Ćwiczenie 4 Część teoretyczna: I. ZIARNIAKI GRAMDODATNIE Do tej rodziny należą drobnoustroje stanowiące normalną mikroflorę powietrza, mleka i przetworów mlecznych; spotykamy je w glebie, na skórze zwierząt i ludzi, gdzie mogą powodować stany ropne i zapalenia, a także przewodu pokarmowego ludzi i zwierząt. Gronkowce są spotykane w produktach żywnościowych i stanowią duże niebezpieczeństwo dla konsumentów. Cechy charakterystyczne: - komórki kuliste, - dzielą się w jednej, dwóch lub trzech płaszczyznach i mogą występować jako komórki pojedyncze, dwoinki, paciorkowce i gronkowce, - są nieruchliwe, - są gramdodatnie, - nie wytwarzają przetrwalników, - są mezofilami, - są tlenowcami lub względnymi beztlenowcami, - są katalazododatnie (Micrococcus i Staphylococcus) lub katalazoujemne (Enterococcus i Streptococcus), - fermentują węglowodany bez wytworzenia gazu, przy czym powstają małe ilości kwasu (mlekowego), - niektóre gatunki wytwarzają charakterystyczne barwniki (żółte, złociste, pomarańczowe lub czerwone), inne zaś tworzą kolonie bezbarwne. Do najważniejszych rodzajów należą Micrococcus i Staphylococcus. Przedstawiciele: - M. luteus jasnożółte kolonie - S. aureus gronkowiec złocisty pomarańczowe kolonie - S. saprophyticus kolonie białe. Rodzaj Micrococcus - bakterie szeroko rozpowszechnione w przyrodzie, powietrzu, kurzu, wodzie - optymalna temperatura wzrostu 25-30 C, niektóre gat. ciepłooporne, niektóre rosną w niskich temperaturach - tolerują wysoką zawartość soli składniki solanek przemysłowych - powodują psucie się produktów konserwowanych sola, mleka pasteryzowanego, margaryny, żywności przechowywanej w chłodniach - najważniejsze gatunki biorące udział w psuciu: Micrococcus freudenreichii, M. varians, M. luteus, M. caseolyticus 1
- opisano dziewięć gatunków Micrococcus, osiem może występować na skórze człowieka - typowy przedstawiciel Micrococcus luteus - uważane są za niechorobotwórcze, jednak mogą być oportunistami - średnica komórki przekracza 2 μm - są tlenowcami, niektóre gatunki fermentują glukozę z pożywki - wytwarzają katalazę - mają niewielkie wymagania odżywcze - są halotolerantami (np. rosną w obecności 5% NaCl) - kolonie są nieprzejrzyste i wyraźnie zabarwione (od cytrynowożółtego do czerwonego) Rodzaj Staphylococcus - katalazododatnie, gramdodatnie - gronkowce występujące na powierzchni ciała ludzi i zwierząt, na błonach śluzowych, w nosogardzieli, u krów w przewodach strzykowych, a także w glebie i wodzie - względne beztlenowce, choć wykazują lepszy wzrost w obecności tlenu - wzrost temperatura 15-46 C i ph 4,2-9,3 - gatunek chorobotwórczy Staphylococcus aureus (gronkowiec złocisty) wywołuje ropnie skóry, anginy, zatrucia pokarmowe typu intoksykacji, u krów ostre lub przewlekłe zapalenie wymienia - obecność w środkach spożywczych soli peklujących nie zapobiega ich rozwojowi i produkcji enterotoksyn - wytwarzanie enterotoksyn hamuje temperatura poniżej 10 C i ph poniżej 4,5 - zapobieganie zakażeniom gronkowcami polega na przestrzeganiu higieny produkcji i temperatury obróbki termicznej, aby nie dopuścić do rozmnażania się bakterii i produkcji ciepłoodpornej enterotoksyny przed ich zniszczeniem - w pracowniach diagnostycznych podział na gronkowce koagulazododatnie (Staphylococcus aureus) gronkowce koagulazoujemne (S. epidermidis, S. saprophyticus) ze względu na zdolność wykrzepiania osocza przez S. aureus i brak takich zdolności u innych gatunków, choć nowe badania taki podział uznały za mało precyzyjny - znanych jest kilkadziesiąt gatunków połowa związana z człowiekiem - kolonizują skórę człowieka naturalna flora bakteryjna, ale w zmienionych warunkach mogą wywołać infekcje - najczęściej wywołują zakażenia szpitalne: 2
S. aureus (gronkowiec złocisty) infekcje miejscowe wszystkich tkanek i narządów oraz uogólnionych: ropne stany zapalne skóry i tkanek miękkich (czyraki, jęczmienie, liszajec, ropnie, ropowice, zapalenie szpiku kostnego, septyczne zapalenie stawów, zapalenie wsierdzia, zapalenie płuc) S. epidermidis (gronkowiec naskórkowy) czynnik etiologiczny szpitalnych posocznic, zapalenie wsierdzia S. saprophyticus (gronkowiec saprofityczny) zakażenie dróg moczowych - komórki gramdodatnie - przekraczają średnicę 1 μm, są nieruchliwe - w większości są względnymi beztlenowcami - kolonie gładkie, okrągłe, lekko wypukłe (po 24 godz. w temp. 30-35 C), barwa: od białej do pomarańczowej - na podłożu płynnym rosną dyfuzyjnie, czasem z kłaczkowatym osadem Rodzaj Enterococcus paciorkowce kałowe - bakterie ciepłooporne, choć rosną też w niskich temperaturach 4-5 C, dobrze przeżywają proces zamrażania i warunki pasteryzacji stosowane w przemyśle spożywczym - bytują głównie w przewodzie pokarmowym ludzi i zwierząt używane są za wskaźnik zanieczyszczenia kałowego wody i środków spożywczych (pasteryzowanych lub mrożonych) - powszechnie występują w różnych rodzajach żywności - są przyczyną psucia się pasteryzowanych konserw mięsnych przechowywanych w chłodniach, mleka i pasteryzowanych produktów mlecznych, powodują też zielenienie powierzchni mięsa - nadmierny rozwój enterokoków i produkcja przez nie amin biogennych (w produktach białkowych) to przyczyna zatruć pokarmowych lub reakcji alergicznych u ludzi - wcześniej klasyfikowane jako paciorkowce grupy D, ale w wyniku badań filogenetycznych uzyskały status oddzielnego rodzaju, nie wszystkie gat. mają w ścianie komórkowej antygen D - spotyka się je czasem w jamie ustnej patogeny oportunistyczne, przyczyniają się do zakażenia dróg moczowych, bakteriemii, zapalenia wsierdzia - wyodrębniono kilkanaście gatunków; u ludzi dominują E. faecalis (80-90%), E. faecium (10-15%) - enterokoki nie dysponują licznymi czynnikami chorobotwórczymi, niektóre szczepy wytwarzają adhezynę (czynnik agregujący) czy enzym hialuronidazę 3
- są gramdodatnie, katalazoujemne, nieco owalne, duże około 2,5 μm ziarenkowce - w preparatach tworzą pary, krótkie łańcuszki lub nieregularne skupiska - są względnie beztlenowe, - rosną w temp. 10-45 C (optimum 35 C), czas 18-24 godz. - na pożywkach płynnych rosną dyfuzyjnie - na stałych tworzą duże (2 mm) szarawoprzejrzyste kolonie - zdolność wzrostu na zwykłych podłożach i na bulionie z dodatkiem 6,5% NaCl wyraźnie odróżnia rodzaj Enterococcus od pozostałych paciorkowców Rodzaj Streptococcus inne paciorkowce Liczne gatunki paciorkowców są chorobotwórcze m.in. paciorkowiec ropotwórczy (Streptococcus pyogenes), zieleniejący (S. viridans), czy wywołujący zapalenie płuc S. pneumoniae. Paciorkowce są katalazoujemne. Najczęściej względne beztlenowce lub beztlenowce. II. TEST NA OBECNOŚĆ KATALAZY Powstający w procesach oddychania nadtlenek wodoru (H 2 O 2 ) jest substancją silnie trującą dla komórek bakteryjnych. Mikroorganizmy likwidują jej nadmiar za pomocą enzymu katalazy. Katalaza enzym przyspieszający reakcje: 2 H 2 O 2 2 H 2 O + O 2 Wykrywanie katalazy znalazło praktyczne zastosowanie w diagnostyce bakterii, szczególnie w rozróżnianiu ziarenkowców (Staphylococcus, Micrococcus od Streptococcus, Enterococcus) oraz laseczek gramdodatnich (Bacillus od Clostridium). Wyróżniamy organizmy: - katalazododatnie - katalazoujemne Obecność enzymu wykrywa się, dodając do hodowli 3% roztwór wody utlenionej. Wynik dodatni wydzielanie się pęcherzyków powietrza. 4
III. BAKTERIE PRZETRWALNIKUJACE BACILLACEAE Przetrwalnikowanie, czyli tworzenie endospor jest cechą wspólną bakterii z rodziny Bacillaceae, obejmującej bardzo zróżnicowane fizjologicznie rodzaje: Bacillus i Clostridium. Większość gatunków bakterii przetrwalnikujących bytuje w środowisku naturalnym jako organizmy saprofityczne. Niektóre jednak, np. laseczka wąglika (B. anthracis), laseczka jadu kiełbasianego (C. botulinum), laseczka tężca (C. tetani), należą do groźnych drobnoustrojów chorobotwórczych. Wśród bakterii przetrwalnikujących występują laseczki tlenowe (rodzaj Bacillus) oraz beztlenowe (Clostridium), gatunki mezofilne i termofilne, a także bakterie osmofilne. Bakterie te są szeroko rozpowszechnione w przyrodzie: w glebie i wodzie, na częściach roślin, w psującej się żywności, treści żołądkowej zwierząt przeżuwających, w mule, osadach wód powierzchniowych, gorących źródłach. Cechy charakterystyczne: - są laseczkami, - tworzą przetrwalniki, - są tlenowcami lub względnymi beztlenowcami, - są w większości mezofilami, - są gramdodatnie, - nieruchliwe lub ruchliwe okołorzęse, - katalazododatnie (Bacillus) lub katalazoujemne (Clostridium) - wiele z nich rozkłada niektóre węglowodany oraz białka. IV. FERMENTACJA Jest to beztlenowy proces biochemiczny, polegający na enzymatycznym rozpadzie cukrów, który jest jednym z elementów fizjologii drobnoustrojów. Do przebiegu fermentacji konieczne są drobnoustroje lub wytworzone przez nie enzymy. - homofermentacja proces fermentacji, w której powstaje 1 produkt końcowy, np. fermentacja mlekowa (glukoza kwas mlekowy) prowadzona przez Lactococcus lactis. - heterofermentacja powstaje 2 lub więcej produktów, np. mlekowa (glukoza kwas mlekowy + CO 2 + alkohol) prowadzona przez Lactobacillus, 5
Do najważniejszych typów fermentacji należą: alkoholowa, cytrynowa, propionowa, masłowa, mlekowa, octowa. Fermentacja masłowa Jest to typowy proces beztlenowy, w wyniku którego przy rozkładzie węglowodanów powstaje kwas masłowy. Jest to heterofermentacja. Wytwarzane są również: kwas octowy, butanol, aceton, metan, propan itp. Przedstawiciele: Clostridium pasteurianum 1, C. butyricum 1, C. pectinovorum 2, C. felsineum 3, C. acetobutylicum 3. 1 rozkładają glukozę do kwasu masłowego, 2 rozkładają pektyny do kwasu masłowego, 3 rozkładają różne substancje organiczne do kwasu masłowego. Udział bakterii masłowych w niszczeniu produktów spożywczych w mleczarstwie powodują psucie się pasteryzowanego mleka i tzw. późne wzdęcia serów podpuszczkowych dojrzewających (gł. C. tyrobutyricum, C. butyricum, C. sporogenes, do mleka mogą dostać się np. przy karmieniu krów nieprawidłowo przygotowanymi kiszonkami), powodują psucie się konserw warzywnych i owocowych (C. butyricum, C. pasteurianum, C. sporogenes), powodują psucie się kiszonych pasz. Korzystny udział bakterii masłowych Bakterie masłowe odgrywają ważną rolę w roszarnictwie lnu i konopi (podczas ich moczenia po ścięciu), ponieważ rozkładają pektyny, dzięki czemu len i konopie dają się rozdzielać na pojedyncze włókna i można oddzielić włókna przędne od tkanki korowej i zdrewniałej. V. METODA BARWIENIA PRZETRWALNIKÓW WG SCHAEFFERA-FULTONA Zdjęcie spod mikroskopu wybarwionych na zielono przetrwalników i różowo-czerwonych komórek wegetatywnych bakterii 6
Technika barwienia przetrwalników bakteryjnych metodą Schaeffera-Fultona 1. Na wysuszony i utrwalony preparat działamy zielenią malachitową na gorąco do trzeciej pary ok. 5 minut. 2. Studzimy powoli preparat. 3. Spłukujemy wodą. 4. Działamy safraniną 40 sekund. 5. Spłukujemy wodą. 6. Preparat suszymy i oglądamy pod immersją. VI. REDUKCJA AZOTANÓW NO - - 3 NO 2 Test redukcji azotanów przez rosnące bakterie oceniany jest w hodowli w probówce, na podłożu azotanowym, zawierającym 0,5% azotanu(v) potasowego. Po inkubacji hodowla jest badana pod kątem - obecności gazu i jonów NO 2 w pożywce. Do wykrywania reakcji wykorzystuje się odczynnik Griessa (kwas sulfanilowy reaguje z azotynami dając sól dwuazową, która w reakcji z N-1-naftalenodiaminą daje barwny (różowomalinowy) związek azowy, wykrywany spektrofotometrycznie przy 548 nm. 7
VII. BADANIE RUCHU BAKTERII W KROPLI WISZĄCEJ połóż szkiełko podstawowe na nakrywkowym Część praktyczna: Wszystkie doświadczenia wykonujemy w warunkach sterylnych! 1. Barwienie metodą Grama bakterii Bacillus wyizolowanych z gleby (jeden preparat na grupę) a) wykonać rozmaz z badanej hodowli Bacillus wyizolowanej z gleby a następnie przeszczepionej metodą posiewu redukcyjnego na agar odżywczy na szalkę Petriego b) rozmaz utrwalić a następnie barwić metodą Grama wg instrukcji, obserwować pod mikroskopem (immersja) c) obserwacje rysunek wraz z opisem (sprawozdanie 1) 2. Barwienie metodą Schaeffera-Fultona przetrwalników bakterii Bacillus wyizolowanych z gleby (dwa preparaty na grupę) a) wykonać rozmaz z badanej hodowli Bacillus wyizolowanej z gleby a następnie przeszczepionej metodą posiewu redukcyjnego na agar odżywczy na szalkę Petriego b) rozmaz utrwalić a następnie barwić metodą Schaeffera-Fultona wg instrukcji powyżej c) obserwacje spod mikroskopu (immersja) rysunek wraz z opisem (sprawozdanie 1) 8
3. Test na katalazę (jeden na grupę) a) materiał mikrobiologiczny stanowią: ziarniaki (hodowla na skosie) i Bacillus (hodowla na szalce Petriego) b) na szkiełko nakrywkowe (nie sterylne) nanieść dwie krople wody utlenionej (jedną kroplę podpisać ziarniaki, drugą Bacillus) c) w warunkach sterylnych pobrać niewielką ilość ziarniaków i włożyć do odpowiednio opisanej kropli wody utlenionej, to samo powtórzyć dla Bacillus d) obserwować czy nastąpi pienienie hodowli, d) wynik zinterpretować (sprawozdanie 1) 4. Posiew Bacillus na podłoże płynne do wykrywania mikroorganizmów redukujących azotany (jeden na grupę) a) pobrać ezą Bacillus i przeszczepić go do hodowli płynnej zawierającej azotany (V) b) pozostawić opisane probówki hodowlane do inkubacji we wskazanym miejscu 5. Określanie ruchu bakterii Bacillus w kropli wiszącej prezentacja 9