For Use With The High Pure System

COBAS TaqMan HCV Test, v2.0 For Use With The High Pure System DO STOSOWANIA W DIAGNOSTYCE IN VITRO. COBAS TaqMan HCV Test, v2.0 HCV HPS V2 48 Tests P/N: 04861817 190 High Pure System Viral Nucleic Acid Kit 48 Tests P/N: 03502295 001 PRZEZNACZENIE Test COBAS TaqMan HCV, v2.0, przeznaczony do użytkowania łącznie z zestawem High Pure System (HPS), jest testem in vitro opartym na amplifikacji kwasu nukleinowego w celu ilościowej oceny stężenia RNA wirusa zapalenia wątroby typu C (HCV), genotyp od 1 do 6, w ludzkiej surowicy lub osoczu, z wykorzystaniem zestawu High Pure System Viral Nucleic Acid do ręcznego przygotowywania próbek oraz analizatora COBAS TaqMan 48 do automatycznej amplifikacji i detekcji. Test jest przeznaczony do stosowania łącznie z kliniczną oceną chorego oraz wynikami innych badań laboratoryjnych w celu oceny odpowiedzi wirusologicznej na leczenie przeciwwirusowe, mierzonej za pomocą zmian poziomu RNA HCV w osoczu lub surowicy. Najnowsze dane sugerują, że wczesne zmiany poziomów RNA HCV w surowicy/osoczu pozwalają przewidzieć odległą reakcję na leczenie interferonem 1. Test COBAS TaqMan HCV, v2.0, nie jest przeznaczony do przesiewowego badania na obecność wirusa HCV we krwi lub produktach krwiopochodnych ani do stosowania jako test diagnostyczny, potwierdzający zakażenie wirusem HCV. PODSUMOWANIE ORAZ OPIS TESTU Wirus zapalenia wątroby typu C (Hepatitis C Virus, HCV) jest uważany za główny czynnik etiologiczny odpowiedzialny za 90 95% przypadków poprzetoczeniowego zapalenia wątroby nie-a i nie-b 2-4. HCV jest wirusem zawierającym jednoniciowy, sensowny RNA z genomem o długości około 10 000 nukleotydów kodujących 3000 aminokwasów. Jako wirus występujący we krwi, HCV może być przenoszony przez krew i produkty krwiopochodne. Powszechnie przyjęte badania przesiewowe krwi w kierunku obecności wirusa HCV doprowadziły do znacznego obniżenia ryzyka zapalenia wątroby związanego z transfuzjami. Największa częstość zakażeń wirusem HCV występuje w związku z nadużywaniem leków dożylnych oraz, w mniejszym stopniu, z innymi rodzajami przezskórnej ekspozycji 4. Ogólnoświatowa częstość występowania zakażenia HCV, ustalonego za pomocą badania immunoserologicznego, waha się od 1,0% w Europie do 5,3% w Afryce 5. Z uwagi na obecność przeciwciał anty-hcv u pacjentów zakażonych HCV opracowano testy immunoserologiczne swoiste dla tych przeciwciał. Obecność przeciwciał anty-hcv jest jednak miarą wcześniejszego narażenia na zakażenie i nie może być uważana za marker aktualnego zakażenia. Ponadto nie jest dostępny sposób bezpośredniej detekcji za pomocą metod hodowli wirusowej. Pomiar aktywności aminotransferazy alaninowej (ALT) jest uważany za zastępczy wskaźnik zakażenia HCV. Nie jest jednak sposobem bezpośredniej oceny wiremii. Stopień zwiększenia aktywności ALT może nie być bezpośrednio skorelowany z poziomem zakażenia HCV. W rzeczywistości aktywność ALT może być zwiększona przez liczne przyczyny zapalenia wątroby. Należy do nich m.in. wirusowe zapalenie wątroby. Natomiast wykrycie i oznaczenie ilościowe RNA HCV za pomocą amplifikacji kwasu nukleinowego metodą reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR) pozwala na pomiar aktywnej wiremii 6-8. Przy użyciu metody PCR możliwe jest wykrycie wiremii HCV przed serokonwersją immunologiczną 9-10, a także wykrycie zmian w zawartości wirusa w organizmie pacjentów z przeciwciałami, przewlekle zakażonych HCV i leczonych interferonem 1. 1

ZASADY PROCEDURY Test COBAS TaqMan HCV, v2.0, jest oparty na trzech głównych procesach: (1) ręcznym przygotowaniu próbki w celu uzyskania RNA HCV; (2) automatycznej transkrypcji docelowego RNA w celu uzyskania komplementarnego DNA (cdna); (3) równoczesnej amplifikacji PCR docelowego cdna z użyciem swoistych dla HCV, komplementarnych primerów oraz detekcji rozszczepionych, podwójnie znakowanych barwnikiem fluorescencyjnym detekcyjnych sond oligonukleotydowych, które umożliwiają ilościową ocenę amplifikowanego docelowego produktu HCV (amplikonu). Odczynnik Master Mix zawiera pary primerów i sondy, swoiste zarówno dla RNA HCV, jak i RNA preparatu HCV Quantitation Standard. Detekcji amplifikowanego DNA dokonuje się przy użyciu swoistych dla sekwencji docelowych oraz swoistych dla preparatu Quantitation Standard, podwójnie znakowanych sond oligonukleotydowych, pozwalających na niezależną identyfikację amplikonu HCV i amplikonu HCV Quantitation Standard. Oznaczenie ilościowe RNA wirusa HCV przeprowadza się za pomocą preparatu HCV Quantitation Standard. HCV Quantitation Standard to niezakaźny konstrukt Armored RNA, zawierający identyczne miejsca wiązania primerów z posiadanymi przez docelowy RNA HCV, oraz charakterystyczne miejsce wiązania sondy, które umożliwia zróżnicowanie amplikonu HCV Quantitation Standard od amplikonu HCV. HCV Quantitation Standard wchodzi w skład każdej poszczególnej próbki i kontroli; znana jest liczba jego kopii; razem z docelowym HCV przechodzi etapy: przygotowania próbki, odwrotnej transkrypcji, amplifikacji PCR oraz detekcji. Analizator COBAS TaqMan 48 oblicza miano RNA HCV w badanych próbkach na podstawie porównania sygnału HCV z sygnałem HCV Quantitation Standard w każdej próbce oraz kontroli. HCV Quantitation Standard rekompensuje wpływ hamowania oraz kontroluje procesy przygotowywania i amplifikacji, umożliwiając uzyskanie dokładnego oznaczenia ilościowego RNA HCV w każdej próbce. Wybór sekwencji docelowej Wybór docelowej sekwencji RNA dla HCV zależy od identyfikacji regionów, w których genom HCV posiada największą konserwatywność sekwencji dla wielu różnych genotypów HCV 11,12. Nieulegający transkacji region 5' genomu HCV zidentyfikowano jako najbardziej konserwatywną sekwencję RNA wśród znanych genotypów HCV 13. Test COBAS TaqMan HCV, v2.0, wykorzystuje w reakcjach odwrotnej transkrypcji i amplifikacji PCR primery, które definiują sekwencję w obrębie wysoce konserwatywnego, nieulegającego translacji regionu 5' genomu HCV. Przygotowanie próbki W teście COBAS TaqMan HCV, v2.0, przetwarza się próbki osocza z dodatkiem EDTA i próbki surowicy oraz izoluje RNA wirusa HCV w drodze podstawowego przygotowania wykonywanego ręcznie, opartego na wiązaniu kwasu nukleinowego przez włókna szklane. Cząstki wirusa HCV zostają poddane lizie poprzez ich inkubację w podwyższonej temperaturze z proteazą oraz chaotropowym buforem do lizy/wiążącym, który powoduje uwolnienie kwasów nukleinowych i ochronę uwolnionego RNA HCV przed znajdującymi się w osoczu i surowicy cząsteczkami RNazy. Znana liczba cząsteczek RNA preparatu HCV Quantitation Standard RNA jest wprowadzana do każdej próbki wraz z odczynnikiem lizującym. W dalszej kolejności do mieszaniny, w której dokonano lizy, dodaje się izopropanol, po czym mieszaninę wiruje się i przepuszcza przez kolumnę z wkładem filtrującym, zawierającym włókna szklane. W trakcie wirowania cząsteczki RNA wirusa HCV i preparatu HCV Quantitation Standard ulegają związaniu na powierzchni włókien szklanych filtra. Substancje niezwiązane, takie jak sole, białka i inne zanieczyszczenia pochodzenia komórkowego, zostają usunięte w wyniku wirowania. Zaadsorbowany kwas nukleinowy jest wymywany i poddany elucji roztworem wodnym. Materiały jednorazowego użytku umożliwiają równoczesną obróbkę 12 próbek lub wielokrotności tej liczby. Poddawana obróbce próbka, zawierająca RNA wirusa HCV oraz RNA preparatu HCV Quantitation Standard, jest następnie dodawana do mieszaniny do amplifikacji/detekcji. Następnie docelowy RNA wirusa HCV oraz preparatu HCV Quantitation Standard zostają poddane amplifikacji i detekcji za pomocą analizatora COBAS TaqMan 48 oraz odczynników do amplifikacji i detekcji, dostarczanych wraz z zestawem testowym. 2

Odwrotna transkrypcja oraz amplifikacja PCR Odwrotna transkrypcja Reakcje odwrotnej transkrypcji, amplifikacji PCR oraz detekcji przeprowadza się z użyciem termostabilnego, rekombinowanego enzymu polimerazy DNA Thermus specie Z05 (Z05). W obecności manganu (Mn 2+ ) i w odpowiednich warunkach układu buforowego Z05 uzyskuje aktywność odwrotnej transkryptazy i polimerazy DNA 14,15. Umożliwia to wystąpienie reakcji odwrotnej transkrypcji, amplifikacji PCR i detekcji w tej samej mieszaninie reakcyjnej. Poddane obróbce próbki dodaje się do mieszaniny amplifikacyjnej w probówkach do amplifikacji (K-tube), gdzie zachodzi zarówno odwrotna transkrypcja, jak i amplifikacja PCR. Mieszanina reakcyjna jest ogrzewana, aby primer znajdujący się za miejscem rozpoczęcia transkrypcji mógł wtopić się swoiście w docelowy RNA HCV oraz w RNA preparatu HCV Quantitation Standard. W obecności jonów Mn 2+ i przy nadmiarze trójfosforanów dezoksyrybonukleotydów (dntp), do których należą trójfosforany dezoksyadenozyny, dezoksyguanozyny, dezoksycytydyny i dezoksyurydyny, polimeraza Z05 wydłuża przyłączony w wyniku hybrydyzacji primer, tworząc nić DNA (cdna) komplementarną do docelowego RNA. Amplifikacja sekwencji docelowej Po odwrotnej transkrypcji docelowego HCV RNA oraz RNA preparatu HCV Quantitation Standard mieszanina reakcyjna jest ogrzewana, aby doszło do denaturacji hybrydy RNA:cDNA oraz odsłonięcia docelowych sekwencji primera. Po ochłodzeniu mieszaniny i swoistym związaniu primerów sensownych z nicią cdna Z05 wydłuża primer, syntetyzując drugą nić DNA. W ten sposób kończy się pierwszy cykl PCR. W jego wyniku powstała dwuniciowa kopia DNA regionu docelowego RNA HCV oraz RNA HCV Quantitation Standard. Mieszanina reakcyjna jest po raz kolejny podgrzewana w celu rozdzielenia powstałego dwuniciowego DNA i odsłonięcia sekwencji docelowych primerów. Podczas schładzania mieszaniny primery hybrydyzują do DNA docelowego. Z05, w obecności jonów Mn 2+ i nadmiaru trójfosforanów dezoksyrybonukleotydów, wydłuża wtopione primery wzdłuż docelowych matryc, tworząc dwuniciową cząsteczkę DNA, zwaną amplikonem. Analizator COBAS TaqMan 48 automatycznie powtarza powyższy proces przez określoną liczbę cykli, w każdym cyklu zmierzając do podwojenia ilości amplikonu DNA. Wymagana liczba cykli jest zaprogramowana w analizatorze COBAS TaqMan 48. Amplifikacja zachodzi wyłącznie w regionie genomu wirusa HCV znajdującym się pomiędzy primerami; cały genom HCV nie ulega zwielokrotnieniu. Amplifikacja wybiórcza Selektywną amplifikację badanego kwasu nukleinowego z próbki klinicznej w teście COBAS TaqMan HCV, v2.0, uzyskuje się dzięki zastosowaniu enzymu AmpErase (uracylo-n-glikozylaza) i trójfosforanu dezoksyurydyny (dutp). Enzym AmpErase rozpoznaje i katalizuje niszczenie nici DNA zawierających dezoksyurydynę 16, lecz nie DNA zawierającego dezoksytymidynę. W DNA występującym w naturze nie stwierdza się dezoksyurydyny, natomiast jest ona zawsze obecna w amplikonie, ze względu na stosowanie trójfosforanu dezoksyurydyny jako jednego spośród trójfosforanów dezoksyrybonukleotydu (dntp) w odczynniku Master Mix. Dlatego też dezoksyurydynę zawiera wyłącznie amplikon. Dezoksyurydyna powoduje wrażliwość zanieczyszczającego amplikonu na rozkład przez enzym AmpErase przed amplifikacją docelowego RNA. Także jakiekolwiek nieswoiste produkty reakcji, powstałe po wstępnej aktywacji odczynnika Master Mix przez jony manganu, na skutek działania enzymu AmpErase ulegają zniszczeniu, co powoduje poprawę czułości i swoistości testu. Enzym AmpErase, zawarty w odczynniku Master Mix, katalizuje rozkład DNA zawierającego dezoksyurydynę w miejscu reszt dezoksyurydynowych przez otwarcie pierścienia dezoksyrybozy w pozycji C1. Podczas ogrzewania w pierwszym cyklu termicznym łańcuch amplikonu DNA pęka w miejscu, w którym znajduje się dezoksyurydyna, w ten sposób wykluczając dalszą amplifikację DNA. Enzym AmpErase jest nieczynny w temperaturach powyżej 55 C, tj. w czasie trwania całego cyklu termicznego, dlatego też nie niszczy on amplikonu docelowego, powstałego podczas amplifikacji. 3

Detekcja produktów reakcji PCR w teście COBAS TaqMan Test COBAS TaqMan HCV, v2.0, wykorzystuje technologię reakcji PCR czasu rzeczywistego 17,18. Zastosowanie sond podwójnie znakowanych barwnikiem fluorescencyjnym zapewnia ciągłą detekcję gromadzenia się produktu reakcji PCR na podstawie monitorowania intensywności emisji fluorescencyjnych barwników reporterowych, uwalnianych w trakcie procesu amplifikacji. Sondy składają się z oligonukleotydów, swoistych dla HCV i HCV Quantitation Standard, znakowanych barwnikiem reporterowym i wygaszaczem. W teście COBAS TaqMan HCV, v2.0, sondy dla HCV i HCV Quantitation Standard są oznakowane różnymi fluorescencyjnymi barwnikami reporterowymi. Gdy podwójnie oznakowane barwnikami fluorescencyjnymi cząsteczki sond są nienaruszone, fluorescencja reportera jest przytłumiona bliskością wygaszacza, na zasadzie efektu przenoszenia energii typu Förstera. Podczas reakcji PCR sonda ulega hybrydyzacji z sekwencją docelową, a następnie rozszczepieniu pod wpływem posiadanej przez termostabilną polimerazę DNA Z05 aktywności 5' 3' nukleazy. Od chwili uwolnienia i rozdzielenia reportera i wygaszacza nie zachodzi już zjawisko wygaszania, a aktywność fluorescencyjna barwnika reporterowego nasila się. Amplifikację RNA HCV oraz RNA HCV Quantitation Standard mierzy się niezależnie od siebie, wykorzystując różne długości fal. Proces ten powtarza się zgodnie z wyznaczoną liczbą cykli, a w każdym cyklu następuje efektywne zwiększenie intensywności emisji poszczególnych barwników reporterowych, umożliwiając niezależną identyfikację RNA HCV oraz RNA preparatu HCV Quantitation Standard. Intensywność sygnałów odnosi się do ilości materiału wyjściowego na początku reakcji PCR. Podstawy oceny ilościowej w teście COBAS TaqMan HCV, v2.0 Test COBAS TaqMan HCV, v2.0, zapewnia dokładne wyniki ilościowe w bardzo szerokim zakresie dynamiki, ponieważ monitorowanie amplikonu przeprowadza się w fazie wykładniczej amplifikacji. Im wyższe jest miano HCV w badanej próbce, tym wcześniej fluorescencja barwnika reporterowego sondy HCV wzrasta powyżej wyjściowego poziomu fluorescencji (patrz rysunek 1). Ponieważ ilość RNA preparatu HCV Quantitation Standard (QS) jest stała we wszystkich próbkach, fluorescencja barwnika reporterowego sondy HCV QS powinna pojawiać się w każdej próbce w tym samym cyklu (patrz rysunek 2). W przypadku gdy na amplifikację i detekcję QS wpływa obecność inhibitorów lub niska wartość próbki, pojawienie się fluorescencji ulegnie opóźnieniu, pozwalając tym samym na odpowiednią modyfikację obliczonej wartości miana docelowego RNA wirusa HCV. Pojawienie się swoistego sygnału fluorescencyjnego jest rejestrowane jako krytyczna wartość progowa (Ct). Wartość Ct definiuje się jako liczbę cykli cząstkowych, po której fluorescencja barwnika reporterowego przekracza ustaloną wcześniej wartość progową (ustalony poziom fluorescencji) i zapoczątkowuje fazę wykładniczego wzrostu siły sygnału (patrz rysunek 3). Większa wartość Ct wskazuje na niższe miano początkowe docelowego RNA wirusa HCV. 2-krotny wzrost miana koreluje ze zmniejszeniem wartości Ct docelowego RNA HCV o 1, natomiast 10-krotny wzrost miana koreluje ze zmniejszeniem Ct o 3,3. Rysunek 1 przedstawia krzywe wzrostu docelowego dla serii rozcieńczeń próbek wirusa, obejmującej przedział 5-krotnej wartości log 10. W miarę wzrostu stężenia wirusów krzywe wzrostu przesuwają się w kierunku wcześniejszych cykli. Zatem krzywa wzrostu leżąca najdalej na lewo odzwierciedla najwyższy poziom miana wirusa, natomiast krzywa wzrostu leżąca najdalej na prawo oznacza najniższy poziom miana wirusa. 4

Rysunek 1 45,00 Normalizowana fluorescencja 40,00 35,00 30,00 25,00 20,00 15,00 10,00 5,00 0,00 Miano najwyższe Miano najniższe 0 10 20 30 40 50 60 Liczba cykli Rysunek 2 przedstawia krzywe wzrostu preparatu Quantitation Standard dla próbek z serią rozcieńczeń wirusa, obejmującą przedział 5-krotnej wartości log 10. Ilość dodanego do każdej próbki preparatu Quantitation Standard jest stała dla każdej reakcji. Wartość Ct dla preparatu Quantitation Standard jest podobna, niezależnie od miana wirusa. Rysunek 2 12,00 Normalizowana fluorescencja 10,00 8,00 6,00 4,00 2,00 0,00 Podobne wartości Ct dla preparatu HCV QS niezależnie od wartości miana HCV 0 10 20 30 40 50 60 Liczba cykli Miano najniższe Miano najwyższe Rysunek 3 przedstawia na przykładzie, w jaki sposób wartości fluorescencji w każdym cyklu są normalizowane dla każdej krzywej wzrostu. Liczbę cykli cząstkowych (Ct) oblicza się w chwili, gdy sygnał fluorescencyjny przekracza ustalony poziom fluorescencji. Rysunek 3 2,80 Normalizowana fluorescencja 2,60 2,40 2,20 2,00 1,80 1,60 1,40 1,20 1,00 0,80 Ustalony poziom fluorescencji Wartość Ct = 17,4 8 10 12 14 16 18 20 22 Liczba cykli 5

ILOŚCIOWE OZNACZENIE RNA HCV Test COBAS TaqMan HCV, v2.0, pozwala ilościowo oznaczyć RNA wirus HCV, wykorzystując drugą sekwencję docelową (HCV Quantitation Standard), którą w znanym stężeniu dodaje się do każdej próbki testowej. Preparat HCV Quantitation Standard jest niezakaźnym konstruktem Armored RNA, zawierającym fragmenty sekwencji HCV z obszarami wiązania primerów, które są identyczne z obszarami wiązania na docelowej sekwencji HCV. Preparat HCV Quantitation Standard wytwarza również produkt amplifikacji o tej samej długości łańcucha i składzie zasad co docelowy RNA wirusa HCV. Miejsce wiążące sondę detekcyjną amplikonu HCV Quantitation Standard zostało zmodyfikowane w celu różnicowania amplikonu HCV Quantitation Standard i amplikonu docelowego HCV. Podczas fazy hybrydyzacji reakcji PCR w analizatorze COBAS TaqMan 48, próbki zostają oświetlone i wzbudzone światłem przefiltrowanym, a następnie rejestruje się wyniki emisji przefiltrowanej fluorescencji każdej próbki. Odczyty dotyczące poszczególnych próbek poddaje się korekcji w celu wyeliminowania zmienności wywołanej działaniem instrumentów. Aparat wprowadza odczyty fluorescencji do programu AMPLILINK i zapisuje w bazie danych. Stosuje się metodę odczytów wstępnych w celu określenia, czy RNA HCV oraz RNA preparatu HCV Quantitation Standard reprezentują zestawy, które można uznać za ważne. W sytuacji gdy dane nie mieszczą się w ustalonych granicach, aparat opatruje je odpowiednimi oznaczeniami. Po ukończeniu i pomyślnej ocenie odczytów wstępnych odczyty fluorescencji są przetwarzane w celu obliczenia wartości Ct dla RNA HCV i dla RNA preparatu HCV Quantitation Standard. Tablica stałych, swoistych dla danej serii wartości kalibracji, dołączona do testu COBAS TaqMan HCV, v2.0, jest wykorzystywana do obliczania wartości miana próbek i kontroli na podstawie wartości Ct RNA HCV oraz RNA preparatu HCV Quantitation Standard. Test COBAS TaqMan HCV, v2.0, jest wystandaryzowany według drugiego międzynarodowego standardu WHO dla testów NAT wykrywających RNA HCV [Second WHO International Standard for HCV RNA NAT assays (NIBSC Code 96/798)] 19, a wartości miana są wyrażane w jednostkach międzynarodowych (IU/ml). ODCZYNNIKI High Pure System Viral Nucleic Acid Kit 48 testów Zestaw High Pure System Viral Nucleic Acid (P/N: 03502295 001) LYS 2 x 25 ml (Bufor do lizy/wiążący) Tris 52% chlorowodorek guanidyny < 1% mocznik 20% Triton X-100 Xn 52% (udział wagowy) chlorowodorek guanidyny + Produkt szkodliwy CAR (RNA, liofilizowany) PK (Proteinaza K, liofilizowana) 99% proteinaza K, liofilizowana Xn 99% proteinaza K, liofilizowana + Produkt szkodliwy IRB (Bufor usuwający inhibitor) Tris 65% chlorowodorek guanidyny Xn 65% (udział wagowy) chlorowodorek guanidyny + Produkt szkodliwy 6 2 x 2 mg 2 x 100 mg 1 x 33 ml

WASH (Bufor płuczący) Tris NaCl (dodać 50 ml etanolu i 30 ml wody dejonizowanej) ELB (Bufor do elucji) RS (Zestaw High Pure System Viral Nucleic Acid Rack) Statyw do przeprowadzania lizy Statyw z rurkami filtracyjnymi z mocowanym statywem na odpady Statyw do elucji Statyw z pokrywkami Chwytaki WR (Statyw na odpady High Pure System Viral Nucleic Acid) COBAS TaqMan HCV Test, v2.0 HCV HPS V2 (P/N: 04861817 190) Odczynniki do przygotowywania próbki i odczynniki kontrolne HCV QS (COBAS TaqMan HCV Quantitation Standard) Bufor fosforanu sodu EDTA < 0,005% Poly ra RNA (syntetyczny) < 0,001% konstrukt Armored RNA, zawierający wstawkę z sekwencją HCV wiążącą primer oraz niepowtarzalny region wiążący sondę (niezakaźny RNA obecny w bakteriofagu MS2) Barwnik amarantowy 0,1% Substancja konserwująca Proclin 300 Xi Proclin zawiera mieszaninę 5-chloro-2-metylo-2H-izotiazol- 3-onu i 2-metylo-2H-izotiazol-3-onu w stosunku (3:1) + Produkt drażniący R43: Może powodować uczulenie w kontakcie ze skórą. HCV H(+)C, v2.0 [Kontrola HCV silnie (+), v2.0] < 0,001% konstrukt Armored RNA zawierający sekwencje HCV (niezakaźny RNA obecny w bakteriofagu MS2) Ujemne osocze ludzkie niereaktywne w testach na obecność przeciwciał przeciwko HCV, przeciwciał przeciwko HIV-1/2, antygenu HIV p24 oraz antygenu HBsAg; RNA HIV-1, RNA HCV i DNA HBV niewykrywalne przy użyciu metod PCR 0,1% Substancja konserwująca Proclin 300 Xi Proclin zawiera mieszaninę 5-chloro-2-metylo-2H-izotiazol- 3-onu i 2-metylo-2H-izotiazol-3-onu w stosunku (3:1) + Produkt drażniący R43: Może powodować uczulenie w kontakcie ze skórą. 1 x 20 ml 1 x 30 ml 4 x każdy 8 x każdy 48 testów 2 x 1,0 ml 2 x 1,0 ml 7

HCV H(+)C, v2.0 [Kontrola HCV słabo (+), v2.0] < 0,001% konstrukt Armored RNA zawierający sekwencje HCV (niezakaźny RNA obecny w bakteriofagu MS2) Ujemne osocze ludzkie niereaktywne w testach na obecność przeciwciał przeciwko HCV, przeciwciał przeciwko HIV-1/2, antygenu HIV p24 oraz antygenu HBsAg; RNA HIV-1, RNA HCV i DNA HBV niewykrywalne przy użyciu metod PCR 0,1% Substancja konserwująca Proclin 300 Xi Proclin zawiera mieszaninę 5-chloro-2-metylo-2H-izotiazol- 3-onu i 2-metylo-2H-izotiazol-3-onu w stosunku (3:1) + Produkt drażniący R43: Może powodować uczulenie w kontakcie ze skórą. CTM ( ) C [COBAS TaqMan ujemna próba kontrolna (osocze ludzkie)] Ujemne osocze ludzkie niereaktywne w testach na obecność przeciwciał przeciwko HCV, przeciwciał przeciwko HIV-1/2, antygenu HIV p24 oraz antygenu HBsAg; RNA HIV-1, RNA HCV i DNA HBV niewykrywalne przy użyciu metod PCR 0,1% Substancja konserwująca Proclin 300 Xi Proclin zawiera mieszaninę 5-chloro-2-metylo-2H-izotiazol- 3-onu i 2-metylo-2H-izotiazol-3-onu w stosunku (3:1) + Produkt drażniący R43: Może powodować uczulenie w kontakcie ze skórą. Odczynniki do amplifikacji i detekcji HCV MMX (COBAS TaqMan HCV Master Mix) Bufor Tricine Wodorotlenek potasu Octan potasu < 20% dimetylosulfotlenek Glicerol < 0,001% datp, dctp, dgtp, dutp < 0,001% preparat primerów sensownych i antysensownych nieulegającego translacji regionu 5'-HCV < 0,001% preparat znakowanych barwnikami fluorescencyjnymi sond oligonukleotydowych, swoistych dla HCV oraz HCV Quantitation Standard < 0,05% polimeraza DNA Z05 (bakteryjna) < 0,1% enzym AmpErase (uracylo-n-glikozylaza) (bakteryjny) 0,09% azydek sodu CTM Mn 2+ (Roztwór manganu COBAS TaqMan ) < 1,2% octan manganu Lodowaty kwas octowy 0,09% azydek sodu 2 x 1,0 ml 4 x 1,0 ml 2 x 24 testy 2 x 1,4 ml 2 x 24 testy 2 x 1,0 ml 8

OSTRZEŻENIA I ŚRODKI OSTROŻNOŚCI A. DO STOSOWANIA W DIAGNOSTYCE IN VITRO. B. Test ten nie jest przeznaczony do przesiewowego badania na obecność wirusa HCV we krwi lub produktach krwiopochodnych ani do stosowania jako test diagnostyczny, potwierdzający zakażenie wirusem HCV. C. Wartości przypisane współczynnikom kalibracji są swoiste dla serii i swoiste dla testu COBAS TaqMan HCV, v2.0, przeznaczonego do stosowania z zestawem High Pure. Wartości te mogą być nieważne przy stosowaniu w połączeniu z innymi metodami przygotowania próbek. D. Test ten jest przeznaczony do stosowania z osoczem ludzkim pobranym na antykoagulant EDTA oraz z ludzką surowicą. E. Nie pipetować za pomocą ust. F. Nie jeść, nie pić ani nie palić w obszarach roboczych laboratorium. Posługując się próbkami i odczynnikami z zestawów, stosować jednorazowe rękawice, fartuchy laboratoryjne oraz odpowiednią ochronę oczu. Po zakończeniu pracy z próbkami i odczynnikami testowymi należy dokładnie umyć ręce. G. Przy pobieraniu poszczególnych dawek odczynników z butelek unikać skażenia bakteryjnego odczynników i ich zanieczyszczenia rybonukleazą. H. Zaleca się używanie jałowych jednorazowych pipet oraz końcówek pipet wolnych od RNazy. I. Nie łączyć odczynników z różnych serii ani z różnych butelek z tej samej serii. J. Nie mieszać odczynników pochodzących z różnych zestawów. K. Wyrzucić wszystkie niezużyte odczynniki, odpady i próbki, postępując zgodnie z przepisami krajowymi, federalnymi, stanowymi i lokalnymi. L. Nie używać zestawu po upływie daty ważności. M. Karty charakterystyki substancji niebezpiecznych (Material Safety Data Sheets MSDS) są dostępne na żądanie w miejscowym przedstawicielstwie firmy Roche. N. Z próbkami oraz kontrolami należy obchodzić się jak z materiałem zakaźnym, stosując bezpieczne procedury laboratoryjne, przedstawione w Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories 20 oraz w CLSI Document M29-A3 21. Dokładnie wyczyścić i zdezynfekować wszystkie powierzchnie robocze świeżo przygotowanym 0,5% roztworem podchlorynu sodowego w wodzie dejonizowanej lub destylowanej. Uwaga: Dostępny w handlu płynny domowy wybielacz zawiera zazwyczaj podchloryn sodu w stężeniu 5,25%. Rozcieńczenie domowego wybielacza w stosunku 1:10 daje 0,5% roztwór podchlorynu sodu. O. UWAGA: Odczynniki: CTM( ) C, HCV L(+)C, v2.0, oraz HCV H(+)C, v2.0, zawierają ludzkie osocze otrzymane z krwi ludzkiej. Materiał źródłowy został przebadany i uznany za niereaktywny pod względem obecności antygenu powierzchniowego wirusa zapalenia wątroby typu B (HBsAg), przeciwciał przeciwko HIV-1/2 oraz HCV, a także antygenu HIV p24. Badania ujemnego osocza ludzkiego przy użyciu metod PCR nie wykryły obecności HIV-1 RNA, HCV RNA ani HBV DNA. Nie ma znanych metod testowych mogących zapewnić całkowitą pewność, że produkty pochodzące z krwi ludzkiej nie przenoszą czynników zakaźnych. Dlatego też każdy materiał pochodzenia ludzkiego należy traktować jako potencjalnie zakaźny. Z odczynnikami CTM ( ) C, HCV L(+)C, v2.0 i HCV H(+)C, v2.0, należy obchodzić się jak z materiałem zakaźnym, stosując laboratoryjne procedury bezpieczeństwa, takie jak wymienione w wytycznych Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories 20 oraz w CLSI Document M29-A3 21. Dokładnie wyczyścić i zdezynfekować wszystkie powierzchnie robocze świeżo przygotowanym 0,5% roztworem podchlorynu sodowego w wodzie dejonizowanej lub destylowanej. P. Odczynniki: HCV MMXoraz CTM Mn 2+ zawierają azydek sodu. Azydek sodu może wchodzić w reakcje z instalacjami wodno-kanalizacyjnymi wykonanymi z ołowiu lub miedzi, tworząc silnie wybuchowe azydki metali. Usuwając roztwory zawierające azydek sodu do zlewów laboratoryjnych, należy spłukać je dużą ilością wody, aby zapobiec nagromadzeniu azydków. 9

Q. Podczas pracy z jakimkolwiek odczynnikiem używać osłon na oczy oraz fartuchów laboratoryjnych i rękawic jednorazowych. Unikać kontaktu wymienionych materiałów ze skórą, oczami i błonami śluzowymi. Jeżeli dojdzie do kontaktu, natychmiast spłukać dużą ilością wody. Jeżeli nie zostaną podjęte odpowiednie środki, może dojść do oparzeń. W razie rozlania wspomnianych odczynników należy przed wytarciem plam rozcieńczyć je wodą. WYMAGANIA DOTYCZĄCE PRZECHOWYWANIA I UŻYTKOWANIA Odczynniki do przygotowywania próbki A. Po dostarczeniu przechowywać odczynniki z zestawu High Pure System Viral Nucleic Acid Reagents w temperaturze 15 25 C. B. Przechowywać bufor do elucji (ELB) oraz bufor do lizy/wiążący (LYS) w temperaturze 15 25 C. Po otwarciu przechowywać ELB i LYS w temperatur ze 15 25 C. Po otwarciu należy zużyć ELB i LYS w ciągu 28 dni lub przed upływem daty ważności (zależnie od tego, który termin wypada wcześniej). C. Po dodaniu buforu do elucji (ELB) w celu rozpuszczenia nośnika RNA i proteinazy K przechowywać niezużyty nośnik RNA (CAR) oraz niezużytą proteinazę K (PK) w temperaturze od -15 do -25 C. Po rozpuszczeniu nośnik RNA oraz proteinazę K należy zużyć w ciągu 28 dni lub przed upływem daty ważności, zależnie od tego, która z dat wypada wcześniej. D. Po dodaniu etanolu do bufora usuwającego inhibitor oraz po dodaniu etanolu i wody do buforu do wymywania przechowywać bufor usuwający inhibitor (IRB) oraz bufor do wymywania (WASH) w temperaturze 15 25 C. Wymienione roztwory robocze zachowują stabilność przez 28 dni lub do daty ważności, w zależności od tego, który termin wypada wcześniej. E. Roboczy roztwór do lizy/wiążący [bufor do lizy/wiążący w połączeniu z nośnikiem RNA, proteinazą K oraz HCV QS] należy zużyć natychmiast po jego przygotowaniu. Wszelkie jego pozostałości należy wyrzucić. Odczynniki do amplifikacji i detekcji A. Nie zamrażać odczynników ani kontroli. B. Przechowywać HCV MMX; CTM ( ) C; HCV L(+)C, v2.0; HCV H(+)C, v2.0; HCV QS i CTM Mn 2+ w temperaturze 2 8 C. Jeżeli nie zostały otwarte, odczynniki te zachowują stabilność do daty ważności. Po otwarciu HCV MMX; HCV L(+)C, v2.0; HCV H(+)C, v2.0; HCV QS i CTM Mn 2+ w celu pobrania ilości wystarczających do serii 12 próbek przechowywać odczynniki w temperaturze 2 8 C. Po otwarciu odczynniki: HCV MMX; HCV L(+)C, v2.0; HCV H(+)C, v2.0; HCV QS i CTM Mn 2+ są stabilne w temperaturze 2 8 C przez 28 dni lub do daty ważności, zależnie od tego, który termin wypada wcześniej. Po otwarciu opakowania wszelkie niezużyte porcje odczynnika CTM ( ) Cnależy wyrzucić. C. Odczynnik roboczy Master Mix (przygotowany przez dodanie CTM Mn 2+ do HCV MMX) należy przechowywać w temperaturze 2 8 C w ciemnym miejscu. Przygotowane próbki i kontrole należy dodać w ciągu 1 godziny od przygotowania odczynnika roboczego Master Mix. D. Poddane obróbce próbki i kontrole zachowują stabilność do 3 godzin w temperaturze 20 30 C, do 24 godzin w temperaturze 2 8 C lub do 1 tygodnia w stanie zamrożenia do temperatury -20 C. E. Amplifikację należy rozpocząć w ciągu 2 godzin od chwili dodania przygotowanych próbek badanych i kontrolnych do głównej mieszaniny roboczej. DOSTARCZONE MATERIAŁY Odczynniki do przygotowywania próbki A. High Pure System Viral Nucleic Acid Kit Zestaw High Pure System Viral Nucleic Acid (P/N: 03502295 001) LYS (Bufor do lizy/wiążący) CAR (Nośnik RNA) 10

PK (Proteinaza K) IRB (Bufor usuwający inhibitor) WASH (Bufor płuczący) ELB (Bufor do elucji) RS (Zestaw High Pure System Viral Nucleic Acid Rack) WR (Statyw na odpady High Pure System Viral Nucleic Acid) Odczynniki do amplifikacji i detekcji B. COBAS TaqMan HCV Test, v2.0 HCV HPS V2 (P/N: 04861817 190) HCV QS (COBAS TaqMan HCV Quantitation Standard) HCV H(+)C, v2.0 [Kontrola HCV silnie (+), v 2.0] HCV L(+)C, v2.0 [Kontrola HCV słabo (+), v2.0] CTM ( ) C [COBAS TaqMan ujemna próba kontrolna (osocze ludzkie)] HCV MMX (COBAS TaqMan HCV Master Mix) CTM Mn 2+ (Roztwór manganu COBAS TaqMan ) MATERIAŁY WYMAGANE, LECZ NIEDOSTARCZANE Przyrządy i oprogramowanie Analizator COBAS TaqMan 48 Oprogramowanie AMPLILINK Stacja robocza dla programu AMPLILINK Instrukcja obsługi analizatora COBAS TaqMan 48 używana z oprogramowaniem AMPLILINK wersji 3.1.0 lub Instrukcja obsługi analizatora COBAS TaqMan 48 zgodna z Podręcznikiem oprogramowania AMPLILINK serii 3.2. Podręcznik oprogramowania AMPLILINK serii 3.1 używany z urządzeniem COBAS AmpliPrep, analizatorem COBAS TaqMan i analizatorem COBAS TaqMan 48 lub Podręcznik oprogramowania AMPLILINK serii 3.2 stosowany z urządzeniem COBAS AmpliPrep, analizatorem COBAS TaqMan, analizatorem COBAS TaqMan 48 i analizatorem COBAS AMPLICOR. Urządzenie do mocowania korka w probówkach K-tube Materiały jednorazowe Opakowanie zawierające probówki K-tube 12 x 96 Wymagania dotyczące wirówki Wirówka Sigma 4 15 C Benchtop lub odpowiadający jej typ wirówki z płytką mikrotitracyjną, umożliwiający wirowanie z przyspieszeniem 4600 x g Wirnik horyzontalny do wirówki Sigma P/N: 11118 (zawiera 2 koszyki P/N: 13218 oraz 2 uchwyty do płytek P/N: 17978) bądź ich odpowiedniki. 11

INNE MATERIAŁY WYMAGANE, LECZ NIEDOSTARCZANE Izopropanol (> 99%) odpowiadający specyfikacjom ACS lub lepszy Etanol (96 100%) odpowiadający specyfikacjom ACS lub lepszy Woda dejonizowana Regulowane pipetory*: (pojemność 250 µl i 1000 µl) z barierą aerozolową lub końcówkami dodatniego wypierania wolnymi od RNazy Rękojeść pomocnicza do pipety: Drummond (P/N: 4-000-100) bądź ich odpowiedniki Łaźnia wodna o temperaturze 50 C (± 2 C) Suchy blok grzejny o temperaturze 70 C (± 2 C) Jałowe, jednorazowe pipety serologiczne: 5, 10 i 25 ml Jałowe probówki stożkowe z polipropylenu; 15 ml i 50 ml: Corning (P/N: 430052 i P/N: 430290) bądź ich odpowiedniki Jałowe probówki o pojemności 2,0 ml do mikrowirówki: Sarstedt (P/N: 72.693.005) bądź ich odpowiedniki Mieszadło wibracyjne Statywy do probówek Rękawice jednorazowe bezpudrowe Kalibrowane termometry do łaźni wodnej i suchego bloku grzejnego * Pipetory powinny być dokładne w zakresie 3% objętości znamionowej. We wskazanych przypadkach należy używać pozbawionych RNazy końcówek do pipet z barierą dla aerozoli lub dodatnim wypieraniem w celu zapobieżenia skażeniu krzyżowemu między próbką i amplikonem. POBIERANIE, TRANSPORT I PRZECHOWYWANIE PRÓBEK Uwaga: Ze wszystkimi próbkami należy obchodzić się jak z materiałem potencjalnie zakaźnym. A. Pobieranie próbek Za pomocą testu COBAS TaqMan HCV, v2.0, można badać jedynie próbki osocza lub surowicy. Krew powinno się pobierać do probówek BD SST Serum Separator lub do jałowych probówek zawierających EDTA (korek lawendowy) jako antykoagulant. Krew pełną należy przechowywać w temperaturze 2 25 C nie dłużej niż 6 godzin. W celu oddzielenia surowicy lub osocza od krwi pełnej w ciągu 6 godzin od jej pobrania należy stosować się do instrukcji producenta probówek. Przenieść surowicę lub osocze do jałowej probówki polipropylenowej. Rysunki 4 i 5 przedstawiają dane z badań dotyczących pobierania próbek. Badania przeprowadzono przy użyciu testu COBAS AMPLICOR HCV MONITOR, wersja 2.0 (v2.0). Rysunek 4 Stabilność HCV we krwi pełnej; probówki SST (surowica) Średni wynik miana RNA HCV Log 10 HCV RNA (IU/ml) < 1 godzina 2 8C 6 godzin 2 8C 24 godziny 2 8C 48 godzin 2 8C 72 godziny 2 8C < 1 godzina 20 25C 6 godzin 20 25C 24 godziny 20 25C 48 godzin 20 25C 72 godziny 20-25C Numer próbki 12

Rysunek 5 Stabilność HCV we krwi pełnej; probówki EDTA (osocze z dodatkiem EDTA) Średni wynik miana RNA HCV Log 10 HCV RNA (IU/ml) < 1 godzina 2 8C 6 godzin 2 8C 24 godziny 2 8C 48 godzin 2 8C 72 godziny 2 8C < 1 godzina 20 25C 6 godzin 20 25C 24 godziny 20 25C 48 godzin 20 25C 72 godziny 20 25C Numer próbki B. Transport próbek Transport krwi pełnej, surowicy lub osocza musi przebiegać zgodnie z przepisami krajowymi, federalnymi i lokalnymi dla transportu czynników zakaźnych 22. Krew pełną należy transportować w temperaturze 2 25 C i poddać obróbce w ciągu 6 godzin od pobrania. Osocze lub surowica mogą być transportowane w temp. 2 8 C lub zamrożone do temperatury od -20 C do -80 C. C. Przechowywanie próbek Surowica i osocze mogą być przechowywane w temperaturze 2 8 C do 3 dni lub zamrożone do temperatury -70 C albo niższej. Zaleca się przechowywanie próbek w objętościach 800 900 µl wjałowych polipropylenowych probówkach zakręcanych o pojemności 2,0 ml (takich jak Sarstedt P/N: 72.694.006). Rysunki 6 i 7 przedstawiają dane z badań dotyczących przechowywania próbek. Badania przeprowadzono przy użyciu testu COBAS AMPLICOR HCV MONITOR, v2.0. Rysunek 6 Stabilność HCV w surowicy Średni wynik miana RNA HCV Log 10 HCV RNA (IU/ml) < 1 godzina 2 8C 72 godziny 2 8C 120 godzin 2 8C 168 godzin 2 8C 240 godzin 2 8C < 1 godzina 20 25C 72 godziny 20 25C 120 godzin 20 25C 168 godzin 20 25C 240 godzin 20 25C Numer próbki 13

Rysunek 7 Stabilność HCV w osoczu z dodatkiem EDTA Średni wynik miana RNA HCV Log 10 HCV RNA (IU/ml) < 1 godzina 2 8C 72 godziny 2 8C 120 godzin 2 8C 168 godzin 2 8C 240 godzin 2 8C < 1 godzina 20 25C 72 godziny 20 25C 120 godzin 20 25C 168 godzin 20 25C 240 godzin 20 25C Próbki surowicy i osocza można zamrażać i rozmrażać do 3 razy bez utraty RNA HCV. W tabeli 1 przedstawiono dane pochodzące z badań dotyczących zamrażania i rozmrażania, przeprowadzonych z użyciem testu COBAS AMPLICOR HCV MONITOR, v2.0. Tabela 1 Log 10 różnic w stężeniu HCV w surowicy i osoczu z dodatkiem EDTA pomiędzy stężeniem w cyklu 0 a stężeniami po 5 cyklach zamrażania i rozmrażania Macierz Stabilność Próbka nr Cykl zamrażania/rozmrażania Cykl 0 Cykl 1 Cykl 2 Cykl 3 Cykl 4 Cykl 5 1 0,00-0,052 0,238 0,179-0,670-0,277 2 0,00 0,293 0,228-0,206-0,338 0,175 Surowica 3 0,00-0,270-0,023-0,430 0,008-0,229 4 0,00 0,071-0,516-0,295-0,564-0,670 5 0,00 0,342-0,031-0,344-0,436-0,277 Średnia dla surowicy 0,00 0,077-0,021-0,239-0,400-0,246 Osocze z dodatkiem EDTA Średnia dla osocza z dodatkiem EDTA Numer próbki 11 0,00-0,006 0,043-0,143-0,159-0,140 12 0,00-0,329-0,375-0,234-0,642-0,265 13 0,00-0,056-0,248-0,371-0,395-0,142 14 0,00 0,186-0,066-0,034-0,241-0,084 15 0,00-0,120-0,111-0,055 0,250-0,217 0,00-0,065-0,151-0,167-0,237-0,170 INSTRUKCJA UŻYTKOWANIA Uwaga: Szczegółowe instrukcje obsługi, drukowania wyników oraz interpretacje znaczników, komentarze i komunikaty o błędach można znaleźć w (1) Instrukcji obsługi analizatora COBAS TaqMan 48 używanej z oprogramowaniem AMPLILINK wersji 3.1.0 i w Podręczniku oprogramowania AMPLILINK serii 3.1 stosowanym z urządzeniem COBAS AmpliPrep, analizatorem COBAS TaqMan i analizatorem COBAS TaqMan 48 lub w (2) Instrukcji obsługi analizatora COBAS TaqMan 48 używanej z Podręcznikiem oprogramowania AMPLILINK serii 3.2 i w Podręczniku oprogramowania AMPLILINK serii 3.2 stosowanym zurządzeniem COBAS AmpliPrep, analizatorem COBAS TaqMan, analizatorem COBAS TaqMan 48 i analizatorem COBAS AMPLICOR. 14

Uwaga: Przed użyciem wszystkie odczynniki do amplifikacji i detekcji należy ogrzać do temperatury otoczenia. Należy wyjąć je z miejsca przechowywania o temperaturze 2 8 C co najmniej na 30 minut przed użyciem. Uwaga: Próbki surowicy i osocza należy przed użyciem ogrzewać do temperatury otoczenia przez 15 30 minut. Uwaga: Tam gdzie jest to wskazane, należy używać pipetorów z końcówkami z barierą aerozolową lub dodatnim wypieraniem. Zachować najdalej posuniętą ostrożność, aby uniknąć zanieczyszczenia. Liczba testów w serii: Każdy zestaw zawiera odczynniki wystarczające do czterech przebiegów po 12 oznaczeń, które można wykonywać oddzielnie lub równocześnie. W każdym z przebiegów testowych, liczących do 24 próbek i kontroli, należy włączyć 1 powtórzenie kontroli: CTM ( ) C, HCV L(+)C, v2.0, i HCV H(+)C, v2.0 (patrz rozdział Kontrola jakości ). Odczynniki do amplifikacji i detekcji są pakowane do butelek dwukrotnego użytku, wystarczających do wykonania 24 testów. Aby jak najwydajniej wykorzystać odczynniki, próbki badane i kontrolne należy poddawać obróbce w seriach będących wielokrotnością 12. Przygotowanie próbki i kontroli Uwaga: Jeśli używa się zamrożonych próbek surowicy lub osocza, należy umieścić próbki w temperaturze pokojowej do ich całkowitego rozmrożenia, a następnie przed użyciem mieszać na mieszadle wibracyjnym przez 5 10 sekund. Uwaga: Przed przystąpieniem do wykonywania testu pozwolić odczynnikom na ogrzanie się do temperatury otoczenia. Przed rozpoczęciem reakcji oczyszczania materiału ogrzać blok grzewczy do temperatury 70 C (± 2 C) oraz łaźnię wodną do temperatury 50 C (± 2 C). A. Przygotowanie odczynników Uwaga: Przygotować roboczy roztwór do lizy/wiążący dopiero wtedy, gdy w ciągu 15 30 minut wszystkie próbki i kontrole ogrzeją się do temperatury otoczenia. 1. Przygotować bufor usuwający inhibitor, przenosząc pipetą 20 ml 96 100% etanolu do odczynnika Inhibitor Removal Buffer (bufor usuwający inhibitor) (IRB). Dokładnie wymieszać zawartość, odwracając 5 10 razy. Przygotowany w ten sposób bufor usuwający inhibitor stanowi zapas wystarczający na 48 testów. 2. Przygotować bufor do wymywania, przenosząc pipetą 50 ml 96 100% etanolu i 30 ml wody dejonizowanej do buforu do wymywania (WASH). Dokładnie wymieszać zawartość, odwracając 5 10 razy. Przygotowany w ten sposób bufor do wymywania stanowi zapas wystarczający na 48 testów. 3. Ogrzać bufor do elucji (ELB) do temperatury 70 C (± 2 C) w zakręcanej probówce do mikrowirówki o pojemności 2,0 ml. Można w tym celu używać wielu probówek. Objętość elucji na jedną próbkę wynosi 75 µl. Należy ogrzać objętość odczynnika podaną wponiższej tabeli, zgodnie z liczbą testów. Liczba powtórzeń testu Odczynnik 12 24 Bufor do elucji (ml) 2,0 4,0 4. Przenieść za pomocą pipety do czystej, jałowej probówki objętość izopropanolu określoną w poniższej tabeli w zależności od ilości testów. Liczba powtórzeń testu Odczynnik 12 24 Izopropanol (ml) 5,0 10,0 5. Przenieść za pomocą pipety 0,5 ml buforu do elucji (ELB) do nośnika RNA (CAR). Zatkać korkiem, odwrócić fiolkę i wytrząsać ją do chwili pełnego rozpuszczenia się nośnika RNA. Rozpuszczony nośnik RNA wystarczy do wykonania 24 testów. Niezużyty rozpuszczony 15

nośnik RNA można przechowywać w temperaturze od -15 do -25 C do 28 dni lub do upływu daty ważności, zależnie od tego, która z dat wypada wcześniej. 6. Przenieść za pomocą pipety 5,0 ml buforu do elucji (ELB) do proteinazy K (PK). Zatkać korkiem, odwrócić fiolkę i wytrząsać ją do chwili pełnego rozpuszczenia się proteinazy K. Rozpuszczona proteinaza K wystarczy do wykonania 24 testów. Niezużytą rozpuszczoną proteinazę K można przechowywać w temperaturze od -15 do -25 C do 28 dni lub do upływu daty ważności, zależnie od tego, która z dat wypada wcześniej. 7. Przygotować roboczy roztwór do lizy/wiążący w następujący sposób: przenieść za pomocą pipety objętości odczynników przedstawionych w poniższej tabeli, zgodne z liczbą próbek i kontroli przeznaczonych do obróbki: Liczba powtórzeń testu Odczynniki 12 24 Bufor do lizy/wiążący (ml) 7,0 14,0 Nośnik RNA (µl) 140 280 HCV QS (µl) 56 112 Proteinaza K (ml) 1,4 2,8 Uwaga: Objętość odczynnika HCV QS jest swoista dla testu COBAS TaqMan HCV, v2.0. Uwaga: Jeśli zamierza się użyć uprzednio zamrożonego, rozpuszczonego nośnika RNA lub proteinazy K, należy je rozmrażać w temperaturze pokojowej, a przed użyciem kilkakrotnie wymieszać, odwracając fiolkę. Dodać wskazaną objętość buforu do lizy/wiążącego do czystej, jałowej probówki o pojemności 50 ml. Do probówki zawierającej bufor do lizy/wiążący dodać wskazaną objętość rozpuszczonego nośnika RNA. Wytrząsać naczynie z preparatem HCV QS przez 3 5 sekund, po czym dodać wskazaną objętość HCV QS do probówki zawierającej bufor do lizy/wiążący oraz rozpuszczony nośnik RNA. Zamknąć probówkę i wymieszać zawartość, odwracając 10 15 razy. NIE wytrząsać na mieszadle wytrząsanie spowoduje tworzenie się pęcherzyków w roztworze. Dodać wskazaną objętość rozpuszczonej proteinazy K do probówki zawierającej bufor do lizy/wiążący. Zamknąć probówkę i wymieszać zawartość, odwracając 10 15 razy. NIE wytrząsać na mieszadle wytrząsanie spowoduje tworzenie się pęcherzyków w roztworze. Rozpocząć rozdzielanie roboczego roztworu do lizy/wiążącego natychmiast po dodaniu proteinazy K do buforu do lizy/wiążącego i wymieszaniu zawartości. Niezużyte partie buforu do lizy/wiążącego (LYS) można przechowywać w temperaturze 15 25 C do 28 dni lub do upływu daty ważności, zależnie od tego, która z dat wypada wcześniej. Niezużyte partie roboczego roztworu do lizy/wiążącego należy wyrzucić. B. Przygotowanie próbki i kontroli Uwaga: Do wykonania tej procedury zaleca się stosowanie regulowanych pipetorów zkońcówkami z barierą aerozolową. Uwaga: A Do wykonania czynności z etapów 19 i 22 można używać pipety repetycyjnej zjałowymi końcówkami typu combi-tip odpowiedniego rozmiaru. Należy jednak zachowywać dodatkową ostrożność, aby uniknąć rozpryskiwania się odczynników i zanieczyszczenia krzyżowego próbek. 1. Dodać pipetą 625 µl roboczego roztworu do lizy/wiążącego do każdego z dołków statywu do przeprowadzania lizy (I, przezroczysty). Zepchnąć pokrywki w dół, nadając im taką pozycję, by osłaniały dołki. 2. Otwierając pojedynczo każdy dołek, dodawać pipetą do odpowiednich dołków po 500 µl próbki bądź kontroli. Po dodaniu każdej próbki bądź kontroli zepchnąć pokrywkę w dół aż do zamknięcia się zatrzasku szczelnie zamykającego dołek. 16

3. Po dodaniu wszystkich próbek i kontroli wymieszać zawartość napełnionego statywu do przeprowadzania lizy, wytrząsając go przez około 10 sekund. Potwierdzić wzrokowo, że wszystkie dołki ulegają wytrząsaniu i ich zawartość jest dokładnie wymieszana. 4. Inkubować statyw do przeprowadzania lizy w łaźni wodnej ogrzanej do temperatury 50 C (± 2 C) przez 10 minut. Zanurzyć statyw do wykonywania lizy w łaźni wodnej napełnionej wodą na głębokość około 5 7 cm. Po wyjęciu z łaźni wodnej osuszyć statyw do wykonywania lizy. 5. Odwirować statyw do wykonywania lizy przez 10 20 sekund z przyspieszeniem 4600 x g w wirówce z płytką mikrotitracyjną. Wirówka może nie osiągnąć w tym czasie nastawionej prędkości obrotów. 6. Otwierając dołki pojedynczo, za pomocą pipety dodawać do każdego dołka po 250 µl izopropanolu. Po każdym dodaniu odczynnika zepchnąć pokrywkę w dół aż do zamknięcia się zatrzasku szczelnie zamykającego dołek. Uwaga: Objętość izopropanolu jest swoista dla testu COBAS TaqMan HCV, v2.0. 7. Wymieszać próbki, trzykrotnie odwracając statyw, a następnie wytrząsać go przez około 10 sekund. Potwierdzić wzrokowo, że wszystkie dołki ulegają wytrząsaniu i ich zawartość jest dokładnie wymieszana. 8. Odwirować statyw do wykonywania lizy przez 10 20 sekund z przyspieszeniem 4600 x g w wirówce z płytką mikrotitracyjną. Wirówka może nie osiągnąć w tym czasie nastawionej prędkości obrotów. 9. Otwierając dołki pojedynczo, przenieść 750 µl próbki lub mieszaniny kontrolnej do odpowiednich dołków statywu z rurkami filtracyjnymi (II, żółty) z przymocowanym statywem na odpady (biały). Po dodaniu każdej próbki bądź mieszaniny kontrolnej zepchnąć pokrywkę w dół aż do zamknięcia się zatrzasku szczelnie zamykającego dołek. 10. Po dodaniu wszystkich próbek lub kontroli wirować zestaw zawierający statyw z rurkami filtracyjnymi przez 2 minuty z przyspieszeniem 4600 x g w wirówce z płytką mikrotitracyjną. 11. Otwierając dołki pojedynczo, przenieść pozostałe partie próbek i mieszanin kontrolnych do odpowiednich dołków statywu z rurkami filtracyjnymi. Po dodaniu każdej próbki lub mieszaniny kontrolnej mocno zamknąć pokrywkę dołka. We właściwy sposób wyrzucić statyw do wykonywania lizy. 12. Wirować zestaw zawierający statyw z rurkami filtracyjnymi przez 2 minuty z przyspieszeniem 4600 x g w wirówce z płytką mikrotitracyjną. 13. Wyjąć statyw z rurkami filtracyjnymi ze statywu na odpady, przyciskając obie spinki na górnej części statywu z rurkami filtracyjnymi. Wyrzucić statyw na odpady. Zastąpić zużyty statyw na odpady nowym i przypiąć statyw z rurkami filtracyjnymi do statywu na odpady. 14. Otworzyć wszystkie pokrywki statywu z rurkami filtracyjnymi za pomocą chwytaków i dodać pipetą 400 µl buforu usuwającego inhibitor (IRB), wlewając płyn po ściance każdego dołka. Nie dotykać ścianek dołka. Po dodaniu buforu usuwającego inhibitor do wszystkich dołków szczelnie zamknąć pokrywki. 15. Wirować zestaw zawierający statyw z rurkami filtracyjnymi przez 2 minuty z przyspieszeniem 4600 x g w wirówce z płytką mikrotitracyjną. 16. Otworzyć wszystkie pokrywki za pomocą chwytaków i dodać pipetą 700 µl buforu wymywającego (WASH), wlewając płyn po ściance każdego dołka. Nie dotykać ścianek dołka. Po dodaniu buforu wymywającego do wszystkich dołków szczelnie zamknąć pokrywki. 17. Wirować zestaw zawierający statyw z rurkami filtracyjnymi przez 2 minuty z przyspieszeniem 4600 x g w wirówce z płytką mikrotitracyjną. 18. Wyjąć statyw z rurkami filtracyjnymi ze statywu na odpady, przyciskając obie spinki na górnej części statywu z rurkami filtracyjnymi. Wyrzucić statyw na odpady. Zastąpić zużyty statyw na odpady nowym i przypiąć statyw z rurkami filtracyjnymi do statywu na odpady. 19. Otworzyć wszystkie pokrywki za pomocą chwytaków i dodać pipetą 700 µl buforu wymywającego, wlewając płyn po ściance każdego dołka. Nie dotykać ścianek dołka. Po dodaniu buforu wymywającego do wszystkich dołków szczelnie zamknąć pokrywki. 17

20. Wirować zestaw zawierający statyw z rurkami filtracyjnymi przez 3 minuty z przyspieszeniem 4600 x g w wirówce z płytką mikrotitracyjną. 21. Wyjąć statyw z rurkami filtracyjnymi ze statywu na odpady, przyciskając obie spinki na górnej części statywu z rurkami filtracyjnymi. Nałożyć statyw z rurkami filtracyjnymi na statyw do elucji (IIIA, niebieski) i przypiąć statyw z rurkami filtracyjnymi do statywu do elucji. W odpowiedni sposób wyrzucić statyw na odpady. 22. Otworzyć wszystkie pokrywki za pomocą chwytaków i dodać pipetą 75 µl ogrzanego buforu do elucji (ELB) na środek każdego filtra, nie dotykając samego filtra. Uwaga: Nie dodawać buforu do elucji przez wlewanie go po ściance dołka. Po dodaniu buforu do elucji do wszystkich dołków szczelnie zamknąć pokrywki. Inkubować statyw do elucji w temperaturze pokojowej co najmniej przez 3 minuty od dodania buforu do elucji do ostatniego dołka. 23. Wirować zestaw zawierający statyw z rurkami filtracyjnymi przez 3 minuty z przyspieszeniem 4600 x g w wirówce z płytką mikrotitracyjną. 24. Wyjąć statyw z rurkami filtracyjnymi ze statywu do elucji, przyciskając obie spinki na górnej powierzchni statywu z rurkami filtracyjnymi. We właściwy sposób wyrzucić statyw z rurkami filtracyjnymi. 25. Nałożyć statyw z pokrywkami (IIIB, niebieski) na statyw do elucji (IIIA, niebieski). Docisnąć mocno i zapiąć spinki na statywie do elucji. Zamknąć wszystkie pokrywki. 26. Poddawane obróbce próbki i kontrole są stosowane bezpośrednio w reakcji PCR. Do amplifikacji należy użyć po 50 µl poddawanych obróbce próbek i kontroli. Dodać obrabiane próbki i kontrole do roboczego odczynnika Master Mix w ciągu 3 godzin od ukończenia przygotowania próbek i kontroli. Jeśli obrabianych próbek i kontroli nie można wykorzystać w ciągu 3 godzin od ich przygotowania, można przechowywać obrabiane próbki i kontrole w temperaturze 2 8 C do 24 godzin w zamkniętym statywie do elucji bądź zamrożone do temperatury -20 C do 1 tygodnia w jałowych, polipropylenowych, zakręcanych probówkach o pojemności 2,0 ml (takich jak Sarstedt P/N: 72.694.006). Poddać obrabiane próbki i kontrole amplifikacji w ciągu 2 godzin od dodania tych próbek i kontroli do roboczego odczynnika Master Mix. Odwrotna transkrypcja, amplifikacja i detekcja Uwaga: Zasobniki na probówki K-tube oraz uchwyt zasobnika należy przetrzeć tkaniną nieuwalniającą włókien, zwilżoną 70% roztworem izopropanolu. C. Przygotowanie odczynników Uwaga: Odczynniki COBAS TaqMan HCV Master Mix (HCV MMX), roboczy Master Mix (Working MMX) oraz roboczy Master Mix z dodanymi próbkami lub kontrolami są wrażliwe na światło. Chronić wymienione odczynniki przed światłem. Uwaga: Odczynniki COBAS TaqMan HCV Master Mix (HCV MMX) oraz roztwór manganu COBAS TaqMan (CTM Mn 2+ ) należy ogrzać do temperatury otoczenia co najmniej na 30 minut przed przygotowaniem roboczego odczynnika Master Mix. Uwaga: Przygotować roboczy odczynnik MMX po zakończeniu przygotowywania próbek i kontroli. Uwaga: Roboczy odczynnik MMX należy zużyć w ciągu 1 godziny od jego przygotowania. Uwaga: Amplifikacja powinna się rozpocząć w ciągu 2 godzin po dodaniu obrabianych próbek i kontroli do roboczego odczynnika MMX. 1. Ogrzewać jedną fiolkę odczynnika HCV MMX oraz jedną fiolkę odczynnika CTM Mn 2+ do temperatury otoczenia przez co najmniej 30 minut. 2. Umieścić zasobnik na probówki K-tube w uchwycie zasobnika. 3. Włożyć nowe probówki K-tube do zasobnika na probówki K-tube, nie dotykając bocznych ścianek probówek. Uwaga: Jeśli do przebiegu testowego mają być włączone mniej niż 24 probówki, należy wypełnić probówkami następujące pozycje zasobnika: 1, 2, 5, 20, 23 i 24, tak aby obciążenie zasobnika na probówki K-tube po umieszczeniu w termocyklerze było równomierne. 18

4. Zdjąć korki z probówek K-tube za pomocą urządzenia do mocowania korków. Umieścić korki w podręcznym uchwycie na probówki K-tube. 5. Przygotować roboczy odczynnik MMX w następujący sposób: W celu wykonania 24 testów dodać 170 µl odczynnika CTM Mn 2+ do fiolki zawierającej HCV MMX. Zamknąć butelkę korkiem i dokładnie wymieszać zawartość, odwracając 10 razy. Nie wytrząsać roboczego odczynnika MMX na mieszadle wibracyjnym. Chronić roboczy odczynnik MMX przed światłem i zużyć w ciągu 1 godziny. W celu wykonania 12 testów pobrać 669 µl odczynnika HCV MMX i wlać do probówki o pojemności 2 ml. Dodać 81 µl odczynnika CTM Mn 2+ do probówki o pojemności 2 ml, zawierającej HCV MMX, zamknąć probówkę korkiem i dokładnie wymieszać zawartość, odwracając probówkę 10 razy. Chronić roboczy odczynnik MMX przed światłem i zużyć w ciągu 1 godziny. Pozostałość niezużytych odczynników HCV MMX i CTM Mn 2+ przechowywać w oryginalnych fiolkach w temperaturze 2 8 C. Po otwarciu odczynniki HCV MMX i CTM Mn 2+ zachowują stabilność w temperaturze 2 8 C przez 28 dni lub do upływu daty ważności, zależnie od tego, która z dat wypada wcześniej. Uwaga: Objętość odczynnika CTM Mn 2+ jest swoista dla testu COBAS TaqMan HCV, v2.0. 6. Przenieść pipetą 50 µl roboczego odczynnika MMX do każdej probówki K-tube. Uwaga: Jeśli obrabiane próbki i kontrole były przed amplifikacją przechowywane w stanie zamrożonym, rozmrozić je w temperaturze pokojowej i dokładnie wymieszać przed przystąpieniem do etapu 7. 7. Dodać 50 µl każdej poddanej obróbce próbki i kontroli do odpowiednich probówek K-tube zawierających roboczy odczynnik MMX, wykorzystując do tego celu mikropipetor zkońcówką z barierą aerozolową lub dodatnim wypieraniem. Ostrożnie wymieszać każdą próbkę i próbę kontrolną, trzy razy nabierając do mikropipetora i wypuszczając ponownie, nie doprowadzając przy tym do tworzenia się pęcherzyków. 8. Powtórzyć czynności z etapu 7 w odniesieniu do każdej próbki i poddawanej obróbce kontroli aż do przeniesienia każdej z nich do probówki K-tube. Do każdej próbki badanej i kontrolnej użyć nowej końcówki. Sprawdzić wzrokowo probówki w poszukiwaniu pęcherzyków i usunąć je w razie konieczności. Za pomocą urządzenia do mocowania korków nałożyć korki na probówki K-tube. Sprawdzić wzrokowo, czy dodano odpowiednie objętości próbek. 9. Amplifikację należy rozpocząć w ciągu 2 godzin od czasu dodania przygotowanych próbek badanych i kontrolnych do probówek K-tube zawierających roboczy odczynnik MMX. D. Ładowanie i obsługa analizatora COBAS TaqMan 48 1. Włączyć komputer na stanowisku roboczym i zalogować się do systemu Windows XP, używając odpowiedniej nazwy użytkownika i hasła. 2. Włącz analizator COBAS TaqMan 48. Upewnij się, że urządzenie uruchamia się i jest gotowe do użytku. Jeśli nośniki K z poprzednich przebiegów testowych znajdują się nadal w którymkolwiek z termocyklerów, wyjmij je za pomocą przenośnika. 3. Uruchomić na komputerze program AMPLILINK. Zalogować się, używając odpowiedniej nazwy użytkownika i hasła. 4. Aby wprowadzić numerację próbek przeznaczonych do analizy w zasobniku na probówki K-tube, kliknąć ikonę z napisem Orders. Wybrać zakładkę z napisem Sample, następnie kliknąć przycisk z napisem New i za pomocą klawiatury lub czytnika kodów kreskowych wprowadzić numer porządkowy każdej próbki. Wybierz opcję Definicja testu, aby wykonać test COBAS TaqMan HCV wer. 2.0. Powtórzyć opisaną procedurę w odniesieniu do każdej próbki. Kliknąć przycisk Save. Uwaga: Jeśli do przebiegu testowego mają być włączone mniej niż 24 probówki, należy wypełnić probówkami następujące pozycje zasobnika: 1, 2, 5, 20, 23 i 24, tak aby obciążenie zasobnika na probówki K-tube po umieszczeniu w termocyklerze było równomierne. 5. Wprowadzić dane dotyczące kontroli jakości, wybierając zakładkę Quality Control w oknie Orders. Kliknąć przycisk New i za pomocą klawiatury lub czytnika kodów kreskowych wprowadzić dane zamieszczone na dostarczonej wraz z zestawem karcie COBAS TaqMan HCV Test, v2.0 Controls Value Card. Wprowadzić w odpowiednich oknach: 19

numer serii testu COBAS TaqMan HCV, v2.0, datę przydatności do użycia, zakresy wartości kontroli Low (+) i High (+) oraz swoiste dla każdej serii współczynniki kalibracji. Kliknąć przycisk OK. 6. Przypisać numer zasobnika na probówki K-tube przebiegowi testowemu, klikając zakładkę K-Carrier w oknie Orders. W okienku znajdującym się na prawo od napisu K-Carrier ID wprowadzić numer zasobnika probówek K-tube zamieszczony na jego kodzie kreskowym, używając klawiatury lub czytnika kodów kreskowych. Wymagane jest zaakceptowanie wyników poprzedniego przebiegu testowego, dokonanego przy wprowadzonym tym samym numerze identyfikacyjnym (ID) zasobnika na probówki K-tube. Z panelu testowego w dolnej części okna wybierz opcję Definicja testu, aby wykonać test COBAS TaqMan HCV wer. 2.0. 7. W oknie Worklist wybrać pierwszy wiersz w kolumnie Type (T). Podświetlić to pole w celu uzyskania dostępu do menu rozwijanego i wybrać wymagany typ kontroli. Następnie kliknąć dwukrotnie pole z numerem identyfikacyjnym próbki w tym samym wierszu. Wyświetli się okno LookUp Control ze wszystkimi dostępnymi próbami kontrolnymi. Po wybraniu kontroli w dolnej części po prawej stronie panelu Information wyświetlą się odpowiednie wartości kalibracji i kontrolne. Powtórzyć opisaną procedurę w odniesieniu do wszystkich wymaganych kontroli. 8. W celu wprowadzenia próbek na listę Worklist kliknąć dwukrotnie pierwszą pozycję (wiersz) okna informacyjnego danej próbki. Spowoduje to wyświetlenie okna Lookup Sample, zawierającego numerację przypisaną danej próbce. W celu podświetlenia więcej niż jednego numeru porządkowego użyć klawiszy Shift + strzałek. Upewnij się, że opcji Definicja testu zostały przypisane wszystkie polecenia, aby móc wykonać test COBAS TaqMan HCV wer. 2.0. 9. Kliknąć przycisk Save, aby zapisać przypisany numer zasobnika probówek K-tube. E. Odwrotna transkrypcja, amplifikacja i detekcja 1. Wybrać ikonę Systems w zakładce System ; kliknąć przycisk Open, aby otworzyć termocykler. Gdy w oknie Systems pokrywa termocyklera jest całkowicie uchylona i widoczny jest napis Ready to Load, przyciągnąć i przytrzymać pokrywę termocyklera w celu otwarcia urządzenia. Za pomocą przenośnika zasobników na probówki K-tube wprowadzić załadowany zasobnik na probówki K-tube, zawierający zamknięte probówki K-tube z roboczym odczynnikiem Master Mix, próbkami i kontrolami do termocyklera. Zamknij pokrywę termocyklera. 2. Upewnić się, że do bieżącego przebiegu testowego został załadowany plik Test Definition HCVHP2. Kliknąć przycisk Start w oknie Systems poniżej ikony TC w celu zamknięcia pokrywy termocyklera i uruchomienia aparatu. 3. Analizator COBAS TaqMan 48 automatycznie wykonuje odwrotną transkrypcję, amplifikację i detekcję. 20