PL 213858 B1 RZECZPOSPOLITA POLSKA (12) OPIS PATENTOWY (19) PL (11) 213858 (13) B1 Urząd Patentowy Rzeczypospolitej Polskiej (21) Numer zgłoszenia: 383363 (22) Data zgłoszenia: 16.09.2007 (51) Int.Cl. G01N 33/569 (2006.01) G01N 33/577 (2006.01) G01N 33/60 (2006.01) C12N 1/20 (2006.01) C12Q 1/04 (2006.01) C12Q 1/16 (2006.01) (54) Sposób wykrywania obecności bakterii Clavibacter michiganensis ssp sepedonicus, w analizowanej próbce (43) Zgłoszenie ogłoszono: 30.03.2009 BUP 07/09 (73) Uprawniony z patentu: INSTYTUT HODOWLI I AKLIMATYZACJI ROŚLIN PAŃSTWOWY INSTYTUT BADAWCZY, Radzików, PL (45) O udzieleniu patentu ogłoszono: 31.05.2013 WUP 05/13 (72) Twórca(y) wynalazku: WŁODZIMIERZ PRZEWODOWSKI, Skorzewo, PL (74) Pełnomocnik: rzecz. pat. Andrzej Witek
2 PL 213 858 B1 Opis wynalazku Przedmiotem wynalazku jest sposób wykrywania obecności bakterii Clavibacter michiganensis ssp. sepedonicus, w analizowanej próbce mający zastosowanie w przemyśle spożywczym lub rolnictwie. Bakteria Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus (Spickermann et Kotthoff) Davis et al. (Cms) - sprawca bakteriozy pierścieniowej ziemniaka, jest jednym z najważniejszych patogenów ziemniaka (Lee i in. 1997, OEPP/EPPO 2006). Synonimy nazwy patogena to: Clavibacter michiganensis ssp. sepedonicus (Spieckermann et Kotthof) Carlson et Vidaver, Corynebacterium michiganensis ssp. sepedonicus (Spieckermann et Kotthof) Dye et Kemp oraz Corynebacterium sepedonicus (Spieckermann et Kotthof) Skaptason et Burkholder (OEPP/EPPO, 2006). Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus to gramdodatnie bakterie stanowiące formy pałeczkowate oraz kuliste (OEPP/EPPO, 2006), które wspólnie z rodzajem Rathayibacter tworzą grupę fitopatogenicznych corynebakterii o wspólnym pochodzeniu filogenetycznym (Lee i in. 1997). Kolonie większości szczepów hodowanych na pożywkach agarowych są mukoidalne, jakkolwiek zdarzają się również szczepy pośrednie i niemukolidalne (Bishop i in. 1988, Baer i Gudmestadt 1993). Do poznanych dotychczas czynników wirulencji Cms należą: a) Śluzy bakteryjne o kwaśnym charakterze i wielkości 1-10 MDa (Jahr i in. 1999) charakterystyczne są również dla innych podgatunków z gatunku C. michiganensis. Składają się one z kilku (I-III) komponentów cukrowych o podobnym składzie chemicznym, zróżnicowanych pod względem stopnia aglomeracji (Westra i Slack 1992). Występowanie IV komponentu składającego się głównie z mannozy jest charakterystyczne tylko dla bakterii Cms (Denny 1995). Śluzy bakteryjne z jednej strony zabezpieczają komórki bakteryjne przed utratą wilgoci, natomiast z drugiej poprzez fizyczną okluzję na ściankach wiązek przewodzących są przyczyną zahamowania transpiracji i więdnięcia roślin (Jahr i in. 1999). Skład chemiczny śluzów bakteryjnych oraz ich obecność jest istotna w diagnostyce bakterii Cms opartej na testach serologicznych, w których składniki śluzu wykorzystuje się zazwyczaj jako antygeny. Prawidłowa ocena patogena na podstawie śluzów bakteryjnych jest zależna nie tylko od uwarunkowań genetycznych, lecz również od zmienności w chemicznym charakterze i ilości śluzów produkowanych przez poszczególne szczepy bakterii Cms (Bishop i Slack 1987, Baer i Gudmestadt 1993). b) Celulaza wytwarzana przez większość przebadanych szczepów Cms (Baer i Gudmestad 1993) bierze udział w degradacji tkanek wiązki naczyniowej powodując rozwarstwianie się części zewnętrznej bulwy od rdzenia (Jahr i in. 1999, Nissinen i in. 2001). Laine i współpracownicy (2000) wykazali, że celulaza kodowana jest przez gen w natywnym plazmidzie pcs1 bakterii Cms (Laine i in. 2000). c) Toksyczny glikoproteid wyizolowany przez Strobela (1970), poprzez wysokie powinowactwo w stosunku do fragmentów ścian i membran komórek gospodarza, prawdopodobnie powoduje zaburzenia w przepuszczalności tych drugich (Romanenko i in. 1997). Dotychczas nie zdołano opracować skutecznej metody bezpośredniego chemicznego lub biologicznego zwalczania patogena. Dezynfekcja powierzchni bulw nie spełnia swego zadania wskutek przebywania bakterii w wiązkach naczyniowych, do których nie mają dostępu środki dezynfekujące. Jednym z najbardziej skutecznych sposobów ograniczenia, czy też eliminacji sprawcy bakteriozy pierścieniowej ziemniaka, jest jego wczesne wykrycie. Detekcja potrzebna jest zarówno w proc e- sie produkcji, obróbki, jak i dystrybucji materiału roślinnego. Stąd właściwe metody detekcji powinny być odpowiednio czułe i specyficzne, jak również proste, szybkie, wiarygodne i powtarzalne (Wal e- ron i in. 2003). Zgodnie z przyjętymi wymogami fitosanitarnymi, prawidłowa diagnostyka sprawcy bakteriozy pierścieniowej ziemniaka wymaga stosowania przynajmniej dwóch testów laboratoryjnych opartych na różnych zasadach biologicznych łącznie z testem patogeniczności (OEPP/EPPO, 2006). W zależności od ekspresji objawów bakteriozy pierścieniowej ziemniaka stosuje się odpowiednie schematy postępowania zawierające testy fizjologiczne, biochemiczne, serologiczne, molekularne i inne (Dyrektywa Komisji WE 2006/56). Testy fizjologiczne i biochemiczne stosowane do rutynowej kontroli, pozwalają określić właściwości fenotypowe Cms. Zgodnie z najnowszą Dyrektywą Komisji WE, testy te muszą być przeprowadzane przy użyciu izolatów bakterii uzyskanych w procesie pasażowania na agarze odżywczym z glukozą. Natomiast porównania morfologiczne muszą być przeprowadzane na kulturach uzyskanych
PL 213 858 B1 3 po wzroście na agarze odżywczym z glukozą w obecności znanej kontroli Cms (Dyrektywa Komisji WE 2006/56). W przypadku roślin wykazujących wyraźne symptomy choroby stosuje się izolację bakterii na pożywkach półselektywnych NCP-88 (De la Cruz i in. 1992) oraz MTNA (Jansing i Rudolph 1998), natomiast do rutynowych hodowli czystych kultur bakterii Cms wykorzystuje się ogólne podłoża wzrostowe, jak agar odżywczy (NA), agar odżywczy z glukozą (NDA). agar drożdżowo-peptonowo-glukozowy (YPGA) oraz pożywkę mineralną z glukozą i wyciągiem drożdżowym (YGM) (De Boer i Copeman 1980, Dyrektywa Komisji WE 2006/56). Jednym z głównych problemów związanych z detekcją i identyfikacją bakterii Cms jest wolne tempo wzrostu tego patogena. Przy bezpośrednim posiewie ekstraktów na pożywkę uniwersalną, obce bakterie saprofityczne, charakteryzujące się znacznie szybszym tempem wzrostu, porastają całą jej powierzchnię, często uniemożliwiając skuteczną izolację czystych szczepów Cms (OEPP/EPPO, 2006). Izolacja patogena na pożywkach półselektywnych zawierających w swym składzie antybiotyki takie jak: siarczan polimyksyny B, kwas nalidyksylowy i cykloheksymid (NCP-88) oraz trimetoprim, kwas nalidyksylowy i amfoterycynę B (MTNA), pozwala znacznie zmniejszyć ilość obcych bakterii. Najlepsze efekty izolacji na podłożu pólselektywnym można uzyskać po uprzedniej inokulacji roślin oberżyny ekstraktem z komórkami patogena. Rośliny oberżyny są dobrym środowiskiem dla selektywnego namnażania sprawcy bakteriozy pierścieniowej ziemniaka (OEPP/EPPO 2006). Test patogeniczności na młodych siewkach oberżyny inokulowanej trzydniową kulturą testowanego izolatu, stosowany jest jako ostateczny test dla potwierdzenia infekcji latentnej oraz oceny wirulencji kultur zidentyfikowanych jako Cms. Test ten cechuje stosunkowo niska czułość (10 6 CFU/ml) oraz duża czasochłonność - ok. 40 dni. Dla skrócenia czasu testu biologicznego jako roślinę indykatorową stosuje się również tytoń. Wadą tego testu jest niestety mniejsza czułość (10 8-10 9 CFU/ml) (OEPP/EPPO 2006). Jako jedną z metod identyfikacji bakterii Cms przez długi czas stosowano barwienie Gramma wymazów z wydzieliny wiązek naczyniowych z łodygi i bulwy (Glick i in. 1944, Slack 1987). Jednakże jednoznaczna diagnoza tą metodą jest trudna ze względu na możliwość występowania innych gramdodatnich bakterii, jak Clostridium ssp. Bacillus ssp., a także saprofitycznych bakterii z rodzaju Corynebacterium (Crowley i De Boer 1982). W niektórych pracowniach stosowano również aglutynacyjny test lateksowy pozwalający wykryć 10 7 komórek w 1 ml (Slack i in. 1979). Test odwróconej pasywnej hemoaglutynacji (RPH) z krwinkami owcy opłaszczonymi przeciwciałami anty-cms z surowicy królika lub żółtka jaja kury, pozwala na wykrywanie w czasie ok. 90 minut obecności Cms w stężeniu 6x10 6 komórek w 1 ml (Kohm i Eggers- -Schumacher 1995). Wykrywanie sprawcy bakteriozy pierścieniowej ziemniaka metodami serologicznymi nadal stwarza znaczne trudności ze względu na zróżnicowanie morfologiczne form patogena (Mills i Russell 2003). Powszechnie stosowanymi metodami serologicznymi w detekcji Cms są test pośredniej immunofluorescencji - IF (Slack i in. 1979, De Boer i Copeman 1980) oraz test immunoenzymatyczny - ELI- SA (ang. Enzyme Linked Immunosorbent Assay) (Drennan i in. 1993, De Boer i in. 1994, 2005). Jakkolwiek test ELISA niedopuszczony przez EPPO jako test przesiewowy, cieszy się znacznie większym powodzeniem w krajach Ameryki Północnej. Zastosowanie przeciwciał monoklonalnych MAb 9A1 w teście IF zapewnia wysoką specyficzność (De Boer i Wieczorek 1984) i wykrywalność bakterii Cms w granicach 10 4 komórek bakterii w 1 ml ekstraktu z tkanki ziemniaka (Baer i Gudmestad 1993). Często dla zwiększenia czułości metod serologicznych stosuje się również tańsze, ale mniej specyficzne przeciwciała poliklonalne. Niestety wadą takiego rozwiązania są występujące często fałszywie pozytywne wyniki wskutek reakcji krzyżowych z innymi bakteriami (Crowley i De Boer 1982) oraz niewykrywalnie niemukoidalnych szczepów bakterii Cms (Baer i Gudmestad 1993). Zasadniczym wykrywanym antygenem nie są komórki bakterii Cms, lecz rozpuszczalne egzopolisacharydy, których ilość w stosunku do liczby komórek może być zmienna (Lewosz 1997). Obie metody IF i ELISA pozwalają wykrywać bakterie Cms w bulwach i łodygach ziemniaka, przy czym metoda immunofluorescencyjna wykazuje większą czułość i specyficzność dla bulw, natomiast metoda ELISA pozwala z większą czułością wykrywać patogena w łodygach ziemniaka (De Boer i in. 1994). We współczesnej diagnostyce wykorzystuje się tradycyjne, posiadające wiele zalet, dobrze sprawdzone metody detekcji mikroorganizmów. Zwykle są one czasochłonne i wymagają stosowania specjalistycznego sprzętu laboratoryjnego. Wyklucza to przeprowadzenie testu w warunkach polowych, gdzie wymagany jest niemal natychmiastowy wynik pomiaru, a próbka powinna być zanalizo-
4 PL 213 858 B1 wana najlepiej w miejscu jej pobrania (Łoś i Węgrzyn, 2005). Ponieważ jak dotąd najskuteczniejszym sposobem ograniczającym rozprzestrzenianie się patogenów bakteryjnych jest ich wczesne wykrycie, toteż warunki takie muszą być spełniane w coraz to większej liczbie procedur. Istnieje zatem rosnące zapotrzebowanie na szybkie, czułe i bezpośrednie metody detekcji, które będą jednocześnie specyficzne i niedrogie, a które umożliwią bieżącą kontrolę zarówno podczas wzrostu roślin, procesu produkcyjnego, przechowywania, jak i dystrybucji żywności (De Boer i Beumer 1999). Tak więc problemem jest znalezienie sposobu oceny ilościowej bakterii Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus (Cms) metodami szybkich testów takich jak testy filtracyjne. Przedmiotem wynalazku jest sposób wykrywania obecności bakterii Clavibacter michiganensis ssp. sepedonicus, w analizowanej próbce, charakteryzujący się tym, że bakterie zawiesza się w roztworze buforowym, kontaktuje się bakterie ze znakowanym złotem koloidalnym przeciwciałem otrzymanym poprzez prowadzenie immunizacji z wykorzystaniem antygenu bakteryjnego otrzymanego z komórek bakterii pozbawionych śluzu bakteryjnego poprzez przemywanie bakterii roztworem buforowym wybranym spośród roztworu buforowego glicyna - HCl lub roztworu buforowego glicyna - Na- OH, specyficznym wobec antygenu powierzchniowego pochodzącego z wykrywanej bakterii, następnie roztwór odfiltrowuje się na filtrze nie przepuszczającym bakterii, przy czym obecność na filtrze wyznakowanych bakterii świadczy o obecności bakterii w analizowanej próbce. Równie korzystnie sposób według wynalazku charakteryzuje się tym, że filtrami są membrany celulozowe, poliwęglanowe lub inne znane. Korzystniej sposób według wynalazku charakteryzuje się tym, że obecność przeciwciał wyznakowanych złotem koloidalnym wykrywa się poprzez redukcję jonów srebra na złocie koloidalnym. Prezentowany jest sposób znakowania bakterii z wykorzystaniem membran, zwłaszcza poliwęglanowych, posiadających dobre własności fizykochemiczne daje białe tło, na którym wybarwione bakterie są bardzo dobrze widoczne. Barwa wyznakowanych komórek bakteryjnych nie ulega osłabieniu jak to ma miejsce w przypadku stosowania barwników immunofluorescencyjnych, które z czasem tracą intensywność ( płowieją"). Wybarwienie koniugatem złota koloidalnego i następne wysrebrzenie wyznakowanych komórek bakteryjnych pozwala utrwalić ich obraz przez wiele miesięcy. Test pozwala w bardzo szybki i prosty sposób ocenić obecność komórek bakterii Cms wyizolowanych z czystych kultur w kilkunastu próbach jednocześnie. Dodatkowym atutem jest uniwersalność testu, który w zależności od stosowanych przeciwciał można zastosować z powodzeniem również w detekcji innych bakterii. P r z y k ł a d 1. Wykorzystanie komórek Cms pozbawionych śluzu do wytwarzania przeciwciał do testów immunologicznych Sporządzono wodne zawiesiny komórek bakteryjnych posiadanych szczepów bakterii Cms BPR-527, PD 221 oraz PD 406. Zawiesiny trzykrotne przemywano sterylną 2 x dest. H 2 O i wirowano 15-25 min 7000 x g na wirówce Beckman J-21. Supernatant odrzucano, a egzopolisacharydy pozostające na odwirowanych komórkach bakteryjnych odmywano 1-6 razy 0,001-1 M buforem glicyna - HCl (ph 1,5-3,5), 1-6 razy 0,001-1 M buforem glicyna - NaOH (ph 9,5-12), trzykrotnie sterylną H 2 O odwirowując bakterie za każdym razem jw. Bakterie liofilizowano i następnie sporządzono mieszaninę trzech liofilizatów w stosunku wagowym 1:1:1. Do immunizacji podskórnej królika stosowano 1% wodną zawiesinę liofllizatu z dodatkiem adiuwanta Gerbu 100 (1:1, v/v). Zawiesinę podawano sześciokrotnie w dwutygodniowych odstępach w 1 ml porcjach. Skrwawianie królika i izolację przeciwciał wykonywano wg Ball i inni (1993). Krew pobierano z żyły brzeżnej ucha królika bezpośrednio do probówek wirówkowych. Po zebraniu pozostawiano do skrzepnięcia 30 minut w temperaturze 37 C, a następnie przez noc w 4 C. Skrzep delikatnie oddzielano od ścianek i wirowano 15 minut 1000 x g w temp. 4 C w wirówce Beckman J-21. Surowicę zlewano delikatnie znad osadu, dodawano NaN, do stężenia 0,02%, dziesięciokrotnie rozcieńczano 2 x dest. H 2 O i dodawano równoważną objętość nasyconego siarczanu amonu, delikatnie mieszano i pozostawiano na 60 min w temperaturze pokojowej w celu wytrącenia osadu. Mieszaninę zwirowywano 5 min 8000 x g na wirówce Sorvall RC-5B, usuwano supernatant, a osad rozpuszczano w buforze 0,5xPBS ph 7,4 w objętości dwukrotnie większej niż początkowa objętość surowicy i dializowano przez noc wobec trzech zmian tego samego buforu z 0,02% NaN 3. Dializowany roztwór nakładano na kolumnę wypełnioną DEAE - celulozą zrównoważoną buforem 0,5xPBS z 0,02% NaN 3, którym następnie przemywano złoże uzyskując elucję przeciwciał. Zbierano 3 ml frakcje, dla których stosunek absorbancji A 280 /A 250 = 2,5 2,7. Frakcje łączono i filtrowano następnie przez filtr antybakteryjny 0,2 μm i przechowywano w 4 C. Roztwory przeciwciał doprowadzano ww. buforem do stężenia 2 mg/ml, przyjmując, że absorbancja IgG w stężeniu 1 mg/ml
IgG skierowane na komórki bakteryjne bez śluzu IgG skierowane na komponenty śluzu bakteryjnego 1:200 1:400 1:800 1:1600 1:3200 1:6400 PL 213 858 B1 5 przy λ = 280 nm wynosi 1,4. Przeciwciała reagują z komórkami Cms pokrytymi śluzem oraz reagują nieznacznie z komórkami częściowo pozbawionymi śluzu bakteryjnego (Tabela 1). T a b e l a 1. Porównanie miana przeciwciał anty-cms względem średnio mukoidalnego szczepu bakterii Cms - PD 221 10 4 CFU/ml oceniane testem IF. IgG Zawiesina bakterii Cms Miano Ślepa (bez IgG) - Bakterie w zawiesinie wodnej + + +/- -/+ -/+ -/+ - Bakterie przemyte 3-krotnie wodą podwójnie destylowaną Bakterie przemyte buforem o odczynie kwaśnym Bakterie przemyte buforem o odczynie zasadowym + + +/- -/+ - - - + +/- - - - - - + +/- + - - - - Bakterie w zawiesinie wodnej - - - - - - - Bakterie przemyte 3-krotnie wodą podwójnie destylowaną Bakterie przemyte buforem o odczynie kwaśnym Bakterie przemyte buforem o odczynie zasadowym + - - - - - - +/- -/+ - - - - - + + -/+ - - - - Legenda: + - silna fluorescencja, +/- - średnia fluorescencja, -/+ - słaba fluorescencja, - brak fluorescencji P r z y k ł a d 2. Znakowanie przeciwciał poliklonalnych skierowanych na bakterie Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus W celu uzyskania fragmentów przeciwciał, przeprowadzano redukcję wiązań dwusiarczkowych S-S całych cząsteczek IgG inkubując je w roztworze EDTA - DTT w warunkach beztlenowych. Sporządzono sześć roztworów o różnych stężeniach przeciwciał w zakresie od 20 do 500 μg/ml w 0,2 ml końcowej objętości świeżo sporządzanego roztworu EDTA - DTT. Roztwory w 1,5 ml probówkach Eppendorf umieszczano i inkubowano przez noc w temperaturze pokojowej pod próżnią 0,1 MPa. Po rozszczelnieniu układu, roztwory z uzyskanymi fragmentami IgG natychmiast łączono ze standardowym roztworem złota koloidalnego OD 4,0 sporządzając mieszaniny w proporcji 1:1 (v/v). Roztwory inkubowano przez 10 minut w temperaturze pokojowej łagodnie mieszając, po czym pobierano po 50 μl każdego z roztworów i mieszano z 50 μl 2 N NaCl. Po ustaleniu optymalnych proporcji, złoto koloidalne mieszano z odpowiednią ilością zredukowanych przeciwciał i inkubowano 5-60 minut w temp. pokojowej łagodnie mieszając. Dla uniknięcia niespecyficznej sorpcji, pozostałą powierzchnię złota koloidalnego blokowano 1-20% roztworem BSA, natomiast nadmiar niezwiązanych fragmentów przeciwciał usuwano z roztworu koniugatu poprzez trzykrotne płukanie roztworem TBS BSA i zatężanie na wirówce Eppendorf 5415C (0,5-2 godzin przy 1000-4000 x g). Osad uzyskany przy ostatnim wirowaniu, doprowadzano buforem TBS - BSA do gęstości optycznej OD535 nm = 0,1-4,0 i przechowywano w 4 C (roztwór IgG-Au1). P r z y k ł a d 3. Znakowanie przeciwciał poliklonalnych skierowanych na bakterie Clavibacter michiganensis subsp. Sporządzano roztwory przeciwciał o stężeniu 0,01-1 mg/ml, które dializowano przez noc w 4 C wobec trzech zmian 10 mm buforu boranowego ph 9,2 i doprowadzano do stężenia 0,1 mg/ml przyjmując, że A280 nm takich roztworów odpowiada wartości 0,140. Natomiast standardowy roztwór złota koloidalnego doprowadzano 10 mm buforem boranowym do ph 9,0. Wstępne miareczkowanie przeprowadzono sporządzając roztwory IgG o stężeniach od 5 do 50 μg/ml, które łączono z dwukrotną objętością standardowego roztworu złota koloidalnego OD 4,0, mieszano i inkubowano 10 minut w temp. pokojowej. Następnie pobierano po 50 μl każdego z roztworów i mieszano z 50 μl 2 N NaCl. Po ustaleniu optymalnych proporcji, złoto koloidalne mieszano z odpowiednią ilością zredukowanych
6 PL 213 858 B1 przeciwciał i inkubowano 5-60 minut w temp. pokojowej łagodnie mieszając. Dalej postępowano podobnie jak w punkcie 1. Osad uzyskany przy ostatnim wirowaniu, doprowadzano buforem TBS BSA do gęstości optycznej OD535 nm = 0,1-4,0 i przechowywano w 4 C (roztwór IgG-Au2). P r z y k ł a d 4. Test filtracyjny wykrywający obecność Ervinia carotovora subsp carotovora Sporządzano serie zawiesin bakterii Ervinia carotovora subsp carotovora w 10 mm buforze fosforanowym ph 7,2 w rozcieńczeniach od 5*102 do 5*105 CFU/ml. Pobierano po 100 μl każdej z zawiesin i dodawano po 20 μl koniugatu złota koloidalnego znakowanego IgG anty-ecc. Po 10 minutach mieszaniny filtrowano na membranach poliwęglanowych o porowatości 0,4 μm umieszczonych w urządzeniu do blottingu próżniowego. Po 1-6-krotnym przemyciu buforem 1xPBS ph 7,4 z 0,005-1% Tween 20 oceniano intensywność barwy plam na powierzchni membrany lub obserwowano bakterie pod mikroskopem optycznym. Dla polepszenia widoczności wyznakowanych bakterii Ecc, stosowano amplifikację uzyskanego sygnału optycznego poprzez redukcję jonów srebra na złocie koloidalnym. W tym celu membrany umieszczano w świeżo sporządzonym roztworze zawierającym 0,015-0,5 M hydrochinon. 0,033-15 mm azotan srebra w 10 mm buforze cytrynianowym ph 2,5-4,0 i inkubowano przez około 2-12 minut. Reakcję zatrzymano umieszczając membrany w dwukrotnie destylowanej H 2 O i osuszając na bibule. Bakterie Ecc znakowane koniugatem złota koloidalnego z IgG - AP kontrastowano na drodze enzymatycznej z użyciem substratu BCIP/NBT. Plamki na membranie pokrywano 50 μl świeżo sporządzonego roztworu BCIP/NBT i inkubowano 2-20 minut w temperaturze pokojowej. Re-akcję zatrzymano umieszczając membrany w buforze 1xPBS, ph 7,4 z 0,05% Tween 20 i osuszając na bibule. Po amplifikacji ponownie oceniano intensywność barwy plam na powierzchni membrany nieuzbrojonym okiem lub obserwowano bakterie pod mikroskopem optycznym. P r z y k ł a d 5. Test filtracyjny wykrywający obecność Ervinia amyloria Sporządzano serie zawiesin bakterii Ervinia amylovora w 10 mm buforze fosforanowym ph 7,2 w rozcieńczeniach od 5*102 do 5*105 CFU/ml. Pobierano po 100 μl każdej z zawiesin i dodawano po 20 μl koniugatu złota koloidalnego znakowanego IgG anty-ea. Po 10 minutach mieszaniny filtrowano na membranach poliwęglanowych o porowatości 0,4 μm umieszczonych w urządzeniu do blottingu próżniowego. Po 1-6-krotnym przemyciu buforem 1xPBS ph 7,4 z 0,005-1% Tween 20 oceniano intensywność barwy plam na powierzchni membrany lub obserwowano bakterie pod mikroskopem optycznym. Dla polepszenia widoczności wyznakowanych bakterii Ea, stosowano amplifikację uzyskanego sygnału optycznego poprzez redukcję jonów srebra na złocie koloidalnym. W tym celu membrany umieszczano w świeżo sporządzonym roztworze zawierającym 0,015-0,5 M hydrochinon, 0,033-15 mm azotan srebra w 10 mm buforze cytrynianowym ph 2,5-4,0 i inkubowano przez około 2-12 minut. Reakcję zatrzymano umieszczając membrany w dwukrotnie destylowanej H 2 O i osuszając na bibule. Po amplifikacji ponownie oceniano intensywność barwy plam na powierzchni membrany nieuzbrojonym okiem lub obserwowano bakterie pod mikroskopem optycznym. P r z y k ł a d 6. Test filtracyjny wykrywający obecność Cms Sporządzano serie zawiesin bakterii Clavibacter michiganensis subsp. w 10 mm buforze fosforanowym ph 7,2 w rozcieńczeniach od 5*102 do 5*105 CFU/ml. Pobierano po 100 μl każdej z zawiesin i dodawano po 20 μl koniugatu złota koloidalnego znakowanego IgG anty-cms. Po 10 minutach mieszaniny filtrowano na membranach poliwęglanowych o porowatości 0,4 μm umieszczonych w urządzeniu do blottingu próżniowego. Po 1-6-krotnym przemyciu buforem 1xPBS ph 7,4 z 0,005-1% Tween 20 oceniano intensywność barwy plam na powierzchni membrany lub obserwowano bakterie pod mikroskopem optycznym. Dla polepszenia widoczności wyznakowanych bakterii Cms, stosowano amplifikację uzyskanego sygnału optycznego poprzez redukcję jonów srebra na złocie koloidalnym. W tym celu membrany umieszczano w świeżo sporządzonym roztworze zawierającym 0,015-0,5 M hydrochinon, 0,033-15 mm azotan srebra w 10 mm buforze cytrynianowym ph 2,5-4,0 i inkubowano przez około 2-12 minut. Reakcję zatrzymano umieszczając membrany w dwukrotnie destylowanej H 2 O i osuszając na bibule. Zastrzeżenia patentowe 1. Sposób wykrywania obecności bakterii Clavibacter michiganensis ssp. sepedonicus, w analizowanej próbce, znamienny tym, że bakterie zawiesza się w roztworze buforowym, kontaktuje się bakterie ze znakowanym złotem koloidalnym przeciwciałem otrzymanym poprzez prowadzenie immu-
PL 213 858 B1 7 nizacji z wykorzystaniem antygenu bakteryjnego otrzymanego z komórek bakterii pozbawionych śluzu bakteryjnego poprzez przemywanie bakterii roztworem buforowym wybranym spośród roztworu buforowego glicyna - HCl lub roztworu buforowego glicyna - NaOH, specyficznym wobec antygenu powierzchniowego pochodzącego z wykrywanej bakterii, następnie roztwór odfiltrowuje się na filtrze nie przepuszczającym bakterii, przy czym obecność na filtrze wyznakowanych bakterii świadczy o obecności bakterii w analizowanej próbce. 2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że filtrami są membrany celulozowe, poliwęglanowe lub inne znane. 3. Sposób według zastrz. 1 albo 2, znamienny tym, że obecność przeciwciał wyznakowanych złotem koloidalnym wykrywa się poprzez redukcję jonów srebra na złocie koloidalnym.
8 PL 213 858 B1 Departament Wydawnictw UP RP Cena 2,46 zł (w tym 23% VAT)