Narzędzia ułatwiające identyfikację właściwych genów GLIMMER TaxPlot Narzędzia ułatwiające amplifikację tych genów techniki PCR Primer3, Primer3plus PrimerBLAST Reverse Complement Narzędzia ułatwiające weryfikację produktów: NEBcutter 2 Glimmer umożliwia znalezienie regionów kodujących 3 1
Glimmer = Gene Locator and Interpolated Markov Modeler System do znajdowania genów w DNA mikroorganizmów szczególnie genomów bakterii, archeowców i wirusów Stosowanie tego programu obejmuje 2 etapy: [1] Trening algorytmu na genomie konkretnego organizmu (możliwie najbliżej spokrewnionego z gospodarzem, z którego pochodzi identyfikowane DNA). Na tym etapie program identyfikuje ORFs na zestawie treningowym, czasem wykonuje też dopasowania z bazami danych i na podstawie wyników modyfikuje model. [2] Uruchomienie nauczonego (udoskonalonego) algorytmu na nieznanej sekwencji. 4 Glimmer jest dostępny z @NCBI http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genomes/microbes/glimmer_3.cgi 5 2
Wyniki Glimmer ORFs 6 TaxPlot http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sutils/taxik2.cgi Three-way view of genome similarities narzędzie do porównywania 3 genomów na podstawie sekwencji białkowych, które one kodują. Aby użyć TaxPlot, należy najpierw wybrać genom zapytania, a następnie wybrać kolejne dwa genomy do których będzie porównywany. Wstępnie wyliczone wyniki BLAST są następnie wykorzystywane do wykreślenia wykresu, na którym punkty oznaczają każde przewidywane białko w genomie odniesienia, w oparciu o najlepsze dopasowanie z białkami w każdym z dwóch porównywanych genomów. 7 3
TaxPlot http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sutils/taxik2.cgi 8 TaxPlot interpretacja wyników 9 4
TaxPlot 10 TaxPlot wyniki Numer dostępowy, opis i przekierowanie do BLASTp i NCBI Protein: - BLAST link 11 5
Przydatne linki z rekordów sekwencyjnych 12 łańcuchowa reakcja polimerazy (polymerase chain reaction) W połowie lat 80 opracowano technikę, służącą do amplifikacji dowolnej sekwencji DNA z użyciem pary oligonukleotydowych starterów oraz termostabilnej polimerazy DNA. PCR przeprowadza się całkowicie in vitro, bez wykorzystania komórek. 13 6
Matryca DNA lub RNA Startery Bufor Substraty - dntp Jony Mg 2+ Termostabilna polimeraza DNA 14 PCR reakcja łańcuchowa polimerazy matryca denaturacja hybrydyzacja wydłużanie Forward primer = lewy starter Backward (reverse) primer = prawy starter 15 7
PCR przebieg każdego cyklu denaturacja wydłużanie hybrydyzacja 16 Denaturacja DNA pod wpływem temperatury Tm temperatura topnienia, to temperatura w której połowa cząsteczek DNA jest w formie jednoniciowej (rozdysocjowanej) Tm jest parametrem definiującym termiczną stabilność DNA 17 8
PCR i Tm Obydwa startery powinny hybrydyzować w podobnej temp ( Tm < 5 C) w temp < Tm starterów 18 Zasady projektowania starterów 1. Długość startera: typowo 18-22 nt (im dłuższe tym bardziej specyficzne) 2. Specyficzne = komplementarne tylko do 1 matrycy w danym organizmie 3. Długość amplikonu (produktu): zależy od celu eksperymentu 4. Temperatura topnienia (mięknięcia) starterów, zwykle T m = 52-58 C dają najlepsze wyniki, ale ten zakres może być dużo szerszy 5. Zawartość GC: najlepiej 40-60%, związany z Tm 6. Tm pary starterów: różnice w Tm starterów większa niż 5 C może prowadzić do problemów z amplifikacją 7. Temperatura hybrydyzacji (annealing) podczas PCR zwykle jest ustawiana o kilka stopni poniżej Tm starterów: T H = T m - 2 C 19 9
Rodzaje reakcji PCR: RT-PCR (Reverse Transcriptase) modyfikacja polegająca na użyciu mrna jako matrycy. Synteza DNA na matrycy mrna odbywa się przy użyciu odwrotnej transkryptazy (RT). Następnie DNA namnaża się za pomocą zwykłej reakcji PCR. Metoda ta pozwala na amplifikację wyłącznie sekwencji zawartej w dojrzałym mrna, a więc tylko egzonów. Powstały DNA określany jest jako cdna komplementarny DNA. Real time PCR do środowiska reakcji wprowadzane są znakowane (np. barwnikami fluorescencyjnymi) nukleotydy bądź sondy łączące się z DNA, które pozwalają na podstawie odczytów w kolejnych cyklach określić ilość matrycy użytej do reakcji, jak również śledzić ilość powstającego produktu. nested-pcr stosowany gdy dysponuje się niewielką ilością matryc DNA. Jego istotą jest synteza kilku długich fragmentów zawierających interesujący nas fragment na początku reakcji (dzięki czemu powielamy nasz materiał badawczy), a dopiero w następnym kroku dodajemy startery okalające nasz badany odcinek. 20 Rodzaje reakcji PCR: RAPD-PCR (Losowa Amplifikacja Polimorficznego DNA) metoda polega na użyciu jednego, krótkiego, losowego startera. Po zakończeniu reakcji i analizie elektroforetycznej otrzymuje się różnej długości prążki będące cechą charakterystyczną danego osobnika (fingerprinting REP-PCR (Repetitive sequence based PCR) jest to PCR z wykorzystaniem sekwencji repetytywnych. Metoda polega na wykorzystaniu w reakcji PCR starterów komplementarnych do sekwencji repetytywnych występujących w genomie. Produkty reakcji rozdzielane są na drodze elektroforezy w żelu agarozowym, tworząc swoisty wzór prążków, charakterystyczny dla danego szczepu bakterii. PCR-RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism) metoda wykorzystująca enzymy restrykcyjne w celu identyfikacji mutacji w obrębie miejsc cięcia danego enzymu. Pozwala też na wykrycie mutacji prowadzących do powstania nowych miejsc cięcia. 21 10
Multiplex PCR Pozwala na amplifikację różnych genów w jednej reakcji PCR Używamy różnych par starterów Zastosowanie: Identyfikacja patogenów Analiza mutacji Analiza delecji Detekcja RNA Genotypowanie SNP 22 23 11
Darmowe narzędzia do projektowania starterów: Primer3 http://frodo.wi.mit.edu/primer3/ Primer3plus http://www.bioinformatics.nl/cgibin/primer3plus/primer3plus.cgi primerblast http://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/ 24 Primer3 http://primer3.sourceforge.net/ 25 12
26 27 13
28 29 14
30 31 15
PrimerBLAST http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/blast.cgi 32 PrimerBLAST http://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/ 33 16
Jeżeli jako matrycę poda się numer dostępowy do baz NCBI organizm jest rozpoznawany automatycznie, w pozostałych przypadkach warto podać organizm źródłowy, aby ograniczyć poszukiwania. 34 Wskazówki: * Primer-BLAST was developed at NCBI to help users make primers that are specific to the input PCR template. It uses Primer3 to design PCR primers and then submits them to BLAST search against userselected database. The blast results are then automatically analyzed to avoid primer pairs (all combinations including forward-reverse primer pair, forward-forward as well as reverse-reverse pairs) that can cause amplification of targets other than the input template. 35 17
36 37 18
Reverse Complement http://www.bioinformatics.org/ sms/rev_comp.html 38 Enzymy restrykcyjne: NEBcutter NEB cutter bardzo przydatne narzędzie dostępne online tool do znajdowania miejsc restrykcyjnych, zawiera także zbiór sekwencji standardowych (np. popularnych wektorów jak puc19). 39 19
40 41 20