AmpliTest Babesia spp. (PCR) Zestaw do wykrywania sekwencji DNA specyficznych dla pierwotniaków z rodzaju Babesia techniką PCR Nr kat.: BAC21-100 Wielkość zestawu: 100 oznaczeń Objętość pojedynczej reakcji: 20 µl Przed użyciem zestawu należy uważnie zapoznać się z niniejszą instrukcją. Amplicon sp. z o. o. ul. Duńska 9 54-427 Wrocław Polska, NIP: 8943052339, KRS: 0000501830 www.amplicon.pl email: contact@amplicon.pl, tel. +48 71 733 67 06, fax +48 71 733 67 24
ZASTOSOWANIE Zestaw AmpliTest Babesia spp. (PCR) jest przeznaczony do wykrywania sekwencji specyficznych dla pierwotniaków z rodzaju Babesia w próbkach DNA uzyskanych z tkanek zwierzęcia (kleszcza, ssaka). W celu uniknięcia problemów z wydajnością reakcji PCR próbki DNA powinny być przygotowane przy użyciu metod pozwalających otrzymać wysokiej jakości DNA pozbawiony inhibitorów reakcji PCR. Zalecane są zestawy do izolacji DNA oparte o złoża krzemionkowe (tzw. zestawy kolumienkowe). ZAKRES STOSOWANIA Diagnostyka weterynaryjna in vitro Badania i rozwój (B+R) SKŁADNIKI ZESTAWU Nazwa Opis Ilość Kolor wieczka MIX Mix do reakcji PCR 4 500 µl Zielony RMZ Mieszanina reakcyjna Z 4 x 50 µl Fioletowy RMW Mieszanina reakcyjna W 4 x 50 µl Żółty PC Kontrola pozytywna 4 200 µl Czerwony NC Kontrola negatywna 4 200 µl Niebieski Woda Woda 4 500 µl Biały TRANSPORT i PRZECHOWYWANIE Transport odbywa się w suchym lodzie. Po otrzymaniu przesyłki należy ją natychmiast rozpakować. Składniki testu przechowywać w -20 C. Unikać wielokrotnego zamrażania i rozmrażania składników testu. Nie używać składników testu po upływie daty przydatności do użycia. 2
ZASADA DZIAŁANIA Zestaw AmpliTest Babesia spp. (PCR) zawiera startery namnażające fragment genomu pierwotniaków z rodzaju Babesia. Produkty reakcji PCR są rozdzielane w żelu agrozowym i wykrywane dzięki zastosowaniu barwnika interkalującego (bromek etydyny, Midori Green lub inny), który przyłączając się do powstającego amplikonu (powielanego fragmentu bakteryjnego DNA) powoduje jego uwidocznienie w świetle UV. W celu zapewnienia wysokiej specyficzności i czułości reakcji zestaw oparty jest na technice Nested PCR. Polega ona na przeprowadzeniu kolejno dwóch reakcji PCR. Produkt powstały w wyniku pierwszej reakcji PCR (nie zawsze jest widoczny na żelu agarozowym) służy jako matryca do drugiej reakcji PCR. Produkty tej reakcji po rozdzieleniu w żelu agarozowym definiują ostateczny wynik testu. W celu zwiększenia wiarygodności wyników składnik MIX w zestawie AmpliTest Babesia spp. (PCR) zawiera kontrolę wewnętrzną (egzogenny fragment DNA) oraz układ starterów do jej namnożenia. Produkt PCR dla kontroli wewnętrznej jest dłuższy dzięki czemu można go łatwo odróżnić od produktu PCR dla pierwotniaków z rodzaju Babesia. Obecność kontroli wewnętrznej pozwala na monitorowanie prawidłowego przebiegu reakcji PCR. Amplifikacja kontroli wewnętrznej nie wpływa na wydajność wykrywania sekwencji specyficznej dla pierwotniaków z rodzaju Babesia. 3
POTRZEBNY SPRZĘT I DODATKOWE MATERIAŁY Aparat do PCR: Probówki reakcyjne (probówki PCR, płytki PCR, w zależności od posiadanego aparatu do PCR) Wirówka do probówek reakcyjnych Wirówka stołowa (mikrowirówka) Pipety automatyczne w zakresie 1-1000 µl Sterylne końcówki z filtrami do pipet automatycznych Zestaw do izolacji DNA W zależności od użytego zestawu do izolacji DNA może być potrzeby dodatkowy sprzęt i materiały. IZOLACJA DNA Z poszczególnych osobników pobrać fragmenty tkanek, a następnie wyizolować DNA. Ilość potrzebnego materiału zależy od użytej metody izolacji DNA. Do izolacji DNA zaleca się stosowanie zestawów opartych o złoża krzemionkowe (tzw. zestawów kolumienkowych), gdyż zapewniają one uzyskanie próbek DNA o odpowiedniej jakości pozbawionych inhibitorów reakcji PCR. W przypadku innych metod izolacji preparat DNA może zawierać związki, które istotnie zmniejszają wydajność reakcji PCR. Prowadzi to do obniżenia czułości testu, a w skrajnych przypadkach do braku amplifikacji DNA. Próbki DNA należy przechowywać w +4 C (krótki okres przechowywania) lub w -20 C (długi okres przechowywania). REAKCJA PCR 1. Określić liczbę próbek DNA poddawanych analizie (n). 2. Rozmrozić składniki testu. Po rozmrożeniu składników dokładnie wymieszać zawartość probówek i krótko je zwirować. Składniki po rozmrożeniu przechowywać w +4 C lub na lodzie. 3. Określić ilość DNA dodawanego do reakcji (x µl). Optymalna ilość DNA w reakcji wynosi 100-200 ng. Ilość DNA dodawanego do reakcji nie powinna przekroczyć 400 ng. Duże ilości DNA dodanego do reakcji PCR hamują aktywność polimerazy DNA i obniżają czułość testu. Typowo 100-200 ng 4
DNA jest zawarte w 1-5 µl próbki DNA uzyskanej przy użyciu zestawu kolumienkowego. 4. Dokładnie wymieszać ze sobą (n + 3) 10 µl składnika MIX, (n+3) x 1 µl składnika RMZ oraz (n + 3) (9 - x) µl wody. 5. Do n + 2 probówek reakcyjnych (probówek PCR, studzienek na płytce itp.) nanieść po (20 x) µl przygotowanej mieszaniny. 6. Do n probówek reakcyjnych dodać po x µl przygotowanych próbek DNA. Do jednej z pozostałych dwóch próbówek reakcyjnych dodać kontrolę negatywną NC, a do drugiej kontrolę pozytywną PC. UWAGA: Kontrolę pozytywną należy dodać jako ostatnią. 7. Zamknąć probówki reakcyjne, a następnie krótko je zwirować. 8. Probówki reakcyjne umieścić w aparacie do PCR i wykonać reakcję według następującego protokołu: Denaturacja wstępna Amplifikacja (30 cykli) Wydłużanie końcowe 95 C 5 min 95 C 30 s 55 C 30 s 72 C 30 s 72 C 2 min Schłodzenie aparatu 4 C 9. Uzyskane mieszaniny rozcieńczyć 10-krotnie wodą posłużą jako matryce w drugiej reakcji PCR. 10. Dokładnie wymieszać ze sobą (n + 3) 10 µl składnika MIX, (n+3) x 1 µl składnika RMW oraz (n + 3) 7 µl wody. 11. Do n + 2 probówek reakcyjnych (probówek PCR, studzienek na płytce itp.) nanieść po 19 µl przygotowanej mieszaniny. 12. Do probówek reakcyjnych dodać po 1 µl rozcieńczonych reakcji PCR w p. 9. UWAGA: Kontrolę pozytywną należy dodać jako ostatnią. 13. Zamknąć probówki reakcyjne, a następnie krótko je zwirować. 5
14. Probówki reakcyjne umieścić w aparacie do PCR i wykonać reakcję według następującego protokołu: Denaturacja wstępna Amplifikacja (25 cykli) Wydłużanie końcowe 95 C 5 min 95 C 30 s 53 C 30 s 72 C 20 s 72 C 2 min Schłodzenie aparatu 4 C 15. Wykonać elektroforezę w 2% żelu agarozowym z użyciem uzyskanych próbek. 16. Ocenić wielkość otrzymanych produktów PCR dla każdej z próbek. 6
INTERPRETACJA WYNIKÓW Powielony fragment genomu pierwotniaków z rodzaju Babesia ma wielkość 161 pz. Produkt PCR służący jako kontrola wewnętrzna 331 pz. Wynik testu należy odczytać zgodnie z poniższą tabelą. PRODUKT 161 pz 331 pz WYNIK + + pozytywny + - pozytywny - + negatywny - - nieprawidłowy Dla kontroli pozytywnej wynik prawidłowy to obecność produktu o wielkości 161 pz (obecność produktu 331 pz nie ma znaczenia). Dla kontroli negatywnej poprawny wynik to powstanie produktu PCR o wielkości 331 pz i brak produktu 331 pz. Brak produktów PCR o wielkości 161 pz i/lub 331 pz w przypadku kontroli pozytywnej i negatywnej oraz badanych próbek DNA wskazuje na złą jakość zestawu AmpliTest Babesia spp. (PCR) (niewłaściwe przechowywanie, transport, wygaśnięcie terminu przydatności do użycia itp.) lub niewłaściwe jego użytkowanie. Obecność produktów PCR o wielkości 161 pz i/lub 331 pz w przypadku kontroli pozytywnej i negatywnej oraz brak przynajmniej jednego produktu PCR w przypadku badanych próbek DNA oznacza ich złą jakość (obecność związków hamujących reakcję PCR) lub zbyt dużą ilość DNA użytego w reakcji. W tym przypadku należy do reakcji dodać mniejszą objętość próbki DNA, jednocześnie dodając taką objętość wody, aby końcowa objętość reakcji wynosiła 20 µl. UWAGI DODATKOWE Przygotowany test wykrywa powyżej 3 genomów DNA obecnych w dodawanej próbce. Próbki DNA uzyskane z pojedynczych osobników można ze sobą pulować i wykorzystywać w pojedynczym oznaczeniu. W tym celu równe 7
objętości próbek DNA (np. 10 µl) przeznaczonych do pulowania należy ze sobą dokładnie wymieszać i użyć jako matrycy w reakcji PCR. Pulowaniu można również poddawać kleszcze, tj. izolować DNA z kilku osobników jednocześnie. Należy jednak pamiętać, że pulowanie próbek DNA zmniejsza możliwość uzyskania pozytywnego wyniku w przypadku próbek zawierających niewielką ilość bakterii. Nie stosować objętości reakcji mniejszych niż 20 µl. Zmniejszenie objętości reakcji powoduje znaczące zmniejszenie czułości testu. Należy zachować szczególną ostrożność podczas izolacji DNA, a materiał biologiczny uzyskany od chorych zwierząt traktować jako potencjalnie zakażony. Izolację DNA oraz detekcję obecności pierwotniaków z rodzaju Babesia. powinien wykonać odpowiednio przeszkolony personel w laboratorium spełniającym odpowiednie wymogi i dopuszczonym do pracy z zakażonym materiałem biologicznym. Należy zwrócić szczególną uwagę, aby podczas izolacji DNA nie doszło do krzyżowego zanieczyszczenia próbek DNA izolowanych równolegle. W celu maksymalnego wyeliminowania fałszywych wyników powinno się przestrzegać następujących zasad: - w miarę możliwości wyznaczyć osobne stanowiska do izolacji DNA, przygotowania reakcji PCR oraz jej wykonania/analizy. - pomiędzy etapami izolacji DNA, przygotowania reakcji PCR należy dokonać zmiany odzieży laboratoryjnej (fartucha) oraz zmiany rękawiczek jednorazowych. - powierzchnię stanowisk do izolacji DNA i przygotowania reakcji PCR należy przemywać środkami usuwającymi/niszczącymi DNA. - do pipet automatycznych należy stosować wyłącznie sterylne końcówki z filtrem. - podczas przygotowywania reakcji PCR kontrolę pozytywną PC należy dodać jako ostatnią. Przed jej dodaniem, w miarę możliwości, należy zamknąć probówki z dodanymi próbkami DNA i kontrolą negatywną NC. 8