Dozymetria biologiczna

Transkrypt

1 OCHRONA RADIOLOGICZNA 2 Dozymetria biologiczna Jakub Ośko

2 Dozymetria biologiczna Pozwala na ocenę dawki pochłoniętej na podstawie zmian zachodzących w organizmie człowieka. Stosowana w sytuacjach awaryjnych do określania dużych dawek. 2

3 Estymator dawki System zarządzania wypadkami radiacyjnymi (Radiation Event Medical Management) opracowany przez Narodowy Instytut Zdrowia (National Health Institute) w USA zawiera estymator dawki (REMM Dose Estimator) oparty na trzech metodach oszacowania dawki: ocenie czasu wystąpienia wymiotów ocenie kinetyki zaniku limfocytów ocenie częstości występowania chromosomów dicentrycznych. 3

4 Estymator dawki Ocena czasu wystąpienia wymiotów i ocena kinetyki zaniku limfocytów obserwacje kliniczne Badanie odpowiedzi całego organizmu 4

5 Estymator dawki Częstość występowania chromosomów dicentrycznych (dozymetria biologiczna) metoda laboratoryjna ocena natężenia czynnika uszkadzającego DNA (np. dawki pochłoniętej promieniowania) na podstawie zmian w komórkach lub tkankach człowieka (np. komórkach krwi obwodowej lub szpiku kostnego, kościach czy szkliwie zębów) korelacja skutków napromienienia z badaniami modelowymi pozwala na oszacowanie dawki pochłoniętej 5

6 Metody dozymetrii biologicznej natychmiastowe retrospektywne 6

7 Metody natychmiastowe Ocena dawki w krótkim czasie po napromienieniu poprzez pomiar zjawisk przemijających, związanych z powstawaniem uszkodzeń DNA. 7

8 Metody natychmiastowe ZALETA pomiar zjawisk bezpośrednio związanych z ekspozycją na promieniowanie WADA pomiar zjawisk bezpośrednio związanych z ekspozycją na promieniowanie procesy naprawy uszkodzeń DNA zachodzące w komórce po napromienieniu eliminują przyczynę powstawania tych zjawisk, metod natychmiastowych nie można użyć retrospektywnie. 8

9 Metody natychmiastowe Test kometowy Test ognisk histonu γh2ax 9

10 Test kometowy Metoda badania narażenia populacji ludzkich na określone czynniki środowiskowe lub endogenne. Oznaczanie uszkodzeń DNA na poziomie pojedynczych komórek w limfocytach krwi obwodowej. 10

11 Test kometowy Umieszczenie zawiesiny badanych komórek w agarozie o niskiej temperaturze krzepnięcia Naniesienie preparatu na podstawowe szkiełko mikroskopowe Zestalenie się warstwy agarozowej komórki Liza w obecności detergentu Elektroforeza niskonapięciowa Zobojętnienie preparatu i barwienie barwnikiem fluorescencyjnym interkalującym DNA Ocena wybarwionego DNA przy uzyciu mikroskopu fluorescencyjnego i ocena uszkodzenia DNA Agaroza - polisacharyd będący polimerem pochodnych galaktozy, otrzymywany przez oczyszczanie z agaru jadalnego. Liza - rozpad obłonionych elementów (zwykle komórek) poprzez dezintegrację błony i wylanie się zawartości do środowiska 11

12 Test kometowy Wysokie ph i stężenie soli w procesie lizy i elektroforezy powoduje oddysocjowanie większości białek macierzy jądrowej oraz rozerwanie wiązań wodorowych pomiędzy nićmi DNA, co powoduje częściową relaksację superzwinięcia nici DNA. Po przyłożeniu napięcia nici DNA są wywlekane z jądra w kierunku anody, powodując powstawanie tzw. "ogona" komety. Nieuszkodzona część DNA, pozostaje związana z macierzą jądrową tworząc "głowę" komety. 12

13 Test kometowy Prostota wykonania Mała inwazyjność Do przeprowadzenia testu wystarczy kropla krwi z palca. Duża czułość Możliwość mierzenia uszkodzeń DNA w pojedynczych komórkach 13

14 Test ognisk histonu γh2ax Określenie liczby podwójnoniciowych pęknięć nici DNA (DSB) na podstawie występowania skupisk (ognisk) charakterystycznych białek w miejscach uszkodzeń. Histony białka składowe chromatyny, bezpośrednio związanymi z nićmi DNA. W momencie powstania DSB jeden z histonów (H2AX) ulega fosforylacji, dając γh2ax. Reakcja ta występuje tylko w miejscu powstania DSB. Liczba ognisk γh2ax odpowiada liczbie DSB. Fosforylacja przyłączenia reszty fosforanowej do nukleofilowego 14

15 Test ognisk histonu γh2ax Umieszczenie komórek na szkiełku podstawowym Utrwalenie Dodanie przeciwciała wyznakowanego barwnikiem fluorescencyjnym specyficznie wiążącego się z histonem γh2ax. 15

16 Test ognisk histonu γh2ax WADA szybkie zanikanie ognisk w wyniku naprawy DSB, co uniemożliwia użycie testu w dozymetrii retrospektywnej. ZALETA wysoka specyficzność, histon H2AX ulega fosforylacji tylko w momencie wystąpienia DSB. 16

17 Metody retrospektywne oparte na pomiarze zjawisk biologicznych lub zjawisk fizyko-chemicznych badanie trwałych skutków działania promieniowania. biologiczne fizyko-chemiczne 17

18 Metody biologiczne określenie częstości powstawania zmian genetycznych w wyniku nieprawidłowej naprawy DNA mikrojądrowa, oznaczanie częstości występowania wymian odcinków chromatyd siostrzanych oznaczanie częstości występowania aberracji chromosomowych Czułość 0,1-0,5 Gy 18

19 Metody fizyko-chemiczne spektroskopia elektronowego rezonansu paramagnetycznego (EPR) czułość 0,1 Gy 19

20 Metoda mikrojądrowa Metoda cytogenetyczna pozwalającą na wykrywanie podwójnoniciowych pęknięć DNA i uszkodzeń wrzeciona podziałowego ujawniających się po podziale komórek. Mikrojądro powstaje, jeżeli w czasie mitozy cały chromosom lub fragment chromosomu nie zostanie rozdzielony pomiędzy dwa jądra potomne. Powinno ono być: mniejsze niż ⅓ wielkości normalnego jądra, wyraźnie oddzielone od jądra, podobnie wybarwione jak jądro komórki. 20

21 Metoda mikrojądrowa Mikrojądra łatwo liczy się przy użyciu mikroskopu w czasie normalnych podziałów komórki (historycznie pierwsza metoda), w komórkach dwujądrzastych stosując cytochalazynę B, która blokuje podział cytoplazmy (cytokinezę) łącząc test z metodą fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ 21

22 Metoda mikrojądrowa z cytochalazyną 0h stymulacja podziałów komórki przez dodanie fitohemaglutyniny mitoza 48h zablokowanie podziału cytoplazm-my przez dodanie cytochalazyny B bez cytochalazyny 22

23 Metoda mikrojądrowa Test mikrojądrowy wykonuje się z reguły na: limfocytach krwi obwodowej komórkach nabłonka worka policzkowego, erytrocytach komórkach szpiku kostnego. 23

24 Metoda wymian odcinków chromatyd siostrzanych SCE, ang. sister chromatid exchange Badanie częstości występowania wzajemnych, symetrycznych wymian fragmentów pomiędzy identycznymi sekwencjami DNA obu chromatyd w chromosomie. Ocena w płytkach metafazalnych uzyskanych z hodowli komórek prowadzonych w obecności bromodeoksyurydyny (BrdU), która jest wbudowywana w nić DNA w czasie syntezy. 24

25 Metoda wymian odcinków chromatyd siostrzanych W czasie podziału mitotycznego BrdU trafia do jednej z komórek potomnych. Obecność BrdU w DNA można wykryć stosując specjalne metody barwienia. W drugiej mitozie obserwuje się symetryczne wymiany pomiędzy chromatydami zawierającymi BrdU i tymi, które BrdU nie zawierają. 25

26 Metoda wymian odcinków chromatyd siostrzanych + BrdU + BrdU Limfocyt G 0 1 mitoza 2 mitoza 0h stymulacja podziałów komórki przez dodanie fitohemaglutyniny 72h zablokowanie podziału jądra przez dodanie kolcemidu 26

27 Metoda wymian odcinków chromatyd siostrzanych SCE jest prawdopodobnie procesem naturalnym zwiększający zróżnicowanie genetyczne. Brak korelacji z dawką pochłoniętą promieniowania. Obecnie metoda wychodzi z użycia i jest używana głównie do badania cytotoksyczności związków chemicznych in vitro. 27

28 Metoda aberracji chromosomowych Aberracje chromosomowe powstają w wyniku błędnej naprawy DSB (jeżeli w komórce występują jednocześnie dwa lub więcej DSB, wolne końce nici mogą zostać błędnie połączone). translokacje międzychromosomowe translokacje wewnątrzchromosomowe 28

29 Metoda aberracji chromosomowych W wyniku aberracji przywrócona zostaje ciągłość nici DNA, więc zmiany, o ile nie prowadzą do śmierci komórki, są trwałe i mogą być przekazywane w czasie podziału komórkom potomnym. Do badań narażenia ludzi wykorzystuje się zwykle limfocyty krwi obwodowej. Po około 48 godzinach dodaje się do hodowli limfocytów kolcemidu, substancji blokującej tworzenie się wrzeciona podziałowego i rozchodzenie się chromosomów w czasie mitozy. W ten sposób podział komórki jest zablokowany na początku mitozy, co pozwala na ocenę wszystkich chromosomów 29

30 Metoda aberracji chromosomowych Analiza aberracji chromosomowych w komórkach pozwala na wykrycie dostrzegalnych przy użyciu mikroskopu zmian w liczbie (aberracje numeryczne) i morfologii chromosomów (aberracje strukturalne). 30

31 Metoda aberracji chromosomowych Aberracje numeryczne zwykle są nieprzydatne dla potrzeb dozymetrii biologicznej, z uwagi na często występujące artefakty związane z preparatyką komórek. Aberracje strukturalne złamania chromosomów i chromatyd, chromosomy pierścieniowe chromosomy dicentryczne fragmenty acentryczne. są wykorzystywane do szacowania dawki pochłoniętej. 31

32 Metoda aberracji chromosomowych Najlepszą korelację pomiędzy występowaniem określonego typu aberracji i dawką pochłoniętą uzyskuje się dla chromosomów dicentycznych. Powstanie chromosomu dicentrycznego prowadzi zwykle do śmierci komórki, co powoduje, że są one stosunkowo szybko eliminowane z krwioobiegu. Duża pracochłonność i konieczność zatrudnienia do oceny preparatów wysokokwalifikowanego personelu. 32

33 Metoda aberracji chromosomowych Metoda hybrydyzacji in situ z zastosowaniem barwników fluorescencyjnych (FISH) pozwala na wykrywanie niedostrzegalnych bez takiego barwienia translokacji fragmentów chromosomów. 33

34 Metoda aberracji chromosomowych Fluorescencyjna hybrydyzacja in situ (ang. fluorescent in situ hybridization, FISH) technika cytogenetyczną, wykrywanie w badanym materiale genetycznym określonej sekwencji DNA za pomocą fluorescencyjnych sond DNA. usunięcie cytoplazmy z komórek i utrwalenie jąder komórkowych na szkiełku podstawowym naniesienie sondy na preparat i krótkotrwała denaturacja w podwyższonej temperaturze, która powoduje rozerwanie się wiązań wodorowych pomiędzy nićmi DNA hybrydyzacja, w czasie której fluorescencyjnie wyznakowane odcinki znanego DNA (sonda) wiążą się z komplementarnymi odcinkami badanego DNA. analiza przy użyciu mikroskopu fluorescencyjnego. 34

35 Metoda aberracji chromosomowych FISH badanie aberracji chromosomowych w limfocytach krwi obwodowej dokładniejsza analiza translokacji niż w klasycznej analizie cytogenetycznej technika wielokolorowej FISH (ang. multicolor FISH, m-fish), każdy chromosom hybrydyzuje z sondą wyznakowaną innym kolorem badanie translokacji złożonych z fragmentów kilku chromosomów 35

36 Metoda aberracji chromosomowych 36

37 EPR Metoda elektronowego paramagnetycznego rezonansu (EPR) pomiar ilości stałych rodników tworzących się w ciele człowieka pod wpływem promieniowania jonizującego np. hydroksyapatyt (Ca10 (PO4)6(OH)2) zawarty w kościach i szkliwie zębów Węglany zawarte w hydroksyapatycie pod wpływem promieniowania jonizującego przekształcają się w anionorodniki węglanowe (CO2 -). Trwałość: 107 lat. 37

38 EPR Przygotowanie próbki: oddzielenie korzenia zęba od jego korony i usunięcie z niej dentyny kruszenie szkliwa i rozcieranie na proszek. Pomiar w spektrometrze EPR w paśmie X. Dawkę pochłoniętą określa się na podstawie wielkości piku sygnału charakterystycznego dla CO2 -. Czułość: 0,1 Gy. 38

39 Dziękuję za uwagę 39