stężenie [g l -1 ] Ćwiczenie 3: Bioreaktor mikrobiologiczny Cel ćwiczenia: Wyznaczanie równania kinetycznego wzrostu mikroorganizmów oraz współczynników stechiometrycznych w hodowli okresowej szczepu Bacillus licheniformis. Kinetyka wzrostu Wzrost mikroorganizmów to bardzo złożony proces. We wnętrzu komórek zachodzi wiele, powiązanych ze sobą przemian enzymatycznych o skomplikowanej kinetyce. Uwzględnienie wszystkich tych relacji stechiometrycznych i kinetycznych jest bardzo skomplikowane, dlatego też do opisu wzrostu mikroorganizmów wykorzystuje się jedynie najbardziej istotne zależności występujące w czasie wzrostu danej populacji. Wzrost mikroorganizmów można rozpatrywać jako bardzo złożoną przemianę, w której tworzona jest biomasa i produkty metabolizmu i ewentualnie substancje organiczne (np. białka enzymatyczne, antybiotyki) produkowane przez szczep w specyficznych warunkach. Jednym z najważniejszych parametrów, który określa szybkość wzrostu biomasy mikroorganizmów jest właściwa szybkość wzrostu () zdefiniowana jako: 1 X dx dt (1) gdzie: X-stężenie biomasy [g l -1 ] t czas [h] W trakcie hodowli okresowej wyróżnia się 4 główne fazy (Rys. 1). faza zastoju faza wzrostu.3 logarytmicznego.25 faza stacjonarna faza obumierania.2.15 biomasa.1.5 substrat 4 8 12 16 2 24 28 32 36 4 44 czas [h] Rys. 1 Wzrost mikroorganizmów w hodowli okresowej przebieg zmiany stężenia substratu i biomasy w czasie.
Jedynie w fazie wzrostu logarytmicznego właściwa szybkość wzrostu przyjmuje stałą, maksymalną w danej hodowli (= przy danym stężeniu substratu) wartość. W fazie wzrostu logarytmicznego wzrost podlega zasadom kinetyki I rzędu względem stężenia biomasy. Równanie (1) sprowadza się do postaci (2), gdzie właściwa szybkość wzrostu jest odpowiednikiem stałej szybkości reakcji. dx dt X (2) Po scałkowaniu równania (2) dla zakresu odpowiadającego wzrostowi logarytmicznemu uzyskuje się zależność: ln X 2 ln X1 t2 t1 (3) gdzie: X 1, X 2 - graniczne stężenie biomasy w obrębie wzrostu logarytmicznego [g l -1 ] t 1, t 2 - czasy odpowiadające odpowiednio X 1, X 2 [h] Wartość właściwej szybkości wzrostu jest zależna od szczepu mikroorganizmów, parametrów fizykochemicznych (T, ph, siła jonowa) oraz jest funkcją stężenia substratu (-ów) (zwykle substratu węglowego stanowiącego główne źródło węgla i energii, nazywane substratem limitującym). Najprostszym, ale najczęściej spotykanym modelem opisującym relację właściwej szybkości wzrostu i stężenia substratu limitującego jest model przedstawiony przez Monoda: K max S (4) S c c S gdzie: c S -stężenie substratu limitującego[g l -1 ] K S - stała Monoda [g l -1 ] max maksymalna szybkość wzrostu [h -1 ] Zależność ta, analogiczna do równania Michaelisa-Menten, przedstawiona jest schematycznie na Rys. 2. max K S c S Rys. 2 Zależność właściwej szybkości wzrostu od stężenia substratu limitującego opisana modelem Monoda. Stałe powyższego równania kinetycznego można wyznaczyć zarówno przy wykorzystaniu wyników z hodowli okresowej, jak i z hodowli ciągłej. Realizacja hodowli
ciągłej jest znacznie bardziej skomplikowana, aniżeli hodowli okresowej, stąd wyznaczenie wartości tych stałych z reguły rozpoczyna się na podstawie danych uzyskanych w hodowli okresowej. Założenia modelu: 1. Równanie kinetyczne jest funkcją empiryczną, stąd obowiązuje tylko dla danego szczepu w danych warunkach procesowych (T, ph, skład mineralny pożywki), w badanym zakresie stężenia substratu limitującego. 2. Przyjęło się, że substratem limitującym wzrost komórek jest zwykle substrat węglowy. Pozostałe składniki (również tlen) pozostają w nadmiarze przez cały okres trwania hodowli nie powodując inhibicji. 3. W przypadku procesów z inhibicją substratową lub produktową, równanie Monoda obowiązuje w bardzo wąskim zakresie. 4. Równanie kinetyczne wyznaczone z hodowli okresowej dotyczy medium rozcieńczonego; w przypadku znacząco wyższych stężeń biomasy (X >15 g l -1 ), opis procesu jest znacznie bardziej skomplikowany. Stechiometria procesu Stechiometrię procesu wyznacza się najczęściej względem organicznego składnika węglowego, który stanowi czynnik limitujący proces. Część masy tego składnika zużywana jest na przyrost biomasy, część na tzw. przemianę podstawową komórek (m s ) obecnych w reaktorze a część na syntezę substancji organicznych, w tym enzymów. W procesach produkcyjnych, gdzie celem hodowli jest pozyskanie wysokiego stężenia substancji czynnych (enzymów, antybiotyków ) dąży się do wytworzenia takich warunków hodowli, by ilość substancji zużywana na przyrost substancji czynnych była jak najwyższa. Najprostszymi parametrami wyrażającym stechiometrię procesu są współczynniki wydajności, które wyraża się w literaturze naukowej przez tzw. równoważniki C-mol. Uproszczoną metodą jest wyrażenie ich poprzez stężenia poszczególnych składników: - biomasy Y X/S =dx/dc S - produktu Y Pr/S =dc Pr /dc S W hodowli okresowej zmiana stężenia poszczególnych składników odnosi się do wartości granicznych tj. na początku hodowli, gdzie stężenie substratu jest najwyższe, biomasy bliskie zera a produkowanych substancji organicznych równe zero oraz do momentu, gdzie stężenie danego składnika jest maksymalne (jak pokazano na Rys. 3), co może, ale nie musi odpowiadać spadkowi stężenia substratu do zera.
stężenie [g l -1 ].3.25.2.15.1.5 4 8 12 16 2 24 28 32 36 4 44 czas [h] Rys. 3 Przebieg zmiany stężenia substratu i biomasy w czasie. Przebieg doświadczenia Badania prowadzi się w termostatowanym bioreaktorze (przy temperaturze dobranej dla danego szczepu) wyposażonym w mieszadło mechaniczne, które zapewnia pseudohomogeniczność układu, przy odpowiednim natlenieniu hodowli. Wszystkie elementy bioreaktora, jak i pożywka poddawane są uprzednio sterylizacji (121 C). Schematycznie układ badawczy przedstawiono na Rys. 4. rotametr pobór próbek powietrze sterylne Rys. 4 Schemat bioreaktora mieszalnikowego do hodowli wgłębnej pracującego w systemie okresowym.
Sposób przeprowadzenia eksperymentu Przygotowane przez zajęciami dydaktycznymi: Do bioreaktora o pojemności 2,5 dm 3 wprowadza się 1,5 dm 3 pożywki mineralnej o składzie na 1 litr: K 2 HPO 4 6g, KH 2 PO 4 3g, MgSO 4,1g, CaCl 2,4g, MnSO 4,1g, FeSO 4 *7H 2 O,1g, ZnSO 4 *6H 2 O,1g, cytrynian trójsodowy 1g, (NH 4 ) 2 SO 4 1g, NaNO 3 3g i poddaje sterylizacji w autoklawie (121 C) przez 1h. Jednocześnie w osobnym naczyniu sterylizuje się roztwór glukozy (15 g l -1 ). Hodowlę rozpoczyna się poprzez dodanie odpowiedniej ilości glukozy do sterylnej pożywki mineralnej, tak aby w poszczególnych hodowlach okresowych uzyskać stężenie początkowe cukru,4-1 g l -1 i zaszczepienie reaktora bezpośrednio z płytki agarowej (2 pełne oczka ezy). Strumień powietrza podawany jest do bioreaktora ze sprężarki poprzez filtr celulozowy. W trakcie zajęć dydaktycznych: Próbki do analizy (2 x 5 ml) pobiera się do plastikowych, krótkich probówek w odstępach 2-3 minutowych zwracając uwagę na sterylność używanych do tego celu pipet i otoczenia przy otwieranym zaworze (opalanie palnikiem). Pobrane próbki służą następnie do wykonania poniższych analiz. 1. Stężenie komórek oznacza się spektrofotometrycznie poprzez pomiar mętności hodowli, przy 55 nm względem wody. Krzywa standardowa dla Bacillus licheniformis uzyskana metodą suchej masy przy drodze optycznej wynoszącej 1mm, opisana jest równaniem A(55nm)= 4,286. X [g/l], gdzie X-stężenie biomasy. Wszystkie pomiary należy wykonać przynajmniej w dwukrotnym powtórzeniu, w razie potrzeby odpowiednio rozcieńczając próbkę wodą, tak aby nie przekroczyć wartości absorbancji 1, (absorbancja po rozcieńczeniu nie powinna być niższa niż,1). Należy zwrócić uwagę na zamieszanie prób przed wykonaniem rozcieńczenia i zmierzeniem w spektrofotometrze. 2. Odwirowanie prób wyjściowych przy 3 obr./min. przez 15 min. (proszę zwrócić uwagę na wyważenie wirówki poprzez ustawienie naprzeciwko probówek z taką samą ilością płynu). 3. Stężenie białek zewnątrzkomórkowych (w tym proteaz) oznacza się spektrofotometrycznie poprzez pomiar (z odwirowanych prób) absorbancji przy 28 nm względem wody. Krzywa standardowa dla białek produkowanych przez Bacillus licheniformis opisana jest równaniem A(28nm)=,982. c Pr [g/l], gdzie c Pr -stężenie białek (produktu organicznego). Wszystkie pomiary należy wykonać przynajmniej w dwukrotnym powtórzeniu, w razie potrzeby odpowiednio rozcieńczając próbkę wodą, tak aby nie przekroczyć wartości absorbancji 1, (absorbancja po rozcieńczeniu nie powinna być niższa niż,1). Należy zwrócić uwagę na klarowność mierzonych prób. 4. Stężenie substratu węglowego (glukozy) oznacza się za pomocą testu DNS. W tym celu do,5 ml odwirowanego medium hodowlanego należy dodać 1,5 ml odczynnika DNS i próby wstawić na 5 min. do łaźni wodnej o temp. 1 C. Następnie próby należy szybko ochłodzić, dodać 8 ml wody destylowanej i po 25 min od wyjęcia z łaźni zmierzyć absorbancję przy 55 nm względem kontroli. Próbę kontrolną uzyskuje się poprzez dodanie,5 ml wody destylowanej zamiast,5 ml medium traktując następnie próbę kontrolną, jak wszystkie pozostałe. Krzywa standardowa
stężenie [g l -1 ] dla glukozy opisana jest równaniem A(55nm)=,65. c S [g/l] -,2 przy drodze optycznej wynoszącej 1mm. Zakres stosowalności równania,1-1,6 g l -1. Jeżeli stężenie cukru w próbie pobranej z reaktora przekracza 1,6 g l -1, przed wykonaniem testu należy rozcieńczyć je wodą destylowaną odpowiednią ilość razy. Test DNS wykonuje się w 2 ml, szklanych probówkach. Przed pomiarem bardzo istotne jest dokładne wymieszanie prób po uprzednim zamknięciu probówek parafilmem. Odczynnik DNS zawiera fenol, stąd należy zwrócić uwagę, by nie miał kontaktu ze skórą. Opracowanie wyników 1.Wyniki uzyskane w trakcie hodowli zbiera się w formie tabelarycznej. 1. Czas hodowli [h] A (55nm) X [g l -1 ] A (28nm) Rozcieńczenie Rozcieńczenie c Pr [g l -1 ] DNS (55nm) Rozcieńczenie c S [g l -1 ] 2. 2. Wyznaczenie stałych równania kinetycznego. Na podstawie danych z tabeli wykreśla się wykres:.8.7.6.5.4.3.2.1 25 5 75 1 125 15 175 2 czas [h] biomasa glukoza Rys. 5 Zmiana stężenia komórek i stężenia glukozy w hodowli okresowej. W celu obliczenia wartości (dla danego reaktora = dla danego stężenia substratu) sporządza się wykres w układzie współrzędnych ln X=f(t) (Rys. 6), na którym wyodrębnia się odcinek prostoliniowy odpowiadający fazie logarytmicznego wzrostu.
[h 1 ] ln X -.5 czas [h] 25 5 75 1 125 15 175 2 225-1 -1.5-2 -2.5-3 -3.5 Rys. 6 Zmiana stężenia komórek -wykres półlogarytmiczny. Dla przedstawionego przypadku uzyskana na podstawie współczynnika kierunkowego prostej (Rys.6) wartość wyniosła,53 [h -1 ]. Odcinek prosty został wykreślony na podstawie zmiany stężenia biomasy pomiędzy 19 a 23,5 godziną hodowli. Średnie stężenie glukozy w tym przedziale czasu wynosiło,581 g l -1. Uzyskaną parę punktów (,581;,53) wraz z analogicznie uzyskanymi punktami z kolejnych hodowli okresowych nanosi się na wykres przedstawiony na Rys. 7..1.8.6.4.2 2 4 6 8 1 stężenie glukozy [g l -1 ] Rys. 7 Zależność właściwej szybkości wzrostu od stężenia substratu. Po linearyzacji równania Monoda (równ.(5)) 1 K S max 1 c S 1 max (5)
w prosty sposób znajduje się wartości szukanych stałych (Rys.8). 1/ [h -1 ] 3 25 2 15 1 5 y = 5.93x + 1.136-3 -2-1 1 2 3-5 1/c S [l g -1 ] Fig. 8 Zlinearyzowana postać równania Monoda kinetycznego. służąca wyznaczeniu stałych równania Z uwagi na fakt, że w trakcie zajęć prowadzone będą badania tylko na 3 bioreaktorach, prowadzący poda dodatkowe punkty do wykreślenia funkcji =f(c S ). 3. Na podstawie tabeli wykreślić wykres zmian stężenia substratu i produktu (białka) w czasie i wybrać punkty do wyznaczenia współczynnika wydajności produktu. Analogicznie w celu wyznaczenia współczynnika wydajności biomasy wykorzystać wykres przedstawiony na Rys. 5. Wyznaczone wartości współczynników winne być zawarte w przedziale (,1). Literatura (obowiązująca obok przedstawionego powyżej materiału na kartkówce): Schleger Mikrobiologia ogólna, W-wa 1996; rozdz. 6.1-6.2 (str.225-236), 6.4-6.55 (str.238-259). Opracowała: Anna Trusek-Hołownia