GENOMIKA FUNKCJONALNA Jak działają geny i genomy? Poziom I: Analizy transkryptomu
Adnotacja (ang. annotation) pierwszy etap po uzyskaniu kompletnej sekwencji nukleotydyowej genomu analiza bioinformatyczna (in silico) identyfikacja genów, sekwencji regulatorowych i przypisywanie im funkcji (hipotetycznych)
Komputerowa analiza sekwencji nie może być ostatecznym dowodem na istnienie genu Analiza bioinformatyczna musi być potwierdzona eksperymentalnie Jednym ze sposobów stwierdzenia, że dany odcinek DNA jest rzeczywiście genem jest zbadanie transkryptomu komórki, czyli sprawdzenie: czy w komórce znajduje się transkrypt danego (hipotetycznego) genu, a jeśli tak to: ile jest jego kopii kiedy (tj. w jakich warunkach: czas, miejsce, czynniki zewnętrzne), dany transkrypt się pojawia
Analiza trankryptomu komórki (globalna czy dotycząca wybranych genów) dostarcza nam wielu cennych informacji dotyczących sposobu działania genomu: 1. pozwala zmapować we fragmencie DNA pozycje transkrybowane czyli mówi nam, że w konkretnym regionie znajduje się gen (a nie np. pseudogen) 2. umożliwia lokalizację granicy intron-ekson w przypadku genów nieciągłych 3. pozwala pokazać różnice w poziomie i czasie ekspresji genów
Test hybrydyzacyjny typu Northern najprostsza metoda ustalenia czy dany fragment zawiera sekwencję ulegającą ekspresji 1. Ekstrakcja RNA z komórki (Uwaga na RNAzy) Stosunkowo trudna w przypadku bakterii (szybka degradacja transkryptów mrna, krótki okres półtrwania) Łatwa w przypadku eukariontów obecność ogonka Poly(A) 2. Elektroforeza w warunkach denaturujących (żel agarozowy z formaldehydem zapobiega tworzeniu się struktur dsrna)
3. Transfer na membranę zasada analogiczna jak w przypadku hybrydyzacji Southerna różnice dotyczą warunków samego transferu 4. Przygotowanie sondy- najczęściej wyznakowany fragment DNA, który podejrzewamy, że jest genem 5. Hybrydyzacja i detekcja
Alternatywą dla hybrydyzacji typu Northern jest RT-PCR
Real-Time PCR Reakcja PCR z wykrywaniem produktów w czasie rzeczywistym czyli bez konieczności sprawdzania obecności produktów np. poprzez elektroforezę w żelu agarozowym Polimeraza (z aktywnością egzonukleazy 5-3 ) dntp bufor, MgCl Matryca - DNA Denaturacja nici, przyłączanie Starterów Wydłużanie nici
Real-Time PCR Dzięki użyciu sond fluorescencyjnych reakcja ma gigantyczną czułość i można ją zastosować do precyzyjnego oznaczania ilości cząsteczek kwasów nukleinowych
Wydajność amplifkacji obserwujemy poprzez pomiar fluorescencji Intensywność świecenia jest skorelowana z ilością odłączanego znacznika a zatem ilością powstającego produktu to z kolei zależy od wyjściowej ilości kopii cząsteczek matrycy np. ilości kopii mrna danego genu qrt-pcr (ang. quantitative reverse transcriptase real-time PCR), pierwszym etapem jest przepisanie RNA na cdna przy pomocy odwrotnej transkryptazy W reakcji można wykorzystywać kilka sond wyznakowanych różnymi fluorochromami, co umożliwia obserwację amplifikacji różnych fragmentów cdna (dla różnych genów)
Badanie różnicy ilości mrna Różnych genów w tej samej tkance, komórce Tego samego genu w różnych tkankach (np. zdrowych i zmienionych chorobowo) u różnych pacjentów z tą samą chorobą
Badanie promotorów i innych sekwencji regulatorowych za pomocą genów reporterowych pozwala pokazać różnice w poziomie ekspresji genów Stosuje dla określenia gdzie (np. w jakiej tkance), kiedy (w jakich warunkach, w jakim okresie życia), a także na jakim poziomie (możliwość ilościowego oznaczenia) gen ulega ekspresji. Gen reporterowy to taki, którego ekspresję można łatwo zaobserwować najlepiej wzrokowo.
Zasada działania: Aby gen reporterowy mógł wiarygodnie wskazywać gdzie i kiedy badany gen ulega ekspresji, trzeba zastąpić ORF badanego genu, otwartą ramką odczytu genu reporterowego tworząc tzw. fuzję tranksrypcyjną Teraz gen reporterowy będzie miał taki sam wzór ekspresji jak gen badany
lacz -galaktozydaza badania promotorów (głównie bakterie) detekcja test histochemiczny XhoI BglII EcoRI KpnI XbaI PstI o r i T M C S la c Z o r i V p M P 2 2 0 ( 1 0 4 0 0 0 p z ) t r f A T e t uida glukuronidaza (GUS) oznaczenia enzymatyczne szczególnie w komórkach i ekstraktach roślinnych (brak naturalnego tła GUS w roślinach) detekcja test histochemiczny
Lux: enzymatyczne utlenianie lucyferyny katalizowane lucyferazą: chemiluminescencja świetliki Phausis splendidula Photobacterium phosphoreum lux badanie aktywności promotorów zarówno bakteryjnych jak i eukariotycznych
GFP (green fluorescent protein) detekcja fluorescencja GFP - meduza występująca w Pacyfiku Aequoria victoria
Globalne (czyli dotyczące dużej liczby genów) analizy transkryptomu macierze DNA Macierz DNA - gęsto ułożone cząsteczki DNA, umieszczone na stałym podłożu (nośniku: np. szkle, plastiku, membranie nylonowej) reprezentujące a) cały genomu b) kodujące odcinki genomu, czyli geny (najczęściej wszystkie, albo dużą ich część) badanego organizmu Tego typu układy przeznaczone są do równoległych analiz hybrydyzacyjnych, za pomocą których możemy pokazać np.: wyrażanie się genów w komórce oraz różnice w poziomie ich ekspresji (transkrypcji)
Nazewnictwo inne niż w tradycyjnych technikach hybrydyzacyjnych: probe - sonda - kwas nukleinowy o znanej sekwencji, unieruchomiony na nośniku target - wolny kwas nukleinowy, zwykle wyznakowany, który poddajemy badaniu, jest to cała populacja cząsteczek np. całkowite mrna komórkowe czyli transkrypty wszystkich genów
Macierze są opisywane w wersji makro i mikro. Różnica dotyczy pojemności macierzy tj. liczby unieruchomionych na stałej powierzchni odcinków DNA Makromacierze mała gęstość sond na dużej powierzchni, mała pojemność jeśli chodzi o reprezentację genów z danego genomu Mikromacierze duża gęstość sond, łatwo zmieścić wszystkie geny genomu
Istnieją dwa podstawowe warianty mikromacierzy DNA które różnią się: rodzajem sondy - rodzajem kwasu nukleinowego umieszczonego na stałej powierzchni przeznaczeniem (zastosowaniem) Format I: mikromacierz oligonukleotydowa chip genowy, chip DNA sondy reprezentujące geny z genomu umieszczone są na stałej powierzchni w postaci bardzo krótkich odcinków DNA długości 20~80 nt (oligonukleotydów) Ten typ mikromacirzy z syntezą in situ został opracowany przez firmę Affymetrix, Inc. Format II: mikromacierz cdna sondy reprezentujące geny z genomu umieszczone są na stałej powierzchni w postaci odcinków cdna długości 500~5,000 pz
Zasadnicze zastosowanie macierzy oligonukleotydowych (Format I) : (1) Oznaczenie ilości mrna genów w pojedynczej (tej samej) próbce Macierz oligonukleotydowa ma ogromną specyficzność wiązania i wykrywania targetu (na chipie jest kilkanaście kopii sond danego genu) co czyni ją bardziej użyteczną przy monitorowaniu ekspresji genów w genomach, w których mrna ulega dojrzewaniu
Ważne: W eksperymentach z chipami oligonukloetydowymi do jednego chipa hybrydyzowana jest tylko jedna próbka target. Etapy przygotowania targetu 1. Ekstrakcja mrna 2. Odwrotna transkrypcja do cdna 3. Znakowanie (np. biotyną) z transkrypcją cdna do crna Po wyznakowaniu crnas hybrydyzuje się z chipem, a następnie wybarwia w celu uwidocznienia hybrydyzacji i określenia intensywności wiązania do sondy
Mikromacierze cdna (Format II) Podstawowe zastosowanie macierzy cdna to porównywanie poziomu ekspresji genów pomiędzy różnymi próbkami Eksperyment z macierzą cdna obejmuje najczęściej przygotowanie dwóch próbek targetów : kontrolnej i badanej (np. tkanki zdrowej i zmienionej nowotworowo). Przygotowanie dwóch targetów Z dwóch różnych próbek izoluje się mrna poddaje się je odwrotnej transkrypcji do cdna w czasie której próbki znakuje się fluorescencyjnym barwnikiem np. próbkę kontrolną barwnikiem zielonym (Cy3), a badaną czerwonym (Cy5). Dzięki temu można je użyć równocześnie do hybrydyzacji do tej samej macierzy.
Macierz cdna jest bardzo przydatna przy globalnych analizach ekspresji całego genomu polegających na równoczesnym porównywaniu ekspresji genów komórek rosnących w dwu różnych warunkach (stanach fizjologicznych) Co się wtedy stanie? Dwie próbki kompetycyjnie wiążą się do macierzy a próbka, która zawiera więcej specyficznego cdna (tzn. wyjściowo zawierała więcej mrna czyli poziom ekspresji określonych genów był wyższy) wygra to współzawodnictwo. Jeśli np. w tzw. próbce kontrolnej jest więcej mrna dla danego genu w porównaniu z tzw. próbką badaną (czyli ekspresja danego genu w próbce badanej jest zmniejszona) więcej DNA wyznakowanego Cy3 (zielony barwnik) zwiąże się z sondą i plamka będzie świecić na zielono. Jeśli będzie odwrotnie plamka będzie świecić na czerwono.