzie związków chemicznych o właściwościach rakotwórczych lub teratogennych, które nie wykazują efektu genotoksycznego w testach bakteryjnych: arsenu, chromu, kadmu (tylko w próbach powietrza), niklu, ołowiu i benzenu. W miarę potrzeb, do kolejnych etapów monitoringu można będzie włączyć chemiczne pomiary innych związków rakotwórczych i teratogennych po ich identyfikacji i wykryciu źródła emisji. 136