RZECZPOSPOLITA POLSKA (12) TŁUMACZENIE PATENTU EUROPEJSKIEGO (19) PL (11) PL/EP 1608685 Urząd Patentowy Rzeczypospolitej Polskiej (96) Data i numer zgłoszenia patentu europejskiego: 26.03.2004 04758372.9 (97) O udzieleniu patentu europejskiego ogłoszono: 21.02.2007 Europejski Biuletyn Patentowy 2007/08 EP 1608685 B1 (13) T3 (51) Int. Cl. C07K19/00 C07K14/52 C07K14/71 C07K16/28 A61P3/10 A61K31/7088 (2006.01) (2006.01) (2006.01) (2006.01) (2006.01) (2006.01) (54) Tytuł wynalazku: Antagoniści VEGF do leczenia cukrzycy (30) Pierwszeństwo: US20030458790P 28.03.2003 (43) Zgłoszenie ogłoszono: 28.12.2005 Europejski Biuletyn Patentowy 2005/52 (45) O złożeniu tłumaczenia patentu ogłoszono: 31.07.2007 Wiadomości Urzędu Patentowego 07/2007 (73) Uprawniony z patentu: REGENERON PHARMACEUTICALS, INC., Tarrytown, US PL/EP 1608685 T3 (72) Twórca (y) wynalazku: SLEEMAN Mark W., Mahopac, US WIEGAND Stanley J., Croton-on-Hudson, US (74) Pełnomocnik: Polservice Kancelaria Rzeczników Patentowych Sp. z o.o. rzecz. pat. Bartnik Urszula 00-950 Warszawa skr. pocz. 335 Uwaga: W ciągu dziewięciu miesięcy od publikacji informacji o udzieleniu patentu europejskiego, każda osoba może wnieść do Europejskiego Urzędu Patentowego sprzeciw dotyczący udzielonego patentu europejskiego. Sprzeciw wnosi się w formie uzasadnionego na piśmie oświadczenia. Uważa się go za wniesiony dopiero z chwilą wniesienia opłaty za sprzeciw (Art. 99 (1) Konwencji o udzielaniu patentów europejskich).
Dziedzina wynalazku 2 Dziedzina wynalazku jest ogólnie związana ze sposobami leczenia cukrzycy. Stan techniki Opisywano, że myszy db/db, mysi model cukrzycy typu 2, leczone przeciwciałem skierowanym przeciwko VEGF, wykazują poprawę w zakresie powodowanych przez cukrzycę zmian w nerkach, lecz nie wykazują zmniejszenia masy ciała, obniżenia stężenia glukozy w surowicy, stężenia insuliny ani zmniejszenia ilości przyjmowanego pożywienia (Flyvbjerg i wsp. (2002), Diabetes 51:3090-3094). Ponadto, swoistych dla VEGF antagonistów, stanowiących białka fuzyjne, oparte na składowych receptora VEGF, i ich zastosowanie opisano w publikacjach WO00/75319, WO02/060489 i US2003/0017977. Krótkie streszczenie wynalazku W pierwszym aspekcie, przedmiotem niniejszego wynalazku jest zastosowanie antagonisty VEGF VEGFR1R2-Fc C1(a) (SEQ nr 1) do wytwarzania leku do leczenia cukrzycy u ssaka. W swoistych wykonaniach, sposób leczenia według wynalazku powoduje zmniejszenie stężenia glukozy w surowicy, poprawę tolerancji glukozy, poprawę wrażliwości na insulinę, zmniejszenie hiperinsulinemii i(lub) poprawę kontroli glikemii. W swoistym wykonaniu, cukrzycą jest cukrzyca typu 2 (zwana również cukrzycą nieinsulinozależną). W swoistych warunkach, wynalazek ma także zastosowanie do cukrzycy typu 1 lub do cukrzycy ciężarnych. Podawanie środka może odbywać się dowolnym sposobem znanym ze stanu techniki, włączając w to podawanie podskórne, domięśniowe, śródskórne, dootrzewnowe, dożylne, donosowe i doustne. Ssakiem jest, korzystnie, człowiek chory na cukrzycę. Wynalazek ma również zastosowanie do osób narażonych na ryzyko cukrzycy typu 2, u których występuje jeden lub więcej niż jeden objaw cukrzycy typu 2 lub choroby związanej z rozwojem cukrzycy typu 2, taki jak na przykład oporność na insulinę, dyslipidemia, zespół jajników wielotorbielowatych, otyłość, hiperglikemia,
3 hiperlipidemia, hipercholesterolemia, hipertrójglicerydemia, hiperinsulinemia i nadciśnienie tętnicze. Wynalazek znajduje także zastosowanie do hamowania lub spowalniania progresji cukrzycy typu 2 u ssaka. Inne cele i korzyści ujawni zapoznanie się z poniższym szczegółowym opisem. Krótki opis rysunków Fig. 1A-B: (A) stężenie glukozy w surowicy i (B) masa ciała po 4 tygodniach u myszy z cukrzycą (db/db) i bez cukrzycy (db/?), leczonych VEGFR1R2-Fc C1(a). Fig. 2: Stężenie glukozy w surowicy po 8 tygodniach leczenia myszy z grupy kontrolnej oraz myszy z cukrzycą (db/db) i bez cukrzycy (db/?), leczonych VEGFR1R2-Fc C1(a). Fig. 3: Test doustnej tolerancji glukozy po 4 tygodniach leczenia u myszy z grupy kontrolnej i u otrzymujących VEGFR1R2Fc C1(a) myszy z cukrzycą (db/db) i bez cukrzycy (db/?). Fig. 4: Test doustnej tolerancji glukozy po 8 tygodniach leczenia u myszy z grupy kontrolnej i u otrzymujących VEGFR1R2-Fc C1(a) myszy z cukrzycą (db/db) i bez cukrzycy (db/?). Fig. 5A-B: Stężenie glukozy i insuliny w surowicy na czczo po 8 tygodniach leczenia u myszy z grupy kontrolnej i u otrzymujących VEGFR1R2-Fc C1(a) myszy z cukrzycą (db/db) i bez cukrzycy (db/?). Szczegółowy opis wynalazku Należy rozumieć, że wynalazek nie ogranicza się do szczególnych, opisanych sposobów i warunków doświadczalnych, ponieważ takie sposoby i warunki można zmieniać. Należy również zdawać sobie sprawę, że zastosowana w opisie terminologia służy tylko opisaniu szczegółowych wykonań i nie ma na celu ograniczenia, jako że zakres niniejszego wynalazku ograniczają wyłącznie załączone zastrzeżenia. W niniejszym opisie i załączonych zastrzeżeniach, formy gramatyczne liczby pojedynczej obejmują również odpowiedniki w liczbie mnogiej, chyba że kontekst w oczywisty sposób sugeruje, że tak nie jest. Jeżeli nie zdefiniowano inaczej, wszystkie terminy techniczne i naukowe, użyte w niniejszym opisie, mają takie samo znaczenie, jakie jest powszechnie rozumiane przez specjalistę z dziedziny, której wynalazek dotyczy. Jakkolwiek przy
4 wykorzystywaniu lub badaniu niniejszego wynalazku można stosować dowolne sposoby i materiały, podobne do opisanych lub równoważne opisanym, poniżej opisano korzystne sposoby i materiały. Opis ogólny Wynalazek opiera się częściowo na odkryciu, że podawanie antagonisty VEGF może obniżać poziom glukozy w surowicy i poprawiać eliminację glukozy u ssaków z cukrzycą. Odkrycie to po raz pierwszy dowodzi, że antagonista VEGF może pozwalać uzyskać poprawę w cukrzycy. Definicje Termin dawka terapeutycznie skuteczna oznacza dawkę powodującą uzyskanie pożądanego efektu, celem którego jest podawana. Dokładna dawka będzie zależała od celu leczenia i będzie możliwa do ustalenia dla specjalisty za pomocą znanych sposobów (zob. na przykład, Lloyd (1999) The Art, Science and Technology of Pharmaceutical Compounding). Termin antagonista" oznacza substancję opóźniającą chemiczną lub fizjologiczną reakcję lub odpowiedź lub zapobiegającą wystąpieniu takiej reakcji lub odpowiedzi. Przedmiotem niniejszego wynalazku jest oparty na receptorze VEGF antagonista VEGFR1R2-Fc C1(a) (SEQ nr 1). Pełny opis opartych na VEGF antagonistów, w tym VEGFR1R2-Fc C1(a), można znaleźć w publikacji PCT WO 00/75319. Drobną cząsteczkę definiuje się w niniejszym opisie jako cząsteczkę o masie cząsteczkowej poniżej około 500 daltonów. Może to być zarówno cząsteczka chemiczna, jak i peptydowa. Konstrukty kwasów nukleinowych Poszczególne składowe swoistych wobec VEGF, stanowiących białka fuzyjne antagonistów według niniejszego wynalazku można wytwarzać metodami biologii molekularnej, znanymi ze stanu techniki, stosując zalecenia zawarte w niniejszym opisie. Składowe te dobiera się z grupy, do której należy pierwsze komórkowe białko receptorowe, takie jak na przykład VEGFR1, drugie komórkowe białko receptorowe, takie jak na przykład VEGFR2, i składowa tworząca multimery, taka jak Fc.
5 Swoiste wykonania swoistych wobec VEGF, stanowiących białka fuzyjne antagonistów, korzystnych w sposobach według niniejszego wynalazku, zawierają tworzącą multimery składową, umożliwiającą łączenie się białek fuzyjnych, na przykład jako multimerów, korzystnie dimerów. Korzystnie, tworząca multimery składowa zawiera domenę pochodzącą z immunoglobuliny. Korzystnymi składowymi tworzącymi multimery są sekwencje kodujące region zawiasowy łańcucha ciężkiego immunoglobulin (Takahashi i wsp., 1982 Cell 29: 671-679), sekwencje genów immunoglobulin i ich części. Konstrukty kwasów nukleinowych kodujące stanowiących białka fuzyjne antagonistów korzystnych w sposobach według niniejszego wynalazku wprowadza się do wektora ekspresji sposobami znanymi ze stanu techniki, przy czym cząsteczka kwasu nukleinowego jest połączona w sposób umożliwiający działanie z sekwencją kontroli ekspresji. Układy gospodarz-wektor do wytwarzania białek zawierających wektor ekspresji wprowadzany do komórki-gospodarza, korzystnej do ekspresji białka, są znane ze stanu techniki. Korzystną komórką-gospodarzem może być komórka bakterii, na przykład E. coli, komórka drożdży, na przykład Pichia pastoris, komórka owada, na przykład Spodoptera frugiperda, lub komórka ssaka, na przykład komórka COS, CHO, 293, BHK lub NS0. Populacja leczona Ocenia się, że liczba ludzi cierpiących na cukrzycę do roku 2009 osiągnie 300 milionów (Type 2 Diabetes Prediction and Prevention (1999) pod red. G. A. Hitman, John Wiley & Sons); około 80-90% przypadków stanowi cukrzyca typu 2. Retinopatia cukrzycowa jest najczęstszą przyczyną utraty wzroku; do innych powikłań cukrzycy należą choroby nerek, problemy dotyczące stóp i neuropatie. W cukrzycy typu 1, czyli cukrzycy insulinozależnej, dochodzi do zniszczenia wytwarzających insulinę komórek B trzustki, prawdopodobnie wskutek procesów autoimmunologicznych. Korzystnym sposobem leczenia jest terapia substytucyjna insuliną. Ustalono natomiast, że w patogenezie cukrzycy typu 2, czyli cukrzycy nieinsulinozależnej, rolę odgrywa zarówno uszkodzenie komórek B, jak i oporność na insulinę. U pacjentów z cukrzycą typu 2 występują zatem dwojakiego rodzaju zaburzenia: nadmierne wydzielanie insuliny (we wczesnej fazie cukrzycy typu 2) i oporność na insulinę w tkankach docelowych. I tak, w pierwszej fazie cukrzycy typu 2 stężenie glukozy w osoczu jest prawidłowe mimo stwierdzanej oporności na insulinę z
6 podwyższeniem stężenia insuliny. W drugiej fazie oporność na insulinę nasila się, tak że dochodzi do hiperglikemii poposiłkowej mimo podwyższenia stężenia insuliny. W fazie trzeciej, czyli późnej, cukrzycy typu 2, oporność na insulinę nie zmienia się, lecz zmniejszenie wydzielania insuliny powoduje hiperglikemię na czczo i jawną cukrzycę. Do zaburzeń związanych z opornością na insulinę należą: cukrzyca typu 2, angiopatia cukrzycowa, miażdżyca, nefropatia cukrzycowa, neuropatia cukrzycowa i powikłania oczne cukrzycy, takie jak retinopatia, powstawanie zaćmy i jaskry, jak również wywołana przez glukokortykoidy oporność na insulinę, dyslipidemia, zespół jajników wielotorbielowatych, otyłość, hiperglikemia, hiperlipidemia, hipercholesterolemia, hipertrójglicerydemia, hiperinsulinemia i nadciśnienie tętnicze. Zgodnie z powyższym, do populacji, która ma być leczona sposobem według niniejszego wynalazku, należą osoby (osobniki) cierpiące na cukrzycę typu 2, osoby (osobniki) cierpiące na oporność na insulinę i osoby (osobniki) narażone na ryzyko pogorszenia cukrzycy typu 2 lub oporności na insulinę. Ponadto, do leczenia sposobem według niniejszego wynalazku może kwalifikować się osoba (osobnik), u której występuje jeden lub więcej niż jeden objaw cukrzycy typu 2. Rozpoznanie istnienia u pacjenta cukrzycy typu 2 lub ryzyka powstania cukrzycy typu 2 stawia, korzystnie, wykwalifikowany lekarz klinicysta. Sposoby rozpoznawania cukrzycy typu 2 opisano na przykład w publikacji US 5,719,022, którą włącza się do niniejszego opisu przez przywołanie. Podawanie W korzystnym aspekcie, antagonista według niniejszego wynalazku jest w zasadzie oczyszczony (na przykład, w zasadzie wolny od substancji ograniczających jego efekt lub powodujących działania niepożądane). Osobnikiem jest, korzystnie, zwierzę, na przykład krowa, świnia, koń, kura, kot, pies itp.; korzystnie, jest to ssak, najkorzystniej, człowiek. Znane są różne układy podawania, które można stosować do podawania środka według niniejszego wynalazku, takie jak zamykanie w liposomach, mikrocząstki, mikrokapsułki, rekombinowane komórki zdolne do ekspresji związku, endocytoza regulowana przez receptor (zob. na przykład Wu i Wu, 1987, J. Biol. Chem. 262: 4429-4432), konstruowanie kwasu nukleinowego jako części wektora retrowirusowego lub innego itp. Antagonistów według niniejszego wynalazku można wprowadzać drogą jelitową lub pozajelitową. Do dróg podawania należą, lecz bez ograniczenia, droga śródskórna, domięśniowa, dootrzewnowa, dożylna, podskórna, do-
7 nosowa i doustna. Ze związków można wytwarzać preparaty do podawania dowolną korzystną drogą, na przykład we wlewie lub wstrzyknięciu w postaci bolusu, przez wchłanianie przez nabłonek lub wyściółkę śluzówkowo-skórną (na przykład przez śluzówkę jamy ustnej, odbytnicy lub jelita itp.) i można je podawać wraz z innymi środkami biologicznie czynnymi. Podawanie może być ogólne lub miejscowe. Podawanie może być doraźne lub przewlekłe (na przykład codzienne, cotygodniowe, comiesięczne itp.) lub w połączeniu z innymi środkami. W innym wykonaniu, ze środka czynnego można wytwarzać kompozycję w pęcherzyku, korzystnie, w liposomie (zob. Langer (1990) Science 249: 1527-1533). W jeszcze innym wykonaniu, ze środka czynnego można wytwarzać kompozycję w układzie do kontrolowanego uwalniania. W jednym z wykonań można stosować pompę (zob. Langer (1990) jw.). W innym wykonaniu można stosować materiały polimerowe (zob. Howard i wsp. (1989) J. Neurosurg. 71: 105). Terapie złożone W wielu wykonaniach, stanowiących białka fuzyjne, swoistych wobec VEGF antagonistów według niniejszego wynalazku można podawać w połączeniu z jednym lub więcej niż jednym związkiem lub lekiem. Terapia złożona obejmuje podawanie jednego preparatu farmaceutycznego, zawierającego stanowiącego białko fuzyjne, swoistego wobec VEGF antagonistę i jeden lub więcej niż jeden dodatkowy środek obniżający stężenie glukozy lub powodujący zmniejszenie masy ciała, jak również podawanie stanowiącego białko fuzyjne, swoistego wobec VEGF antagonisty i jednego lub więcej niż jednego dodatkowego środka obniżającego stężenie glukozy lub powodującego zmniejszenie masy ciała w oddzielnych preparatach farmaceutycznych. Na przykład, stanowiącego białko fuzyjne, swoistego wobec VEGF antagonistę i środek obniżający stężenie glukozy można podawać pacjentowi razem, w jednej doustnej kompozycji, takiej jak tabletka lub kapsułka, lub można podawać każdy środek w oddzielnej kompozycji doustnej. Gdy stosuje się oddzielne preparaty, swoiste wobec VEGF białko fuzyjne według niniejszego wynalazku i jeden lub więcej niż jeden dodatkowy środek obniżający stężenie glukozy można podawać w zasadzie w tym samym czasie, to znaczy jednocześnie, lub rozdzielnie, to znaczy kolejno. Przykładem takiego środka powodującego zmniejszenie masy ciała jest Axokine (Regeneron). Przykładami takiego środka obniżającego stężenie glukozy są: insulina, biguanidy, takie jak metformina Glucophage (BMS) i buformina, pochodne
8 sulfonylomocznika, takie jak acetoheksamid, Diabinese (Pfizer), Amaryl (Aventis), Glynase Pres Tabs (Pharmacia), Glucotrol XL (Roering Pfizer), tolazamid, tolbutamid, DiaBeta (Hoechst), Glucotrol (Pfizer) i gliklazyd, tiazolidynodiony, takie jak Rezulin (Park Davis), Actos (Takeda) i Avandia (GSK), inhibitory α- glukozydazy, takie jak Precose (Bayer) i Glyset (Bayer), meglitynid na przykład Prandin (Novo Nordisk), środki podwyższające stężenie glukozy, takie jak Glucagon (Lilly) i agoniści receptorów β 3 -adrenergicznych, tacy jak CL-316,243. Kompozycje farmaceutyczne Kompozycje farmaceutyczne korzystne według niniejszego wynalazku zawierają terapeutycznie skuteczną ilość środka czynnego i farmaceutycznie dopuszczalny nośnik. Termin farmaceutycznie dopuszczalny oznacza zaakceptowany przez urząd ds. rejestracji leków (federalny lub stanowy) lub wymieniony w Farmakopei Stanów Zjednoczonych lub innej powszechnie uznawanej farmakopei jako nadający się do stosowania u zwierząt, bardziej szczegółowo, u człowieka. Termin nośnik oznacza rozcieńczalnik, adiuwant lub zaróbkę, z którą podawany jest środek leczniczy. Takie nośniki farmaceutyczne mogą być jałowymi cieczami, takimi jak woda i oleje, w tym oleje pochodzące z ropy naftowej, od zwierząt, z roślin lub wytworzone syntetycznie, na przykład olej arachidowy, sojowy, mineralny, sezamowy i tym podobne. Do korzystnych zaróbek farmaceutycznych należą skrobia, glukoza, laktoza, sacharoza, żelatyna, słód, ryż, mąka, kreda, żel krzemionkowy, stearynian sodowy, monostearynian glicerolu, talk, chlorek sodu, odtłuszczone mleko w proszku, glicerol, propylen, glikol, woda, etanol i tym podobne. Kompozycja, jeżeli jest to korzystne, może również zawierać niewielkie ilości środków zwilżających lub emulgujących lub środków buforujących ph. Kompozycje można wytwarzać w postaci roztworów, zawiesin, emulsji, tabletek, pigułek, kapsułek, proszków, preparatów o przedłużonym uwalnianiu itp. Kompozycje można wytwarzać w postaci czopków, z tradycyjnymi środkami wiążącymi i nośnikami, takimi jak trójglicerydy. Preparaty do podawania doustnego mogą zawierać standardowe nośniki, takie jak mannit, laktoza, skrobia, stearynian magnezu, sól sodowa sacharyny, celuloza, węglan magnezu itp. czystości farmaceutycznej. Przykłady korzystnych nośników farmaceutycznych opisano w Remington's Pharmaceutical Sciences" E. W. Martin. W korzystnym wykonaniu, kompozycję wytwarza się rutynowymi sposobami jako kompozycję farmaceutyczną dostosowaną do podawania dożylnego, podskórnego
9 lub domięśniowego człowiekowi. Jeżeli jest to konieczne, kompozycja może również zawierać środek zwiększający rozpuszczalność i środek miejscowo znieczulający, taki jak lidokaina, do złagodzenia bólu w miejscu wstrzyknięcia. Jeżeli kompozycja ma być podawana we wlewie, można ją umieszczać w butelce do wlewów, zawierającej jałową wodę lub sól fizjologiczną czystości farmaceutycznej. Jeżeli kompozycja ma być podawana we wstrzyknięciu, można zapewnić ampułkę jałowej wody do wstrzyknięć lub soli fizjologicznej, tak aby można było zmieszać składniki przed podaniem. Z antagonistów VEGF według niniejszego wynalazku można wytwarzać postacie obojętne lub postacie soli. Do farmaceutycznie dopuszczalnych soli należą sole utworzone z wolnymi grupami aminowymi, takie jak pochodne kwasu solnego, fosforowego, octowego, szczawiowego, winowego itp., i sole wytworzone z wolnymi grupami karboksylowymi, takie jak pochodne sodu, potasu, amonu, wapnia, wodorotlenków żelaza, izopropyloaminy, trietyloaminy, 2-etylaminoetanolu, histydyny, prokainy itd. Ilość antagonisty VEGF według niniejszego wynalazku, która będzie skuteczna w leczeniu cukrzycy, można określić standardowymi technikami klinicznymi, opartymi na niniejszym opisie. Ponadto można ewentualnie zastosować testy in vitro w celu ułatwienia ustalenia optymalnego zakresu dawkowania. Dokładna dawka preparatu, którą należy zastosować, będzie także zależeć od drogi podawania i nasilenia choroby. Decyzję w tej sprawie powinien podjąć lekarz praktyk na podstawie własnej oceny, zależnej od sytuacji danego pacjenta. Korzystny zakres dawkowania przy podawaniu dożylnym wynosi jednak zwykle około 50-5000 mikrogramów związku czynnego na kilogram masy ciała. Korzystny zakres dawkowania przy podawaniu donosowym wynosi zwykle od około 0,01 pg/kg masy ciała do około 1 mg/kg masy ciała. Dawki skuteczne można ekstrapolować z krzywych zależności odpowiedzi od dawki, pochodzących z systemów z badań in vitro lub na modelach zwierzęcych. Dawkę terapeutycznie skuteczną do podawania ogólnego można wstępnie oszacować na podstawie testów in vitro. Na przykład, można określić dawkę w modelach zwierzęcych tak, aby uzyskać zakres stężenia w krążeniu obejmujący IC 50 oznaczony w hodowli komórkowej. Takie informacje można wykorzystać do dokładniejszego ustalenia dawek skutecznych u człowieka. Dawkowanie początkowe można również oszacować na podstawie danych in vivo, na przykład pochodzących z modeli zwierzęcych, sposobami dobrze znanymi ze stanu techniki. Specjalista może łat-
10 wo ustalić optymalne podawanie środków u człowieka na podstawie danych z modeli zwierzęcych. Podawaną dawkę i odstęp między kolejnymi dawkami można indywidualnie modyfikować tak, żeby uzyskać poziom związków w osoczu wystarczający do podtrzymania efektu terapeutycznego. Specjalista będzie w stanie bez zbędnych doświadczeń ustalić optymalne, terapeutycznie skuteczne dawkowanie przy podawaniu miejscowym. Ilość podawanego związku będzie oczywiście zależeć od leczonego pacjenta, masy ciała pacjenta, ciężkości choroby, sposobu podawania i oceny lekarza. Terapię można okresowo powtarzać, gdy objawy są wykrywalne lub nawet wtedy, gdy są niewykrywalne. Terapię można stosować jako jedyny lek (leki) lub w połączeniu z innymi lekami. Inne cechy niniejszego wynalazku uwidocznią się w miarę zapoznawania się z poniższym opisem przykładowych wykonań, które podano celem ilustracji niniejszego wynalazku i które nie mają na celu jego ograniczenia. Przykłady Poniższe przykłady przedstawiono po to, żeby dostarczyć specjaliście pełnego ujawnienia i opisu metody przeprowadzania i wykorzystywania sposobów i kompozycji według niniejszego wynalazku; nie mają one na celu ograniczenia zakresu tego, co autorzy uważają za swój wynalazek. Dołożono starań celem zapewnienia dokładności co do użytych wartości (na przykład ilości, temperatury itd.), lecz należy się liczyć z pewnymi błędami doświadczalnymi i odchyleniami. Jeżeli nie wskazano inaczej, części są częściami wagowymi, masa cząsteczkowa jest średnią masą cząsteczkową, temperaturę podano w stopniach Celsjusza, a ciśnienie jest ciśnieniem atmosferycznym lub zbliżonym do atmosferycznego. Przykład 1: Efekt leczenia VEGFR1R2-Fc C1(a) myszy z cukrzycą (db/db) Myszy z cukrzycą (db/db) w wieku 8-10 tygodni aklimatyzowano przez 1 tydzień, po czym rozpoczęto leczenie. Grupy myszy db/db (n=6) przydzielono losowo do grup terapeutycznych według masy ciała i leczono podawaniem wstrzyknięć s.c. jeden raz w tygodniu przez 4 tygodnie jedną z następujących kompozycji: nośnik; białko Fc C1 (Fc) lub 25, 12,5 lub 2,5 mg/kg VEGFR1R2-Fc C1(a). Dodatkowo, dwie grupy myszy bez cukrzycy (db/?) leczono podawaniem wstrzyknięć s.c. w następujący
11 sposób: 25 mg/kg VEGFR1R2-Fc C1(a) i nośnika (nośnik cukrzycowy). Przez 4 tygodnie leczenia, co tydzień, o tej samej porze, bezpośrednio przed następnym wstrzyknięciem, oznaczano stężenie glukozy we krwi. W tym momencie u wszystkich grup wykonywano test doustnej tolerancji glukozy. Leczenie zwierząt prowadzono przez kolejne 4 tygodnie (w sumie przez 8 tygodni) w opisanym powyżej schemacie. Po 8 tygodniach leczenia oznaczano stężenie glukozy we krwi. Wyniki po 4 tygodniach leczenia. Na początku doświadczenia u wszystkich zwierząt z cukrzycą (db/db) rozwinęła się hiperglikemia, czego dowodzi podwyższenie stężenia glukozy we krwi (grupy myszy z cukrzycą w momencie rozpoczynania doświadczenia - Fig. 1A, czas 0). Zwierzęta leczone 25, 12,5 i 2,5 mg/kg VEGFR1R2- Fc C1(a) wykazały znamienne i postępujące obniżanie się stężenia glukozy w surowicy w ciągu 8 tygodni leczenia. Zwierzęta leczone 25, 12,5 i 2,5 mg/kg VEGFR1R2- Fc C1(a) nie wykazały znamiennego zmniejszenia masy ciała w porównaniu z myszami otrzymującymi zaróbkę lub myszami z grupy kontrolnej, otrzymującymi Fc C1, w ciągu pierwszych 4 tygodni leczenia (wielokrotne pomiary ANOVA, brak znamienności, zob. Fig. 1B). Wyniki po 8 tygodniach leczenia. Wszystkie zwierzęta z cukrzycą (db/db) nadal wykazywały hiperglikemię, czego dowodzi podwyższony poziom glukozy we krwi (grupy myszy z cukrzycą w momencie rozpoczynania doświadczenia - Fig. 2 po 8 tygodniach). Zwierzęta leczone 25, 12,5 i 2,5 mg/kg VEGFR1R2-Fc C1(a) wykazywały znamienne zmniejszenie stężenia glukozy we krwi nie na czczo po 8 tygodniach leczenia (wielokrotne pomiary ANOVA, d.f. 4,25, F grupa =6,36, p=0,001, F czas =38,5, p<0,0001; F interakcja =1,8, p=0,04 ; zob. Fig. 1A). Przykład 2: Wpływ VEGFR1R2-Fc C1(a) na doustną tolerancję glukozy u myszy z cukrzycą Myszy z cukrzycą (db/db) i bez cukrzycy (db/?), w wieku 8-10 tygodni, leczono w sposób opisany powyżej. Oceniano zdolność do eliminacji bolusu glukozy, podanego do żołądka przez sondę, po 4 wstrzyknięciach (tydzień 5) i po 8 wstrzyknięciach (w tygodniu 9). W celu przeprowadzenia tej oceny, myszy pozbawiano jedzenia na czas około 18 godzin i po podaniu glukozy przez sondę oznaczano poziom glukozy we krwi po 0, 30, 60 i 120 min.
12 Wyniki po 4 tygodniach leczenia. U otrzymujących zaróbkę i białko Fc C1 myszy z cukrzycą (db/db) zdolność do eliminacji glukozy była zmniejszona w porównaniu do myszy z grupy kontrolnej, bez otyłości i bez cukrzycy (db/?) (Fig. 3). Po 4 wstrzyknięciach (w tygodniu 5) zwierzęta leczone 25, 12,5 i 2,5 mg/kg VEGFR1R2- Fc C1(a) wykazywały znamienną poprawę zdolności do eliminowania podanej glukozy. Wyniki te dowodzą, że zahamowanie VEGF poprawia tolerancję glukozy u ssaków z cukrzycą. Przeciwnie, myszy z cukrzycą (db/db), otrzymujące zaróbkę i białko Fc C1, nie wykazują poprawy w zakresie zdolności do eliminowania glukozy ani tolerancji glukozy (Fig. 3). Wyniki po 8 tygodniach leczenia. U otrzymujących zaróbkę i białko Fc C1 myszy z cukrzycą (db/db) zdolność do eliminacji glukozy była nadal zmniejszona w porównaniu do myszy z grupy kontrolnej, bez otyłości i bez cukrzycy (db/?) (Fig. 4). Po 8 wstrzyknięciach (w tygodniu 9) zwierzęta leczone 25, 12,5 i 2,5 mg/kg VEGFR1R2- Fc C1(a) wykazywały znamienną poprawę zdolności do eliminowania podanej glukozy. Wyniki te dowodzą, że zahamowanie VEGF poprawia tolerancję glukozy u ssaków z cukrzycą. Przeciwnie, myszy z cukrzycą (db/db), otrzymujące zaróbkę i białko Fc C1, nie wykazują poprawy w zakresie zdolności do eliminowania glukozy ani tolerancji glukozy (Fig. 4). Przykład 3. Wpływ leczenia VEGFR1R2-Fc C1(a) na poziom glukozy i insuliny w surowicy na czczo u myszy z cukrzycą (db/db) Myszy z cukrzycą (db/db) aklimatyzowano przez 1 tydzień i rozpoczęto leczenie opisane powyżej. Po 8 wstrzyknięciach (w tygodniu 9) oznaczano poziom glukozy i insuliny we krwi na czczo (Fig. 5B). U otrzymujących zaróbkę i białko Fc C1 myszy z cukrzycą (db/db) poziom glukozy we krwi na czczo był podwyższony w porównaniu do myszy z grupy kontrolnej, bez otyłości i bez cukrzycy (db/?) (Fig.5A). Zwierzęta leczone VEGFR1R2- Fc C1(a) wykazywały znamienne obniżenie poziomu glukozy we krwi na czczo w porównaniu z myszami z grupy kontrolnej z cukrzycą (zaróbka lub Fc C1; Fig 5 A) i znamienne obniżenie stężenia insuliny. Dowodzi to, że zahamowanie VEGF powoduje u ssaka z cukrzycą nie tylko poprawę hiperglikemii, lecz również poprawę wrażliwości na insulinę. SEQ nr 1
13 Met Val Ser Tyr Trp Asp Thr Gly Val Leu Leu Cys Ala Leu Leu Ser Cys Leu Leu Leu Thr Gly Ser Ser Ser Gly Ser Asp Thr Gly Arg Pro Phe Val Glu Met Tyr Ser Glu Ile Pro Glu Ile Ile His Met Thr Glu Gly Arg Glu Leu Val Ile Pro Cys Arg Val Thr Ser Pro Asn Ile Thr Val Thr Leu Lys Lys Phe Pro Leu Asp Thr Leu Ile Pro Asp Gly Lys Arg Ile Ile Trp Asp Ser Arg Lys Gly Phe Ile Ile Ser Asn Ala Thr Tyr Lys Glu Ile Gly Leu Leu Thr Cys Glu Ala Thr Val Asn Gly His Leu Tyr Lys Thr Asn Tyr Leu Thr His Arg Gln Thr Asn Thr Ile Ile Asp Val Val Leu Ser Pro Ser His Gly Ile Glu Leu Ser Val Gly Glu Lys Leu Val Leu Asn Cys Thr Ala Arg Thr Glu Leu Asn Val Gly Ile Asp Phe Asn Trp Glu Tyr Pro Ser Ser Lys His Gln His Lys Lys Leu Val Asn Arg Asp Leu Lys Thr Gln Ser Gly Ser Glu Met Lys Lys Phe Leu Ser Thr Leu Thr Ile Asp Gly Val Thr Arg Ser Asp Gln Gly Leu Tyr Thr Cys Ala Ala Ser Ser Gly Leu Met Thr Lys Lys Asn Ser Thr Phe Val Arg Val His Glu Lys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys Zastrzeżenia patentowe
14 1. Zastosowanie antagonisty VEGF VEGFR1R2-Fc C1(a) (SEQ nr 1) do wytwarzania leku do leczenia cukrzycy u ssaka. 2. Zastosowanie według zastrz. 1, znamienne tym, że cukrzycą jest cukrzyca nieinsulinozależna. 3. Zastosowanie według zastrz. 1, znamienne tym, że leczenie cukrzycy u ssaka polega na hamowaniu rozwoju lub progresji cukrzycy typu 2 u człowieka cierpiącego na cukrzycę lub narażonego na ryzyko rozwoju cukrzycy typu 2. 4. Zastosowanie według dowolnego z zastrz. 1-3, znamienne tym, że leczenie cukrzycy powoduje jeden lub więcej niż jeden z następujących skutków: zmniejszenie stężenia glukozy w surowicy, poprawę tolerancji glukozy, zwiększenie wrażliwości na insulinę, zmniejszenie hiperinsulinemii i poprawę kontroli glikemii. 5. Zastosowanie według zastrz. 1 do wytwarzania leku do poprawy tolerancji glukozy lub wrażliwości na insulinę u człowieka wymagającego takiego postępowania. 6. Zastosowanie według dowolnego z poprzednich zastrz., znamienne tym, że ssakiem jest człowiek cierpiący na cukrzycę. 7. Zastosowanie według dowolnego z poprzednich zastrz., znamienne tym, że lek zawiera ponadto środek obniżający stężenie glukozy we krwi lub środek powodujący zmniejszenie masy ciała. 8. Zastosowanie według dowolnego z poprzednich zastrz., znamienne tym, że lek przeznaczony jest do podawania drogą podskórną, domięśniową, śródskórną, dootrzewnową, dożylną, donosową lub doustną. Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Zastępca:
15
16
17
18
19
20
21