Kamil Jurowski. Kamila Kochan. Anna Jurowska. Grzegorz Zając. Kornel Roztocki

Kamil Jurowski Kamila Kochan Anna Jurowska Grzegorz Zając Kornel Roztocki

mgr Kamil Jurowski jurowski@chemia.uj.edu.pl Absolwent Wydziału Chemii Uniwersytet Jagiellońskiego w Krakowie (2012) praca pod tytułem Zastosowanie metody LA ICP MS do obrazowania cynk w strukturach mózgu szczura jak narzędzie do badania patofizjologii depresji. Obecnie doktorant na macierzystej jednostce. Jego zainteresowania naukowe dotyczą zastosowania technik spektrometrii mas w badaniach bioanalitycznych (metalomika, proteomika, lipidomika). W swoim dorobku posiada cztery publikacje związane z zastosowaniem spektrometrii mas w badaniach biomedycznych. Jest autorem wielu wystąpień konferencyjnych zarówno krajowych jak również międzynarodowych. Oprócz zainteresowań naukowych aktywnie zajmuje się dydaktyką akademicką. Od początku studiów doktoranckich jest stypendystą Konsorcjum KNOW (Krajowy Narodowy Ośrodek Wiodący) im. Mariana Smoluchowskiego w Krakowie. Członek Polskiego Towarzystwa Chemicznego oraz Polskiego Towarzystwa Spektrometrii Mas.

mgr Kamila Kochan kochan@chemia.uj.edu.pl Absolwentka Wydziału Chemii Uniwersytetu Jagiellońskiego w Krakowie (2012). Pracę magisterską pod tytułem Obrazowanie pojedynczych komórek za pomocą spektroskopii FT-IR zrealizowała w Zespole Obrazowania Ramanowskiego. Obecnie doktorantka na Wydziale Chemii UJ. W ramach pracy doktorskiej zajmuję się aplikacją komplementarnych technik obrazowania metodami spektroskopii oscylacyjnej (FT-IR, Raman) do badania modeli uszkodzenia wątroby. Skupia się stosowaniu technik spektroskopii oscylacyjnej zarówno ex vivo jak również do badań żywych komórek. W swoim dorobku posiada 11 publikacji w czasopismach z listy filadelfijskiej dotyczących aplikacji technik obrazowania metodami spektroskopii oscylacyjnej do badań biomedycznych. Jest autorką licznych wystąpień konferencyjnych, a także stypendystką Konsorcjum KNOW (Krajowy Narodowy Ośrodek Wiodący) im. Mariana Smoluchowskiego w Krakowie oraz kierownikiem i wykonawcą kilku grantów badawczych.

mgr Anna Jurowska jurowska@chemia.uj.edu.pl Absolwentka Wydziału Chemii Uniwersytetu Jagiellońskiego w Krakowie praca magisterska pt. Synteza i charakterystyka fizykochemiczna nowych kompleksów Mo(IV) z ligandami N, i N,N-donorowymi. Obecnie doktorantka II roku Chemii na macierzystej jednostce. Badania związane z tematem rozprawy doktorskiej realizuje w Zespole Chemii Koordynacyjnej. W swojej pracy naukowej zajmuje się syntezą i charakterystyką fizykochemiczną kompleksów metali d- elektronowych z dendrymerycznymi ligandami opartymi na strukturze triazyny. Od początku studiów doktoranckich jest stypendystką Konsorcjum KNOW (Krajowy Narodowy Ośrodek Wiodący) im. Mariana Smoluchowskiego w Krakowie. Jest autorką czterech publikacji z listy filadelfijskiej i kilkunastu wystąpień na konferencjach krajowych oraz międzynarodowych.

mgr Grzegorz Zając zajac@chemia.uj.edu.pl Tytuł magistra uzyskał w 2014 roku na Wydziale Chemii Uniwersytetu Jagiellońskiego; temat pracy: "Struktura, spektroskopia i stereochemia astaksantyny". W swoich badaniach, realizowanych na studiach doktoranckich, wykorzystuje nowoczesne techniki chiralooptyczne do badania struktury i równowagi konformacyjnej cząsteczek chiralnych o znaczeniu biologicznym. Jego zainteresowania naukowe dotyczą przede wszystkim badań układów chiralnych z wykorzystaniem ramanowskiej aktywności optycznej ROA (ang. Raman Optical Activity), oraz jej zaawansowanych rozwinięć: RROA (ang. Resonance Raman Optical Activity) i SEROA (ang. Surfaceenhanced Raman Optical Activity), jak również innych metod chiralooptycznych (ECD, VCD). Jest autorem dwóch publikacji w czasopismach z listy filadelfijskiej i licznych wystąpień na krajowych i międzynarodowych konferencjach naukowych.

mgr Kornel Roztocki kornel.roztocki@doctoral.uj.edu.pl Absolwent Wydziału Chemii Uniwersytetu Jagiellońskiego w Krakowie, studia magisterskiej ukończył z wyróżnieniem w 2014; tytuł pracy: Synteza układów M-MOF z udziałem metaloligandów hydrazonowych. Doktorat realizuje na macierzystej uczelni zajmując się głównie zagadnieniami związanymi z chemią koordynacyjną, a w szczególności chemią supramolekularną oraz związkami typu MOF (sieci metalo-organiczne).

11 K. Jurowski, K. Kochan, A. Jurowska, G. Zając, K. Roztocki, Intepretacja

12 K. Jurowski, K. Kochan, A. Jurowska, G. Zając, K. Roztocki, Intepretacja

13 W polskiej literaturze fachowej brak jest monografii, która przedstawiałaby w jednej pozycji różnorodne podejścia do interpretacji widm spektroskopowych i spektrometrycznych. Informacje na temat interpretacji widm opisane w niniejszej monografii są bardzo ważne z dydaktycznego punktu widzenia, bowiem stanowią zestawienie najważniejszych informacji w przypadku interpretacji widm w jednej monografii. Dla Autorów niniejszej monografii jest dużym zaskoczeniem, iż do tej pory nie było w polskiej literaturze żadnej pozycji poświęconej tym podstawowym, niezwykle ważnym zagadnieniom. We współczesnym Świecie dominuje komputeryzacja, cyfryzacja i coraz większa ilość monografii występuje w postaci elektronicznej (e-booki). W tego typu rozwiązaniach można dopatrywać się zarówno wad jak K. Jurowski, K. Kochan, A. Jurowska, G. Zając, K. Roztocki, Intepretacja

14 i zalet, niemniej jest to obecnie jedyny możliwy środek przekazu do najszerszego grona odbiorców. Taki właśnie cel przyświecał Autorom niniejszej monografii, którzy zdecydowali się wydać tę pozycję tylko w postaci elektronicznej. Autorzy dokonali możliwie największych starań, aby uniknąć ewentualnych błędów i zastosować poprawną nomenklaturę fachową. Niemniej Autorzy zdają sobie sprawę z ewentualnych niedoskonałości pracy i proszą o zgłaszanie swoich wątpliwości bezpośrednio na adresy mailowe przedstawione w notach biograficznych niniejszej monografii. Wszystkie zaprezentowane widma stanowią wyniki badań Autorów lub zostały zapożyczone z bezpłatnych i ogólnodostępnych baz danych, które mogą być wykorzystywane w monografiach na potrzeby dydaktyczne. Mamy nadzieję, iż praca ta będzie stanowić cenne źródło wiedzy w nowoczesnym wydaniu, które umożliwi zapoznanie wielu czytelników z obliczeniami spektroskopowymi i spektrometrycznymi, patrząc przez pryzmat młodych naukowców, którzy też byli studentami i zdają sobie sprawę jak trudno jest znaleźć źródło wiedzy związane z tego typu tematyką. Kraków, 2015 Autorzy K. Jurowski, K. Kochan, A. Jurowska, G. Zając, K. Roztocki, Intepretacja

15 1.1. Wstęp 1 Spektrometria mas Widmo mas (z ang. mass spectrum) to graficzne przedstawienie zależności intensywności sygnału od stosunku m/z dla jonów. Innymi słowy, widmo mas w określonych warunkach eksperymentalnych stanowi zapis (wykres lub tabelę) natężenia sygnałów analitycznych (natężenie prądu wytwarzanego przez jony w miarę ich docierania do detektora) dla danych wartości m/z. Intensywność sygnału (piku) na widmie wskazuje zatem na względną liczbę jonów im wyższy jest pik, tym większa jest populacja jonu, od którego ten pik pochodzi. Z uwagi na to, że na widmie mas można zaobserwować zazwyczaj sygnały charakteryzujące się smukłym i ostrym kształtem, sygnały te nazywa się pikami, a nie pasmami tak jak ma to miejsce w różnych metodach spektroskopowych. Poniżej przedstawiono przykładowe widmo mas dla o-ksylenu rysunek 1.1 oraz tabela 1.1.

16 Rys. 1.1. Widmo mas o-ksylenu w postaci wykresu. widm spektroskopowych i spektrometrycznych okiem młodych naukowców,

17 Tabela 1.1. Widmo mas o-ksylenu w postaci tabeli. m/z Intensywność względna [%] 26 1,29 27 9,61 38 2,77 39 18,12 40 2,19 41 3,09 50 7,09 51 16,7 52 7,41 53 5,03 61 1,42 62 3,16 63 7,67 64 1,81 65 9,80 66 1,29 74 2,26 75 1,74 76 1,55 77 18,43 78 8,83 79 7,22 89 2,83 91 99,99 92 8,32 102 1,35 103 5,8 104 2,77 105 21,92 106 55,77 107 5,09

18 Należy zauważyć, że najczęstszym sposobem przedstawiania widma mas jest prezentacja graficzna, a nie tabelaryczna. Niemniej w zależności od celu badań, obie formy prezentacji wyników są ważne. Powszechnie więc widmo mas kojarzy się z wykresem słupkowym, gdzie na osi x odłożona jest wartość (m/z), a na osi y odłożona jest intensywność względna (%). Na widmie mas najbardziej intensywny pik nazywany jest pikiem podstawowym. Wysokość piku podstawowego przyjmuje się za 100%, a wysokość pozostałych pików odnosi się do tej wartości. Z kolei jony powstałe w wyniku fragmentacji związku są rozdzielane w zależności od ich stosunku masy do ładunku (m/z). Warto zwrócić uwagę na to, że większa liczba jonów jest naładowana pojedynczo, stąd skalę widma traktuje się często jako skalę wyrażoną w jednostkach masy. Nie tak rzadko możliwe są jony naładowane podwójnie, które pojawiają się na skali m/z przy wartościach odpowiadających połowie ich masy. Na widmie mas mogą również występować takie jony, które powstały na skutek usunięcia z cząsteczki jednego elektronu takie jony nazywają się jonami cząsteczkowymi (molekularnymi, M) i zazwyczaj występują na widmie mas przy największej wartości m/z. Wyjątkiem są grupy sygnałów charakteryzujących się wartościami m/z równymi: M+1, M+2, M+3, itd. Sygnały tego typu noszą nazwę pików izotopowych. Źródłem takich pików jest to, że liczne pierwiastki obecne w związkach występują w przyrodzie

19 w postaci wielu izotopów (wiele pierwiastków nie jest monoizotopowych). Liczba pików o znacznej intensywności w widmie mas oraz ich rozmieszczenie jest charakterystyczną cechą danej cząsteczki analitu. Masa i względne stężenie jonu molekularnego wskazują na wielkość i ogólną trwałość cząsteczki. Widmo mas zawierające kilka pików o znacznej intensywności wskazuje, że cząsteczka ulega tylko niewielkiej liczbie rozpadów, co świadczy o trwałości produktów lub o obecności małej liczby nietrwałych wiązań. 1.2. Interpretacja widm mas 1.2.1. Identyfikacja piku jonu molekularnego Z uwagi na to, że wzór cząsteczkowy jest zazwyczaj jedną z najważniejszych informacji otrzymywaną z widma mas, stąd należy mieć pewność, że w grupie pików o masach: M, M+1, M+2 itd. pik jonu molekularnego został prawidłowo zidentyfikowany. Wiadomo, że jon cząsteczkowy musi być jonem posiadającym nieparzystą liczbę elektronów, z uwagi na fakt, iż powstaje z cząsteczki na skutek utraty jednego elektronu.

20 1.2.1.1. Stopień nienasycenia (wskaźnik deficytu atomów wodoru) Jedną z metod umożliwiających określenie, czy dany jon ma nieparzystą liczbę elektronów jest tzw. stopień nienasycenia (S), który określa sumę wiązań wielokrotnych oraz układów pierścieniowych. W niektórych źródła literaturowych stopień nienasycenia określa się czasami jako tzw. wskaźnik deficytu atomów wodoru. Dla prostych cząsteczek organicznych, w których obecne są tylko atomy węgla, wodoru, tlenu, siarki, azotu oraz chlorowców można zapisać uproszczony wzór na stopień nienasycenia (S): S = 2n C n H +n N n X +2 2 (1.1) gdzie: n C atomy węgla n H atomy wodoru n N atomy azotu n X atomy chlorowców Podsumowując: Jeśli w cząsteczce są obecne atomy wodoru, to ich liczbę odejmuje się od podwójnej liczby atomów węgla;

21 Jeśli w cząsteczce są obecne atomy azotu, to ich liczbę dodaje się do podwójnej liczby atomów węgla; Jeśli w cząsteczce są obecne atomy chlorowców, to ich liczbę odejmuje się od podwójnej liczby atomów węgla; Niech jako przykład posłuży cząsteczka kwasu cynamonowego: W cząsteczce tej obecnych jest: n C = 9 n H = 8 n N 0 n X 0 Wówczas stopień nienasycenia wynosi 6, ponieważ: S = 2n C n H + n N n X + 2 2 = 2 9 8 + 0 0 + 2 2 = 6 Analizując wzór półstrukturalny można stwierdzić,

22 że w cząsteczce kwasu cynamonowego znajduje się 5 wiązań typu π (czerwone strzałki) oraz jeden pierścień aromatyczny (różowe tło) w sumie 6, co jest w zgodzie z wcześniejszymi obliczeniami: Z punktu widzenia spektrometrii mas, ważne jest, by pamiętać, że stopień nienasycenia dla jonów o nieparzystej liczbie elektronów musi być liczbą całkowitą. Z kolei dla jonów o parzystej liczbie elektronów, stopień nienasycenia będzie liczbą niecałkowitą. 1.2.1.2. Reguła azotowca Jeśli cząsteczka związku organicznego lub jon posiada nieparzystą liczbę atomów azotu, to liczba określająca jej masę cząsteczkową jest nieparzysta. Jeśli z kolei cząsteczka lub jon zawiera parzystą liczbę atomów azotu lub nie zawiera ich wcale, to masa cząsteczkowa jest wyrażona liczbą parzystą. Reguła ta znajduje

23 zastosowanie do wszystkich związków zawierających atomy: C, H, O, N, S, P, B, Si oraz atomy fluorowców. Na podstawie przedstawionych wcześniej informacji można dojść do następujących wniosków: Jony o nieparzystej liczbie elektronów (tzw. jony nieparzystoelektronowe), odpowiadające cząsteczce niezawierającej atomów azotu lub zawierających ich parzystą liczbę będą miały masę wyrażoną liczbą parzystą; Jony o parzystej liczbie elektronów (tzw. jony parzystoelektronowe), odpowiadające cząsteczce zawierającej nieparzystą liczbę atomów azotu będą miały masę wyrażoną liczbą nieparzystą. Warto zwrócić uwagę na to, że jony nieparzystoelektronowe powstają głównie w EI, z kolei jony parzystoelektronowe powstają głównie w ESI, APCI oraz MALDI. 1.2.1.3. Analiza pików jonów fragmentacyjnych w pobliżu piku badanego jonu Rozpoznawanie piku jonu molekularnego można również dokonać poprzez analizę pików jonów fragmentacyjnych w pobliżu badanego jonu. Utrata fragmentów o masach z zakresu: 3 15 oraz z zakresu:

24 20 26 jest bardzo mało prawdopodobna, stąd jeśli obserwuje się piki odpowiadające fragmentom o tak zmienionej masie, to można przypuszczać, że rozpatrywany jon jest raczej jonem fragmentacyjnym, a nie cząsteczkowym. 1.2.1.4. Zmiana warunków pomiaru Zmiana warunków pomiarowych daje również możliwości na dostarczenie dowodów potwierdzających właściwe rozpoznanie jonu cząsteczkowego. W takim przypadku pomocne może okazać się maksymalne wzmocnienie, co ułatwi obserwację bardzo słabego piku jonu molekularnego. Drugim sposobem może być zmniejszenie energii strumienia elektronów, co powoduje zmniejszenie intensywności jonów fragmentacyjnych w porównaniu z intensywnością jonu cząsteczkowego. Należy zauważyć, że dotyczy to również jonów fragmentacyjnych pochodzących od kontaminacji. Innym podejściem może być również zastosowanie innego typu jonizacji niż EI, np. jonizacja chemiczna, jonizacja polem w większym stopniu sprzyjają tworzeniu grupy pików jonu molekularnego, stąd jeśli są dostępne to również powinny być zastosowane.

25 1.2.2. Intensywność piku jonu molekularnego Intensywność piku molekularnego w widmie mas jest tym większa, im mniejsza jest energia potrzebna do jonizacji cząsteczki i im trwalszy jest jon cząsteczkowy. Strukturze cząsteczki odpowiadają charakterystyczne wartości energii jonizacji, a to określa wielkość energii potrzebnej do wytworzenia jonu cząsteczkowego. Należy zwrócić uwagę, że jeśli cząsteczka zawiera wiązanie łatwo ulegające rozszczepieniu, to pik jonu molekularnego będzie charakteryzował się bardzo małą intensywnością. Zazwyczaj intensywność jonu molekularnego wzrasta ze wzrostem nienasycenia i ze wzrostem liczby pierścieni, przy czym jest mniejsza dla łańcuchów rozgałęzionych. Wzrost intensywności piku jonu cząsteczkowego może być z kolei powodem obecności heteroatomów, mających na zewnętrznych powłokach łatwo ulegające dysocjacji elektrony. W tabeli 1.2. przedstawiono ogólne wskazówki pomocne podczas przewidywania intensywności piku jonu molekularnego dla widm różnego rodzaju klasy związków organicznych....

26 Tabela 1.2. Ogólne wskazówki pomocne podczas przewidywania intensywności piku jonu molekularnego. intensywność piku jonu molekularnego mała lub pik nie występuje średnia duża klasa związków alkohole alifatyczne aminy alifatyczne nitryle związki o rozgałęzionych łańcuchach aromatyczne bromoi jodopochodne sprzężone alkeny pochodne benzylowe oraz benzoilowe ketony i aldehydy o prostych łańcuchach, estry, kwasy karboksylowe, amidy węglowodory aromatyczne aromatyczne nitryle i aminy oraz fluoro- i chloropochodne nasycone związki cykliczne związki nitrowe etery halogenki alkilowe 1.2.3. Wzory cząsteczkowe Jedną z najbardziej użytecznych informacji, pozyskiwanych z widma mas, jest wzór cząsteczkowy danego związku. Jeśli istnieje możliwość identyfikacji jonu molekularnego, to istnieją dwa sposoby ustalania wzoru cząsteczkowego w zależności od rozdzielczości stosowanego spektrometru mas. Najlepszą metodą jest zastosowanie aparatu odznaczającego się dużą

27 zdolnością rozdzielczą, co umożliwia dokładny pomiar masy jonu molekularnego. Z uwagi na to, że masy atomowe nie wyrażają się liczbami całkowitymi, masa każdego zestawu atomów będzie wyrażona charakterystyczną liczbą niecałkowitą. Dokładny pomiar masy pozwala zatem odróżnić dwa sygnały. Warto zwrócić uwagę, iż istnieją różnorodne tabele, które ułatwiają powiązanie dokładnych mas ze wzorami cząsteczkowymi. Dokładne wyznaczanie masy cząsteczkowej jest szczególnie ważne podczas, gdy zachodzi potrzeba potwierdzenia poprawności identyfikacji konkretnego jonu cząsteczkowego, natomiast jest mało przydatne w przypadku prób ustalania wzoru nieznanego analitu. Inną metodą może być pomiar intensywności pików izotopowych, szczególnie jeśli wykorzystuje się widma mas wykonane przez spektrometry mas o małej rozdzielczości. W tym przypadku należy stosować abundancje trwałych izotopów. Dane dla poszczególnych izotopów są przedstawiane w dwojaki sposób jako odsetek wszystkich występujących izotopów, albo jako odsetek izotopu występującego w największej ilości. Każda więc kombinacja atomów będzie dawała grupę pików izotopowych o możliwych do przewidzenia intensywnościach. Niech jako przykład posłuży metan, w którym stosunek intensywności pików 12 CH 4 : 13 CH 4 wynosi 100:1,08. Intensywność piku M+1 będzie równa 1,08% intensywności piku molekularnego. Warto

28 nadmienić, że bardzo mały wkład w intensywności tego piku będzie też wnosiła cząsteczka 12 C 1 H 3 2 H. Należy zauważyć, że jednym z warunków, jaki musi być spełniony, aby możliwe było zastosowanie intensywności pików izotopowych do określenia wzoru cząsteczkowego, jest względnie duża intensywność piku molekularnego. W innym przypadku piki izotopowe mogą być zbyt słabe, aby można było zmierzyć ich intensywność z wymaganą dokładnością. Innym problemem może być nakładanie się piku sprotonowanego jonu molekularnego, słabych jonów tła lub pików kontaminacji próbki. Warto zwrócić uwagę, iż metoda ta daje poprawne wyniki tylko dla cząsteczek o masie nie większej niż 250 300. 1.2.4. Fragmentacja Pik jonu molekularnego dostarcza podstawowych informacji na temat tożsamości cząsteczki. Dalsze informacje można uzyskać z układu pików fragmentacyjnych, które pochodzą od jonów powstałych na drodze rozpadu jonu molekularnego. Ponieważ nie wszystkie jony mają takie samo znaczenie, poniżej zestawiono najważniejsze zasady i metody postepowania podczas interpretacji widm: Najważniejszy na widmie mas jest pik jonu molekularnego;

29 Spośród jonów o podobnej masie lub powstających w porównywalnych ilościach, jony o nieparzystej liczbie elektronów mają na ogół większe znaczenie niż jony o parzystej liczbie elektronów jony o nieparzystej liczbie elektronów tworzą się zwykle w reakcjach przegrupowania, które mogą być charakterystyczne dla poszczególnych klas związków; można się spodziewać, że jony o dużych masach będą dostarczały ważniejszych informacji niż te, o małych masach powstających w wyniku prostych, łatwych do wyjaśnienia fragmentacji; Źródłem cennych informacji o rodzajach procesów rozpadu mogą być jony metastabilne; Istnieją dwa ważne czynniki decydujące o intensywności pików jonów fragmentacyjnych w widmie mas: 1) różnice między energiami wiązań rozrywających się i tworzących w trakcie powstawania jonu; 2) trwałość danego jonu. Widmo mas stanowi swojego rodzaju molekularny odcisk palca, ponieważ każda cząsteczka posiada własny, charakterystyczny szablon fragmentacji, a z kolei prawdopodobieństwo, że dwie cząsteczki będą posiadały identyczny szablon fragmentacyjny, jest bardzo małe. Obecnie bardzo rzadko dochodzi do samodzielnej

30 interpretacji złożonych widm mas, ponieważ możliwa jest komputerowa identyfikacja nieznanego związku poprzez analizę porównawczą badanego szablonu fragmentacyjnego z widmem mas z darmowych bibliotek widm mas, oferowanych przez różnorodne firmy specjalizujące się w budowie instrumentów analitycznych. Jeśli jednak zachodzi potrzeba samodzielnej analizy widma mas, to możliwe jest wyciąganie wniosków, dotyczących struktury badanej cząsteczki na podstawie sposobu jej fragmentacji. Wiadomo jest, że fragmentacja zachodzi wówczas, gdy wzbudzony, mający znaczną energię kationorodnik, rozpada się samorzutnie na mniejsze fragmenty - wiązania chemiczne pękają i powstają w najprostszym przypadku dwa fragmenty. Jeden z tych dwóch fragmentów ma ładunek dodatni, jest karbokationem, natomiast drugi jest obojętnym elektrycznie rodnikiem. Co więcej, ładunek dodatni pozostaje na tym fragmencie, na którym jest trwalszy, czyli lepiej stabilizowany - w czasie fragmentacji powstają karbokationy bardziej trwałe. Poniżej przedstawiono zarys informacji na temat charakterystycznych właściwości fragmentacyjnych niektórych wybranych grup funkcyjnych: alkohole ta klasa związków organicznych posiada dwie charakterystyczne ścieżki fragmentacji: rozpad alfa oraz dehydratację; w przypadku pierwszej z nich

31 rozerwaniu ulega wiązanie C C najbliższe grupy hydroksylowej, dając obojętny rodnik oraz fragment naładowany elektrycznie i zawierający atom tlenu, co można schematycznie przedstawić jako: W drugim przypadku (dehydratacja), eliminowana jest cząsteczka wody, dając alkenowy kationorodnik o 18 u lżejszy od masy jonu molekularnego, co można schematycznie przedstawić jako: aminy ulegają charakterystycznemu rozpadowi α, podobnie jak alkohole; wiązanie C C najbliższe do atomu azotu ulega rozerwaniu, dając obojętny rodnik alkilowy oraz kation z atomem azotu, co można schematycznie przedstawić jako:

32 aldehydy i ketony jeśli na trzecim atomie węgla od grupy karbonylowej znajduje się atom wodoru (γ atom węgla), to ulegają charakterystycznemu rozczepieniu cząsteczki tzw. rozszczepieniu McLaffertyego. W takim przypadku atom wodoru zostaje przeniesiony do atomu tlenu z grupy karbonylowej, następnie pęka wiązanie C C, co z kolei prowadzi do powstania obojętnej cząsteczki alkenu, a ładunek dodatni pozostaje na fragmencie, zawierającym atom tlenu, co można schematycznie przedstawić jako: Oprócz tej przemiany aldehydy i ketony mogą ulegać również fragmentacji poprzez rozpad α, polegający na rozerwaniu wiązania między grupą karbonylową a najbliższym atomem węgla, w wyniku czego powstaje obojętny rodnik oraz kation zawierający atom tlenu, co można schematycznie przedstawić jako:

33 1.2.5. Reguły przydatne podczas interpretacji widm mas Podczas interpretacji widma mas, warto posługiwać się pewną strategią, której etapy przedstawiono poniżej. Należy jednakże zauważyć, że każde widmo mas stanowi indywidualny problem i nie można sztywno trzymać się jakiegokolwiek schematu postępowania. Dlatego też poniżej przedstawiono jedynie ogólne zasady, które mogą być przydatne podczas interpretacji widm mas: Etap I. Należy najpierw zidentyfikować jon molekularny (M + ); Etap II. Poddać związek analizie elementarnej oraz obliczyć na jej podstawie stopień nienasycenia związku (S); Etap III. Na podstawie ogólnej analizy widma mas należy wyciągnąć wszystkie możliwe wnioski na temat struktury związku - zidentyfikować serie pików i jony charakterystyczne; Etap IV. Na podstawie obecności jonów o dużych masach należy ustalić prawdopodobną strukturę fragmentów obojętnych;

34 Etap V. Należy zidentyfikować piki jonów o nieparzystej liczbie elektronów i rozważyć możliwe przegrupowania; Etap VI. Na podstawie danych uzyskanych z widma mas oraz innych przesłanek należy zaproponować prawdopodobną strukturę związku, posiłkując się w razie potrzeby bazami danych lub tablicami spektrometrycznymi. 1.2.6. Przegląd widm mas wybranych klas związków organicznych Z uwagi na fakt, iż monografia ta nie jest dedykowana wyłącznie spektrometrii mas, stąd poniżej zestawiono jedynie zarys podstawowych informacji na temat widm mas wybranych klas związków organicznych. 1.2.6.1. Węglowodory 1.2.6.1.1. Alkany Ponieważ do zjonizowania węglowodorów nasyconych jest wymagana relatywnie duża wartość energii, stąd powstałe jony ulegają najczęściej przypadkowym przegrupowaniom. Zazwyczaj jon molekularny daje się zaobserwować, ale jego intensywność może być niewielka. Zwykle widma mas alkanów zawierają serię

35 pików, których położenie różni się o czternaście jednostek masy, co odpowiada jonom różniącym się liczbą grup metylenowych (-CH 2 - lub =CH 2 ). Warto zwrócić również uwagę na to, że jon M-CH 3 zazwyczaj nie jest obecny na widmie mas. Dla węglowodorów o prostych łańcuchach intensywność pików innych jonów stopniowo się zwiększa, osiągając maksimum przy m/z 43 (C 3 H 7 + ) lub m/z 57 (C 4 H 9 + ) piki te powstają od jonów znacznie rozgałęzionych, powstających w wyniku przegrupowań cząsteczkowych. Przykład widma mas dla alkanów nierozgałęzionych na przykładzie undekanu przedstawiono na rysunku 1.2. W przypadku alkanów rozgałęzionych można zaobserwować piki odpowiadające preferowanym rozszczepieniom przy III lub IV atomach węgla. Przykładem tego może być pik m/z 113 na widmie mas dla 2,6-dimetylooktanu, które zostało przedstawione na rysunku 1.3. Pik m/z 113 odpowiada drugorzędowemu karbokationowi, który powstaje poprzez oderwanie grupy etylenowej....

36 Rys. 1.2. Widmo mas nierozgałęzionego węglowodoru nasyconego na przykładzie undekanu. widm spektroskopowych i spektrometrycznych okiem młodych naukowców,

37 Rys. 1.3. Widmo mas rozgałęzionego węglowodoru nasyconego na przykładzie 2,6-dimetylooktanu. widm spektroskopowych i spektrometrycznych okiem młodych naukowców,

38 1.2.6.1.2. Alkeny Zazwyczaj na widmach mas alkenów, pik jonu molekularnego jest wyraźny. Ponadto, bardziej intensywna w porównaniu do alkanów jest seria pików odpowiadająca masie C n H + n-1. Seria ta jest widoczna np. w widmie mas heks-1-enu, które zostało przedstawione na rysunku 1.4. Zazwyczaj określenie położenia wiązania podwójnego nie jest możliwe z uwagi na łatwo zachodzące przegrupowania. 1.2.6.1.3. Areny Z uwagi na stabilizujący wpływ pierścienia aromatycznego, w widmach mas arenów występuje zazwyczaj bardzo intensywny pik jonu molekularnego. Zazwyczaj można również zanotować piki jonów podwójnie zjonizowanych, które występują w widmie mas przy wartościach odpowiadających połowie ich masy rzeczywistej. W widmach pochodnych benzenu obecny jest pik m/z 91, który pochodzi od jonu tropyliowego (C 7 H 7 + ), który po utracie obojętnej cząsteczki etynu przekształca się w jon o wartości m/z 65 (C 5 H 5 + ). Przykład widma mas pochodnej benzenu na przykładzie toluenu przedstawiono na rysunku 1.5. Warto zwrócić uwagę, że w przypadku związków aromatycznych podstawionych grupami alkilowymi posiadającymi co najmniej trzy atomy węgla, atom wodoru z pozycji γ może ulegać przeniesieniu w analogii do

39 przegrupowania McLafferty ego. Efektem tego jest pik m/z 92. Przykład widma mas dla tego typu związków aromatycznych na przykładzie butylobenzenu przedstawiono na rysunku 1.6. Rys. 1.4. Widmo mas alkenu na przykładzie heks-1-enu...

40 Rys. 1.5. Widmo mas pochodnej benzenu na przykładzie toluenu. widm spektroskopowych i spektrometrycznych okiem młodych naukowców,

41 Rys. 1.6. Widmo mas związku aromatycznego podstawionego grupami alkilowymi, posiadającymi co najmniej trzy atomy węgla na przykładzie butylobenzenu. widm spektroskopowych i spektrometrycznych okiem młodych naukowców,

42 1.2.6.2. Alkohole, fenole i etery Zazwyczaj pik jonu molekularnego na widmach mas alkoholi jest bardzo słaby lub wręcz niezauważalny. W przypadku tej klasy związków charakterystycznymi jonami są stabilizowane przez rezonans karbokationu, powstałe na drodze rozpadu α. Preferowanym kierunkiem tego rozpadu jest ten, w którym oderwaniu ulegają jak największe grupy alkilowe. W przypadku alkoholi I charakterystycznym pikiem jest M 18, co wynika z utraty cząsteczki wody przez jon molekularny. Warto zwrócić uwagę na to, że pik ten może również pochodzić od jonu powstałego na drodze termicznego rozkładu alkoholu w komorze jonizacyjnej. Jako przykład może posłużyć widmo mas propan-1-olu przedstawione na rysunku 1.7. Na widmie tym można zauważyć pik m/z 42 z uwagi na utratę cząsteczki wody, pik m/z 59 z uwagi na utratę atomu wodoru oraz jon m/z 31, który pochodzi od jonu CH 2 =O + H. W przypadku fenoli na widmie mas występuje intensywny pik jonu molekularnego. Do charakterrystycznych pików fenoli można zaliczyć takie, które pochodzą od jonów M-28 (co wynika z utraty CO i powstania jonu nieparzystoelektronowego) oraz M-29 (co wynika z utraty CHO). Na rysunku 1.8 przedstawiono widmo mas dla fenolu (hydroksybenzenu). Charakterystycznymi pikami na tym widmie są: m/z 65 (pochodzący z utraty CHO) oraz m/z 66 (pochodzący z utraty CO), a ponadto pik jonu molekularnego m/z 94.

43 W przypadku eterów pik jonu molekularnego jest bardzo mało intensywny lub niezauważalny. W przypadku tej klasy związków obserwuje się bardzo często piki pochodzące z dwóch charakterystycznych procesów fragmentacyjnych. Pierwszy z nich to rozpad wiązania węgiel-tlen, co skutkuje pojawieniem się piku o największej intensywności. Drugi proces polega na rozerwaniu wiązania między atomami węgla α oraz β (czyli rozszczepienie α). Przykładem może być widmo mas eteru dietylowego, na którym obserwuje się intensywne piki: m/z 59, m/z 45 oraz m/z 31- rysunek 1.9. Rys. 1.7. Widmo mas alkoholu I na przykładzie propan-1-olu.

44 Rys. 1.8. Widmo mas fenolu (hydroksybenzenu). widm spektroskopowych i spektrometrycznych okiem młodych naukowców,

45 Rys. 1.9. Widmo mas eteru dietylowego. widm spektroskopowych i spektrometrycznych okiem młodych naukowców,

46 1.2.6.3. Aldehydy i ketony W przypadku aldehydów i ketonów pik dla jonu molekularnego jest zazwyczaj zauważalny. Na widmie mas dla tych klas związków istnieją charakterystyczne piki pochodzące od karbokationów, jakie powstają w wyniku rozpadu α względem grupy karbonylowej, co prowadzi do powstania dwóch możliwych jonów acyliowych, które w konsekwencji tracą cząsteczkę tlenku węgla(ii). W przypadku aldehydów oraz ketonów aromatycznych pikiem podstawowym jest zazwyczaj pik jonu C 6 H 5 -C O +, co daje pik m/z 105. Warto zauważyć, że rozpad α ma mniejsze znaczenie niż w przypadku ketonów, chociaż intensywny pik przy m/z 29, odpowiadający CHO, jest czasami obecny na widmie mas. Dla aldehydów i ketonów charakterystyczne jest również przegrupowanie McLafferty ego, pod warunkiem jednak, że grupa alkilowa związana z grupą karboksylową ma łańcuch zbudowany z co najmniej trzech atomów węgla. Na drodze tej przemiany powstają jony o nieparzystej liczbie elektronów, co jest pomocne podczas analizy widma. Pik tego typu odpowiadający jonowi nieparzystoelektronowemu o m/z 43 może być zaobserwowany np. na widmie 4-metylopentan-2-onu rysunek 1.10.

47 Rys. 1.10. Widmo mas 4-metylopentan-2-onu. widm spektroskopowych i spektrometrycznych okiem młodych naukowców,

48 1.2.6.4. Kwasy karboksylowe W przypadku widm mas kwasów monokarboksylowych pik jonu molekularnego zazwyczaj jest obecny. Rozpad α daje dwa piki jonów o masach: M-17 (OH) oraz M-45 (COOH), np. widmo mas dla C 3 H 5 COOH rysunek 1.11. 1.2.6.5. Estry kwasów karboksylowych W przypadku estrów kwasów karboksylowych o ogólnym wzorze R 1 COOR 2 pik pochodzący od jonu molekularnego jest zazwyczaj widoczny, jeśli grupa alkilowa R 1 zawiera mniej niż cztery atomy węgla. Piki charakterystyczne pochodzą od jonów powstałych na skutek przegrupowania McLafferty ego. Przegrupowanie to może zachodzić z udziałem grup alkilowych takich jak acylowa oraz alkoksylowa, ale pod warunkiem, że grupy te są zbudowane przynajmniej z trzech (w przypadku pierwszej grupy) lub dwóch (w przypadku drugiej grupy) atomów węgla. Warto zauważyć, że charakterystyczny jon dla estrów alkoholi, charakteryzujących się długimi łańcuchami, powstaje na skutek przegrupowania dwóch atomów wodoru jest to tzw. przegrupowanie typu McLafferty ego + 1. Przykładowo w widmie mas butanianu etylu przedstawionym na rysunku 1.12., obecne są dwa charakterystyczne piki pochodzące od nieparzystoelektronowych jonów o m/z 88 oraz m/z 60, które powstały na skutek dwóch następujących po sobie

49 przegrupowań McLafferty ego. Co więcej, odczepienie grupy alkoksylowej powoduje intensywny pik o m/z 71 (M-OCH 2 CH 3 ). Często w spektrometrii mas mówi się o tzw. diagnostycznym wskaźniku, jakim jest pik o m/z 71. Rys. 1.11. Widmo mas dla kwasu masłowego....

50 Rys. 1.12. Widmo mas dla butanianu etylu. widm spektroskopowych i spektrometrycznych okiem młodych naukowców,

51 1.2.6.6. Aminy W przypadku amin alifatycznych pik jonu molekularnego posiada małą intensywność, z kolei w przypadku amin aromatycznych intensywność ta jest wysoka. Charakterystyczne reakcje rozpadu są analogiczne jak w przypadku alkoholi i eterów. W przypadku amin I podstawionych w pozycji α jest preferowane odczepienie największej grupy alkilowej analogiczna sytuacja jest w przypadku amin II oraz III. Niech jako przykład posłuży widmo mas dla dietyloaminy przedstawione na rysunku 1.13. 1.2.6.7. Amidy Jeśli chodzi o zachowanie amidów, to rozpad ich przebiega podobnie jak ma to miejsce w przypadku odpowiednich kwasów karboksylowych i estrów metylowych. Dla wszystkich amidów charakterystyczne jest tworzenie jonów o masie M+1 w reakcji między jonami i cząsteczkami. Co więcej, w widmach amidów I występuje zwykle intensywny pik przy m/z 44. Co więcej, podobnie jak w innych klasach związków organicznych, obserwuje się przegrupowania McLafferty ego. Na rysunku 1.14 przedstawiono przykładowe widmo mas dla acetamidu.

52 Rys. 1.13. Widmo mas dla dietyloaminy. widm spektroskopowych i spektrometrycznych okiem młodych naukowców,

53 Rys. 1.14. Widmo mas dla acetamidu. widm spektroskopowych i spektrometrycznych okiem młodych naukowców,

54 Spektroskopia 2 ramanowska 2.1. Wstęp Widma ramanowskie dostarczają informacji o kompozycji badanej próbki na poziome molekularnym. Oznacza to, że pozwalają one na identyfikację wszystkich składników próbki. Spektroskopia ramanowska może być stosowana zarówno do oznaczeń jakościowych, jak i ilościowych. W przypadku analizy ilościowej konieczne jest jednak wykonanie odpowiedniej kalibracji. Co więcej, możliwe jest określenie np. konformacji molekuł, długości łańcucha, czy stopnia nienasycenia kwasów tłuszczowych. W poniższym rozdziale przedstawione zostanie

55 podejście do interpretacji widm ramanowskich na przykładzie odpowiednio dobranych związków chemicznych z grupy lipidów, białek i węglowodanów, a także na przykładzie widm pochodzących z bardziej skomplikowanych układów biologicznych. Przy analizie widm ramanowskich wyodrębnić można zazwyczaj dwa interesujące zakresy: tzw. fingerprint (0 1800 cm -1 ) oraz wysoki zakres (2800 3200 cm -1 ). Ze względu na brak pasm w obszarze pomiędzy tymi dwoma zakresami (1800 2800 cm -1 ) region ten zazwyczaj nie jest przedstawiany na widmach materiałów biologicznych. 2.2. Interpretacja widm ramanowskich - lipidy Lipidy stanowią grupę związków doskonale nadających się do badania techniką spektroskopii ramanowskiej, ze względu na duży przekrój czynny molekuł na rozpraszanie. Sygnały lipidowe charakteryzują się zazwyczaj dobrą intensywnością. W przypadku mieszanin lipidów, oprócz identyfikacji ich obecności w próbce, możliwe jest również oznaczenie np. stopnia nienasycenia komponentów lipidowych, czy rozgałęzienia łańcucha lipidowego. Na rysunku 2.1 przedstawiono widmo ramanowskie kwasu palmitynowego wraz z przypisanymi najważniejszymi pasmami. W obszarze odcisku palca wyraźnie widoczne jest kilka pasm. W zakresie pomiędzy 1000 a ok. 1200 cm -1 obserwujemy pasma związane z drganiami rozciągającymi szkieletu C C. Następnie,

56 widoczne są pasma związane z drganiami skręcającymi grupy CH 2 (δ(ch 2 ), z ang. twisting) oraz drganiami deformacyjnymi grup CH 3 i CH 2 (δ(ch 3 ) i δ(ch 2 )). W wysokim zakresie z kolei widoczne są pasma związane z drganiami rozciągającymi wiązań C H, odpowiednio dla grup CH 2 oraz CH 3, przy czym pasma, odpowiadające drganiom rozciągającym asymetrycznym, pojawiają się przy niższej wartości liczby falowej niż pasma odpowiadające drganiom rozciągającym symetrycznym. W tabeli 2.1 zestawiono obserwowane pasma dla widma ramanowskiego kwasu palmitynowego wraz z ich odpowiednim przypisaniem. Tabela 2.1. Zestawienie położenia pasm wraz z ich przypisaniem dla widma kwasu palmitynowego (rys.2.1). Położenie pasma [cm -1 ] Przypisanie 1068 ν (C C) 1134 ν (C C) 1300 τ (CH 2 ) 1427 β (CH 2 ) 1442 α (CH 2 /CH 3 ) 1467 β (CH 2 /CH 3 ) 2848 ν s (=CH 2 ) 2882 ν as (=CH 2 ) 2925 ν s (=CH 3 ) 2967 ν as (=CH 3 )

57 Rys. 2.1. Widmo ramanowskie kwasu palmitynowego wraz z przypisaniem najważniejszych pasm. widm spektroskopowych i spektrometrycznych okiem młodych naukowców,

58 Kwas palmitynowy stanowi przykład lipidu nasyconego. W przypadku obecności wiązań wielokrotnych na widmie ramanowskim pojawiają się dodatkowe pasma, związane z ich drganiami. Przykład takiego widma przedstawiono na rysunku 2.2. Przykładem wymienionych pasm, pochodzących od drgań wiązań wielokrotnych, mogą być m.in. pasma położone przy 1266, 1657 i 3012 cm -1. Ich obecność pozwala na jednoznaczną identyfikację nienasyconych lipidów. W tabeli 2.2 zestawiono obserwowane pasma dla widma ramanowskiego kwasu oleinowego wraz z ich odpowiednim przypisaniem. Tabela 2.2. Zestawienie położenia pasm wraz z ich przypisaniem dla widma kwasu oleinowego (rys.2.2). Pasma pochodzące od wiązań wielokrotnych zaznaczono kolorem czerwonym. Położenie pasma [cm -1 ] Przypisanie 1084 ν (C C) 1266 δ(ch 2 ) 1305 τ (CH 2 ) 1444 α (CH 2 /CH 3 ) 1657 ν(c=c) 2852 ν s (=CH 2 ) 2892 ν as (=CH 2 ) 3012 ν(=ch)

59 Rys. 2.2. Widmo ramanowskie kwasu oleinowego wraz z przypisaniem najważniejszych pasm. widm spektroskopowych i spektrometrycznych okiem młodych naukowców,

60 Fakt występowania pasm pochodzących wyłącznie od drgań wiązań wielokrotnych pozwala nie tylko zidentyfikować obecność takich związków w badanej próbce, ale również zbadać ich stopień nienasycenia. Stopień nienasycenia rozumiany może być jako stosunek ilości wiązań wielokrotnych do ilości wiązań pojedynczych. Intensywność każdego pasma, odpowiadającego danemu drganiu danego wiązania, rozpatrywanego jako oscylator, uzależniona jest od ilości tych wiązań. A zatem intensywność pasm związanych z wiązaniami wielokrotnymi będzie proporcjonalna do ich ilości. Analogiczna sytuacja ma miejsce dla wiązań pojedynczych. Zatem stosunek intensywności pasm odpowiadający wiązaniom wielokrotnym do intensywności pasm odpowiadających wiązaniom pojedynczym będzie ściśle powiązany ze stopniem nienasycenia. W spektroskopii ramanowskiej najczęściej wykorzystuje się tzw. intensywność integralną pasma, tj. wartość całki odpowiadającej polu powierzchni pod pasmem. W spektroskopii ramanowskiej możemy wyodrębnić trzy kryteria wyznaczania stopnia nienasycenia, przy czym pod pojęciem kryterium rozumiany jest zestaw pasm wykorzystywanych do oceny stopnia nienasycenia. Pierwszym z nich są pasma położone przy ok. 1266 i 1305 cm -1, pochodzące odpowiednio od wiązań nienasyconych i nasyconych. Kryterium to jest stosowane powszechnie. Znaczącą trudnością z nim związaną jest jednak słabe rozdzielenie wymienionych pasm. Powoduje to konieczność arbitralnego i często niejednoznacznego

61 określenia granic całkowania. Drugim, najpowszechniej wykorzystywanym kryterium, jest stosunek intensywności pasm położonych przy 1657 i 1444 cm -1. W tym przypadku pasma są zdecydowanie rozdzielone, a ich granice wyraźnie określone. W przypadku skomplikowanych mieszanin, zawierających również składniki białkowe, należy jednak mieć na uwadze fakt, iż pasmo położone przy 1657 cm -1 może częściowo pokrywać się z pasmem amidowym I. Trzecim możliwym do wykorzystania kryterium jest stosunek pasm położonych przy 3012 i 2852 cm -1. Kryterium to jest jednak wykorzystywane stosunkowo rzadko ze względu na jego słabą czułość. Pasmo położone przy 3012 cm -1 (pochodzące od lipidów nienasyconych) jest znacząco mniejsze od pasma położonego przy 2852 cm -1. Tym samym, aby stosunek intensywności wymienionych pasm uległ niewielkiej zmianie konieczna jest istotna zmiana zawartości lipidów nienasyconych. Na rysunku 2.3 przedstawiono zestaw widm kwasów tłuszczowych o wzrastającym stopniu nienasycenia.

62 Rys. 2.3. Zestaw widm ramanowskich kwasów tłuszczowych o różnym stopniu nienasycenia. *** Innym interesującym przykładem zastosowania spektroskopii ramanowskiej do analizy lipidów jest ocena obecności izomerów geometrycznych trans w badanej próbce. Wykorzystywane jest do tego pasmo pochodzące od drgań rozciągających wiązanie C=C. W przypadku obecności izomeru cis pasmo to położone jest przy około 1656 cm -1, natomiast w przypadku konformeru trans ulega

63 przesunięciu do około 1675 cm -1. Na rysunku 2.4 przedstawiono tą zależność na przykładzie kwasu oleinowego oraz jego izomeru geometrycznego kwasu elaidynowego. Rys. 2.4. Widma ramanowskie kwasu oleinowego (wiązanie podwójne w konformacji cis) oraz jego izomeru geometrycznego kwasu elaidynowego (wiązanie podwójne w konformacji trans) z zaznaczonym charakterystycznym położeniem pasma od drgania rozciągającego C=C dla obu konformerów. *** Kolejnym interesującym zagadnieniem, możliwym do obserwacji i oceny za pomocą spektroskopii ramanowskiej

64 jest długość (oraz rozgałęzienie) łańcuchów lipidowych. Jak można było zaobserwować na zaprezentowanych dotychczasowo widmach oraz w tabelach, ugrupowania CH 2 i CH 3 są źródłem różnych pasm (choć często położonych blisko siebie). Zarówno długość, jak i rozgałęzienie łańcucha kwasów tłuszczowych (i innych lipidów) przekładają się bezpośrednio na ilość ugrupowań CH 2 i CH 3 w molekule. Poprzez ocenę stosunku intensywności odpowiadających im pasm możliwe jest podobnie jak w przypadku stopnia nienasycenia określenie długości/rozgałęzienia łańcucha lipidowego. Na rysunku 2.5 przedstawiono przykład dwóch nasyconych kwasów tłuszczowych o różnej długości łańcucha. Rys. 2.5. Widma ramanowskie kwasu palmitynowego i stearynowego.

65 Na rysunku 2.5 zaznaczono dwa obszary, w których występują wyraźne różnice. Pierwszym z nich jest zakres pomiędzy 1400 a 1500 cm -1. W przypadku obu kwasów występują trzy pasma. W przypadku kwasu stearynowego (wyższy stosunek ilości grup CH 2 do grup CH 3 ) pasmo od drgań β grupy CH 2 ulega jednak przesunięciu w kierunku niższej wartości liczby falowej. Zmianie ulegają również stosunki intensywności poszczególnych pasm (rysunek 2.6).. Rys. 2.6. Widma ramanowskie kwasu palmitynowego i stearynowego w zakresach głównych różnic: 1400 1500 cm -1 (po lewej) oraz 2800 3050 cm -1 (po prawej).

66 Różnicę długości łańcucha (rozumianą jako różnicę stosunku ilości grup CH 2 do ilości grup CH 3 ) można wyraźniej zaobserwować w wysokim zakresie (2800 3050 cm -1 ), gdzie pasma od drgań ugrupowań CH 2 i CH 3 są lepiej rozdzielone. W przypadku obu kwasów najintensywniejszym jest pasmo odpowiadające drganiu rozciągającemu asymetrycznemu grupy CH 2 (ν as (=CH 2 ), ok. 2882 cm -1 ). Wyraźnie widoczne (choć mniej intensywne) jest również pasmo pochodzące od drgań rozciągających symetrycznych tej grupy (ν s (=CH 2 ), ok. 2848 cm -1 ). Różnicę w długości łańcucha możemy jednak zaobserwować na podstawie pasm odpowiadających drganiom ugrupowań CH 3. Chociaż liczba tych grup w obu cząsteczkach jest taka sama, to jednak stosunek ilości grup CH 3 do grup CH 2 jest wyższy w kwasie palmitynowym. W widmie kwasu palmitynowego wyraźnie widoczne są zarówno drgania asymetryczne jak i symetryczne grup CH 3, podczas gdy w widmie kwasu stearynowego intensywność pasma pochodzącego od drgania symetrycznego CH 3 jest już zbyt mała. *** Do grupy lipidów, oprócz kwasu tłuszczowych, zaliczamy szereg innych związków chemicznych, m.in. trójglicerydy, cholesterol i jego estry oraz fosfolipidy. Różnice w budowie chemicznej z oczywistych względów znajdują swoje odzwierciedlenie w widmach ramanowskich.

67 Trójglicerydy są to estry glicerolu oraz trzech kwasów tłuszczowych. Z tego względu w ich widmie pojawiać się będą nie tylko pasma od kwasów tłuszczowych (nasyconych i/lub nienasyconych w zależności od trójglicerydu), ale również pasma m.in. od wiązania estrowego. Na rysunku 2.7 przedstawiono widma trójglicerydu nasyconego (tripalmitynian glicerolu) oraz kwasu tłuszczowego, budującego dany trójgliceryd (kwas palmitynowy) wraz z przypisaniem charakterystycznych pasm. Jak widać, widmo trójglicerydu różni się nieco od widma budującego go kwasu tłuszczowego. Podstawową różnicą jest obecność pasma pochodzącego od drgania rozciągającego wiązanie estrowe (ν(c=o)), polożonego przy ok. 1745 cm -1 (zaznaczonego na rysunku 2.7 kolorem czerwonym). Pasmo to będzie obecne w widmach ramanowskich wszystkich trójglicerydów, a także estrów. Poza obecnością wymienionego pasma, na widmie trójglicerydu zauważyć można szereg innych różnic. Wysoki zakres charakteryzuje się wiekszą intesywnością w stosunku do zakresu odcisku palca (600 1800 cm -1 ) w porówananiu do widma kwasu tłuszczowego. Wynika to z faktu, iż w wysokim zakresie obecne są pasma związane z drganiami ugrupowań CH 2 i CH 3. Cząsteczka trójglicerydu posiada w swojej strukturze aż trzy cząsteczki kwasu tłuszczowego (stąd około trzykrotnie większą liczbę ugrupowań CH 2 ). Pasma powiązane z ugrupowaniami CH 2 ( 2850 cm -1 oraz 2885 cm -1 ) będą

68 zatem znacznie bardziej intensywne w widmie trójglicerydu. Rys. 2.7. Widma ramanowskie kwasu palmitynowego (niebieskie) oraz tripalmitynianu glicerolu (czarne) wraz z położeniem pasm.

69 Z drugiej strony jednak czasteczka trójglicerydu posiada nieznacznie większą ilość ugrupowań CH 3 niż cząsteczka kwasu tłuszczowego. Wyraźna zmiana stosunku ilości ugrupowań CH 2 do ilości ugrupowań CH 3 w przypadku trójglicerydu w porównaniu do kwasu tłuszczowego powoduje, że dla trójglicerydu pasma pochodzace od drgań ugrupowań CH 3 są niewidoczne. Pomimo opisanych różnic pomiędzy widmami kwasu tłuszczowego oraz odpowiadającego mu trójglicerydu daje się pomiędzy nimi zauważyć również pewne podobieństwo. Obecność tych samymch pasm lipidowych (z wyjątkiem pasma pochodzącego od drgania rozciągającego C=O), ich zbliżone położenie oraz profil spektralny widma pozwalają wnioskować, że w obrębie obu tych związków występują podobne ugrupowania. Opisane różnice miedzy widmem kwasu tłuszczowego i pochodzącego od niego trójglicerydu są zdecydowanie mniejsze niż różnice pomiędzy widmami ramanowskimi dwóch trójglicerydów o różnym stopniu nienasycenia. Widma takie przedstawiono na rysunku 2.8. Podobnie jak w przypadku kwasów tłuszczowych, również dla trójglicerydów możliwe jest określenie stopnia nienasycenia. Jak widać na rysunku 2.8, obecność wiązań wielokrotnych w łańcuchu kwasu tłuszczowego trójglicerydu jest źródłem pasm pochodzących od drgań rozciągających oraz deformacyjnych tego wiązania. Są to pasma położone (analogicznie jak w widmie ramanowskim kwasu tłuszczowego) przy ok. 1270, 1659 oraz 3008 cm -1

70 (zaznaczone na rysunku 2.8 kolorem niebieskim). W tabeli 2.3 zestawionio pasma obserowane na widmach ramanowskich tripalmitynianu oraz trioleinianu glicerolu wraz z ich przypisaniem. Tabela 2.3. Zestawienie położenia pasm wraz z ich przypisaniem dla widma trójglicerydów przedstawionych na rysunku 2.8. Położenie pasma [cm -1 ] Przypisanie 875 ν (C C) 1066 ν (C C) 1084 ν (C C) 1270 δ(ch 2 ) 1302(6) τ (CH 2 ) 1445 (7) α (CH 2 /CH 3 ) 1470 β (CH 2 /CH 3 ) 1659 ν(c=c) 1745(9) ν(c=o) 2850(3) ν s (=CH 2 ) 2884 ν as (=CH 2 ) 2905 ν as (=CH 2 ) 2932 ν s (=CH 3 ) 3008 ν(=ch)

71 Rys. 2.8. Widma dwóch trójglicerydów o różnym stopniu nienasycenia: tripalmitynianu oraz trioleinianu glicerolu wraz z położeniem pasm.

72 *** Kolejną interesującą grupą lipidów są cholesterole (tj. cholesterol oraz jego estry). Związki te mają w swojej strukturze pierścień, którego drgania są źródłem szeregu specyficznych pasm. Na rysunku 2.9 przedstawiono ramanowskie widmo cholesterolu oraz jego dwóch estrów palmitynianu oraz oleinianu. Widmo ramanowskie cholesterolu jest bogate w pasma. Niektóre z nich jak np. pasmo położone przy 1442 cm -1 nie są specyficzne wyłącznie dla cholesterolu, a raczej dla całej grupy lipidów. Widoczne jest również pasmo pochodzące od drgań wiązań podwójnych w pierścieniu (około 1672 cm -1 ). Nie oznacza to jednak, że są to wiązania w konformacji trans. Energia drgań wiązań wielokrotnych w pierścieniu będzie jednak nieco inna niż w przypadku wolnych kwasów tłuszczowych. Profil spektralny widma szczególnie w wysokim zakresie jest dla cholesterolu na tyle charakterystyczny, że pozwala go jednoznacznie odróżnić od pozostałych lipidów. Przykładem pasma pochodzącego od pierścienia cholesterolu jest pasmo położone przy około 700 cm -1, związane z drganiami deformacyjnymi pierścienia cholesterolu. Estry cholesterolu zbudowane są z pierścienia cholesterolu oraz odpowiedniej reszty kwasu tłuszczowego przyłączonej za pomocą wiązania estrowego. Z tego względu w ich widmie ramanowskim

73 podobnie jak w przypadku każdego estru obserwować będziemy pasmo położone przy około 1740 cm -1 (drganie rozciągające wiązanie C=O). Widoczne będą również pasma markerowe dla reszty kwasu tłuszczowego. A zatem, np. w przypadku gdy jest to kwas tłuszczowy nienasycony, obserwować będziemy pasma pochodzące od drgań wiązań wielokrotnych w łańcuchu (tj. m.in. pasma przy około 1659 i 3009 cm -1 ). Ponieważ w obrębie takiej molekuły występuje w dalszym ciągu pierścień cholesterolowy na widmie występować będą również pasma charakterystyczne dla niego tj. przy ok. 700 cm -1 (drgania deformacyjne pierścienia) oraz 1668 cm -1 (drgania wiązań podwójnych w pierścieniu). Warto zwrócić tutaj uwagę na przykład oleinianu cholesterolu, dla którego w zakresie 1620 1700 cm -1 pojawiają się w rzeczywistości dwa pasma (niezbyt wyraźnie rozdzielone) jedno, od drgania wiązania podwójnego w łańcuchu kwasu tłuszczowego (ok. 1659 cm -1 ) oraz drugie od drgań wiązań podwójnych pierścienia (ok. 1668 cm -1 ).

74 Rys. 2.9. Widma ramanowskie cholesterolu oraz jego dwóch estrów nasyconego (palmitynian) i nienasyconego (oleinian).

75 Podsumowanie: Obecność lipidów w próbce na podstawie widma ramanowskiego można zidentyfikować z łatwością m.in. na podstawie pasm położonych przy 1300 i 1444 cm -1. Obecność wiązania wielokrotnego w lipidach potwierdzają pasma pochodzące od ich drgań położone przy ~1266, 1656 oraz 3010 cm -1. Stopień nienasycenia można wyznaczyć z widma ramanowskiego korzystając ze stosunków intensywności (integralnej) pasm pochodzących od wiązań wielokrotnych i pojedynczych, korzystając z następujących kryteriów: I 1266 /I 1305 I 1656 /I 1444 I 3010 /I 2885 Obecność estrów (kwasów tłuszczowych, cholesterolu, itd.) można potwierdzić na podstawie występowania pasma od drgania rozciągającego wiązanie estrowe, położonego przy ok. 1740 cm -1. Obecność cholesterolu można potwierdzić na podstawie jego profilu spektralnego (wysoki zakres, tj. 2800 3050 cm -1 ) oraz obecności pasm pochodzących od drgań pierścienia cholesterolu (np. ok. 701 cm -1 ). O obecności estrów cholesterolu świadczy natomiast współwystępowanie pasma pochodzące od estrów (~1740 cm -1 ) oraz pasm pochodzących od pierścienia cholesterolu (np. ~701 cm -1 ).

76 2.3. Interpretacja widm ramanowskich - białka Kolejną grupą związków, których analizę można przeprowadzić metodą spektroskopii ramanowskiej są białka. W przypadku białek najbardziej charakterystyczne pasma związane są z grupą CONH. W tabeli 2.4 zestawiono położenia pasm amidowych oraz ich pochodzenie. Dla identyfikacji konformacji białek szczególne znaczenie ma położenie pasm amidowych I, II oraz III. Położenia tych pasm zmieniają się znacznie, w zależności od tego, czy dane białko występuje w formie α lub β. Typowo, dla struktury α pasmo amidowe I położone jest w zakresie pomiędzy 1655 a 1662 cm -1. Dla struktury β natomiast pasmo amidowe I przesunięte jest w kierunku wyższych wartości liczb falowych, tj. 1672 1674 cm -1. Odwrotną zależność możemy zaobserwować dla pasma amidowego III, występującego zazwyczaj w przedziale 1264 1274 cm -1 dla struktury α oraz w przedziale 1227 1242 cm -1 dla białek w konformacji β-kartki. Z powyższych informacji wynika jasno, iż spektroskopia ramanowska pozwala na identyfikację struktury II-rzędowej białek. W niniejszym rozdziale przedstawione zostaną przykłady widm białek o budowie wyłącznie α-helisy, β-kartki oraz złożonych, zaliczanych do grup α/β i α + β (posiadających fragmenty formujące zarówno strukturę wyłącznie α-helisy jak i β-kartki, ulokowane w sposób uporządkowany lub nieuporządkowany).

77 Tabela 2.4. Zestawienie zakresów występowania charakterystycznych pasm amidowych oraz ich pochodzenia. Pasmo Położenie pasma (zakres) Pochodzenie [cm -1 ] Amidowe A ~ 3500 Drganie rozciągające N-H Amidowe B ~ 3100 Drganie rozciągające N-H Amidowe I 1600 1690 Drganie rozciągające C=O Amidowe II 1480 1580 Drganie rozciągające C-N Amidowe III 1230 1300 oraz drganie zginające N-H* Amidowe IV 625 770 Drganie zginające O-C-N Amidowe V 640 800 Drganie zginające** N-H Amidowe VI 540 600 Drganie zginające** C=O Amidowe VII ~ 200 Drgania szkieletowe * drgania sprzężone ** poza płaszczyznę (z ang. out of plane) Na rysunku 2.10 przedstawiono widmo albuminy białka należącego do grupy α. Jest to klasyczny przykład białek o konformacji α (zerowa zawartość struktury β).

78 Rys. 2.10. Widma ramanowskie albuminy (reprezentującej białka grupy α) z zaznaczonymi położeniami pasm oraz pochodzeniem (dla wybranych). widm spektroskopowych i spektrometrycznych okiem młodych naukowców,

79 Jak widać na widmie ramanowskim, zarówno położenie pasma amidowego I (1657 cm -1 ), jak i pasma amidowego III (1273 cm -1 ) potwierdzają strukturę albuminy jako α- helisę. W przypadku analizy widm ramanowskich białek należy również liczyć się z obecnością pasm pochodzących od aminokwasów budujących owe białka. Przykładem tego mogą być pasma położone przy 1009 cm -1 oraz przy 1321 i 1341 cm -1, pochodzące odpowiednio od fenyloalaniny i tryptofanu. W tabeli 2.5 zestawiono przypisanie pasm widocznych na widmie albuminy. Tabela 2.5. Zestawienie położeń pasm wraz z ich przypisaniem dla widma albuminy (α-helisa) przedstawionego na rysunku 2.10. Położenie pasma [cm -1 ] 1009 Fenyloalanina Przypisanie 1273 Amidowe III (ν(c-n) + δ(n-h)) 1321 Tryptofan (δ(c a H) 1341 Tryptofan (δ(c a H) 1454 δ(c-h) 1657 Amidowe I (ν(c=o) 3060 ν(n-h) Na rysunku 2.11 przedstawiono przykład białka elastyny o strukturze β-kartki.

80 Rys. 2.11. Widmo ramanowskie elastyny (reprezentującej białka grupy β) z zaznaczonymi położeniami pasm oraz pochodzeniem (dla wybranych). widm spektroskopowych i spektrometrycznych okiem młodych naukowców,

81 Jak można zauważyć, położenia pasm amidowych są wyraźnie różne niż dla albuminy (struktura α). Szczególnie przydatne do oceny konformacji okazuje się być ponownie pasmo amidowe I (1668 cm -1 ) oraz pasmo amidowe III (1240 cm -1 ). Poza charakterystycznymi pasmami amidowymi obserwujemy szereg pasm pochodzących od aminokwasów, w szczególności od fenyloalaniny, tyrozyny oraz tryptofanu. W tabeli 2.6 zestawiono położenia oraz pochodzenie pasm widocznych na widmie elastyny. Tabela 2.6. Zestawienie położeń pasm wraz z ich przypisaniem dla widma elastyny (β-kartka) przedstawionego na rysunku 2.11. Położenie pasma [cm -1 ] 760 Tryptofan 1009 Fenyloalanina Przypisanie 1240 Amidowe III (ν(c-n) + δ(n-h)) 1343 Tryptofan (δ(c a H) 1452 δ(c-h) 1544 Tryptofan (pierścień indolowy) 1621 Tyrozyna, tryptofan, fenyloanalina 1668 Amidowe I (ν(c=o) 3062 ν(n-h) Na rysunku 2.12 przedstawiono dwa przykłady białek o mieszanej strukturze

82 Rys. 2.12. Widma ramanowskie proteinazy i papainy (reprezentującej białka z grup α/β oraz α+β) z zaznaczonymi położeniami pasm.

83 W tabeli 2.7 zestawiono przypisanie poszczególnych pasm widocznych na widmach. Tabela 2.7. Zestawienie położeń pasm wraz z ich przypisaniem dla widm białek mieszanych (α/β i α+β) przedstawionych na rysunku 2.12. Położenie pasma [cm -1 ] 820 Tryptofan 851(6) Tyrozyna Przypisanie 931 N C α C (α-helisa) 1006(11) Fenyloalanina 1240 1273 Amidowe III (ν(c-n) + δ(n-h)) (β-kartka) Amidowe III (ν(c-n) + δ(n-h)) (α-helisa) 1339(47) Tryptofan (δ(c a H) 1452(6) δ(c-h) 1546 Tryptofan (pierścień indolowy) 1617(19) Tyrozyna, tryptofan, fenyloanalina 1668(9) Amidowe I (ν(c=o) 3062 ν(n-h)

84 Jak widać, na widmie białek mieszanych również pojawiają się sygnały od aminokwasów wchodzących w ich skład. Położenia pasm amidowych sugerują obecność zarówno struktury α, jak i β. Jest to widoczne szczególnie w przypadku pasma amidowego III, o złożonej strukturze. W zakresie pomiędzy 1200 a 1300 cm -1 widoczny jest szereg pasm o maksimach odpowiadających zarówno α-helisie (1273 cm -1 ) jak i β- kartce (1240 cm -1 ). Również położenie pasma amidowego I sugeruje strukturę mieszaną leży ono w zakresie pomiędzy zakresem charakterystycznym dla struktury β (1672 1674 cm -1 ) a zakresem charakterystycznym dla struktury α (1655 1662 cm -1 ). Podsumowanie: W widmach ramanowskich białek widoczne będą sygnały charakterystyczne zarówno dla ugrupowania CONH (pasma amidowe), jak i pasma pochodzące od poszczególnych aminokwasów, budujących białka. Określenie struktury białka z widm ramanowskich jest możliwe na podstawie położenia pasm amidowych (w szczególności pasma amidowego I i III). Dla struktury α pasma te leżą odpowiednio w zakresach: 1655 1662 cm -1 (pasmo amidowe I) i 1264 1274 cm -1 (pasmo amidowe III), natomiast dla struktury β: 1672 1674 cm -1 (pasmo amidowe I) i 1227 1242 cm -1 (pasmo amidowe III).

85 2.4. Interpretacja widm ramanowskich - węglowodany Kolejną grupa związków chemicznych są węglowodany. Widma ramanowskie węglowodanów są bogate w sygnały, szczególnie w zakresie niskich wartości liczb falowych. Przykład widma glukozy oraz galaktozy przedstawiono na rysunku 2.13. Jak można zauważyć na rysunku 2.13, w przypadku widm ramanowskich węglowodanów, obserwujemy szereg pasm w zakresie 200 1400 cm -1. Bogactwo pasm w widmie ramanowskim jest charakterystyczne dla cukrów, szczególnie w odniesieniu do pasm położonych w zakresie niższych wartości liczb falowych. Intensywność i położenia poszczególnych pasm są różne dla różnych cukrów. Co więcej, przykładowo dla D- galaktozy pasma z wysokiego zakresu nie są znacząco intensywniejsze od pasm w zakresie odcisku palca. Szczegółowe przypisanie poszczególnych pasm przedstawiono w tabeli 2.8..

86 Rys. 2.13. Widma ramanowskie D-glukozy (niebieskie) i D-galaktozy (czerwone) z zaznaczonymi położeniami pasm.

87 Tabela 2.8. Zestawienie położeń pasm wraz z ich przypisaniem dla widm węglowodanów przedstawionych na rysunku 2.13. Położenie pasma [cm -1 ] D-glukoza D-galaktoza 405 395 543 515 843 830 917 891 Przypisanie Odkształcenia endocykliczne Odkształcenia egzocykliczne δ(coh), δ(cch), δ(och) δ(coh), δ(cch), δ(och) 1077 - ν(c-o), ν(c-c) 1109 - ν(c-o), ν(c-c) 1348 1249 δ(ch 2 ), δ(ch 2 OH), 2890 2916 ν(ch 2 ) 2944 2971 ν(ch 2 ) 3393 3378 ν(nh), ν(oh)

88 2.5. Interpretacja widm ramanowskich - układy złożone Znając spektralną charakterystykę poszczególnych grup związków oraz przydatność spektroskopii ramanowskiej do ich badania możliwa jest interpretacja widm, pochodzących nie tylko z prostych próbek, ale również ze złożonych układów, np. materiałów biologicznych. Na rysunku 2.14 przedstawiono widma pochodzące z różnych obszarów tkanki wątroby. Widmo tkanki będzie zawierać jednocześnie sygnały od wszystkich grup związków omówionych dotychczasowo. Zbliżone położenie dla wielu pasm pochodzących od różnych związków czyni widma takie trudnymi do interpretacji. Jako przykład podać można położenie pasma amidowego I (~1650 cm -1 ) i pasma pochodzącego od lipidów nienasyconych (~1656 cm -1 ). W celu uniknięcia błędnego przypisania pasm analizę należy prowadzić z uwzględnieniem profilu spektralnego widma. W takim wypadku warto zwracać uwagę na współwystępowania pasm. Przykładowo, na rysunku 2.14 zarówno na widmie niebieskim, jak i czerwonym obserwujemy pasma położone odpowiednio przy 1659 i 1657 cm -1. W przypadku widma niebieskiego jednakże wyraźnie widoczne są również inne pasma charakterystyczne dla lipidów (w tym również lipidów nienasyconych) tj. pasma położone przy 1268 cm -1, 1304 cm -1, 1443 cm -1, czy 3011 cm -1. Profil spektralny widma oraz współobecność

89 innych pasm lipidowych pozwalają zatem na przypisanie pasma położonego przy 1659 cm -1 przede wszystkim do drgań rozciągających ugrupowania C=C w lipidach. Należy jednak pamiętać, że w przypadku rzeczywistego widma materiału biologicznego, wkład do wspominanego pasma mają również sygnały białkowe. Na podstawie profilu spektralnego widma niebieskiego można stwierdzić, że jest to wkład niewielki, nie można go jednak zupełnie wyeliminować. Analizując widmo niebieskie z rysunku 2.14 można zatem stwierdzić, że pochodzi ono z obszaru bogatego w lipidy. Co więcej, w obszarze tym z pewnością znajdują się zarówno lipidy nasycone, jak i nienasycone. Obecność pasma pochodzącego od drgania wiązania C=O wskazuje również na obecność estrów. Brak charakterystycznych sygnałów dla estrów cholesterolu pozwala przypuszczać, że w próbce obecne są trójglicerydy. Na podstawie zaprezentowanego widma możliwe jest również określenie np. stopnia nienasycenia w badanej próbce. W przypadku obszaru II (widmo czerwone) widmo staje się nieco bardziej skomplikowane. Na podstawie obecności pasm położonych przy 1444 i 3006 cm -1 stwierdzić można obecność lipidów. Niewielka intensywność tych pasm sugeruje jednak ich małą zawartość. Tym samym pasmo położone przy ok. 1657 cm -1 pochodzi zarówno od drgań rozciągających wiązania C=C w lipidach (obecność pasma położonego przy ok. 3006 cm -1 wskazuje na obecność lipidów

90 nienasyconych), jak i od drgań rozciągających C=O w białkach (pasmo amidowe I), przy czym wkład drugiego czynnika jest znacząco większy. Rys. 2.14. Widma ramanowskie pochodzące z dwóch obszarów tkanki wątroby o różnej kompozycji z zaznaczonymi położeniami pasm.

91 Podobnie, interpretacja pochodzenia pasma przy ok. 1258 cm -1 jest skomplikowana. Może ono pochodzić zarówno od białek (pasmo amidowe III), jak i lipidów. Pozostałe pasma widoczne na widmie, potwierdzają obecność obu tych grup komponentów. Profil spektralny widma oraz kształt wspomnianego pasma sugerują znacznie większy udział drgań amidowych. Wreszcie, najintensywniejsze pasmo na widmie położone przy ok. 1590 cm -1 jest pasmem charakterystycznym dla ugrupowań hemowych. Ich wysoką zawartość potwierdza również obecność pasm położonych przy 751 i 1134 cm -1 (pasma markerowe ugrupowań hemowych), a także znaczące podniesienie tła w zakresie 600 1600 cm -1. W tabeli 2.9 zestawiono położenia pasm zaobserwowanych na dwóch widmach pochodzących z tkanki wątroby wraz z ich przypisaniem. Tabela 2.9. Zestawienie położeń pasm wraz z ich przypisaniem dla widm tkanki wątroby przedstawionych na rysunku 2.14. Położenie pasma [cm -1 ] Przypisanie Obszar I Obszar II - 751 Ugrupowania hemowe 856 - Prolina, hydroksyprolina, tyrozyna 1070 - ν s (PO 2 - ) (DNA) 1134 Ugrupowania hemowe

92 1268 - δ(ch 2 ) (lipidy) - 1258 1304 1304 τ (CH 2 ) δ(ch 2 ) (lipidy) + pasmo amidowe III 1443 1444 α (CH 2 /CH 3 ) - 1590 Ugrupowania hemowe - 1657 ν(c=c) (lipidy) = pasmo amidowe I 1659 - ν(c=c) (lipidy) 2853 2850 ν s (=CH 2 ) - 2894 ν as (=CH 2 ) - 2932 ν s (=CH 3 ) 3006 3011 ν(=ch)

93 3 Spektroskopia IR 3.1. Wstęp Absorpcyjna spektroskopia w podczerwieni (IR) jest metodą komplementarną do spektroskopii ramanowskiej (RS). Dla obu tych technik obowiązuję tzw. zakaz alternatywny, zgodnie z którym dla molekuł centrosymetrycznych drgania aktywne w spektroskopii IR nie będą aktywne w spektroskopii RS (oraz odwrotnie). Dlatego też, pełne widmo oscylacyjne możemy uzyskać dzięki zastosowaniu obu tych technik równocześnie. Widmo absorpcyjne w podczerwieni reprezentuje

94 zależność intensywności promieniowania od jego częstości, przedstawianą najczęściej w postaci krzywej Lorentza. Pasma na widmie niosące informację o wzbudzonych oscylacjach molekularnych charakteryzuje się poprzez podanie takich parametrów jak: położenie maksimum, intensywność integralną pasma oraz jego szerokość połówkową. Absorpcja promieniowania podczerwonego indukuje przejścia pomiędzy poziomami oscylacyjnymi. Każda cząsteczka chemiczna posiada swój własny, niepowtarzalny zestaw poziomów energetycznych, a tym samym również unikatowe widmo w podczerwieni. Jednakże te same grupy funkcyjne, ujęte jako indywidualne oscylatory, występujące w różnych molekułach charakteryzują się zbliżoną wartością energii drgań. Oznacza to, że pasma o określonej częstości mogą być przypisane konkretnym drganiom odpowiednich grup atomów. Co prawda, każde pasmo stanowi w rzeczywistości złożenie kilku drgań normalnych, zazwyczaj jednak jedno z nich charakteryzuje się znacznie większą amplitudą drgań od pozostałych, a tym samym jego wkład w dane pasmo jest największy. Stanowi to fundament standardowego podejścia do analizy widm, polegającego na przypisaniu pasm do konkretnych drgań grup atomów oraz na tej podstawie określenia składu chemicznego. Podobnie jak w przypadku spektroskopii RS, możliwe jest przeprowadzenie analizy jakościowej oraz ilościowej.

95 Do analizy ilościowej konieczna jest wcześniejsza kalibracja. Spektroskopia IR wykorzystuje dwa interesujące zakresy: tzw. fingerprint (0 1800 cm -1 ) oraz wysoki zakres (2800 3500 cm -1 ). W obszarze pomiędzy tymi dwoma zakresami (1800 2800 cm -1 ) nie występują zazwyczaj pasma (z wyjątkiem pasma od CO 2 lub pasm związanych z ligandami cyjanowymi). W przypadku spektroskopii IR do analizy wykorzystuje się zazwyczaj nie tylko same widma, ale również ich drugie pochodne. Do wyliczania drugich pochodnych wykorzystuje się różne algorytmy, jednak najpowszechniejszym jest algorytm Savitzky Golay a. Algorytm ten dopasowuje wielomian n tego rzędu do widma, uwzględniając każdorazowo określoną liczbę punktów (definiowaną przez osobę analizującą) wokół każdego maksimum. Przykładowo, wybór 9 punktów wygładzania oznacza, iż algorytm uwzględni po 4 punkty po prawej oraz lewej stronie maksimum pasma oraz samo maksimum i na podstawie tych punktów dopasuje krzywą. Dobór liczby punktów wygładzania jest uzależniony od jakości widma. Im wyższy poziom szumów, tym większa liczba stosowanych punktów wygładzania. Jednocześnie, należy mieć jednak na uwadze, że zbyt duża liczba punktów wygładzania doprowadzi do zniekształcenia pasm oraz zafałszowania informacji w widmie. W niniejszym rozdziale przedstawione zostanie podejście do interpretacji widm na przykładzie wybranych

96 związków z grupy lipidów, białek oraz cukrów, a także na przykładzie rzeczywistych próbek. Przed analizą wybranych widm w podczerwieni czytelnik zostanie wprowadzony w praktyczne różnice pomiędzy technikami pomiarowymi. Przy interpretacji wykorzystane zostaną zarówno widma, jak i ich drugie pochodne, wyliczane za pomocą algorytmy Savitzky ego Golay a, z zastosowaniem 9 punktów wygładzania. 3.1.1. Tryby pomiarowe Absorpcyjna spektroskopia w podczerwieni umożliwia wykonywanie pomiarów w różnych trybach: transmisji, refleksji, transfleksji (połączenie trybu transmisji i refleksji) oraz techniką ATR (z ang. Attenuated Total Reflectance), wykorzystującą zjawisko całkowitego wewnętrznego odbicia. Widma, zarejestrowane w różnych trybach pomiarowych, będą wykazywały charakterystyczne cechy. Poniżej przedstawiono w skrócie istotne zagadnienia dotyczące pomiarów w różnych trybach. 3.1.1.1. Porównanie transmisji i transfleksji Najczęstszym sposobem rejestracji widm jest technika transmisji. Coraz większą popularność zyskuje również tryb transfleksji, szczególnie w kontekście cienkich materiałów (np. biologicznych) ze względu na niemal dwukrotne wydłużenie drogi optycznej (a tym samym

97 wzrost intensywności sygnału). Na rysunku 3.1 przedstawiono przykład dwóch widm wątroby (w bloku parafinowym), zarejestrowanych w trybie transmisji oraz transfleksji. Pomiędzy przedstawionymi widmami występują oczywiście pewne różnice natury biologicznej. Z punktu widzenia niniejszego rozdziału istotnymi są jednak różnice wynikające z trybów pomiarowych. Najistotniejszą różnicą między widmami rejestrowanymi w trybie transmisji i transfleksji jest różny stosunek pasm z wysokiego zakresu (tj. 2800 3500 cm -1 ) do pasm z obszaru odcisku palca (tj. dla widm z rysunku 3.1: 900 1800 cm -1 ). Można to zaobserwować na rysunku 3.1 poprzez porównanie stosunku intensywności pasm wysokiego zakresu np. do pasma amidowego I (~ 1650 cm -1 ). Różnice te stają się zdecydowanie bardziej widoczne podczas analizy drugich pochodnych (rysunek 3.2). Można stwierdzić, że stosunek intensywności pasm z zakresu odcisku palca do intensywności pasm z wysokiego zakresu jest wyższy dla widm mierzonych w trybie transmisji, w porównaniu do widm mierzonych techniką transfleksji.

98 Rys. 3.1. Widma IR tkanki wątroby w bloku parafinowym zarejestrowane w trybie transmisji (czerwone) oraz transfleksji (czarne).

99 Rys. 3.2. Pochodne widm IR tkanki wątroby w bloku parafinowym zarejestrowanych w trybie transmisji (czerwone) oraz transfleksji (czarne).

100 3.1.1.2. Widma rejestrowane techniką ATR Intensywność sygnału rejestrowanego w technice ATR jest uzależniona od głębokości penetracji fali stojącej, zgodnie z zależnością: I(z) = I(0) exp( z d p ) (3.1) gdzie: I(z) natężenie fali stojącej w odległości z I(0) natężenie fali stojącej na granicy ośrodków z odległość od powierzchni kryształu d p głębokość penetracji Głębokość penetracji fali zależy z kolei od długości fali światła padającego w następujący sposób: λ d p = (3.2) 2πn c sin 2 (θ) (n p n c ) 2 gdzie: λ długość fali światła padającego Θ kąt padania n C współczynnik refrakcji kryształu n p współczynnik refrakcji próbki Należy więc spodziewać się na widmie ATR zmienności w zależności intensywności sygnału od liczby

101 falowej, przy której jest ona rejestrowana. Dlatego też, w celu umożliwienia porównywania widm uzyskanych techniką ATR z widmami transmisyjnymi, konieczne jest wprowadzenie odpowiedniej korekty. Na rysunku 3.3 przedstawiono przykład widm ATR kolagenu przed oraz po korekcie ATR. Wskutek zastosowania poprawki na względną intensywność wyraźnemu zwiększeniu uległa intensywność wszystkich pasm. Przykładem obserwowanej zależności może być pasmo amidowe I (~ 1647 cm -1 ), stanowiące najintensywniejsze pasmo na obu widmach. Wskutek wprowadzenia korekty jego intensywność wzrasta około 2,5 razy. Zmiana intensywności następuje w różnym stopniu dla poszczególnych pasm. Miarą tego zróżnicowania może być stosunek intensywności względem standardu. Znaczące uwypuklenie obserwowane jest dla pasm z zakresu powyżej 2600 cm -1, a więc dla mniejszych długości fali. Przykładem może być pasmo przy ~3300 cm -1, którego intensywność wskutek korekty wzrasta niemal 5 krotnie. Z kolei pasmo przy ok. 1072 cm -1 ulega spłaszczeniu. Chociaż jego intensywność również wzrasta, to jest to wzrost mniejszy niż dla pasma amidowego I, stąd intensywność pasma przy ok. 1072 cm -1 względem pasma amidowego I maleje. Powyższe obserwacje są zgodne z przewidywaniami teoretycznymi. Na podstawie wzorów 1 i 2 można bowiem stwierdzić, że głębokość penetracji fali stojącej, a więc

102 również intensywność rejestrowanego sygnału, wzrasta w kierunku niższych liczb falowych. Rys. 3.3. Widma ATR IR kolagenu przed (czarne) i po porawce ATR (czerwone).

103 3.2. Interpretacja widm IR - lipidy Znając różnice wynikające z trybów pomiarowych oraz konieczne poprawki można przystąpić do analizy przykładowych widm. Pierwszą grupą związków prezentowanych w niniejszym rozdziale są lipidy. Na rysunku 3.4 przedstawiono widmo reprezentanta tej grupy kwasu palmitynowego. W tabeli 3.1 zestawiono natomiast obserwowane położenia pasm wraz z przypisaniem ich pochodzenia. Rys. 3.4. Widmo IR kwasu palmitynowego wraz z przypisanym położeniem pasm.

104 Tabela 3.1. Zestawienie pasm widocznych na widmie IR kwasu palmitynowego (rys. 3.4) wraz z ich przypisaniem. Położenie pasma [cm -1 ] Przypisanie 698 δ(o-c=o) 772 δ(ch 2 ) 940 δ(coh) 1098 δ(ch 2 ) 1188 δ(ch 2 ) 1228 δ(ch 2 ) 1271 ν(c-oh) 1293 ν(c-oh) 1411 δ(ch 2 ) (drganie zginające) 1430 δ(coh) 1463 δ(ch 2 ) (drganie nożycowe) 2847 ν s (CH 2 ) 2914 ν as (CH 2 ) 2954 ν as (CH 3 ) Jak widać, widmo kwasu palmitynowego jest bogate w sygnały zarówno w wysokim zakresie, jak i w obszarze odcisku palca. Szczególnie pasma z wysokiego zakresu charakteryzują się dużą intensywnością. Oczywiście, w spektroskopii IR, podobnie jak w spektroskopii RS możliwa jest identyfikacja obecności lipidów nienasyconych, a także estrów (w tym trójglicerydów oraz estrów cholesterolu). Szczególną

105 cechą spektroskopii IR, w kontekście tych ostatnich, jest możliwość identyfikacji i potwierdzenia obecności cholesterolu przy współobecności jego estrów. Na rysunku 3.5 przedstawiono widmo czystego cholesterolu oraz jego estru oleininanu cholesterolu. Jak można zaobserwować, widma cholesterolu i jego estru różnią się istotnie. Przede wszystkim, na widmie oleinianu cholesterolu obecne jest pasmo pochodzące od drgania rozciągającego wiązanie estrowe C=O. Pasmo to będzie obecne na widmach wszystkich estrów, pozwalając na ich łatwe odróżnienie od widm czystych kwasów tłuszczowych. Jednakże w przypadku badania próbki, będącej mieszaniną czystego cholesterolu i jego estrów (lub też cholesterolu i dowolnych estrów), istotne znaczenie dla jednoznacznego potwierdzenia obecności niezwiązanego cholesterolu ma fakt, iż na jego widmie widoczne jest pasmo nieobecne w przypadku widm jego estrów. Pasmo to jest położone przy ok. 1055 cm -1. W tabeli 3.2 zestawiono położenia pasm zaznaczonych na rysunku 3.5 wraz z ich przypisaniem...

106 Rys. 3.5. Widma IR cholesterolu i oleinianu cholesterolu z zaznaczonymi pasmami charakterystycznymi dla: cholesterolu (niebieskie) i estrów (czerwone).

107 Tabela 3.2. Zestawienie pasm widocznych na widmach IR cholesterolu i oleinianu cholesterolu (rys.3.5) wraz z ich przypisaniem. Położenie pasma [cm -1 ] Oleinian Cholesterol cholesterolu 1055 - - 1169 Przypisanie Pasmo markerowe cholesterolu Pasmo markerowe estrów cholesterolu 1464 1465 δ(ch 2 ) (drganie nożycowe) - 1737 ν (C=O) (estry) 2868 2885 ν s (CH 2 ) 2933 2930 ν s (CH 2 ) 3.3. Interpretacja widm IR - białka Kolejną grupą omawianych związków chemicznych są białka. Podobnie, jak w przypadku rozdziału dotyczącego interpretacji widm RS, również w spektroskopii IR możemy zidentyfikować 9 podstawowych pasm związanych z drganiami grup amidowych. Pasma te (pochodzenie oraz zakres ich występowania) zestawiono w tabeli 3.3..

108 Tabela 3.3. Zestawienie zakresów występowania charakterystycznych pasm amidowych oraz ich pochodzenia w spektroskopii IR. Pasmo Położenie pasma (zakres) [cm -1 ] Amidowe A ~ 3300 Amidowe B ~ 3100 Amidowe I 1600 1700 Pochodzenie Drganie rozciągające N-H Drganie rozciągające N-H (ok. 80%) Drganie rozciągające C=O Amidowe II 1480 1575 (40 60 %) Drganie rozciągające C-N oraz drganie Amidowe III 1230 1300 Amidowe IV 625 770 Amidowe V 640 800 Amidowe VI 540 600 zginające N-H* Drganie zginające O-C-N Drganie zginające** N-H Drganie zginające** C=O Amidowe VII ~ 200 Drgania szkieletowe Spektroskopia IR doskonale nadaje się do określania struktury II-rzędowej białek. Szczególnie przydatne do tego celu są pasma amidowe I i II, pochodzące od drgań ugrupowań peptydowych. Ponieważ geometria grupy peptydowej zależy od struktury II-rzędowej, pasma te uważane są za markery owej struktury. W tabeli 3.4 zastawiono położenia pasm amidowych I i II w zależności

109 od struktury II-rzędowej białka. Tabela 3.4. Położenie pasm amidowych I i II w zależności od struktury II-rzędowej białka. Pasmo Położenie [cm -1 ] Pasmo amidowe I Pasmo amidowe II ~ 1695 ~ 1685 Struktura IIrzędowa Antyrównoległa β-kartka ~ 1650 α helisa ~ 1640 β-kartka ~ 1540 α helisa ~ 1550 β-kartka Poniżej przedstawiono przykłady widm IR (oraz ich drugich pochodnych) dla białek reprezentujących strukturę α, β oraz struktury mieszane α+β i α/β. Rysunek 3.6 przedstawia widmo IR białka, reprezentującego grupę białek o strukturze α. Widmo to zostało wykonane w pastylce KBr. Jak widać, widmo IR choć uboższe w pasma od widma RS pozwala wyraźnie zaobserwować co najmniej trzy pasma amidowe. Pasmo amidowe I oraz II charakteryzują się znaczącą intensywnością. Ich położenia odpowiednio przy 1659 i 1537 cm -1 odpowiadają strukturze α.

110 Rys. 3.6. Widmo IR albuminy wykonane w pastylce KBr. Na rysunku 3.7 przedstawiono widmo tego samego białka, jednak wykonane w trybie ATR (po uwzględnieniu korekty ATR) oraz drugą pochodną tego widma. Jak widać, położenia pasm różnią się nieznacznie. W dalszym ciągu pozostają jednak charakterystyczne dla struktury α. Co więcej, położenia pasm pozostają stałe również dla drugich pochodnych. Jednakże, zastosowanie drugich pochodnych pozwala na rozdzielenie sygnałów, które na widmie IR widoczne są jako pojedyncze pasmo. Przykładowo, w zakresie 1500 1700 cm -1 na widmie IR obserwujemy dwa pasma (amidowe I i II), podczas gdy na drugiej pochodnej widma, możliwe jest wyodrębnienie co najmniej 4 maksimów.

111 Rys. 3.7. Widmo IR albuminy wykonane w trybie ATR oraz jego druga pochodna. Na rysunku 3.8 przedstawiono z kolei widmo IR (ATR) trypsyny białka należącego do grupy β. Już z samego

112 widma odczytać można położenie pasma amidowego I charakterystyczne dla struktury β-kartki (1637 cm -1 ). Z drugich pochodnych widma można jednak oczytać znacznie więcej informacji. Przede wszystkim, oprócz zdecydowanie dominującej składowej pasma amidowego I położonej przy 1637 cm -1, widoczne są również niewielkie sygnały przy 1665 cm -1 i 1686 cm -1. Świadczą one o pewnej niewielkiej zawartości struktur α i β antyrównoległej. Widoczne również staję się położenie pasma amidowego II (1538 cm -1 ) oraz szereg innych sygnałów. Pochodzenie pasm, widocznych na rysunku 3.8 przedstawiono w tabeli 3.5. Tabela 3.5. Zestawienie położenia pasm wraz z ich przypisaniem dla widm (drugich pochodnych) trypsyny (rys. 3.8). Położenie pasma [cm -1 ] Przypisanie 1686 β kartka antyrów 1665 α helisa 1637 β kartka 1538 Pasmo amidowe II 1518 Tyrozyna 1453 δ (CH 2,CH 3 ) 1389 ν s (COO - ) 1235 Pasmo amidowe III Pasmo amidowe I

113 Rys. 3.8. Widmo IR trypsyny wykonane w trybie ATR oraz jego druga pochodna.

114 Na rysunku 3.9 przedstawiono widma dwóch białek o strukturze mieszanej: proteinazy (zaliczanej do grupy białek α/β) oraz papainy (należącej do grupy α+β). Jak widać, położenia pasm amidowych różnią się między tymi dwoma widmami. Są to jednak różnice nieznaczne. Dla proteinazy, położenie pasma amidowego I sugeruje dominujący udział struktury β. Z kolei położenie pasma amidowego II wydaje się być bliższe położeniu charakterystycznemu dla struktury α. W przypadku papainy natomiast pasmo amidowe I położone jest dokładnie pomiędzy położeniem charakterystycznym dla struktury α i struktury β. Świadczy to o obecności obu tych struktur w cząsteczce. Dokładniejszych informacji o strukturze II-rzędowej analizowanych białek dostarczyć mogą drugie pochodne widm, zaprezentowane na rysunku 3.10. W przypadku obu analizowanych białek pasmo amidowe I jest stosunkowo szerokie. Jego maksimum znajduje się w pozycji ok. 1638 cm -1, co świadczy o dużym udziale struktury β-kartki. Co więcej, widoczny jest również niewielki sygnał, odpowiadający strukturze antyrównoległej β-kartki. Szerokość pasm, oraz obecność pasma amidowego II w położeniu ~1540 cm -1 potwierdza obecność również struktury α helisy.

115 Rys. 3.9. Widma IR białek mieszanych: proteinazy (α/β) oraz papainy (α+β) wykonane w trybie ATR.

116 Rys. 3.10. Drugie pochodne widm IR białek mieszanych: proteinazy (α/β) i papainy (α+β) wykonane w trybie ATR.

117 3.4. Interpretacja widm IR - węglowodany Absorpcyjna spektroskopia w podczerwieni pozwala również na badanie grupy węglowodanów. Na rysunku 3.11 przedstawiono przykładowe widmo oraz jego drugą pochodną dla D-glukozy. Jak widać, widmo to cechuje się dużym bogactwem sygnałów. Profil spektralny pasm w wysokim zakresie jest charakterystyczny dla cukrów. Pasma występujące w tym zakresie są zazwyczaj związane z drganiami grup N-H lub O-H. W przypadku węglowodanów bogactwo grup OH w strukturze cząsteczki powoduje wystąpienie charakterystycznego, szerokiego pasma w wysokim zakresie. Porównując wyłącznie kształt pasm w wysokim zakresie (profil widma) możliwe jest szybkie rozróżnienie węglowodanów, lipidów i białek. W tabeli 6 zestawiono położenia pasm zaznaczonych na rysunku 3.11 wraz z ich przypisaniem. Na rysunku 3.11 przedstawiono również drugą pochodną widma D-glukozy. Widmo to zawiera szereg pasm w zakresie odcisku palca, stanowiące w większości złożenia różnych drgań (tabela 3.6). Stanowi ono bardzo dobry przykład, ilustrujący zasadność i ułatwienie interpretacji widm IR poprzez drugie pochodne. Przykładowo, pasmo zaznaczone na widmie kolorem czerwonym (~616 cm -1 ), jest w rzeczywistości złożeniem co najmniej dwóch pasm, co pokazują wyraźnie drugie pochodne (obszar zaznaczony kolorem czerwonym na drugiej pochodnej widma).

118 Tabela 3.6. Zestawienie położenia pasm wraz z ich przypisaniem dla widm D-glukozy (rys. 3.11). Położenie [cm -1 ] Przypisanie 616 CH 2 775 δ(cco) + δ(cch) 838 δ(ch) 913 ν(co)+ ν(cch) 994 ν(co)+ ν(cc) 1121 ν(co) 1110 ν(co) 1146 ν(co)+ ν(cc) 1339 δ(cch) + δ(och) 1380 δ(och)+ δ(coh)+ δ(cch) 1453 δ (CH 2 )+ δ(och)+ δ(cch)

119 Rys. 3.11. Widmo IR D-glukozy wraz z jego drugą pochodną.

120 3.5. Interpretacja widm IR - układy złożone Użyczeczność spektroskopii IR jest nieoceniona w zakresie badania układów złożonych. Przykładem takich układów mogą być materiały biologiczne. Na ich widmach obserwować będzie można sygnały pochodzące od wszystkich grup związków omówionych w niniejszym rozdziale. Podczas interpretacji, szczególnie przydatne okazują się drugie pochodne widma. Na rysunku 3.12 przedstawiono przykłady drugich pochodnych widm pochodzących z tkanek: mózgu oraz wątroby. Przedstawione widma różnią się dość znacząco. W przypadku mózgu wyraźnie intensywniejsze jest pasmo położone przy ok. 1731 cm -1, co świadczy o wyższej zawartości lipidów (w formie estrów). Są one również obecne w wątrobie, jednak w mniejszej zawartości. Co więcej, w przypadku mózgu pojawia się wyraźnie pasmo położone przy ok. 1059 cm -1, świadczące o obecności cholesterolu w formie niezwiązanej. W przypadku mózgu położenie pasma amidowego I oraz amidowego II wyraźnie wskazuje na dominujący udział struktury α białek budujących tkankę. W przypadku wątroby natomiast pasmo amidowe I przesunięte jest nieco w kierunku wyższych wartości liczb falowych. Co więcej, widoczne jest niewielkie ramię pasma, przy ok. 1685 cm -1, wskazujące na obecność również struktury β-antyrównoległej. Podobnie, położenie pasma amidowego II sugeruje obecność również białek w formie

121 β-kartki. W tabeli 3.7 zestawiono położenia pasm obserwowanych na rysunku 3.12 wraz z ich przypisaniem. Tabela 3.7. Zestawienie położeń pasm wraz z ich przypisaniem dla drugich pochodnych widm mózgu i wątroby przedstawionych na rysunku 3.12. Położenie pasma [cm -1 ] Mózg Wątroba Przypisanie 1056 - Cholesterol - 1085 1241 1238 s (PO 2 - ): fosfolipidy, kwasy nukleinowe as (PO 2 - ): fosfolipidy, kwasy nukleinowe, proteiny 1452 1451 δ(ch 2 ) 1540 1546 Pasmo amidowe II 1651 1657 Pasmo amidowe I - 1686 Pasmo amidowe I (struktura β antyrównoległa) 1731 1740 ν (C=O), estry

122 Rys. 3.12. Drugie pochodne widma IR dla tkanki mózgu i wątroby.

123 4 Spektroskopia UV-Vis 4.1. Wstęp W spektroskopii UV-Vis wykorzystuje się absorpcję promieniowania. Jest to metoda oparta na pomiarze stosunku natężeń lub absorbancji będącej funkcją tego stosunku, dwóch wiązek promieniowania w funkcji długości fali. Warunkiem wystąpienia absorpcji jest odpowiednia energia promieniowania padającego, która odpowiada różnicy energii poziomów elektronowych danej cząsteczki. Do zmiany w rozmieszczeniu elektronów w cząsteczce wymagana jest energia wynosząca kilka elektronowoltów. Emitowane, bądź absorbowane fotony

124 w czasie takiej zmiany, pochodzą z części widzialnej widma (obejmującego długość fali od 380 780 nm) lub z zakresu nadfioletowego (poniżej 380 nm). Dla próbek stałych oraz ciekłych obserwuje się szerokie pasma z uwagi na zlewanie się poszczególnych linii, z kolei dla próbek gazowych obserwuje się oscylacyjną strukturę widma. Przejście elektronowe polega na wzbudzeniu elektronu ze stanu podstawowego do stanu wzbudzonego, posiadającego wyższą energię. Wyróżniamy kilka typów przejść elektronowych: przejście typu charge-transfer, które polega na przeniesieniu elektronu z jednej cząsteczki na niezapełniony orbital drugiej cząsteczki; pierwsza cząsteczka pełni rolę donora, a druga akceptora elektronów; występują przejścia elektronu z ligandu na orbital typu d atomu centralnego (LMCT), bądź odwrotne przejście (MLCT), przejścia pomiędzy metalami (MMCT) oraz pomiędzy ligandami (LLCT), a także pomiędzy metalem a rozpuszczalnikiem (MSCT), bądź odwrotne (SMCT); istnieje również przejście pomiędzy parami jonowymi (IPCT); przejście typu d-d, które jest charakterystyczne dla związków kompleksowych metali, należących do bloku d układu okresowego pierwiastków; rozszczepienie poziomów w kompleksach

125 o symetrii oktaedrycznej jest niewielkie, a przejścia tego typu obserwowane są w zakresie widzialnym widma; rozszczepienie orbitali typu d jest odpowiedzialne za powstawanie barwy związków kompleksowych, w zależności od tego, jaki będzie stopień rozszczepienia orbitali różne będą barwy związków, gdyż różna będzie wartość energii przejść d-d; przejścia w związkach organicznych: z orbitalu σ na σ* oraz z orbitalu n na σ* wymagają znacznych energii, stąd pasma będą występowały w zakresie dalekiego ultrafioletu; przejścia z orbitalu π na π* oraz z orbitalu n na π* wymagają do przejścia mniejszej energii, i dlatego pasma będą obserwowane przy dłuższej długości fali niż w przypadku przejść na antywiążący orbital σ*. Istotne z punktu widzenia interpretacji widm jest zjawisko solwatochromizmu, które polega na zmianie położenia pasma w zależności od polarności rozpuszczalnika. Rozpuszczalniki polarne charakteryzują się znacznym momentem dipolowym, z kolei rozpuszczalniki niepolarne mają niewielki moment dipolowy. Wraz ze zmianą rozpuszczalnika ulegają przesunięciu pasma typu charge-transfer. Dla tego

126 samego związku, rozpuszczonego w różnych rozpuszczalnikach, będą posiadały pasma absorpcji przy różnej długości fali. W przypadku rozpuszczalnika mniej polarnego pasmo będzie przesunięte w stronę większej długości fali (mniejszej energii). Widma w fazie stałej wykonuje się przy użyciu BaSO 4 metodą odbiciową (refleksyjną). W technikach refleksyjnych, jako miarę absorpcji promieniowania, wykorzystywane są wielkości, które stanowią analogi do absorbancji i transmitancji tak zwaną reflektancję, bądź jej ujemny logarytm (wzory 4.1, 4.2). Reflektancja podaje stosunek intensywności promieniowania odbitego od próbki (I) do intensywności promieniowania padającego (I 0 ): R = I I 0 (4.1) log(r) = log ( I 0 I ) (4.2) Promieniowanie, które pada na powierzchnię próbki wnika do jej wnętrza, a następnie ulega wielokrotnemu odbiciu oraz osłabieniu i opuszcza próbkę pod innym kątem. Równanie Kubelki Munka często wykorzystywane jest w pomiarach widm elektronowych w fazie stałej i podaje zależność intensywności promieniowania rozproszonego

127 (w postaci reflektantcji R) od stężenia (c) i molowego współczynnika absorbcji (ε): (1 R) 2 2R = c ε (4.3) 4.2. Interpretacja widm UV-Vis związki nieorganiczne Na początku omówione zostaną widma elektronowe w fazie stałej oraz w roztworze dla cyjanowych kompleksów molibdenu(iv) z ligandami organicznymi. Na rysunku 4.1 zaprezentowane zostało widmo dla kompleksu K 3 Na[Mo(CN) 4 O 2 ] 6H 2 O rozpuszczonego w wodzie. Z przedstawionego widma można odczytać maksymalną wartość absorbancji dla danej długości fali i wyznaczyć stężenie badanego związku, korzystając z prawa Lamberta-Beera (wzór 4.4).

128 Rys. 4.1. Zależność absorbancji od długości fali dla kompleksu K 3 Na[Mo(CN) 4 O 2 ] 6H 2 O rozpuszczonego w wodzie. A = ε d c (4.4) gdzie: A absorbancja (wartość absobrancji dla pasma przy długości fali λ = 596 nm A = 0,272) ε molowy współczynnik absorpcji (ε = 45,8 dm 3 /(mol cm)) d grubość kuwety (d = 1 cm) c stężenie roztworu [mol/dm 3 ] Wstawiając podane dane do przekształconego na stężenie wzoru 4.4 otrzymujemy:

129 c = A ε d = 0,272 mol = 5,94 45,8 dm3 10 3 mol cm 1cm dm 3 Absorpcja przy tej długości fali odpowiada przejściu typu d-d. Badany kompleks posiada symetrię oktaedryczną w związku z tym przejście to zabronione jest regułami wyboru, konkretnie regułą Laporte a, w której przejścia parzyste oraz nieparzyste (czyli g g i u u) są niedozwolone. Obserwowane jest ono ze względu na sprzężenie wibronowe (oddziaływanie pomiędzy elektronowymi i jądrowymi ruchami cząsteczek). Na rysunku 4.2 zamieszczono widma wykonane dla kompleksu K 3 Na[Mo(CN) 4 O 2 ] 6H 2 O po dodaniu 1,10- fenantroliny w odstępach czasowych. Rys. 4.2. Zależność absorbancji od długości fali dla kompleksu K 3 Na[Mo(CN) 4 O 2 ] 6H 2 O z 1,10-fenantroliną w czasie.

130 Na widmie można zaobserwować, że pod wpływem dodania 1,10-fenantroliny do roztworu kompleksu K 3 Na[Mo(CN) 4 O 2 ] 6H 2 O pasmo uległo przesunięciu od około 596 nm do około 455 nm. Ponadto wraz z upływem czasu nastąpił wzrost absorbancji. Można przypuszczać, iż przesunięcie jest wynikiem wymiany ligandów w kompleksie K 3 Na[Mo(CN) 4 O 2 ] 6H 2 O i powstawaniem kompleksu, w którym 1,10-fenantrolina występuje jako ligand. Reakcja wymiany zachodzi zgodnie ze stałymi tworzenia tych dwóch kompleksów. Zwiększenie intensywności pasma absorpcji wskazuje na postępujący proces wymiany ligandów w stronę zwiększenia stężenia kompleksu z 1,10-fenantroliną. W tabeli 4.1 zamieszczono długość fali, przy której obserwowane jest pasmo dla kompleksów [Mo(CN) 4 O 2 ] 4- oraz [Mo(CN) 3 O(phen)] - wraz z przypisaniem typu przejścia elektronowego. Tabela 4.1. Obserwowane przejścia elektronowe dla badanych kompleksów. Wzór jonu kompleksowego Długość fali [nm] [Mo(CN) 4 O 2 ] 4-596 Typ przejścia elektronowego d-d spinowo zabronione [Mo(CN) 3 O(phen)] - 455 charge-transfer W celu porównania przejść typu d-d z przejściami typu charge-transfer wykonano rysunek 4.3, na którym

131 zamieszczono widma obydwu kompleksów. Rys. 4.3. Zależność absorbancji od długości fali dla badanych kompleksów. Widać wyraźną różnicę między tymi dwoma widmami. Przejawia się ona przede wszystkim w położeniu pasma oraz w jego intensywności. Przejścia typu d-d są mniej intensywne niż przejścia typu charge-transfer. Leżą one w zakresie około 590 nm, z kolei CT w rejonie około 450 nm. Szerokość pasma dla kompleksu K 3 Na[Mo(CN) 4 O 2 ] 6H 2 O jest większa niż dla kompleksu podstawionego 1,10-fenantroliną. Dla przejść typu charge-transfer można zaobserwować zjawisko solwatochromizmu, Na rysunku 4.4 zamieszczono otrzymane widma kompleksu [Mo(CN) 3 O(phen)] - w różnych rozpuszczalnikach.

132 Rys. 4.4. Zależność absorbancji od długości fali dla roztworu kompleksu [Mo(CN) 3 O(phen)] - w różnych rozpuszczalnikach (MeCN acetonitryl, DMSO dimetylu sulfotlenek, EtOH etanol, MeOH metanol). Można zauważyć, że wraz ze zmianą rozpuszczalnika następuje przesunięcie pasm, co jest zgodne z efektem solwatochromowym. Ściślej rzecz ujmując zaobserwowano efekt batochromowy, względem rozpuszczalnika, jakim jest woda, ponieważ w miarę zmniejszania się polarności rozpuszczalników maksima pasm absorpcyjnych uległy przesunięciu w kierunku fal dłuższych (mniejszych energii). W celu wyznaczenia rodzaju przejść typu chargetansfer (CT) dla kompleksu Mo(CN) 3 O(phen)] - w różnych rozpuszczalnikach, należy obliczyć energię dla długości fali, przy której zaobserwowano maksimum pasma,

133 korzystając ze wzoru 4.5. Wyniki obliczeń zestawione zostały w tabeli 4.2. Następnie należy wykonać wykresy zależności energii od liczby akceptorowej (rysunek 4.5) oraz liczby donorowej (rysunek 4.6). E = h ʋ = h c λ (4.5) gdzie: E energia przejścia [J] h stała Plancka (6,626 10-34 J s) ʋ częstotliwość promieniowania [1/s] c prędkość światła (2,9979 10 8 m/s) λ długość fali elektromagnetycznej [m] Tabela 4.2. Wyznaczone wartości energii dla poszczególnych pasm odpowiednich rozpuszczalników. Długość Energia Liczba Liczba Rozpuszczalnik fali E [10-19 J] akceptorowa donorowa λ [nm] H 2 O 453 4,38 54,8 18,0 MeOH 499 3,99 41,3 19,0 EtOH 506 3,93 37,1 20,0 MeCN 530 3,75 18,9 14,1 DMSO 535 3,72 19,3 29,8

E [10-19 J] E [10-19 J] 134 4,5 4,4 4,3 4,2 4,1 4,0 3,9 3,8 3,7 3,6 17 22 27 32 37 42 47 52 57 liczba akceptorowa Rys. 4.5. Zależność energii od liczby akceptorowej. 4,5 4,4 4,3 4,2 4,1 4,0 3,9 3,8 3,7 3,6 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 liczba donorowa Rys. 4.6. Zależność energii od liczby donorowej.

135 Analizując otrzymane wykresy można zauważyć, iż dla zależności energii od liczby akceptorowej można wyznaczyć w przybliżeniu zależność liniową. Nie da się tego wykonać dla drugiego wykresu. Na podstawie rysunku 4.5 można stwierdzić, iż wraz ze wzrostem kwasowości Lewisa pasmo ulega przesunięciu w kierunku wyższych energii (krótszych długości fal). W związku z tym wszystkie rozpuszczalniki wykazują efekt hipsochromowy. W przypadku drugiej zależności (rysunek 4.6) trudno jest wyznaczyć jakąkolwiek zależność położenia pasma absorpcji od zasadowości Lewisa. Z otrzymanych wyników można również wyciągnąć wniosek, iż przebadane rozpuszczalniki charakteryzują się zdolnościami akceptorowymi - zachowują się jak kwasy, zgodnie z teorią Lewisa (w danych warunkach reakcji przyjmują elektron). W związku z tym przeniesienie elektronu następuje od metalu (molibdenu) do liganda (1,10-fenantroliny), jest to więc przejście typu MLCT (metal to ligand charge-transfer). *** Kolejny ze związków otrzymano w wyniku reakcji kompleksu K 3 Na[Mo(CN) 4 O 2 ] 6H 2 O z 2,3-dicyjanopirazyną. Reakcja syntezy związku kompleksowego [PPh 4 ] 2 [Mo(CN) 3 O(pz{COO}{CONH 2 })] 2H 2 O, którego wzór anionu zaprezentowano na rysunku 4.7, przebiega poprzez częściową hydrolizę liganda 2,3-

136 dicyjanopirazynowego. Grupy nitrylowe ulegają hydrolizie, jednak tylko jedna ze wspomnianych grup (nieskoordynowana do molibdenu) przekształca się w grupę karboksylową. Drugi podstawnik nitrylowy ulega częściowej hydrolizie do amidu. Rys. 4.7. Struktura anionu [Mo(CN) 3 O(pz{COO}{CONH 2 })] 2-. Atomy wodoru zostały pominięte dla przejrzystości. Dla uzyskanego kompleksu wykonano widma elektronowe w dwóch rozpuszczalnikach organicznych etanolu oraz acetonitrylu oraz widmo w fazie stałej przy użyciu BaSO 4. Poszczególne widma zaprezentowano na rysunkach 4.8. oraz 4.9.

137 Rys. 4.8. Widmo UV-VIS dla uzyskanego kompleksu Mo(IV) w etanolu (linia czarna) oraz acetonitrylu (linia czerwona). Rys. 4.9. Widmo elektronowe w fazie stałej dla uzyskanego kompleksu Mo(IV) po transformacji Kubelki-Munk'a.

138 W badanym związku powinny występować cztery typy przejść elektronowych: pasma związane z przejściami w obrębie liganda; przejścia typu charge-transfer pomiędzy molibdenem a ligandami nieorganicznymi oraz ligandem organicznym (typu metal-ligandcharge-transfer MLCT); przejścia typu charge-transfer pomiędzy ligandami nieorganicznymi oraz ligandem organicznym a molibdenem (typu ligand to metal charge-transfer LMCT); przejścia typu d-d. W części widzialnej można zaobserwować intensywne pasma charge-transfer (MLCT), natomiast w części ultrafioletowej następuje nałożenie pasm liganda z pasmami jonu kompleksowego (typu LMCT), co utrudnia ich interpretację. Biorąc pod uwagę relatywnie mniejszą intensywność pasm LMCT, obserwowane pasma są głównie powiązane z ligandem (pz{coo}{conh 2 }). Ich pozycje są przesunięte ze względu na koordynację, jak i nakładanie się na pasma LMCT. Pasma typu d-d widoczne są jedynie na widmie refleksyjnym (na rysunku 4.8. mają słabą intensywność i są trudno zauważalne), jako przegięcie przy ok. 700 nm

139 i nałożone są na pasma MLCT, widoczne przy ok. 500 nm. Pasma MLCT dla kompleksów Mo(IV) charakteryzują się silnym solwatochromizmem - w zależności od zastosowanego rozpuszczalnika położenie tych pasm ulega zmianie. Podobny efekt solwatochromowy obserwuje się w przypadku otrzymanego kompleksu, przykładowo w etanolu widoczne jest maksimum przy długości fali 506 nm, natomiast w acetonitylu przy długości 493 nm. Pasma jednakże nie są zbyt czułe na zmianę rozpuszczalnika, w przeciwieństwie do innych jonów typu [Mo(CN) 3 O(LL)] n-. *** Kolejny związek kompleksowy, dla którego zostaną omówione widma elektronowe wykonane w roztworze oraz w fazie stałej, otrzymano w wyniku reakcji kompleksu K 3 Na[Mo(CN) 4 O 2 ] 6H 2 O z 2-(aminometylo)pirydyną (wzór anionu kompleksowego zaprezentowano na rysunku 4.10).

140 Rys. 4.10. Struktura anionu [Mo(CN) 3 O(ampy)] - (ampy = 2- (aminometylo)pirydyna). Atomy wodoru zostały pominięte dla przejrzystości. Widmo elektronowe w fazie stałej przedstawiono na rysunku 4.11 z kolei widma w roztworze zaprezentowano na rysunku 4.12. W trakcie pomiarów wykorzystano szeroką gamę rozpuszczalników organicznych (polarnych oraz niepolarnych) w celu przypisania pasm do odpowiedniego typu przejścia oraz zobrazowania zjawiska solwatochromizmu.

141 Rys. 4.11. Widmo elektronowe w fazie stałej dla [Mo(CN) 3 O(ampy)] - po transformacji Kubelki-Munk'a. W części widzialnej widma refleksyjnego, przedstawionego na rysunku 4.11, można zaobserwować dobrze wykształcone pasmo charge-transfer (MLCT) przy długości fali 414 nm. Widoczne jest również szerokie pasmo w rejonie 657 nm, które można przypisać do pasma typu d-d. Takie przypisanie jest potwierdzone widmami zmierzonymi dla roztworów preparatu, gdyż pasmo przy 657 nm jest bardzo słabo intensywne. Intensywne z kolei są pasma MLCT zlokalizowane w zakresie 390 439 nm widoczne na rysunku 4.12. Pasma te dla kompleksów Mo(IV) charakteryzują się silnym solwatochromizmem - w zależności od

142 zastosowanego rozpuszczalnika położenie tych pasm ulega zmianie. Maksima poszczególnych pasm przesuwają się w stronę krótszych długości fal (wyższych energii) wraz ze wzrostem polarności rozpuszczalnika, co jest związane z oddziaływaniami donorowoakceptorowymi oraz tworzeniem wiązań wodorowych pomiędzy ligandami a rozpuszczalnikiem. Rys. 4.12. Widmo elektronowe w roztworach dla [Mo(CN) 3 O(ampy)] - (Me 2 CO aceton, DMF dimetyloformamid, DMSO dimetylu sulfotlenek, EtOH etanol, MeCN acetonitryl, MeOH metanol, AmOH alkohol amylowy/pentan-1-ol, 1-BuOH butan-1-ol, CHCl 3 chloroform, C 2 H 4 Cl 2 dichloroetan, CH 2 Cl 2 dichlorometan, 2-PrOH propan-2-ol, t-buoh tert-butanol).

143 Widma elektronowe w roztworach badanych rozpuszczalników nie wykazują istotnych zmian w czasie, co świadczy o stabilności preparatu w badanych rozpuszczalnikach. Przykładowe widmo w acetonitrylu zaraz po przygotowaniu roztworu oraz po 45 minutach przedstawiono na rysunku 4.13. Rys. 4.13. Widmo elektronowe dla [Mo(CN) 3 O(ampy)] - w acetonitrylu w czasie. Dla lepszego zobrazowania zjawiska solwatochromizmu w badanym kompleksie, sporządzony został wykres zależności liczby falowej od parametru Reichardta E T (rysunek 4.14). Dane potrzebne do sporządzenia wykresu zamieszczone zostały w tabeli 4.3. Pominięto

144 dwa rozpuszczalniki wodę oraz alkohol amylowy ze względu na słabą rozpuszczalność kompleksu w tych rozpuszczalnikach i związany z tym brak możliwości dokładnego wyznaczenia położenia pasma MLCT. Tabela 4.3. Położenia pasma MLCT w kompleksie [Mo(CN) 3 O(ampy)] - oraz parametr E T rozpuszczalnika. Rozpuszczalnik λ [nm] E T [kcal mol -1 ] CHCl 3 431 39,1 CH 2 Cl 2 424 41,1 C 2 H 4 Cl 2 426 41,9 Me 2 CO 439 42,2 DMF 435 43,8 t-buoh 419 43,9 DMSO 427 45,0 MeCN 418 46,0 2-PrOH 410 48,6 1-BuOH 409 50,2 EtOH 396 51,9 MeOH 390 55,5 Na wykresie (rysunek 4.14) zamieszczone zostały trzy grupy rozpuszczalników: hydroksylowe, niehydroksylowe i halogenki alkilów. Do każdej z tych grup uzyskuje się

145 różne nachylenia krzywych korelacyjnych. Podobne zależności można zauważyć dla innych kompleksów typu [Mo(CN) 3 O(LL)] n- i świadczą one o specyficznym oddziaływaniu rozpuszczalnika z ligandami. Rys. 4.14. Wykres zależności liczby falowej od E T dla kompleksu [Mo(CN) 3 O(ampy)] -. *** Ostatni z cyjanowych kompleksów molibdenu, dla którego omówione zostaną widma elektronowe, został otrzymany w wyniku syntezy K 3 Na[Mo(CN) 4 O 2 ] 6H 2 O z aminoetanolem. Wzór anionu kompleksowego przedstawiono na rysunku 4.15.

146 Rys. 4.15. Struktura jonu [Mo(CN) 4 O(amet)] 2- (amet = aminoetanol). Atomy wodoru zostały pominięte dla przejrzystości. Widma elektronowe w fazie stałej i w roztworze zostały przedstawione kolejno na rysunkach 4.16 oraz 4.17. Rys. 4.16. Widmo elektronowe w fazie stałej dla kompleksu [Mo(CN) 4 O(amet)] 2- po transformacji Kubelki-Munk'a.

147 Rys. 4.17. Widma elektronowe w roztworach dla kompleksu [Mo(CN) 4 O(amet)] 2- (DMSO dimetylu sulfotlenek, EtOH etanol, MeOH metanol). Na widmie wykonanym w fazie stałej (rysunek 4.16) widoczne są pasma przy długości fali: 273, 350, 510, 664 oraz 769 nm. Pasmo o najwyższej energii pochodzi od kationu tetrafenylofosfoniowego (PPh 4 ), pasmo przy 350 nm można przypisać skoordynowanemu aminoetanolowi i pasmom typu charge-transfer kompleksu. W zakresie widzialnym obserwowane przejścia przypisuje się, dla kompleksów tetracyjanowych, wyłącznie przejściom typu d-d. Obecność trzech pasm w tym zakresie wskazywać może na niską symetrię kompleksu. Obecność niskoenergetycznego pasma przy 769 nm sugeruje całkowite zniesienie degeneracji orbitali t 2g

148 w zdeformowanym oktaedrze, co skutkować może pojawieniem się niskoenergetycznego przejścia elektronowego. Widma elektronowe w roztworze (rysunek 4.17) wykonane zostały w trzech rozpuszczalnikach etanolu, metanolu oraz DMSO. Charakteryzują się one nietypową liczbą oraz położeniem pasm. Analiza widm pokazuje, że następuje rozkład związku kompleksowego, uwolnienie 2-aminoetanolu i koordynacja rozpuszczalnika. W przypadku widma wykonanego w metanolu pojawia się pasmo w rejonie 613 nm, które jest charakterystyczne dla jonu [M(CN) 4 O(H 2 O)] 2- (M = W lub Mo). 4.3. Interpretacja widm UV-Vis związki organiczne Wiązania wielokrotne węgiel-węgiel Dla izolowanego wiązania podwójnego węgiel-węgiel pasmo absorpcyjne występuje przy ok. 180 nm, co jest wynikiem przejścia elektronowego π π*. W tym przypadku grupy alkilowe powodują niewielkie batochromowe przesunięcie tego pasma, wskutek czego czteropodstawione acykliczne alkeny absorbują przy ok. 200 nm. Przybliżone położenia pasm absorpcji izolowanych wiązań wielokrotnych między atomami węgla przedstawiono w tabeli a) w podrozdziale 7.4.

149 Warto zwrócić uwagę, że również izolowanemu wiązaniu potrójnemu węgiel-węgiel odpowiada pasmo przy ok. 180 nm dla etynu λ max = 173 nm. Co więcej, obecność grup alkilowych powoduje przesunięcie maksimum absorpcji w kierunku fal dłuższych. Z kolei sprzężenie wiązań podwójnych węgiel-węgiel prowadzi do znacznych zmian wartości λ max oraz molowego współczynnika aborpcji. Ponadto, wraz ze wzrostem liczby sprzężonych wiązań podwójnych obserwuje się systematyczne, batochromowe przesunięcie pasma, co przedstawiono w tabeli b) w podrozdziale 7.4. Warto zauważyć, że podstawniki alkilowe, związane z atomem węgla, tworzącym wiązanie wielokrotne, przesuwają maksimum absorpcji o stałą wartość równą 5 nm. Podobnie sprzężenie wiązania potrójnego węgiel-węgiel z innymi wiązaniami potrójnymi (poliyny) lub podwójnymi (polienyny) prowadzi do stopniowego przesuwania się maksimum absorpcji w kierunku fal dłuższych. Jeśli chodzi o układy acykliczne, to położenie omawianego pasma absorpcyjnego często ma tzw. wartość diagnostyczną przy określaniu liczby wiązań wielokrotnych układu sprzężonego. Podstawą do sformułowania zbioru empirycznych reguł, na podstawie których można przewidzieć położenie maksimum absorpcji dla podstawionych dienów sprzężonych, jest regularność zmian maksimum absorpcji, spowodowanych zmianą liczby sprzężonych wiązań podwójnych oraz stopień podstawienia i geometria układu

150 sprzężonego. Jeżeli możliwe są dwie izomeryczne struktury związku, to porównanie wartości λ max obliczonej o eksperymentalnie wyznaczone wartości, może ułatwić przypisanie badanej cząsteczce właściwej budowy. W tabeli 4.4 przedstawiono tzw. reguły Fiesera- Woodwarda dotyczące absorpcji promieniowania przez cząsteczki zawierające dienowy układ sprzężony: Tabela 4.4. Reguły Fiesera-Woodwarda dotyczące absorpcji promieniowania przez cząsteczki zawierające dienowy układ sprzężony. λ max [nm] dien heteroannularny lub dien 214 dien homoannularny 253 poprawki dla: wiązania podwójnego przedłużającego sprzężenie 30 grupy alkilowej lub fragmentu pierścienia 5 wiązania podwójnego egzocyklicznego 5 ugrupowań polarnych: OCOCH 3 0 ugrupowań polarnych: OR 6 ugrupowań polarnych: SR 30 ugrupowań polarnych: Cl, Br 5 ugrupowań polarnych: -NR 2 60 wpływu rozpuszczalnika 0 suma=λ max obl.

151 Podczas formułowania reguł przedstawionych w tabeli 4.4, dotyczących dienów cyklicznych, wzięte jest pod uwagę to, czy dieny są heteroannularne, czy homoannularne, np.: Ponadto przyjęto, że podstawowa wartość λ max dla dienu heteroannularnego wynosi 214 nm, a dla homoannularnego 253 nm. Do wartości tych dodaje się przedstawione w tabel 4.4 poprawki, właściwe dla występujących w związku podstawników i innych cech strukturalnych. Jeśli w cząsteczce występują jednocześnie chromofory homoannularne i heteroannularne i są one ze sobą sprzężone, to do obliczeń przyjmuje się wartość λ max dla układu homoannularnego i do tej wartości dodaje się odpowiednią poprawkę, traktując układ heteroannularny, jako przedłużenie układu sprzężonego. Należy także zauważyć, że w przypadku pierścieniowych dienów homoannularnych o pierścieniach innych niż sześcioczłonowe, nie uzyskuje się zadawalającej zgodności pomiędzy obliczonymi a eksperymentalnymi wartościami λ max. Warto zwrócić uwagę, że przedstawione reguły są

152 słuszne dla dienów acyklicznych i heteroannularnych, ale tylko wówczas, gdy struktura geometryczna nie utrudnia płaskiego ułożenia układu wiązań σ, co związane byłoby z ograniczeniem stopnia nakładania się orbitali π. Grupa karbonylowa *** W przypadku acetonu w roztworze cykloheksanu, na widmie występują dwa pasma absorpcyjne jedno występuje przy 190 nm i odpowiada przejściu π π*, a drugie pasmo przy 280 nm odpowiada przejściu n π*. Należy zdawać sobie sprawę, iż położenie tych pasm zależy od rozpuszczalnika. Z kolei w widmach UV nasyconych aldehydów, kwasów karboksylowych i estrów występuje podobny układ pasm absorpcyjnych i dlatego znaczenie w interpretacji widm jest nieznaczne. Warto zwrócić uwagę, że sprzężenie grupy karbonylowej z podwójnym wiązaniem węgiel-węgiel w istotny sposób zmienia układ pasm absorpcyjnych. W przypadku widm prostych enonów pasmo absorpcyjne, odpowiadające wzbudzeniu elektronu z orbitalu π wiązania węgiel-węgiel na antywiążący orbital grupy karbonylowej tzw. pasmo przeniesienia elektronu (pasmo E.T.), występuje w zakresie: 220 250 nm. Ponadto, obserwuje się pasmo o niewielkiej intensywności w zakresie 310-330 nm, które odpowiada przejściu n π*

153 w grupie karbonylowej. Należy zauważyć, że położenie pasma przeniesienia elektronu zależy m. in. od długości układu sprzężonego oraz stopnia podstawienia i można je wyznaczyć, stosując analogiczne reguły, podobne do wcześniej podanych do przewidywania położenia charakterystycznych pasm dienów sprzężonych. Zestaw reguł przedstawiono w tabeli 4.5. W przypadku enonów acyklicznych oraz enonów cyklicznych sześcioczłonowych za wartość podstawową λ max przyjmuje się 215 nm, a dla α,β-nienasyconych aldehydów 207 nm. Jako układy enonów przyjmuje się: Tabela 4.5. Reguły Fiesera-Woodwarda dotyczące absorpcji promieniowania przez cząsteczki enonów. λ max [nm] Enon acykliczny lub cykliczny 215 sześcioczłonowy Enon cykliczny pięcioczłonowy 202 aldehyd α,β-nienasycony 207 poprawki dla: wiązania podwójnego przedłużającego sprzężenie grupy alkilowej lub fragmentu pierścienia w pozycji: 30

154 α 10 β 12 γ i dalszych 18 ugrupowań polarnych: -OH, w pozycji α 35 ugrupowań polarnych: -OH, w pozycji β 30 ugrupowań polarnych: -OH, w pozycji γ 50 ugrupowań polarnych: w pozycji α, β, γ -OCOCH 3, 6 ugrupowań polarnych: w pozycji α -OCH 3, 35 ugrupowań polarnych: w pozycji β -OCH 3, 30 ugrupowań polarnych: w pozycji γ -OCH 3, 17 ugrupowań polarnych: w pozycji δ -OCH 3, 31 ugrupowań polarnych: -Cl, w pozycji α 15 ugrupowań polarnych: -Cl, w pozycji β 12 ugrupowań polarnych: -Br, w pozycji α 25 ugrupowań polarnych: -Br, w pozycji β 30 ugrupowań polarnych: -NR 2, w pozycji β wiązania podwójnego egzocyklicznego 5 układu homodienowego 39 suma=λ max obl. 95

155 *** Związki aromatyczne Związki aromatyczne dają charakterystyczne pasma w nadfioletowym i widzialnym zakresie widma i chociaż można je łatwo zidentyfikować na podstawie innych właściwości spektroskopowych, to widma elektronowe umożliwiają uwidocznienie albo potwierdzenie faktu posiadania przez cząsteczkę pewnych specyficznych cech strukturalnych. Areny *** W przypadku widma benzenu (w heksanie) obecne są trzy pasma absorpcyjne λ 1, λ 2 oraz λ 3, których maksima wypadają odpowiednio przy 184 nm, 204 nm oraz 254 nm. Odpowiadają one różnym dozwolonym przejściom π π*. Ponadto, podstawniki alkilowe powodują batochromowe przesunięcie pasm λ 2 oraz λ 3, z kolei w małym stopniu wpływają na wartość molowego współczynnika absorpcji. Dla policyklicznych węglowodorów aromatycznych o pierścieniach skondensowanych zarówno kątowo, jak również liniowo, krzywe absorpcji posiadają kształt podobny do krzywej absorpcji benzenu, ale maksima absorpcji są przesunięte w kierunku fal dłuższych, im

156 większa jest liczba pierścieni. Układy heterocykliczne *** W przypadku np. pirydyny widmo elektronowe jest podobne do widma benzenu, ale zawiera dodatkowe pasmo przy 270 nm, które przypisuje się przejściu, w którym bierze udział wolna para elektronowa azotu. Również widma izochinoliny oraz chinoliny, są bardzo podobne do widma naftalenu. Warto zauważyć, że widma pięcioczłonowych związków heterocyklicznych (pirol, tiofen, furan), pomimo ich charakteru aromatycznego, charakteryzują się znacznymi różnicami w porównaniu z widmem benzenu. *** Podstawione układy benzenoidowe Podstawniki halogenowe wykazują podobny efekt do wcześniej opisanych efektów wywołanych przez podstawniki alkilowe niewielkie przesunięcia batochromowe pasm λ 2 oraz λ 3. Z kolei podstawniki zawierające grupy z wiązaniem wielokrotnym, np. C=O, NO 2, C N, C=C, C C, a w mniejszym stopniu podstawniki posiadające niewiążące elektrony sprzężone z układem

157 elektronów π, powodują znaczne batochromowe przesunięcia tych dwóch pasm. Warto zauważyć, że przesunięciom tym towarzyszy często wzrost wartości molowego współczynnika absorpcji pasma λ 3. Ponadto, w niektórych przypadkach na widmie pojawia się dodatkowe pasmo odpowiadające przejściom elektronowym, które związane jest z podstawnikiem. Obserwowane w większości przypadków przesunięcia batochromowe są wynikiem silniejszej stabilizacji mezomerycznej badanych związków, co powoduje zmniejszenie różnicy energetycznej między stanem podstawowym i stanami wzbudzonymi. Efektem tego jest przesunięcie pasma w kierunku fal dłuższych.

158 5.1. Wstęp 5 Spektroskopia NMR Spektroskopia NMR opiera się na pomiarze absorpcji promieniowania o częstości radiowej przez układ zawierający jądra magnetyczne, będące pod wpływem zewnętrznego pola magnetycznego, wytworzonego przez elektromagnes. Konieczność stosowania pola magnetycznego jest jedną z głównych różnic w stosunku do optycznych metod spektroskopowych. Aby mogło dojść do rezonansowej absorpcji promieniowania, badany układ należy poddać działaniu pola magnetycznego, które powoduje rozsunięcie się poziomów spinowych jąder o niezerowej kwantowej liczbie spinowej I (efekt

159 Zeemana). Różnica energii między rozszczepionymi poziomami wzrasta proporcjonalnie do wzrostu indukcji pola magnetycznego, a więc warunek rezonansu (ΔE = γ I ħb 0 = hν) można uzyskać dla wielu kombinacji energii promieniowania ΔE i indukcji pola B 0. Podstawowa metoda pomiaru to metoda fali ciągłej, w której dla stałej indukcji pola przemiata się częstością promieniowania lub dla stałej energii promieniowania przemiata się indukcją pola. Jednak obecnie stosuje się metody impulsowe z transformatą Fouriera, gdzie do próbki będącej w stałym zewnętrznym polu magnetycznym dostarcza się impuls promieniowania o pewnym zadanym zakresie częstości (częstości radiowe), które powodują wzbudzenie wszystkich interesujących nas jąder jednocześnie. Następnie obserwuje się swobodny zanik indukcji (FID ang. Free Induction Decay), czyli powrót spinów jądrowych do warunków równowagi, a uzyskany sygnał (w domenie czasu) poddaje się transformacji Fouriera i uzyskuje się widmo w domenie częstości. Interpretację widm NMR dokonuje się w oparciu o kilka podstawowych informacji. Pierwszą z nich jest ilość sygnałów rezonansowych, która mówi o ilości grup nierównoważnych chemicznie jąder (np. 1 H). Druga informacja to położenie danej linii wartość przesunięcia chemicznego, odpowiadającego częstości rezonansowej danego sygnału. Na podstawie tych wartości jesteśmy w stanie oszacować jakie grupy funkcyjne znajdują się w bliskim sąsiedztwie danego jądra magnetycznego.

160 Kolejną informacją jest intensywność integralna sygnału (powierzchnia pod krzywą), która jest proporcjonalna do ilości jąder równoważnych, tworzących dany sygnał. W ten sposób możemy odpowiedzieć na pytanie ile dokładnie jąder (np. 1 H) jest w badanej cząsteczce oraz jakie równoważne grupy tworzą. Na widmie NMR możemy zaobserwować również sprzężenie spinowo-spinowe między nierównoważnymi zarówno chemicznie, jak i magnetycznie jądrami, będącymi w swoim sąsiedztwie. Sprzężenie to powoduje rozszczepienie sygnału na składowe, których liczba związana jest z ilością jąder sprzęgających się z rozpatrywanym jądrem oraz z wartością ich spinu. Rozpatrywanie tych wszystkich informacji może doprowadzić nas do odpowiedzi na pytanie z jaką cząsteczką mamy do czynienia, jednak w przypadku bardziej skomplikowanych struktur, niezbędne jest zastosowanie metod dwuwymiarowych. 5.2. Podział spektroskopii NMR W zależności od tego, jakie jądro magnetyczne badamy, możemy wyróżnić szereg technik NMR. Zdecydowanie najpopularniejszymi są 1 H NMR oraz 13 C NMR. Dość często wykorzystuje się również 15 N, 19 F czy 31 P NMR. Eksperyment NMR wykonać można dla większości jąder magnetycznych, dobierając odpowiednie parametry pomiaru. Jest również wiele technik dwuwymiarowych NMR, które pozwalają nam na jeszcze

161 dokładniejszą dedukcję połączeń między atomami w cząsteczkach. Wyróżnić tu można metody homojądrowe, gdzie obserwuje się oddziaływania spinów tych samych jąder, bądź heterojądrowe polegające na obserwacji oddziaływania różnych jąder ze sobą. 5.3. Przesunięcie chemiczne Częstość rezonansowa jądra zależy również od jego otoczenia elektronowego i jest różna dla różnych ugrupowań chemicznych. Elektrony rozpatrywanego jądra powodują jego przesłanianie (ekranowanie), co związane jest z efektem diamagnetycznym. W przypadku elektronów grup sąsiednich mamy do czynienia z przesłanianiem, jak i odsłanianiem w zależności od orientacji układu w stosunku do kierunku indukcji pola magnetycznego. W roztworze jednak przyczynki przesłaniania i odsłaniania nie uśredniają się do zera i obserwujemy efekt wypadkowy. Przesunięcie chemiczne δ jest względną skalą częstości rezonansowych jąder. Definiowane jest następująco: δ = ν ν wz ν wz 10 6 [ppm] (5.1) gdzie: ν i ν wz - częstość rezonansowa danego jądra i częstość rezonansowa wzorca.

162 W spektroskopii 1 H NMR i 13 C NMR najczęściej stosowanym wzorcem jest trimetylosilan (TMS). Ze względu na niskie wartości, przesunięcie chemiczne podaje się w ppm (ang. part per milion) Przesunięcie chemiczne nie zależy zatem od indukcji przyłożonego pola magnetycznego, a więc można porównywać eksperymenty wykonywane na różnych spektrometrach NMR. Przesunięcia chemiczne dla jąder, znajdujących się w konkretnych ugrupowaniach atomów są stabelaryzowane i można je obliczyć nawet dla skomplikowanych układów molekularnych. W Internecie można znaleźć również kilka bardzo pomocnych darmowych programów, które symulują widma NMR (najczęściej 1 H NMR oraz 13 C NMR). Typowe zakresy przesunięcia chemicznego dla 1 H NMR obserwować możemy w granicach 0-15 ppm, natomiast 13 C NMR 0-250 ppm. Najniższe przesunięcia chemiczne obserwowane są dla protonów i węgli alifatycznych, a najwyższe dla protonów i węgli w związkach karbonylowych. Przyjęta, względna skala przesunięcia chemicznego nie wyklucza ujemnych wartości, co może mieć miejsce gdy badane jądra są silniej ekranowane od jąder substancji wzorcowej. Typowe zakresy przesunięć chemicznych ( 1 H NMR, 13 C NMR) dla wybranych grup funkcyjnych, przedstawiono na rysunku 5.1 i 5.2. Niektóre zakresy przesunięć chemicznych dla

163 konkretnych grup funkcyjnych mogą nakładać się na siebie, dlatego nie zawsze możemy być pewni z jakim ugrupowaniem atomów mamy do czynienia. Przesunięcie chemiczne protonów grup OH czy NH 2 może znacznie się zmieniać w zależności od rozpuszczalnika i stężenia substancji badanej. W dodatku pasmo jest poszerzone, co związane jest z wymianą labilnych protonów tych grup z protonami rozpuszczalnika. Rys. 5.1. Typowe zakresy przesunięć chemicznych w 1 H NMR. X oznacza atom chlorowca, Ar cząsteczkę aromatyczną.

164 Rys. 5.2. Typowe zakresy przesunięć chemicznych w 13 C NMR. Ar oznacza cząsteczkę aromatyczną. 5.4. Sprzężenie spinowo-spinowe Sprzężenie spinowo-spinowe między sprzęgającymi się nierównoważnymi chemicznie (czy magnetycznie patrz rozdział 5.6) jądrami powoduje rozszczepienie sygnałów rezonansowych na składowe. Miarą tego oddziaływania jest stała sprzężenia spinowo-spinowego J podawana najczęściej w Hz. Stała sprzężenia zależy tylko od rodzaju sprzęgających się jąder i odległości między nimi. Sprzężenie obserwuje się najczęściej dla jąder odległych od siebie o trzy wiązania chemiczne, jednak jest wiele odstępstw od tej reguły. Odległość między rozdzielonymi składowymi sygnału jest równa stałej sprzężenia,