Transplantacje komórek i tkanek rola układu odpornościowego
Rozwój strategii wytwarzania substytutów tkanek in vitro typ tkanki rola substytutu przykład fizyczny biomechaniczna kość naczynia krwionośne fizjologiczny fizjologiczna wątroba, nerka chemiczny produkcja rozpuszczalnych, dyfundujących substancji wysepki Langerhansa kombinacja złożona skóra
Sposób działania implantu fizyczne - biomechanika zależy od składu macierzy i zdolności żywych komórek w obrębie tego implantu do utrzymania takiej struktury- naczynia - wypełniacze tkankowe - mastektomia fizjologiczne i chemiczne - hepatocyty złożone - skóra
Rola gospodarza w implantacji Odrzucanie przeszczepu reakcja niespecyficzna, wrodzona Korzystny wpływ odpowiedzi immunologicznej integracja z tkanką gospodarza Niekontrolowany stan zapalny- zwłóknienie, uszkodzenie architektury konstruktu (enkapsulacja implantu)
Źródła komórek Kryteria wyboru: - łatwość pozyskiwania - funkcjonalność - przeżywalność w implancie
Źródła komórek Komórki autologiczne - proliferacja in vitro krytyczny czas oczekiwania na kmórki biopsja tkanki pacjenta, namnożenie poza organizmem, reimplantacja - aktywowanie zasiedlania nośnika in vivo manipulacja in vivo czynnikami mobilizującymi właściwe komórki do migracji w obszar implantu
Źródła komórek Komórki allogeniczne bankowanie komórek wystandaryzowanie źródło komórek - unieśmiertelnione linie komórkowe możliwość modyfikacji genetycznych, często utrata zdolności do różnicowania, niektóre cechy komórek nowotworowych bezpieczeństwo stosowania
Komórki ksenogeniczne Źródła komórek
Komórki macierzyste embrionalne izolowane z dojrzałego organizmu izolowane z krwi pępowinowej
Komórka macierzysta zdolność do nieograniczonych podziałów daje początek co najmniej jednemu typowi zróżnicowanych komórek
Embrionalne komórki macierzyste Gastrulacja Ektoderma Mezoderma Endoderma Tkanka nerwowa / NSCs Skóra / SSCs Szpik kostny i krew / HSCs, MSCs Mięśnie i kości/ tkankowescs Płuca, wątroba, trzustka / narządowo-specyficznescs Przełyk, żołądek, jelito/ jelitowescs Pierwotne komórki rozrodcze Embrionalne komórki macierzyste Gastrulacja Ektoderma Mezoderma Endoderma Pierwotne komórki rozrodcze Tkanka nerwowa Skóra Szpik kostny i krew Mięśnie i kości Płuca,wątroba, trzustka Przełyk, żołądek, jelito Multipotencjalne komórki macierzyste NSCs/ SSCs HSCs/MSCs/tkankoweSCs NarządoweSCs/jelitoweSCs
totipotencjalne komórki zygoty pluripotencjalne komórki zarodkowe pluripotencjalne zarodkowe komórki rozrodcze gonady multipotencjalne komórki macierzyste multipotencjalne komórki macierzyste tkankowo-specyficzne organy i tkanki komórki macierzyste układu krwiotwórczego komórki macierzyste centralnego układu nerwowego komórki macierzyste mięśni komórki macierzyste skóry
Pluripotencjalne komórki wewnętrznej masy komórkowej ludzkiej blastocysty -zdolne do różnicowania w komórki z 3 warstw germinalnych - różnicują in vitro pod nieobecność czynników wzrostu warunkujących samoodnawianie komórek macierzystych - niski poziom spontanicznego różnicowania podczas pasaży - aktywność alkalicznej fosfatazy - markery powierzchniowe: SSEA-3(stage specyfic embryonic antigen) SSEA-4, TRA-1-60, TRA-1-81, GCTM-2 - ekspresja telomerazy - ekspresja czynnika transkrypcyjnego Oct4 regulującego ekspresję genów
Charakterystyka embrionalnych komórek macierzystych niezdefiniowany potencjał proliferacyjny stabilny diploidalny kariotyp zdolność do wzrostu klonalnego formowanie potworniaków wielokierunkowe różnicowanie in vitro możliwość manipulacji genetycznych
James A. Thomson, Univ. Wisconsin John D. Gearhart, Roger Pedersen, John Hopkins Univ. Gerard Bain i David I Gottlieb, Washington Univ. School of Medicine Meri Firpo, Gordon Keller s Laboratory Loren J. Field, Indiana Univ. Terrence Deacon, Harvard Medical School
Embrionalne komórki macierzyste - sektor komercyjny GERON Melno Park, Calif. ludzkie, małpie PLURION White Plains, New York ludzkie INFIGEN DeForest, Wisc. bydlęce Advanced Cell Technology Worcester, Mass. bydlęce, świńskie, ludzkie Origen Therapeutics San Francisco, Calif. kurze, bydlęce Stem Cell Sciences Monash, Australia świńskie, szczurze MIDAS North Grafton, Mass. świńskie AVIGENICS Athens, Georgia kurze Biotechnology Rsrch&Development Peoria, III. świńskie
Days Embryonic stem (ESC) cells cultivated on feeder layer d0 Cultivation of ESC in hanging drops Formation of embryoid bodies d3 Transfer of embryoid bodies to bacteriological plates and cultivation in suspension d5 Plating of embryoid bodies ( between day 5 and 7) into endo -, ecto - and mesodermal cells d5 + 16
Perspektywy badań komórek macierzystych Badanie leków, testy cytotoksyczności Badanie rozwoju, kontroli genów Pluripotencjalne komórki macierzyste w hodowli in vitro Komórki/tkanki dla celów terapeutycznych szpik kostny komórki nerwowe komórki mięśnia komórki trzustki serca
w dojrzałym organizmie tkankowo swoiste komórki macierzyste posiadają zdolność do różnicowania w komórki tego narządu lub tkanki, dla której stanowią tzw. pulę komórek rezerwowych komórki macierzyste obecne w różnych narządach mogą różnicować w komórki innych tkanek wykazywać tzw. plastyczność alternatywna teoria tłumacząca plastyczność - współzawodnictwo o wspólne nisze w tkankach
Źródła somatycznych komórek macierzystych Szpik kostny hematopoetyczne komórki macierzyste, mezenchymalne komórki macierzyste Skóra epidermalne komórki macierzyste, komórki macierzyste mieszka włosowego Mięśnie szkieletowe komórki satelitarne, komórki macierzyste mięśnia Żołądek komórki macierzyste nabłonka Serce komórki macierzyste kardiomiocytów Mózg neuronalne komórki macierzyste Wątroba- komórki owalne
Schofield 1978 zaproponował hipotezę występowania niszy jako fizjologicznie ograniczonego mikrośrodowiska (komórki, macierz, sygnały) regulujące i chroniącego komórki macierzyste
Nisze warunkują właściwości komórek macierzystych i przejściowo namnażających się skóra zarodek nabłonek jelita tkankowo-specyficzne komórki macierzyste embrionalne komórki macierzyste przejściowo namnażające się komórki szpik kostny terminalnie zróżnicowane komórki Kontrola transdukcji sygnału w niszy proliferacja różnicowanie
Figure 1. Stem cell hierarchy Rizvi, A. Z. et al. Stem Cells 2005;23:150-165 Copyright 2005 AlphaMed Press
Figure 2. Rapidly renewing stem cell niches Rizvi, A. Z. et al. Stem Cells 2005;23:150-165 Copyright 2005 AlphaMed Press
Standaryzacja hodowli komórek do przeszczepów 1. Liczenie wyizolowanych komórek, testy żywotności, wydajność tworzenia kolonii (liczba kolonii utworzonychx100/liczba wysianych komórek)- %CFE 2. Identyfikacja komórek- analiza morfologiczna (mikroskopia elektronowa), antygeny markerowe metoda immunologiczna, kariotypowanie 3. Monitorowanie kontaminacji: Sprawdzenie materiału do izolacji Monitoring w trakcie hodowli Źródła zakażeń: tkanka Niewłaściwa izolacja W trakcie hodowli Z materiałów stosowanych do hodowli Ze środowiska Niewłaściwy układ hodowlany
Immunologia nie autologicznych komórek Profesjonalne i nieprofesjonalne komórki prezentujące antygeny MHCII i białka kostymulujące B7 i CD40 Bezpieczeństwo stosowania komórek nie autologicznych : Badanie komórek donorowych na obecność: wirusa HIV, żółtaczki, adenowirusy, badania kariotypu, tumorogenność, zmiany fenotypowe
IMMUNOMODULACJA Projektowanie tkanek i organów - eliminacja komórek limfoidalnych dawcy - maskowanie lub eliminacja antygenów odpowiadających za reakcję immunologiczną
IMMUNOMODULACJA Projektowanie tkanek i organów /modyfikacja antygenów komórek donorowych/ Źródła koncepcji projektowania tkanek: Spits et al. Science 1986 Alloantigen recognition is preceded by nonspecific ahhesion of cytotoxic T cells and target cells kompleks MHC I na powierzchni komórek przeszczepianych (allo- lub kseno-) jest zaangażowany w adhezję i aktywację limfocytów T cytotoksycznych
Badania nad projektowaniem tkanek Maskowanie przeciwciałami antygen MHC I maskowany fragmentami F(ab )2 - cukrzyca - choroby neurodegeneracyjne choroba Parkinsona i pląsawica Huntingtona
Badania nad projektowaniem tkanek Maskowanie przeciwciałami Dodawanie genów Usuwanie RNA Usuwanie enzymatyczne (papaina)
Usunięcie lub maskowanie MHC I - mechanizmy delecja b2-mikroglobuliny przetrwania przeszczepu Odtwarzanie na powierzchni komórek dawcy antygenów MHC I z wykorzystaniem b2-mikroglobuliny biorcy- ochrona przed komórkami NK, powodującymi lizę komórek bez MHC I
IMMUNOIZOLACJA terapia biohybrydowa enkapsulacja technologia - rodzaje kapsuł (mikro-, makro-) - komórki stosowane do enkapsulacji
Próby kliniczne Cukrzyca - implantacja komórek wysp trzustkowych w kapsułach alginianowych
Próby kliniczne Cukrzyca Chroniczny ból ALS (amyotrophic lateral sclerosis) stwardnienie zanikowe boczne
Wyzwania inżynierii w rozwoju narzędzia immunoizolacji Dostarczenie tkanek z z hodowli pierwotnej bądź komórkowej Ochrona przed immunologicznym odrzutem przeszczepu Utrzymanie żywotności komórek i ich funkcji gradient O 2 Wyspy komórek Langerhansa błona immunoizolacyjna tkanka O 2 komórki białka insulina metabolity: Kwas mlekowy CO 2 H +
Utrzymanie żywotności komórek i ich funkcji dostarczanie składników odżywczych i tlenu Preferowane miejsca implantacji wysp trzustkowych: jama otrzewnej jama opłucnej wątroba