Izolowanie i amplifikacja kwasów nukleinowych

ROZDZIAŁ 4 Izolowanie i amplifikacja kwasów nukleinowych Wojciech Garczorz Diagnostyka molekularna jest obecnie najszybciej rozwijającym się działem diagnostyki medycznej. W wielu dziedzinach medycyny jak mikrobiologia, medycyna sądowa czy diagnostyka chorób uwarunkowanych genetycznie ma już ugruntowaną pozycję. W innych specjalizacjach jak onkologia czy farmakogenetyka jej rola stale rośnie. Pierwszym i najistotniejszym etapem badania jest prawidłowe pobranie próbki i izolacja materiału genetycznego. W zależności od celu badania i dostępnego materiału stosuje się różne metody izolacji kwasów nukleinowych, odrębne dla DNA i RNA. W każdym przypadku obowiązuje zachowanie szczególnej ostrożności, aby zapobiec zanieczyszczeniu próbek, co może prowadzić do uzyskania fałszywych wyników. Zastosowanie metod molekularnych w diagnostyce medycznej Techniki molekularne na czele z metodą PCR (reakcja łańcuchowa polimerazy) stosowane są w: 1. Wykrywaniu patogenów infekcyjnych (bakterii, wirusów, pasożytów). 2. Wykrywaniu zmian w genomowym i mitochondrialnym DNA w chorobach uwarunkowanych genetycznie. 3. Diagnostyce mutacji prowadzących do powstawania nowotworów. 4. Wykrywaniu polimorficznych sekwencji DNA na potrzeby identyfikacji indywidualnej ustalanie pokrewieństwa, w szczególności ojcostwa. 17

5. Ustalaniu zgodności tkankowej. 6. Określaniu typów polimorficznych genów powiązanych z cechami fenotypowymi (aktywność enzymów, podtyp receptora). Obecnie ponad 100 szczepów bakteryjnych można wykrywać i różnicować metodą PCR. Dotyczy to szczególnie takich przypadków, w których hodowla in vitro jest długotrwała i trudna. Przykładem może być opracowanie testów diagnostycznych dla Mycobacterium tuberculosis. Metodą PCR można wykryć antygen B i MPB64 prątka gruźlicy po kilku godzinach, podczas gdy klasyczna metoda hodowlana trwa około 6 tygodni. Metodą PCR można wykrywać zarówno DNA jak i RNA wirusy. Najczęściej ma to miejsce w diagnostyce wirusa HIV (RNA wirus) oraz wirusów zapalenia wątroby HBV (DNA wirus) i HCV (RNA wirus). Badane są również inne wirusy, które są czynnikami etiologicznymi w białaczkach, chłoniakach, mięsakach i rakach. Dla infekcji retrowirusowych charakterystyczny jest okres latencji. Zakażenie wykrywa się przed wystąpieniem objawów klinicznych. Dla przykładu, wirus HIV może być wykryty na kilka lat przed pojawieniem się objawów AIDS. Identyfikacja wirusa typu B zapalenia wątroby metodami klasycznymi (RIA, ELISA) bywa czasem nieskuteczna ze względu na zbyt niski poziom wirusa w surowicy. Metoda PCR zwiększa czułość około 10 razy. Diagnostyka chorób dziedzicznych metodą analizy DNA w Polsce prowadzona jest w kilku ośrodkach, z których każdy specjalizuje się w kilku chorobach. Próbki pobrane od pacjentów, u których podejrzewa się wystąpienie danej choroby wysyła się do takiego ośrodka, otrzymując zwrotnie wyniki analizy. W centrach krwiodawstwa coraz częściej korzysta się z metod molekularnych zarówno do określenia układów grupowych krwi jak i do detekcji patogenów, głównie wirusów. Opracowano testy diagnostyczne dla kilkudziesięciu genów uczestniczących w onkogenezie. Badania genetyczne stosuje się do identyfikacji osób zagrożonych zachorowaniem na określony typ nowotworu, w prognozowaniu przebiegu choroby oraz w celu wyboru terapii. Przykładem są testy wykrywające mutacje w genach BRCA1 i BRCA2. Są to geny supresorowe, które biorą udział w naprawie uszkodzeń DNA. Mutacje w ich obrębie prowadzą do znacznego zwiększenia ryzyka wystapienia nowotworów w szczególności sutka i jajnika. Pobieranie materiału do badań Do izolacji DNA nadają się wszystkie komórki zawierające jądro. Dla każdego typu komórek opracowana jest optymalna metoda. Najczęściej wykorzystywany do izolowania DNA materiał biologiczny to: pełna krew obwodowa, komórki nabłonka (szczególnie nabłonek 18

policzka), szpik kostny, komórki płynu owodniowego i kosmówki, cebulki włosowe. Rzadziej używane są: plamy krwi i nasienia, fragmenty tkanek, bioptaty z biopsji cienkoigłowej. W przypadku diagnostyki bakteriologicznej lub wirusologicznej DNA lub RNA izolowany jest z płynów ustrojowych (np. osocza) pozbawionych ludzkich komórek. Ze względu na techniki badań molekularnych, szczególnie istotne jest unikanie możliwości zanieczyszczenia pobieranego materiału innym DNA. Nawet śladowe zanieczyszczenia innymi kwasami nukleinowymi może być przyczyną błędnego wyniku badania. Ilość materiału Do wykonania pełnych badań diagnostycznych wystarczy: 1 ml krwi obwodowej pobranej na wersenian disodowy (EDTA). Inne antykoagulanty mogą być stosowane pod warunkiem, że nie będą zakłócały dalszej analizy (np. heparyna hamuje aktywność niektórych enzymów restrykcyjnych), 25-30 mg tkanki, 10 ml płynu owodniowego. Do wykonania pełnej diagnostyki potrzebne są powyższe ilości materiału biologicznego, natomiast do pojedynczej reakcji PCR niezbędna jest znacznie mniejsza ilość materiału. W praktyce wystarczy 50 l krwi lub 10 l nasienia. Przechowywanie materiału Izolowanie DNA może być rozpoczęte zaraz po pobraniu próbki. Gdy nie ma takiej możliwości, materiał można przechowywać zamrożony. Próbki przechowuje się w następujących warunkach: zamrożona tkanka, lizat umieszczony w buforze do lizy w temperaturze 4 C przez kilka miesięcy, a do przesyłki w temperaturze pokojowej. Etapy izolacji DNA z krwi: liza komórek, które nie zawierają jąder (erytrocyty), odwirowanie leukocytów; uzyskanie osadu, liza osadu leukocytów buforem do lizy, odbiałczenie przez wytrącenie białka mocznikiem, NaCl lub LiCl, odwirowanie osadu białka i przeniesienie supernatantu do nowej probówki, wytrącenie DNA rozpuszczalnikiem organicznym izopropanolem, przemycie osadu 70% etanolem i wysuszenie, 19

rozpuszczenie w buforze. W części praktycznej jest opisana dokładnie jedna z metod izolowania DNA z krwi, oparta na gotowym zestawie odczynników. W przypadku izolowania DNA z tkanek niezbędne jest ich dokładne rozdrobnienie przez sonifikację (działanie ultradźwiękami) lub rozcieranie w moździerzu zamrożonej próbki. W przypadku niektórych tkanek rozbicie błony komórkowej i jądrowej następuje w obecności detergentu i proteinazy K trawiącej białka w tych warunkach. Do izolowania DNA z plemników, plam nasienia lub wymazów z narządów płciowych stosuje się specjalne techniki, które umożliwiają rozdzielenie DNA wyizolowanego z dróg rodnych badanej kobiety i plemników, tzw. metodę preferencyjnej lizy. Wykorzystuje się oporność chromatyny plemników na lizę z udziałem soli sodowej siarczanu dodecylu (SDS), który jest detergentem, i proteinazy K oraz stosunkowo łatwą lizę chromatyny somatycznej. Chromatyna plemników ssaków w miejsce histonów zawiera liczne cysteinowe protaminy. Reszty cysteinowe tworzą dużą liczbę wiązań dwusiarczkowych, co zapewnia oporność na detergenty i egzogenne proteinazy. DNA z plemników izoluje się za pomocą ditiotreitolu, który redukuje (specyficznie) wiązania dwusiarczkowe. Izolowanie DNA z materiału biologicznego Celem jest uzyskanie wysokocząsteczkowego DNA, oczyszczonego z białek i inhibitorów enzymów. Izolowanie kwasów nukleinowych z materiału biologicznego zasadniczo opiera się na następujących etapach: liza komórek, denaturacja białka, usunięcie białek i innych zanieczyszczeń i zagęszczeniu kwasu nukleinowego. Metody izolowania DNA różnią się sposobem ekstrakcji DNA, usuwania białek oraz wytrącania DNA. Istnieje wiele metod izolowania DNA: zastosowanie ekstrakcji DNA fenolem i chloroformem, z odsalaniem białek, zastosowanie mocznika, izotiocyjanianu guanidyny lub proteinazy K. Większość gotowych zestawów przeznaczonych do izolowania DNA oparta jest na jednej z tych metod. Badając liczne, niewielkie próby, np. w badaniach populacyjnych, stosuje się inną technikę. Wykorzystuje ona detergenty do rozbicia błon komórkowych i inaktywacji nukleaz oraz sole chaotropowe, takie jak chlorowodorek lub izotiocyjanian guanidyny. W obecności chlorowodorku lub izotiocyjanianu guanidyny DNA ulega absorbcji na cząstkach szkła lub krzemionki. Następnie DNA odpłukuje się z tych cząstek buforem i wiruje otrzymując czysty izolat. 20

Izolowanie RNA z materiału biologicznego RNA w porównaniu do DNA jest mniej stabilny termodynamicznie, łatwiej ulega rozpadowi i trawieniu przez rybonukleazy. Warunkiem uzyskania czystego, nie zdegradowanego preparatu RNA jest szybkie i skuteczne zahamowanie aktywności rybonukleaz, które są wyjątkowo stabilnymi i aktywnymi enzymami, występującymi we wszystkich komórkach i bardzo szybko degradują RNA. Do izolowania RNA konieczne jest posiadanie odczynników i naczyń wolnych od rybonukleaz. Wszystkie odczynniki powinny być inaktywowane dietylopirowęglanem (DEPC), który hamuje aktywność rybonukleaz. DEPC jest silnym mutagenem, dlatego wymagana jest duża ostrożność przy pracy z tym związkiem (należy pracować pod wyciągiem i w rękawiczkach). Techniki izolacji RNA Techniki izolacji RNA różnią się w zależności od materiału badanego, jak i od rodzaju RNA, który ma zostać wyizolowany. Najczęściej izoluje się następujące frakcje RNA: informacyjne RNA (mrna) z wykorzystaniem sekwencji poli(a) w celu oddzielenia od innych frakcji RNA, całkowite RNA, rybosomalne RNA. Obecnie w licznych badaniach określa się wpływ różnych czynników na ekspresję genów. W tym celu izoluje się z komórek lub tkanek mrna, następnie przy pomocy odwrotnej transkryptazy następuje przepisanie informacji na komplementarne DNA (cdna). Klasyczne metody izolacji RNA wykorzystują mieszaninę fenolu i chloroformu, jednak ze względu na toksyczność tych składników opracowano nowe metody wykorzystujące selektywne wiązanie RNA do żelu krzemionkowego w środowisku specyficznego wysokojonowego buforu. Metoda ta zapewnia selektywność wiązania RNA a nawet jego określonego typu (np. mrna czy trna). Próbki biologiczne (bakterie, komórki, tkanki roślinne i zwierzęce) są lizowane i homogenizowane w buforze, który jednocześnie inaktywuje rybonukleazy. Lizat pełny lub rozfrakcjonowany (po dodaniu etanolu) nanosi się na mini kolumnę, gdzie następuje selektywna i specyficzna absorbcja RNA do filtru krzemionkowego. Poprzez przemywanie kolumny różnymi buforami usuwa się zanieczyszczenia (białko, DNA) i ostatecznie wypłukuje czysty RNA wodą. Podobnie jak w przypadku izolowania DNA można kupić gotowe zestawy odczynników. Wyizolowany RNA można przechowywać w temperaturze -70 C przez okres 1 roku. 21

Wybrane właściwości fizyczne i chemiczne kwasów nukleinowych Ich wodne roztwory mają odczyn kwaśny dzięki zawartości dużej ilości reszt kwasu fosforowego. Rozpuszczają się dobrze w środowisku zasadowym, trudniej w wodzie i rozcieńczonych roztworach kwasu octowego. W roztworach wodnych tworzą układy koloidowe, z których można je łatwo wytrącić za pomocą środków odwadniających, np. etanolu. W środowisku kwaśnym wiążą zasadowe barwniki (błękit toluidynowy, zieleń metylowa), co wykorzystano w badaniach histochemicznych do barwienia jąder komórkowych. Występują w kompleksach z białkami, tworząc nukleoproteiny. Polinukleotydy wykazują tzw. efekt hiperchromowy, czyli wzrost absorbcji światła UV, gdy nukleotydy są wolne lub przypadkowo zorientowane, w porównaniu do absorbcji przez uporządkowaną strukturę kwasu nukleinowego. Spowodowane temperaturą rozsunięcie podwójnego heliksu, powoduje gwałtowny wzrost pochłaniania promieniowania przy długości fali 260 nm w pobliżu temperatury denaturacji DNA w roztworze. Spada także lepkość roztworu. Stabilność dwuniciowej struktury DNA zależy w dużym stopniu od siły jonowej roztworu i jego ph oraz od składu zasad. Pary G-C (3 wiązania wodorowe) są stabilniejsze niż pary A-T (2 wiązania wodorowe). Wzrost ph, temperatury lub silne obniżenie siły jonowej roztworu powoduje denaturację podwójnej helisy DNA. DNA zdenaturowany występuje w postaci wolnych, pojedynczych nici. Przy powolnym oziębianiu zdenaturowanego termicznie roztworu DNA następuje rekombinacja obydwu nici i zostaje przywrócona struktura podwójnego heliksu (renaturacja). Gdy roztwór gwałtownie się ochłodzi, obie nici pozostają oddzielone. Zjawisko to wykorzystano do otrzymywania jednoniciowego DNA w technice PCR (termocyklery). Jeżeli do próbki zdenaturowanego DNA doda się inny preparat jednoniciowego DNA lub RNA i przeprowadzi renaturację to takie zjawisko nazywa się hybrydyzacją. Hybrydyzacja pozwala na wykrywanie określonych sekwencji nukleotydowych w DNA lub RNA. Połączona z elektroforezą jest wykorzystywana w metodzie Southern blot (dla DNA) i 22

northern blot (dla RNA) oraz w technice amplifikacji DNA (przyłączanie starterów) łańcuchowej reakcji polimerazy (PCR). Analiza chemiczna preparatów DNA i RNA W praktyce wykorzystywane są dwie metody analizy określające zarówno stężenie jak i czystość izolatów DNA i RNA. Każda z nich wykorzystuje inne zjawiska fizyczne. Poniżej zostaną omówione metody: spektrofotometryczna i elektroforetyczna. Metoda spektrofotometryczna Metoda spektrofotometryczna wykorzystuje fakt, że kwasy nukleinowe oraz produkty ich metabolizmu i hydrolizy pochłaniają światło ultrafioletowe. Właściwość taką posiadają wszystkie związki zawierające układ purynowy i pirymidynowy. Grupa fosforanowa oraz cukrowa nie wpływają na intensywność i charakter pochłaniania. Charakterystyki spektralne DNA i RNA są podobne. Maksimum pochłaniania występuje przy długości fali 260 nm. Metoda ta polega na pomiarze absorbancji punktowo przy 260, 280 i 320 nm lub wykonaniu pomiar widma w zakresie 200-320 nm. Pomiary prowadzi się w kwarcowych kuwetach wymagających 100 µl roztworu lub przy użyciu specjalnych czytników, wymagających jedynie 1 2 µl roztworu. Absorbancja przy 260 nm = 1,000: dla dwuniciowego DNA o stężeniu 50 µg/ml; dla jednoniciowego DNA o stężeniu 33 µg/ml; dla RNA o stężeniu 40 µg/ml. Wartość absorbancji przy 320 nm należy odjąć od absorbancji przy 260 nm w celu korekcji rozproszenia światła. Na pomiar stężenia DNA czy RNA mają wpływ inne substancje, dlatego niekiedy zaleca się wykonanie odczytu przy kilku długościach fali. Przy 280 nm maksimum absorbancji wykazują zanieczyszczające izolat białka. Stężenie dwuniciowego DNA oblicza się ze wzoru: C( g / ml) ( A260 A280) 50 23

Długość fali (nm) Substancje absorbujące 230 EDTA, polisacharydy, etanol 260 DNA, RNA 280 Białka 320 Drobiny komórkowe (zanieczyszczenia mechaniczne) Dla oceny stopnia czystości preparatów DNA stosuje się oznaczenie stosunku A 260 /A 280. Gdy stosunek absorbancji A 260 /A 280 wynosi 1,8-2,0 - to preparaty są dobrze oczyszczone, jeśli jednak A 260 /A 280 =1,5 świadczy to, że preparat zawiera 50% białek i 50% RNA lub DNA. Metoda elektroforetyczna Metoda elektroforetyczna jest rzadziej stosowana, ale w odróżnieniu od pomiaru w UV pozwala także ocenić jakość preparatu. Polega ona na porównaniu podczas elektroforezy w żelu agarozowym preparatu badanego z preparatem o znanym stężeniu. Jest to metoda z wyboru w przypadku niewielkiej ilości preparatu, ponieważ po analizie można wyciąć kawałek agarozy i wyekstrahować z niego DNA. Po elektroforezie i wybarwieniu bromkiem etydyny żel ocenia się w transiluminatorze. Prawidłowo wyizolowany DNA w porównaniu z markerem wielkości widoczny jest w postaci zwartego prążka o wielkości około 50 kb, bez widocznych smug. Obecność smug oznacza degradację DNA. Metody rozdziału i barwienia DNA Podstawową techniką służącą do rozdziału, analizy i oczyszczania kwasów nukleinowych jest elektroforeza. DNA i RNA posiadają ujemny ładunek, spowodowany obecnością reszt fosforanowych. Dlatego też w polu elektrycznym przesuwają się w kierunku anody, czyli elektrody dodatniej. Szybkość wędrowania cząsteczek w polu elektrycznym zależy od ich wielkości i kształtu. Minimalna ilość DNA, która jest widoczna w kształcie prążków po wybarwieniu bromkiem etydyny to kilka nanogramów. 24

W żelu agarozowym ruchliwość elektroforetyczna DNA jest odwrotnie proporcjonalna do logarytmu masy cząsteczkowej, wyrażonej w daltonach (Da) lub tysiącach par zasad (kb). Wielkość fragmentu można obliczyć, stosując wzorcowe fragmenty DNA o znanej wielkości. Następnie wykreśla się wykres zależności odległości przebytej w czasie elektroforezy od logarytmu masy cząsteczkowej. Elektroforezę kwasów nukleinowych przeprowadza się w żelach (agarozowym lub poliakrylamidowym) natywnych lub denaturujących. Żel agarozowy wykorzystuje się do rozdziału DNA o wielkości od około 200 pz (par zasad). Krótsze fragmenty DNA lepiej rozdzielają się w żelu poliakrylamidowym. Szybkość migracji (ruchliwość elektroforetyczna) cząsteczek DNA w żelu agarozowym/poliakrylamidowym zależy od: masy cząsteczkowej DNA; ruchliwość elektroforetyczna jest odwrotnie proporcjonalna do logarytmu dziesiętnego liczby par zasad, struktury (konformacji) DNA forma liniowa wędruje najwolniej, forma kolista, zamknięta najszybciej, stężenia agarozy/poliakrylamidu wzrost stężenia zwalania migrację, natężenia pola elektrycznego, temperatury (standardowo jest to temperatura pokojowa), składu i siły jonowej buforu. 1. Elektroforeza na żelu agarozowym Żele agarozowe pozwalają na stosunkowo szybki rozdział produktów reakcji PCR, co w połączeniu z jednoetapowym barwieniem stanowi o popularności tej metody. Zdolność rozdzielcza żelu zależy od wielkości oczek (porów) sita w żelu, których rozmiary można kształtować przez zmianę stężenia agarozy. Do prowadzenia rozdziałów stosuje się żele o stężeniach od 0,5% do 2%. Krótsze produkty rozdziela się przy użyciu bardziej stężonych żeli, natomiast dla dłuższych produktów stosuje się żele o mniejszych stężeniach. Wadą żeli agarozowych jest brak możliwości ich wysuszenia i zarchiwizowania, oraz w stosunku do żeli poliakrylamidowych gorsza zdolność rozdzielcza. 2. Elektroforeza w żelach poliakrylamidowych Żele poliakrylamidowe są trudniejsze w obróbce i barwieniu od żeli agarozowych, ale ze względu na lepsze właściwości rozdzielcze ich zastosowanie jest często konieczne. Żele te otrzymuje się przez polimeryzację akrylamidu w długie łańcuchy z wytworzeniem wiązań 25

poprzecznych przez dodanie bis-akrylamidu. Do reakcji polimeryzacji konieczna jest obecność katalizatora (nadsiarczan amonowy lub potasowy), oraz związku inicjującego reakcję (TEMED N,N,N,N - tetrametyloetylenodiamina). W zależności od potrzeb, stosuje się żele poliakrylamidowe o stężeniach 3 20%. Żel poliakrylamidowy używany jest także do rozdziału jednoniciowego DNA, np. przy sekwencjonowaniu. 3. Żele denaturujące Ruchliwość elektroforetyczna w żelu, w trakcie elektroforezy jednoniciowych cząsteczek, zależy nie tylko od wielkości i ładunku cząsteczek, ale także w dużym stopniu od ich struktury przestrzennej. Aby dokładnie określić wielkość cząsteczek, należy wyeliminować różnice migracji wywołane ich różną konformacją. Szczególnie jest to ważne w przypadku elektroforezy jednoniciowego RNA, który tworzy miejscowe struktury dwuniciowe. Czynnikami denaturującymi kwasy nukleinowe w żelach denaturujących są najczęściej: mocznik, formaldehyd, chlorowodorek guanidyny lub gradient temperatury. Czynniki te zapobiegają tworzeniu par przez zasady azotowe. Żele tego typu wykorzystywane są w technice PCR-DGGE, PCR-TGGE oraz sekwencjonowaniu (patrz: Przesiewowe techniki identyfikacji zmian sekwencji nukleotydów). Barwienie żeli Po rozdziale elektroforetycznym konieczne jest wybarwienie żelu, aby uwidocznić kwasy nukleinowe. Barwienie to przeprowadza się kilkoma metodami różniącymi się czułością i specyfiką zastosowania. Pierwszą z metod jest barwienie substancjami mającymi powinowactwo do kwasów nukleinowych i wykazującymi fluorescencję w zakresie światła widzialnego. Najpopularniejszym barwnikiem jest bromek etydyny, który łatwo interkaluje w cząsteczkę kwasów nukleinowych, a fluorescencja kompleksu bromek etydyny DNA jest dziesięć razy większa niż wolnego bromku. Bromek etydyny dodaje się bezpośrednio do żelu lub wybarwia się żel barwnikiem po ukończeniu elektroforezy. Bromek etydyny wykrywa kilka nanogramów DNA. Wbudowuje się znacznie wydajniej w dwuniciowy niż jednoniciowy DNA. Wybarwiony żel przenosi się na podświetlarkę UV (długość fali wzbudzenia około 300 nm). Kompleks bromek etydyny DNA posiada maksimum emisji w paśmie światła czerwonego o długości fali 590 nm. Barwienie srebrem jest czulsze i umożliwia wykrycie 1-10 pg DNA na 1 mm 2. Jest to technika fotochemiczna podobna do reakcji wykorzystywanych w fotografii. Do barwienia 26

stosuje się azotan srebra. Metaliczne srebro wiąże się z DNA tworząc nierozpuszczalne sole. Istotnym etapem jest bardzo dokładne odpłukanie niezwiązanych związków srebra. Następne etapy polegają na redukcji soli srebra formaldehydem lub tiosiarczanem sodu. Zredukowane srebro ma kolor brązowy i DNA widoczny jest w postaci brązowych prążków. Z tak wybarwionego żelu można ekstrahować DNA do dalszych analiz (np. sekwencjonowania), nawet po dłuższym przechowywaniu. Wadą metody jest duża wrażliwość na zanieczyszczenia nieorganiczne. Metodę srebrzenia wykorzystuje się głównie dla żelu poliakrylamidowego, ponieważ w przypadku żelu agarozowego czułość jest znacznie niższa. Do najczulszych metod detekcji kwasów nukleinowych należą metody wykorzystujące znakowanie radioizotopem lub znacznikiem fluorescencyjnym. Metody amplifikacji DNA Technika PCR (ang. polymerase chain reaction) - reakcja łańcuchowa polimerazy Ta rewolucyjna technika naśladuje zjawisko replikacji DNA i polega na enzymatycznej amplifikacji wybranych fragmentów DNA, za pomocą termostabilnej polimerazy. Zespół enzymów, które in vivo przygotowywują matrycę do replikacji DNA, zostaje zastąpiony termiczną denaturacją DNA, natomiast działanie primosomu i synteza starterów są zastąpione syntetycznym oligonukleotydem (18-25 nukleotydowym) komplementarnym do 3 -końca wybranego regionu matrycy. Reakcję PCR przeprowadza się w probówkach umieszczonych w termocyklerach. Po powieleniu DNA może być poddany elektroforezie, analizie restrykcyjnej, hybrydyzacji lub sekwencjonowaniu. Metoda PCR: Służy do powielenia materiału genetycznego o wielkości do 2 kb (kilopar zasad), a czasem większych fragmentów, metodą enzymatyczną z pikogramowych ilości DNA. Umożliwia amplifikację in vitro wybranych odcinków DNA lub RNA uprzednio przepisanego na cdna. Jest to metoda alternatywna do klonowania i może być używana do amplifikacji bardzo rzadkich sekwencji w mieszaninie, ale pod warunkiem, że znana jest sekwencja otaczająca powielany fragment. 27

Zaletą PCR jest możliwość wykorzystania do reakcji DNA w znacznym stopniu zdegradowanego, jeśli degradacja ta nie dotyczy amplifikowanej sekwencji. Przebieg reakcji PCR Mieszanina reakcyjna musi zawierać: wyizolowany DNA jako matrycę dla polimerazy, cztery rodzaje dntp (trifosforany deoksynukleotydów) jako substraty i dostarczyciele energii do reakcji, dwa primery (startery) syntetyczne oligonukleotydy o długości około 20 nukleotydów komplementarne do 3 - końców obu nici DNA, termostabilną polimerazę DNA, bufor reakcyjny. Metoda PCR polega na cyklicznym powtarzaniu denaturacji termicznej dwuniciowej cząsteczki DNA, przyłączaniu starterów do jednoniciowej matrycy DNA podczas obniżania temperatury i syntezie nowej nici pomiędzy tymi starterami przy udziale termostabilnej polimerazy DNA. Całą reakcje można podzielić na etapy: 1. DENATURACJA termiczna DNA w temperaturze 92-94 C, obie nici kwasu nukleinowego są rozdzielane. 2. HYBRYDYZACJA polega na obniżeniu temperatury do 40-60 C, co powoduje przyłączenie się primerów do komplementarnych odcinków DNA wyznaczając fragment, który ma być powielany. Startery dodawane są w dużym nadmiarze molowym w stosunku do zdenaturowanego DNA. Temperatura przyłączania starterów jest uzależniona od ich długości oraz rodzaju zasad wchodzących w ich skład. 3. ELONGACJA synteza nowej nici odbywa się w temperaturze 72 C przy udziale termostabilnej polimerazy DNA, np. Taq (polimeraza izolowana z bakterii Thermus aquaticus). 28

Denaturacja wstępna 92-94 o C 7 10 min. Denaturacja 92-94 o C 1 min. Hybrydyzacja 40-60 o C 1 min. Elongacja 72 o C 1 min. Elongacja końcowa 72 o C 10 min. POWTARZANE 20 40 RAZY Rysunek 4.1. Warunki termiczne prowadzenia reakcji PCR. Całość mieszaniny jest podgrzewana w celu denaturacji powstałych produktów, czyli ponownie wchodzi w pierwszy etap. Powtórzenie całego cyklu 20-40 krotnie pozwala otrzymać powielony fragment DNA w ilości łatwej do identyfikacji metodą elektroforetyczną. W każdym cyklu liczba kopii sekwencji między primerami rośnie wykładniczo i można ją opisać jak [(2 n -2n) x] (gdzie: n - liczba cykli; x - początkowa liczba kopii; 2n - produkty pierwszo- i drugorzędowego wydłużania primerów o nieokreślonej długości). 29

dwuniciowe DNA denaturacja CYKL 1 przyłączenie starterów i amplifikacja produkty 1 cyklu PCR denaturacja, przyłączenie starterów i amplifikacja CYKL 2 produkty 2 cyklu PCR CYKL 3 produkty 3 cyklu PCR Rysunek 4.2. Przebieg reakcji PCR. Dla cykli 2 i 3 pominięto poszczególne etapy reakcji. Startery reakcji zaznaczono kolorami zielonym i czerwonym. Techniki analizy kwasów nukleinowych Stosowane techniki analizy kwasów nukleinowych można podzielić na dwie grupy, w zależności od zastosowania do wykrywania określonych (znanych) lub nieokreślonych (nieznanych) mutacji. Do metod służących do wykrywania znanych mutacji należą: PCR (ang. polymerase chain reaction) PCR-RFLP (ang. PCR restriction fragment length polymorphism) LCR (ang. ligase chain reaction) PCR-ASA (ang. PCR allele specific amplification) 30

Metody przesiewowe służą do poszukiwania zmian w sekwencji DNA pozwalające zwykle tylko stwierdzić fakt wystąpienia mutacji, ale nie na czym ona polega. Zidentyfikowane próbki poddaje się sekwencjonowaniu celem ustalenia miejsca i rodzaju mutacji. Do metod przesiewowych zaliczamy: PCR-SSCP (ang. PCR single strand conformation polymorphism) PCR-DGGE (ang. PCR denaturating gradient gel electrophoresis) PCR-TGGE (ang. PCR temperature gradient gel electrophoresis) Metodą, która może służyć zarówno do wykrywania znanych i nieznanych mutacji jest sekwencjonowanie. Jest to najkosztowniejsza metoda, jednak z biegiem czasu będzie ona coraz tańsza i szerzej stosowana w diagnostyce. PCR-RFLP W technice tej produkt klasycznej reakcji PCR poddaje się trawieniu enzymem restrykcyjnym. Technika ta jest dokładnie opisana w rozdziale Metody molekularne w diagnostyce. LCR Techniką PCR nie można wykrywać mutacji punktowych. Jedną z metod, jakie do tego służą jest ligazowa reakcja łańcuchowa LCR. W metodzie tej stosuje się dwa dłuższe primery, które obejmują badany region, ale po hybrydyzacji do DNA nie ma między nimi żadnej przerwy. Podobnie jak PCR jest to reakcja cykliczna, ale nie ma etapu wydłużania starterów z udziałem polimerazy DNA, lecz łączenie ich za pomocą termostabilnej ligazy. Łączenie obu primerów przez ligazę ma miejsce jedynie, gdy prawidłowo zhybrydyzują z matrycą DNA. W przypadku mutacji w sekwencji matrycowej primery nie przyłączą się prawidłowo do DNA i nie ulegną połączeniu przez enzym. Metodę LCR i jej modyfikacje stosuje się w diagnostyce do wykrywania mutacji punktowych. Niesparowane zasady w miejscu mutacji uniemożliwiają przebieg reakcji LCR nie powstaje wówczas produkt reakcji. PCR-ASA Metoda PCR-ASA amplifikacji specyficznych alleli polega na wykonaniu tylu reakcji PCR, ile znamy odmian polimorficznych danego regionu genu. Wszystkie reakcje mają jeden starter wspólny (identyczny) natomiast każdy z pozostałych starterów jest komplementarny tylko do jednej z sekwencji polimorficznych. Wykrycie produktu reakcji tylko w jednym przypadku oznacza, że osoba badana jest homozygotą posiadającą wykrytą odmianę 31

polimorficzną w obu allelach. Wykrycie produktów w dwóch reakcjach świadczy o heterozygotyczności pod względem badanego genu. PCR-SSCP PCR-SSCP analiza polimorfizmu jednoniciowych fragmentów umożliwia wykrycie nieznanych mutacji. Analizę prowadzi się na produktach reakcji PCR, które przed elektroforezą denaturuje się termicznie w buforze obciążającym z dodatkiem formamidu. Następnie jednoniciowe fragmenty DNA rozdziela się w natywnym żelu poliakrylamidowym. Podczas elektroforezy przyjmują one strukturę II i III rzędową zależną od ich sekwencji nukleotydowej. Nawet pojedyncze zmiany nukleotydów mogą odbić się na konformacji cząsteczki, a tym samym zmienić prędkość migracji w żelu. PCR-DGGE i PCR-TGGE PCR-DGGE analiza elektroforetyczna w gradiencie czynnika denaturującego. Powielone techniką PCR fragmenty DNA które są dwuniciowe nanosi się na żel poliakrylamidowy, w którym utworzony jest rosnący gradient czynnika denaturującego (mocznik, formamid dla DGGE lub temperatura dla TGGE). Fragment DNA, migrując w żelu natrafia na takie stężenie czynnika denaturującego, które powoduje dysocjację podwójnej nici na pojedyncze. W rezultacie, w obrazie elektroforetycznym jednakowe produkty PCR ulegają denaturacji w tych samych warunkach, a otrzymanie różnych prążków świadczy o zmianie w sekwencji DNA. Metoda ta umożliwia wykrycie nieznanych mutacji. RT-PCR RT-PCR (ang. reverse transcription PCR) technika połączona z odwrotną transkrypcją. Technika ta pozwala na analizę ekspresji genów oraz wykrywanie patogenów, których materiałem genetycznym jest RNA (np. wirusy HCV i HIV). Informacja z RNA zostaje przepisana na DNA za pomocą odwrotnej transkryptazy. Na matrycy RNA syntetyzowany jest komplementarny DNA tzw. cdna. Następnie amplifikuje się cdna za pomocą typowej reakcji PCR. Dla wykrycia mutacji analiza transkryptów ograniczona jest do tkanki, w której dany gen ulega ekspresji. Real Time PCR Techniki Real Time PCR PCR w czasie rzeczywistym, nie należy mylić z wcześniej omówiona metodą RT-PCR. W Real Time PCR wykorzystuje się specjalne urządzenia, pozwalające po każdym cyklu reakcji PCR zmierzyć fluorescencję próbki. 32

5 3 3 5 F W 5 F W Rysunek 4.3. Przebieg reakcji Real Time PCR. Podczas reakcji sonda posiadająca fluorochrom (F) i wyciszacz (W), komplementarnie przyłączona do badanej sekwencji jest degradowana. Uwolniony barwnik fluorescencyjny po wzbudzeniu emituje światło. W porównaniu z klasyczną reakcją PCR mieszanina reakcyjna zawiera dodatkowo sondę oligonukleotydową, komplementarną do badanej sekwencji i przyłączającą się pomiędzy starterami reakcji. Sonda posiada na jednym z końców przyłączony barwnik fluorescencyjny, na drugim końcu wyciszacz związek wygaszający fluorescencję barwnika. Podczas amplifikacji polimeraza DNA, posiadająca aktywność 5 -egzonukleazową degraduje sondę, uwalniając barwnik fluorescencyjny. Po każdym cyklu amplifikacji następuje pomiar fluorescencji, która jest proporcjonalna do ilości zdegradowanej sondy i powstałego produktu PCR. Szczególną zaletą metody Real Time PCR jest uzyskanie wyników, bez potrzeby rozdziału produktów PCR na żelu i jego barwienia. Metoda ta pozwala na określenie ilości kopii badanego fragmentu DNA, co jest niezwykle przydatne w diagnostyce mikrobiologicznej i wirusologicznej. Pozwala wówczas określić nie tylko obecność patogenów, ale również ich ilość. Możliwa jest również analiza ekspresji genów na poziomie mrna, po przepisaniu, przy użyciu odwrotnej transkryptazy na cdna. Pozwala to na porównanie ekspresji genów w różnych tkankach lub we fragmentach tej samej tkanki: zdrowym i objętym procesem nowotworzenia. 33

CZĘŚĆ PRAKTYCZNA ĆWICZENIE 1 Izolowanie DNA z krwi pełnej za pomocą zestawu Master Pure DNA Purification Kit ODCZYNNIKI Zestaw Master Pure DNA Purification Kit Zestaw przeznaczony jest do izolowania dwuniciowego DNA ze świeżej lub zamrożonej krwi, z hodowli komórkowych, z różnych tkanek (ssaków lub roślin), bakterii Gramdodatnich i Gram-ujemnych. Czas izolowania wynosi około 60 minut. Metoda ta nie wymaga ekstrakcji chloroformem, fenolem ani trawienia proteinazami. Podstawą izolowania jest prowadzona etapami liza komórek, odbiałczanie a następnie selektywne wytrącenie DNA izopropanolem. W końcowym etapie DNA jest przemywany etanolem. DNA otrzymany tą metodą, może być używany we wszystkich technikach biologii molekularnej (PCR, trawienie restrykcyjne, klonowanie, analiza Southerna, sekwencjonowanie DNA itp.). Przygotowanie próbek 1. Krew Pobrana na EDTA lub cytrynian. DNA izolowane z krwi heparynizowanej nie może być użyte do PCR. Typowo używa się 200 l świeżej krwi. Jeżeli konieczna jest większa ilość DNA, to należy podwoić ilość krwi oraz wszystkich odczynników. Krew może być przechowywana w temp. 2-4 C nie dłużej niż 2 miesiące. W celu dłuższego przechowywania próbki powinny być rozdzielone na porcje po 200 l i umieszczone w temp. -20 C. 2. Surowica Polecane jest używanie surowicy świeżej. Gdy jest to niemożliwe, można zamrozić roztwór i przechowywać w temp. 20 C. 3. Hodowla komórkowa Komórki z hodowli należy odwirować i zawiesić w 200 l buforu TE. Dla skutecznej preparacji DNA zaleca się użycie około 10 6 komórek. Nie jest polecane stosowanie próbek wysuszonych. 4. Komórki nabłonka 34

Komórki nabłonka zebrać przez odwirowanie (5000 obr/min, 3 min), supernatant usunąć, osad komórek zawiesić w 200 l buforu TE. 5. Tkanki 1-5 mg tkanki ssaków (świeże lub zamrożone w temp. -70 C) bądź roślin (sproszkować w ciekłym azocie; proszek umieścić w probówce i zawiesić w 200 l buforu TE). 6. Hodowle bakteryjne Hodowlę bakterii odwirować przez 10 min przy 7500 obr/min. 10-20 mg hodowli bakterii (świeże lub zamrożone temp. -20 C) przenieść do probówek i zawiesić w 200 l buforu TE. Uwaga! Kilkukrotne zamrażanie i odmrażanie próbek nie jest wskazanie, ponieważ istotnie obniża wydajność izolacji DNA WYKONANIE 1. Do probówki zawierającej 200 l krwi dodać 600 l odczynnika Red Cell Lysis Solution, aby dokonać lizy erytrocytów. Wymieszać zawartość przez 3-krotne odwrócenie probówki. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 5 minut. Zawartość ponownie wymieszać i inkubować przez kolejne 5 minut. 2. Wymieszać zawartość probówki, wirować przez 45 sekund przy 12000 obr/min. Usunąć pipetą automatyczną supernatant, pozostawiając na dnie osad leukocytów (około 25 l płynu). 3. Do osadu leukocytów dodać 300 l odczynnika Tissue and Cell Lysis Solution aby dokonać lizy pozostałych komórek. Dokładnie wymieszać zawartość przez kilkukrotne przepipetowanie zawartości. 4. Dodać 150 l odczynnika Protein Precipitation Reagent, mieszać energicznie przez 10 sekund i wirować 10 minut przy 12000 obr/min. 5. Przenieść supernatant do nowej probówki i dodać do niego 500 l izopropanolu. Wymieszać zawartość poprzez 30-40 krotne odwrócenie probówki (powinna być widoczna cienka, poskręcana, biała nić DNA). 6. Odwirować zawartość probówki przez 10 minut przy 12000 obr/min. Na dnie powinna być widoczna biała plamka DNA. Zlać supernatant przez delikatne odwrócenie probówki, nie naruszając osadu. 35

7. Przepłukać dwukrotnie osad DNA używając każdorazowo 1 ml 75% etanolu, nie naruszyć osadu, nie wirować. Resztki etanolu usunąć pipetą. 8. Do osadu DNA dodać 35 l buforu TE. Probówkę pozostawić na 24 godziny celem rozpuszczenia i renaturacji DNA. 9. Oznaczyć stężenie i czystość DNA w próbce za pomocą aparatu GeneQuant. 36