RZECZPOSPOLITA POLSKA (12) TŁUMACZENIE PATENTU EUROPEJSKIEGO (19) PL (11) PL/EP 1951273 Urząd Patentowy Rzeczypospolitej Polskiej (96) Data i numer zgłoszenia patentu europejskiego: 06.10.2006 06799739.5 (97) O udzieleniu patentu europejskiego ogłoszono: 12.02.2014 Europejski Biuletyn Patentowy 2014/07 EP 1951273 B1 (13) (51) T3 Int.Cl. A61K 35/74 (2006.01) A61P 37/00 (2006.01) C12N 1/20 (2006.01) C12R 1/225 (2006.01) C12R 1/25 (2006.01) (54) Tytuł wynalazku: ZASTOSOWANIE LACTOBACILLUS DO LECZENIA CHORÓB AUTOIMMUNOLOGICZNYCH (30) Pierwszeństwo: 06.10.2005 SE 0502209 07.10.2005 SE 0502250 (43) Zgłoszenie ogłoszono: 06.08.2008 w Europejskim Biuletynie Patentowym nr 2008/32 (45) O złożeniu tłumaczenia patentu ogłoszono: 31.07.2014 Wiadomości Urzędu Patentowego 2014/07 (73) Uprawniony z patentu: PROBI AB, Lund, SE (72) Twórca(y) wynalazku: PL/EP 1951273 T3 JAN ALENFALL, Lomma, SE ANNA BERGEN, Flyinge, SE CAROLE RASK, Mölndal, SE AGNES WOLD, Mölndal, SE SHAHRAM AGHAIBEIK-LAVASANI, Malmö, SE (74) Pełnomocnik: rzecz. pat. Katarzyna Rudnicka SULIMA-GRABOWSKA-SIERZPUTOWSKA BIURO PATENTÓW I ZNAKÓW TOWAROWYCH SP.J. skr. poczt. 6 00-956 Warszawa 10 Uwaga: W ciągu dziewięciu miesięcy od publikacji informacji o udzieleniu patentu europejskiego, każda osoba może wnieść do Europejskiego Urzędu Patentowego sprzeciw dotyczący udzielonego patentu europejskiego. Sprzeciw wnosi się w formie uzasadnionego na piśmie oświadczenia. Uważa się go za wniesiony dopiero z chwilą wniesienia opłaty za sprzeciw (Art. 99 (1) Konwencji o udzielaniu patentów europejskich).
SGS-4899/VAL EP 1 951 273 B1 Opis 5 10 15 20 25 30 35 40 Dziedzina wynalazku [0001] Wynalazek dotyczy stosowania co najmniej jednego szczepu bakterii probiotycznych wybranego z Lactobacillus, do wytwarzania kompozycji farmaceutycznej do leczenia i/lub zapobiegania chorobie autoimmunologicznej. Tło wynalazku według stanu techniki [0002] Bakterie probiotyczne definiuje się jako Ŝywe mikroorganizmy, które oddziałują korzystnie na gospodarza po podaniu w odpowiedniej ilości. Pałeczki kwasu mlekowego i bifidobakterie są najczęściej stosowanymi bakteriami w produktach probiotycznych. Bakterie te są na ogół bezpieczne, tak jak probiotyki oparte na tych organizmach. Brak patogenności dotyczy grup w kaŝdym wieku i osób z obniŝoną odpornością. Wykazano, Ŝe przyjmowanie róŝnych bakterii probiotycznych daje korzyści kliniczne w róŝnych sytuacjach fizjologicznych lub patologicznych. Najwyraźniejsze efekty zaprezentowano w przypadku biegunki powodowanej antybiotykoterapią lub infekcją rotawirusową. Istnieją równieŝ badania wykazujące pozytywne efekty kliniczne w chorobach zapalnych jelita, atopowym zapaleniu skóry i hipercholesterolemii po przyjmowaniu bakterii probiotycznych. Mechanizm, za pomocą którego bakterie probiotyczne przyczyniają się do tych ulepszeń klinicznych nie jest jasny. Badania in vitro u ludzi, jak równieŝ badania zarówno in vivo, jak i in vitro u zwierząt wykazały, Ŝe róŝne gatunki pałeczek kwasu mlekowego róŝnie oddziałują na wrodzoną i nabytą [odporność] układu immunologicznego. [0003] Badania kliniczne wykazały pobudzenie głównie wrodzonej komórkowej [odporności] układu immunologicznego i wzmocnienie humoralnych odpowiedzi immunologicznych na naturalne infekcje i systemową lub doustną immunizację. Odnośnie oddziaływania na wrodzony układ immunologiczny, odnotowywano zwiększoną aktywność fagocytarną komórek polimorfojądrzastych (PMN) i zwiększoną aktywność zabijania odnośnie komórek NK. Zgodnie z naszą wiedzą nie istnieją Ŝadne badania kliniczne wskazujące na efekty względem swoistego komórkowego układu immunologicznego po przyjmowaniu bakterii probiotycznych. [0004] W zgłoszeniu dokładnie przeanalizowano m.in. oddziaływanie na wrodzony i nabyty układ immunologiczny po codziennym przyjmowaniu pałeczek kwasu mlekowego lub Gram-ujemnych bakterii P. lundensis. Co ciekawe, zaobserwowano aktywację swoistego komórkowego układu immunologicznego u uczestników badania otrzymujących L. plantarum i przesłanki tegoŝ u uczestników badania otrzymujących L. paracasei. Ponadto, zaobserwowano działania zwiększające odporność względem wrodzonego układu immunologicznego, takie jak zwiększenie populacji komórek NKT i zwiększoną aktywność fagocytarną u uczestników badania otrzymujących róŝne gatunki pałeczek kwasu mlekowego. Przyjmowanie Gram-ujemnych bakterii P. lundensis nie miało Ŝadnego wpływu, w ogóle, na róŝne parametry immunologiczne mierzone w tym badaniu. [0005] Coraz większym problemem w zachodnim świecie są choroby autoimmunologiczne i powiązane z autoimmunologicznymi, w przypadku których układ immunologiczny danego człowieka atakuje sam siebie przez pomyłkę, a dana osoba moŝe zapaść na powaŝną chorobę. Choroby autoimmunologiczne mogą oddziaływać na tkanki łączne i wiele innych części organizmu, takich jak określone narządy, takie jak skóra, nerwy, mózg, płuca, nerki
2 5 10 15 20 25 30 35 40 i stawy. Przykładem choroby autoimmunologicznej wpływającej na nerwy i mózg jest stwardnienie rozsiane, a na skórę jest łuszczyca. Choroba autoimmunologiczna przybiera wiele róŝnych postaci, i istnieje równieŝ wiele terapii tychŝe. Leczenie zaleŝy od rodzaju choroby i dotkniętego [nią] narządu. [0006] Istnieje zapotrzebowanie w stanie techniki na łagodzenie i leczenie objawów powiązanych z chorobami autoimmunologicznymi, jak równieŝ zapewnianie leczenia profilaktycznego przed rozwinięciem się choroby. Kwestie te są przedmiotem wynalazku, co stanie się oczywiste w związku z poniŝszym. Krótki opis wynalazku [0007] Celem wynalazku jest stosowanie co najmniej jednego szczepu bakterii probiotycznych wybranego z Lactobacillus, do wytwarzania kompozycji farmaceutycznej do leczenia i/lub zapobiegania chorobie autoimmunologicznej. [0008] Kolejnym celem wynalazku jest sposób leczenia choroby autoimmunologicznej, w którym co najmniej jeden szczep bakterii probiotycznych wybrany z Lactobacillus jest podawany danemu osobnikowi. Krótki opis rysunków [0009] Figura 1 pokazuje liczbę ochotników zgłaszających jakiekolwiek niewielkie działania niepoŝądane ze strony przewodu pokarmowego podczas badania. Figura 2 pokazuje liczby na początku badania (dzień 0) róŝnych limfocytów na ml krwi (średnia ± (SEM)) [błąd standardowy]. Figura 3 pokazuje odsetki lub GMFI na początku badania (dzień 0) (średnia ± (SEM)) limfocytów dodatnich dla aktywacji róŝnych komórek i markerów pamięci. Figura 4. Uczestników badania przypisywano losowo do dziewięciu róŝnych grup badanych. Badanie rozpoczynano od okresu wymywania, trwającego dwa tygodnie. Później następował aktywny okres badania. Podczas tego okresu uczestnicy badania spoŝywali jedną dawkę badanego produktu dziennie przez 14 (grupy L. plantarum Heal 19, L. fermentum, L. paracasei, L. gasseri, L. rhamnosus, P. lundensis) lub 35 dni (grupa L. plantarum 299v i grupa placebo). KaŜda dawka zawierała 10 10 jednostek tworzących kolonię (CFU) (grupy pałeczek kwasu mlekowego) lub 10 9 CFU bakterii (grupa P. lundensis). Figura 5. Odsetki limfocytów eksprymujących fenotypy aktywacji CD8CD25, CD8HLA-DR, CD4CD25 i CD4HLA-DR analizowano za pomocą cytometrii przepływowej. Pokazywano średnią dla grupy (±SEM) opartą na poszczególnych stosunkach dzień 14/dzień 0 i dzień 35/dzień 0 (wyłącznie dla grupy L. plantarum 299v i grupy placebo). Figura 6. Odsetki limfocytów eksprymujących fenotypy pamięci CD8CD45RO i CD4CD45RO analizowano za pomocą cytometrii przepływowej. Pokazywano średnią dla grupy (±SEM) opartą na poszczególnych stosunkach dzień 14/dzień 0 i dzień 35/dzień 0 (wyłącznie dla grupy L. plantarum i grupy placebo). Figura 7. Odsetki limfocytów dodatnich dla markerów komórek NKT (CD56CD16CD3) analizowano za pomocą cytometrii przepływowej. Wyliczenia dla grupy oparto na poszczególnych stosunkach (dzień 14/dzień 0).
3 5 10 15 20 25 30 35 40 Figura 8. Aktywność fagocytarną neutrofili analizowano za pomocą inkubowania komórek krwi pełnej ze znakowanymi FITC E. coli lub S. aureus. Stosunek pomiędzy średnimi wartościami fluorescencji otrzymanymi w dniu 14 i dniu 0 określano indywidualnie, a obliczenia dla grupy pokazano na tej figurze. Figura 9. pokazuje leczenie profilaktyczne rozwijającego się EAE, masę ciała i objawy kliniczne (doświadczenie 3). Figura 10. pokazuje leczenie terapeutyczne przewlekłego stanu zapalnego w leczeniu EAE rozpoczętym w dniu po wystąpieniu (doświadczenie 3). Figury 11 i 12 pokazują opóźnienie wystąpienia EAE dzięki podawaniu L. paracasei 8700:2 lub L. plantarum HEAL 9 w porównaniu z kontrolą. Figura 13 pokazuje, Ŝe EAE podlegało hamowaniu dzięki mieszaninie szczepów probiotycznych L. paracasei 8700:2, L. plantarum HEAL 9 i L. plantarum HEAL 19. Pokazuje ona równieŝ, Ŝe efekt hamowania zakłócono przez usunięcie komórek T CD4 +. Figura 14. pokazuje, Ŝe EAE podlegało hamowaniu dzięki mieszaninie L. paracasei 8700:2, L. plantarum HEAL 9 i L. plantarum HEAL 19, w porównaniu z kontrolą, metotreksatem i L. Delbrueckii. Figura 15 pokazuje stosunek limfocytów eksprymujących fenotypy aktywacji CD4CD25 z doświadczenia 2. Figura 16 pokazuje stosunek limfocytów eksprymujących fenotypy aktywacji CD4 + CD25 ++ z doświadczenia 2. Figura 17 pokazuje stosunek limfocytów eksprymujących fenotypy aktywacji CD8 + HLA-DR + z doświadczenia 2. Figura 18 pokazuje stosunek limfocytów eksprymujących fenotypy aktywacji CD8 + CD25 + z doświadczenia 2. Figura 19 pokazuje stosunek limfocytów eksprymujących fenotypy aktywacji CD4CD95R0 z doświadczenia 2. Szczegółowy opis wynalazku [0010] W przykładzie wykonania wynalazku co najmniej jeden szczep bakterii probiotycznych wybrany z Lactobacillus jest stosowany w wytwarzaniu kompozycji farmaceutycznej do leczenia choroby autoimmunologicznej wybranej ze swoistej dla narządu autoimmunizacji, wybranej spośród stwardnienia rozsianego (MS), łuszczycy, reumatoidalnego zapalenia stawów, wrzodziejącego zapalenia jelita grubego, cukrzycy typu I lub tocznia układowego. [0011] W obecnym kontekście pojęcie leczenie i/lub zapobieganie obejmuje leczenie profilaktyczne danego osobnika, tj. leczenie bakteriami probiotycznymi rozpoczyna się przed rozwinięciem się choroby, dla zapobiegania chorobie, jak równieŝ leczenie choroby, która juŝ się rozwinęła u danego osobnika. W tym ostatnim przypadku oczekuje się na przykład łagodzenia objawów lub polepszenia ogólnego stanu pacjenta, lub wyleczenia pacjenta z choroby. Stąd dany osobnik moŝe oznaczać osobę obarczoną ryzykiem rozwinięcia się choroby autoimmunologicznej lub nie, lub oznaczać pacjenta juŝ obarczonego chorobą.
4 5 10 15 20 25 30 35 40 [0012] Lactobacillus stosowany według ujawnienia moŝe być wybrany z, ale nie ograniczając, grupy składającej się z Lactobacillus plantarum, Lactobacillus rhamnosus, Lactobacillus fermentum, Lactobacillus paracasei i Lactobacillus gasseri. [0013] Inne szczepy bakterii probiotycznych, niŝ te wyraźnie ujawnione w opisie, moŝna naturalnie stosować według ujawnienia, o ile zapewniają poŝądane efekty, tj. mają działanie zapobiegawcze względem choroby autoimmunologicznej lub łagodzą objawy choroby autoimmunologicznej. [0014] Lactobacillus plantarum stosowany według wynalazku moŝe być wybrany z, ale nie ograniczając, grupy składającej się z Lactobacillus plantarum 299, DSM 6595, Lactobacillus plantarum 299v, DSM 9843, Lactobacillus plantarum HEAL 9, DSM 15312, Lactobacillus plantarum HEAL 19, DSM 15313 i Lactobacillus plantarum HEAL 99, DSM 15316. [0015] Lactobacillus paracasei stosowany według ujawnienia moŝe być wybrany z, ale nie ograniczając, grupy składającej się z Lactobacillus paracasei 8700:2, DSM 13434 i Lactobacillus paracasei 02A, DSM13432. [0016] Lactobacillus gasseri stosowany według ujawnienia moŝe być wybrany z, ale nie ograniczając, Lactoba-cillus gasseri VPG44, DSM 16737. [0017] W kolejnym przykładzie wykonania wynalazku stosuje się co najmniej dwa szczepy probiotyczne jak zdefiniowano powyŝej, do leczenia i/lub zapobiegania wymienionym chorobom autoimmunologicznym. [0018] W przykładzie wykonania, w której stosuje się co najmniej dwa szczepy probiotyczne do zamierzonego leczenia, wymienione co najmniej dwa szczepy mają być z zało- Ŝenia podawane kolejno lub równocześnie. Stąd szczepy mogą być podawane w mieszaninie w jednej kompozycji, lub mogą być podawane kolejno, oddzielnie, w róŝnych kompozycjach. [0019] W kolejnym przykładzie wykonania wynalazku wymieniona kompozycja farmaceutyczna oznacza formulację ciekłą lub formulację stałą, przy czym wymieniona formulacja stała jest wybrana z grupy składającej się z tabletek, tabletek do ssania, słodyczy, tabletek do Ŝucia, gum do Ŝucia, kapsułek, saszetek, proszków, granulek, cząstek powlekanych i tabletek powlekanych, tabletek i kapsułek powlekanych dojelitowych, i rozpuszczających się pasków i błon, a wymieniona formulacja ciekła jest wybrana z grupy składającej się z roztworów doustnych, zawiesin, emulsji i syropów. [0020] W jeszcze innym przykładzie wykonania wynalazku wymieniona kompozycja zawiera materiał nośnikowy, przy czym wymieniony materiał nośnikowy jest niezaleŝnie wybrany z, ale nie ograniczając, grupy składającej się z kleiku mąki owsianej, Ŝywności fermentowanej kwasem mlekowym, skrobi opornej, błonnika pokarmowego, węglowodanów, białek i białek glikozylowanych. [0021] W kolejnym przykładzie wykonania wynalazku wymieniona kompozycja farmaceutyczna jest wybrana z, ale nie ograniczając, Ŝywności medycznej, Ŝywności funkcjonalnej, suplementu diety, produktu odŝywczego lub przetworu spoŝywczego. Stąd pojęcie kompozycja farmaceutyczna według opisu nie musi koniecznie oznaczać kompozycji farmaceutycznej w jej zwykłym rozumieniu, takim jak lek, ale moŝe równieŝ oznaczać produkt z zakresu Ŝywności medycznej, Ŝywności funkcjonalnej, suplementów diety, produktów odŝywczych lub produktów spoŝywczych. Gdy jest to produkt spoŝywczy, moŝe
5 5 10 15 20 25 30 35 40 on zostać wybrany z, ale nie ograniczając, napojów, jogurtów, soków, lodów, pieczywa, herbatników, płatków zboŝowych, batoników odŝywczych, i produktów do smarowania. [0022] Stąd, Zastosowanie kompozycji według wynalazku moŝe być bardzo korzystne w znaczeniu uŝyteczności profilaktycznej, tj. przed rozwinięciem się choroby autoimmunologicznej. Jako Ŝe stosowana kompozycja farmaceutyczna nie jest koniecznie lekiem w jego zwykłym znaczeniu, ale moŝe równieŝ oznaczać suplement diety lub Ŝywność funkcjonalną, jest bardzo dogodnym, aby kompozycję według wynalazku dla normalnego, zdrowego osobnika, przyjmować profilaktycznie. [0023] W przykładzie wykonania wynalazku kaŝdy z wymienionych szczepów jest obecny w kompozycji w ilości około 1x10 6 do około 1x10 14 CFU, korzystnie od około 1x10 8 do około 1x10 12 i bardziej korzystnie od około 1x10 9 do około 1x10 11. [0024] Kompozycja farmaceutyczna według wynalazku moŝe równieŝ zawierać inne substancje, takie jak obojętna zaróbka, lub farmaceutycznie dopuszczalne adiuwanty, nośniki, konserwanty itp., z których wszystkie są dobrze znane znawcom. Przykłady Przykład 1 Uczestnicy badania i kryteria badania [0025] Wybrano pięćdziesięciu siedmiu jawnie zdrowych ochotników, o wieku w zakresie 18-55 lat (mediana, 26 lat) do tego zaślepionego, kontrolowanego placebo badania. Uczestników badania losowo przypisywano do ośmiu grup, otrzymujących jedno z poniŝszych: bakterie Gram-dodatnie, L. plantarum 299v (n=7), L. plantarum Heal 19 (n=7), L. fermentum 35D (n=7), L. paracasei 8700:2 (n=7), L. gasseri VPG44 (n=7), L. rhamnosus 271 (n=7), lub bakterie Gram-ujemne, P. lundensis (n=7) lub placebo (n=10). Dawka bakterii wynosiła 10 10 bakterii/dziennie dla pałeczek kwasu mlekowego i 10 9 bakterii/dziennie dla P. lundensis. Grupa kontrolna przyjmowała odtłuszczone mleko w proszku (1 g). W zaleŝności od grupy, badanie trwało przez okres 6 lub 9 tygodni, składających się z dwutygodniowego okresu wymywania, 2 lub 5 tygodni okresu aktywnego badania i 2 tygodni okresu obserwacji (Fig. 4). KaŜdemu uczestnikowi badania wręczono listę produktów zawierających produkty probiotyczne, których nie powinien przyjmować przez cały okres trwania badania. Próbki krwi obwodowej pobierano od uczestników badania przez nakłucie Ŝyły, w dwóch lub trzech punktach czasowych, dzień 0, dzień 14 i dzień 35. Podczas trwania badania prowadzono dzienniczek, w którym kaŝdy uczestnik badania odnotowywał działania niepoŝądane, stan zdrowia i potwierdzał przyjmowanie badanego produktu. Cytometria przepływowa [0026] Analizę fenotypową limfocytów w krwi pełnej prowadzono za pomocą cytometrii przepływowej. Stosowano poniŝsze anty-ludzkie przeciwciała monoklonalne, jako markery powierzchniowe dla róŝnych populacji komórek: CD3 FITC (SK7), CD4 APC (SK3), CD8 PerCP (SK1), CD19 PerCP (SJ25C1), CD56 PE (MY31), CD16 PE (B73.1) i CD5 FITC (L17F12). Stosowano poniŝsze anty-ludzkie przeciwciała monoklonalne, do wykrywania róŝnych markerów aktywacji i pamięci: CD25 FITC (2A3), HLA-DR PE (L243), CD45RO PE (UCHL-1), CD38 PE (HB7), CD27 PE (L128) i CD11b PE (D12). Wszystkie przeciwciała zakupiono z firmy Becton-Dickinson (Erembodegum, Belgia). Krew pełną (100 µl) inkubowano z przeciwciałami (10 µl/przeciwciało) przez 30 min w 4 C w ciemności. Następnie dodawano 2 ml roztworu lizującego FACS (Becton-Dickinson) i inkubo-
6 5 10 15 20 25 30 35 40 wano przez 15 min w 20 C w ciemności. Komórki odmywano przez dodanie 3 ml FA- CSFlow i wirowano przy 300 x g przez 5 min. Odmyte komórki zawieszano ponownie w 200 µl FACSFlow i analizowano na FacsCalibur (Becton-Dickinson) za pomocą oprogramowania CellQuest. Oznaczenie fagocytozy [0027] Aktywność fagocytarną granulocytów i monocytów określano ilościowo za pomocą PHAGOTEST (Orpegen Pharma, Heidelberg, Niemcy) według instrukcji producenta, z pewnymi modyfikacjami. Pokrótce, dodawano 20 x 10 6 znakowanych FITC E. coli lub znakowanych FITC S. aureus do wstępnie schłodzonej krwi pełnej (100 µl). Komórki krwi i bakterie inkubowano w temp. 37 C przez 10 na FacsCalibur, z oprogramowaniem CellQuest. Obliczenia [0028] Poszczególne zmiany dotyczące róŝnych parametrów immunologicznych określano poprzez wyliczanie stosunku pomiędzy poszczególnymi wartościami otrzymanymi w dniu 14 i dniu 0, lub wartościami dla dnia 35 i dnia 0. Te stosunki stosowano dla wszystkich wyliczeń dla grupy i do statystyki. Statystyka [0029] Wszystkie analizy statystyczne przeprowadzono z uŝyciem Stat-view. Stosowano test Mann-Whitney U do porównywania róŝnych grup. WYNIKI Obserwacje kliniczne [0030] Pięćdziesięciu czterech z pięćdziesięciu siedmiu ochotników ukończyło badanie. Dwie osoby wykluczono ze względu na infekcję i antybiotykoterapię (jedną w grupie placebo i jedną w grupie otrzymującej P. lundensis). Jedną osobę wykluczono w dniu 16 ze względu na ciąŝę (grupa placebo). Zgłaszano jedynie łagodne działania niepoŝądane ze strony przewodu pokarmowego po przyjmowaniu badanych produktów (Fig. 1). Przyjmowanie pałeczek kwasu mlekowego aktywuje komórki T [0031] Obserwowano duŝe róŝnice osobnicze w momencie rozpoczęcia badania (dzień 0) odnośnie markerów aktywacji na komórkach T CD4 + i CD8 +. Odsetki na początku badania dla komórek eksprymujących róŝne markery powierzchniowe komórki pokazano na Fig. 2. nie stwierdzono istotnych róŝnic pomiędzy róŝnymi grupami, w tym punkcie czasowym. Ze względu na stwierdzenie ogromnych róŝnic między poszczególnymi osobami, zdecydowano się na porównywanie wartości stosunku w dniu 14 i dniu 35 względem dnia 0 dla poszczególnych osób. Wszystkie wyliczenia i porównania prowadzono na tych wartościach stosunków (dzień 14/dzień 0 i dzień 35/dzień 0). Po 14 dniach przyjmowania badanego produktu zawierającego L. plantarum 299v obserwowano w przybliŝeniu dwukrotny wzrost ekspresji markera aktywacji CD25 na komórkach T CD8 + (p=0,01) (fig. 5). Obserwowano równieŝ silne, chociaŝ nieistotne (p=0,12), wskazanie podwyŝszenia ekspresji HLA-DR na komórkach CD8 + po przyjmowaniu L. plantarum 299v. Ponadto, obserwowano równieŝ tendencję do aktywacji komórek T CD4 + po przyjmowaniu L. plantarum 299v. Przyjmowanie innego gatunku pałeczek kwasu mlekowego ujętego w tym badaniu, jak równieŝ Gram-ujemnych bakterii P. lundensis nie aktywowało ani komórek T CD8 +, ani T CD4 +. JednakŜe, obserwowano tendencję, Ŝe przyjmowanie L. paracasei zwiększało ekspresję HLA-DR na komórkach T CD4 + (p=0,18).
7 5 10 15 20 25 30 35 40 Przyjmowanie pałeczek kwasu mlekowego indukowało fenotyp pamięci na komórkach T CD4+ [0032] Porównywano średnią geometryczną intensywność fluorescencji (GMFI) dla ekspresji CD45RO na komórkach T CD4+ i T CD8+ pomiędzy grupami otrzymującymi róŝne produkty badane. Jak powyŝej, do porównań stosowano wyliczenia prowadzone na poszczególnych wartościach stosunków (dzień 14/dzień 0 i dzień 35/dzień 0). Po 35 dniach przyjmowania produktu badanego zawierającego L. plantarum 299v znacząco wzrosła ekspresja CD45RO GMFI na komórkach T CD4+ (p=0,03). Obserwowano równieŝ tendencję ku podwyŝszonej ekspresji CD45RO na komórkach T CD8+ po przyjmowaniu L. plantarum (Fig. 6). Ponadto, przyjmowanie L. paracasei zdaje się mieć pozytywny wpływ na podwyŝszenie ekspresji CD45RO na komórkach T CD8+ (p=0,10) (Fig. 6). Wpływ na róŝne populacje komórek po przyjmowaniu produktu badanego [0033] Po przyjmowaniu L. paracasei obserwowano wzrost odsetka limfocytów identyfikowanych jako komórki NKT (p=0,06) (Fig 7). Względnego wzrostu/spadku w porównaniu z dniem 0 nie moŝna było wykryć w związku z innymi populacjami komórek, takich jak komórki T CD4+, komórki T CD8+, komórki B, komórki B-1 (CD19+CD5+), komórki NK, granulocyty i monocyty. Aktywność fagocytarna [0034] Granulocyty i monocyty identyfikowano na wykresie FSC-SSC. Badano zdolność tych komórek do fagocytozy znakowanych FITC bakterii Gram-dodatnich lub Gramujemnych. Jak pokazano na Fig. 8, granulocyty od ochotników otrzymujących L. plantarum 299v (p=0,064), L. plantarum Heal 19 (p=0,064), L. fermentum (p=0,064) lub L. paracasei (p=0,05) były bardziej skuteczne niŝ granulocyty od ochotników traktowanych placebo w fagocytozie Gram-ujemnych bakterii E. coli. JednakŜe, nie zaobserwowano róŝnic między grupami w fagocytozie Gram-dodatnich bakterii S. aureus. Nie moŝna było wykryć róŝnic w aktywności fagocytarnej monocytów (danych nie pokazano). Dyskusja [0035] Głównym zadaniem układu immunologicznego jest reagowanie szybko i gwałtownie na mikroorganizmy, a tym samym zapobieganie i leczenie infekcji. Zabijanie mikroorganizmów wykorzystuje potęŝne mechanizmy, które powodują równieŝ uszkodzenia własnych tkanek. Tym samym, konieczne jest, aby nie było reakcji wobec własnych tkanek, ani nieszkodliwych substancji obecnych w środowisku. W następstwie czego, układ immunologiczny rozwija i utrzymuje tolerancję, zarówno na składniki własnego organizmu, jak i na poŝywienie i przyswojone białka. JeŜeli to zawiedzie, moŝe wystąpić szereg chorób. Środki do rozwijania swoistej immunotolerancji są zasadniczym zadaniem układu immunologicznego. [0036] Centralną rolę we wszystkich reakcjach immunologicznych odgrywają komórki pomocnicze T. Gdy komórka pomocnicza T zostanie zaktywowana przez swoisty dla niej antygen, staje się aktywowana, dzieli się, dojrzewa i produkuje szereg cytokin, które kierują działaniem komórek innych rodzajów w układzie immunologicznym, takich jak cytotoksyczne komórki T i komórki B. Aktywacja komórek pomocniczych T jest konieczna, dla wytworzenia większości rodzajów reakcji immunologicznych, w tym produkcji przeciwciał. Z drugiej strony, jeśli zapobiegnie się aktywacji komórek pomocniczych T dochodzi do paraliŝu większości rodzajów reakcji immunologicznych.
8 5 10 15 20 25 30 35 40 45 [0037] Istnieje kilka mechanizmów, za pomocą których zapewnia się aktywację komórek pomocniczych T i utrzymywanie tolerancji. Jednym z mechanizmów jest usunięcie w grasicy komórek T, o zdolności do rozpoznawania i reagowania na własne tkanki. JednakŜe, usuwanie to nie jest całkowite, a ponadto, konieczne jest równieŝ opracowanie swoistej immunotolerancji na egzogenne antygeny. W przeciwnym razie gwałtownie reagowalibyśmy na wszystkie rodzaje przyjętych wziewnie i spoŝytych substancji, co prowadzi do stanu zapalnego o duŝym natęŝeniu i marnowania zasobów immunologicznych. [0038] Rodzajem komórki, która odgrywa centralną rolę w utrzymywaniu tolerancji jest regulatorowa komórka T. Ten rodzaj komórki moŝe być rozpoznawany przez niektóre markery, takie jak ekspresja powierzchniowa CD4 i CD25, obecność wewnątrzkomórkowego CTLA-4, i transkrypcja białka jądrowego Foxp3. Komórki T regulatorowe są zdolne do zapobiegania aktywacji innych komórek T przy napotykaniu nieszkodliwych substancji i stąd, zapobiegają wszelkim rodzajom niepoŝądanych reakcji immunologicznych. [0039] W obecnym kontekście symbol + w powiązaniu z określonym markerem, takim jak CD4+ i CD25+ oznacza, Ŝe marker jest eksprymowany na komórce T. Na przykład komórki T CD4+CD25+ oznaczają komórki T, które eksprymują zarówno marker CD4, jak i marker CD25 na swojej powierzchni. JednakŜe, nie wspomina się nic na temat ilości eksprymowanego markera, a jedynie to, Ŝe jest on obecny. W obecnym kontekście symbol ++ w powiązaniu z określonym markerem, takim jak CD4++ i CD25++ oznacza, Ŝe marker jest eksprymowany na wysokim poziomie. Regulatorowe komórki T oznaczają te komórki, które mają duŝe ilości CD25 na powierzchni, tj. komórki CD4+CD25++. Z drugiej strony, komórkami T CD4+CD25+ są jedynie aktywowane komórki T. Niekiedy nie uŝywa się określonych symboli + i ++, np. jedynie CD4CD25, i to oznacza, Ŝe komórki są aktywowane, takie jak komórki CD4+CD25+. Stąd, CD4CD25 oznacza to samo, co CD4+CD25+. Przy omawianiu regulatorowych komórek T, jest to zawsze opisywane jako komórki CD4+CD25++. [0040] To zaślepione, kontrolowane placebo badanie jest unikatowe pod tym względem, Ŝe jest to pierwsze badanie porównujące oddziaływanie kilku parametrów immunologicznych po przyjmowaniu róŝnych Gram-dodatnich pałeczek kwasu mlekowego lub Gramujemnych bakterii P. lundensis. Co interesujące, przyjmowanie P. lundensis nie wpływało na Ŝaden z badanych parametrów. Przeciwnie, przyjmowanie pałeczek kwasu mlekowego oddziaływało na róŝne składniki zarówno swoistego, jak i wrodzonego układu immunologicznego. Nowym stwierdzeniem, dla tego badania, było to, Ŝe przyjmowanie L. plantarum miało wyraźny dodatni wpływ na aktywację i indukcję komórek pamięci w populacjach komórek T. Obserwowano istotne podwyŝszenie ekspresji łańcucha β receptora IL-2 (CD25) i silną tendencję do podwyŝszania ekspresji HLA-DR na cytotoksycznych komórkach T. Tendencję do podwyŝszania ekspresji na tych markerach aktywacji obserwowano równieŝ na pomocniczych komórkach T po przyjmowaniu L. plantarum. Ekspresja markerów aktywacji wskazuje, Ŝe rozpoczęła się proliferacja komórek T w odpowiedzi na bodźce swoiste dla antygenu lub nieswoiste, i Ŝe te komórki mogą z łatwością prowadzić swoje funkcje efektorowe w porównaniu z komórkami T w spoczynku. Mechanizmy leŝące u podstaw indukowanej L. plantarum aktywacji komórek T mogą zachodzić poprzez komórki prezentujące antygen, które są aktywowane przez receptory toll-podobne, wiąŝące się do związków mikrobiologicznych. Aktywacja komórek prezentujących antygen czyni je bardziej skutecznymi w prezentowaniu antygenu komórkom T. Ponadto, wykazano, Ŝe zarówno komórki T pomocnicze, jak i cytotoksyczne mają zróŝnicowaną ekspresję recepto-
9 5 10 15 20 25 30 35 40 45 rów toll-podobnych, co prawdopodobnie czyni te komórki wraŝliwymi na nieswoistą aktywację przez składniki i produkty mikrobiologiczne. [0041] Przez analogię do przedziału komórek pomocniczych T, ekspresja CD45RO zdaje się odznaczać populacje pamięci, jak równieŝ cytotoksycznych komórek T. Stwierdzono znaczny wzrost w ekspresji tego komórkowego markera pamięci na komórkach pomocniczych T, i tendencję do podwyŝszenia ekspresji na cytotoksycznych komórkach T po 35 dniach przyjmowania L. plantarum. Ponadto, przyjmowanie L. paracasei równieŝ wykazywało tendencję ku podwyŝszeniu ekspresji CD45RO na cytotoksycznych komórkach T. W odniesieniu do naiwnych komórek T, komórki T CD45RO+ mogą wydzielać szerokie spektrum cytokin. Ponadto, komórki T CD45RO+ mogą się dzielić i wytwarzać IL-2 gdy kompleks CD3-TCR jest stymulowany w warunkach suboptymalnych, podczas gdy naiwne komórki T wymagają silnego bodźca CD3-TCR do prowadzenia tych funkcji. Tworzenie komórek T pamięci jest waŝne dla indukowania skutecznej odpowiedzi immunologicznej po infekcji i szczepieniu. [0042] Wrodzony komórkowy układ immunologiczny równieŝ reagował na przyjmowanie bakterii probiotycznych. Stwierdzono, Ŝe zwiększyła się populacja komórek naturalnych zabójców (NKT) po przyjmowaniu L. paracasei. Komórki NKT stanowią subpopulację limfocytów, które ko-eksprymują marker komórek NK CD56 i marker komórek T kompleks receptor CD3-komórka T. Badania zarówno na ludziach, jak i myszach wykazały, Ŝe komórki NKT odgrywają centralną rolę w regulacji chorób autoimmunologicznych, takich jak stwardnienie rozsiane, cukrzyca typu I i toczeń układowy. Komórki NKT pełnią równieŝ role efektorowe względem komórek nowotworowych i zainfekowanych wirusem. Stąd komórki NKT są plejotropowe w swoich funkcjach. Inne badania kliniczne oceniające oddziaływanie immunologiczne bakterii probiotycznych pokazały, Ŝe przyjmowanie L. rhamnosus HN001 i Bifidobacterium lactis HN019 wzmacnia aktywność zabijania nowotworów komórek NK (w tym NKT) w komórkach K562. W badaniu tym potwierdzono równieŝ, Ŝe aktywność fagocytarna komórek polimorfojądrzastych podwyŝsza się po przyjmowaniu róŝnych pałeczek kwasu mlekowego. Konsekwencją obserwowanych skutków dla róŝnych parametrów immunologicznych w badaniu jest to, Ŝe moŝna spekulować, Ŝe pokrywająca się aktywacja cytotoksycznych komórek T i ekspansja komórek NKT wskazują na wzmocnioną obronę immunologiczną wobec infekcji wirusowych i/lub nowotworów. Stwierdzenie in vitro, Ŝe pałeczki kwasu mlekowego indukują komórki monojądrzaste do wydzielania IL-12 i IL-18, wspiera teorię, Ŝe przyjmowanie tych bakterii stymuluje aktywność komórkową. [0043] Zgodnie z wynalazkiem, stwierdzono, Ŝe przyjmowanie L. plantarum i L. paracasei ma wyraźny wpływ na swoisty i wrodzony komórkowy układ immunologiczny. Przykład 2 [0044] Celem tego przykładu było zbadanie wpływu na układ immunologiczny przez podawanie tego samego gatunku pałeczek kwasu mlekowego przez dłuŝszy okres, w porównaniu z kilkoma pałeczkami kwasu mlekowego (inny gatunek) podawanymi kolejno jeden za drugim. [0045] Ochotnikom podawano proszek z liofilizowanymi bakteriami przez 14 lub 35 dni. Jako Gram-dodatnie bakterie stosowano bakterie probiotyczne Lactobacillus plantarum 299v samodzielnie lub w kombinacji z L. rhamnosus, L. fermentum, L. paracasei, i L. gasseri. Jako bakterie Gram-ujemne podawano Pseudomonas lundensis. Badano poniŝsze grupy:
10 5 10 15 20 25 30 35 40 1) Lactobacillus plantarum 299v 35 dni 2) L. plantarum 299v 7d, L. rhamnosus 271 7d, L. fermentum 35D 7d, L paracasei 8700:2 7d, L. gasseri VPG44 7d. Ogółem 35 dni. (Sekwencyjnie) 3) Mieszanina L. plantarum 299v, L. rhamnosus 271, L. fermentum 35D, L. paracasei 8700:2, L. gasseri VPG44. Ogółem 14 dni. 4) L. rhamnosus 271, 14 dni 5) L. fermentum 35D, 14 dni 6) L. paracasei 8700:2, 14 dni 7) L. gasseri VPG44, 14 dni 8) Pseudomonas lundensis, 14 dni Grupa kontrolna 1) Placebo, 35 dni Grupa kontrolna 2) Placebo, 14 dni [0046] Próbki krwi pobierano w dniach 0, 14 i 35. Ilość pomocniczych komórek T (CD4+) eksprymujących duŝe ilości CD25 definiowano w kaŝdej grupie za pomocą cytometrii przepływowej, jak wyszczególniono powyŝej w doświadczeniu 1. Wyniki [0047] W dniu 14 stwierdzono graniczną istotność komórek T CD4+CD25++, ulegających zwiększeniu populacji u osobników spoŝywających kolejno pięć róŝnych szczepów pałeczek kwasu mlekowego. Dyskusja [0048] W innych badaniach wykazano, Ŝe pomocnicze komórki T (CD4+) eksprymujące z duŝą gęstością cząsteczkę CD25 (CD4+CD25++) są waŝne przy ochronie przeciwko chorobom autoimmunologicznych, alergiom i chorobom zapalnym jelita. Stwierdzenie, Ŝe te komórki podlegają zwiększeniu populacji po przyjmowaniu kolejno róŝnych pałeczek kwasu mlekowego wskazuje, Ŝe przyjmowanie tych bakterii moŝe być korzystne dla danego osobnika, odnośnie ryzyka rozwinięcia się wspomnianych powyŝej chorób. Przykład 3 Zwierzęta [0049] Ośmiotygodniowe myszy C57BL/6 zakupiono z firmy Taconic Europe (Dania). Zwierzęta trzymano i hodowano w konwencjonalnym ośrodku dla zwierząt wydziału biologii komórki i organizmu, Lund University, a wszystkie doświadczenia prowadzono według zaleceń komisji bioetycznej w Malmo-Lund, Szwecja. Myszy karmiono normalną dietą i podawano wodę ad libitum, i umoŝliwiano im przejście okresu aklimatyzacji do nowego środowiska przez co najmniej jeden tydzień przed rozpoczęciem doświadczeń. Myszy stosowane w doświadczeniach EAE codziennie waŝono, badano pod kątem oznak klinicznych EAE, i oceniano punktowo według skali opisanej w ocenie klinicznej, przez całe doświadczenie. Myszy, które osiągnęły wynik punktowy 6 otrzymywały raz dziennie 0,5 ml roztworu soli fizjologicznej, podskórnie, aby przeciwdziałać odwodnieniu. PoŜywienie umieszczano na podłodze klatki, gdyby jakakolwiek mysz wykazywała objawy kliniczne choroby. Myszy, które osiągnęły wynik punktowy 7 uśmiercano ze względów etycznych. Doświadczenia kończono 24 dni po immunizacji.
11 5 10 15 20 25 30 35 40 Antygeny [0050] Stosowano wywołujący zapalenie mózgu peptyd z glikoproteiny mieliny oligodendrocytów (MOG) do indukowania EAE (doświadczalne autoimmunologiczne zapalenie mózgu i rdzenia) u myszy. Syntetyczny peptyd, aminokwasy 35-55 (MEV- GWYRSPFSRVVHLYRNGK), zakupiono od firmy Schafer-N, Kopenhaga, Dania. Stosowany peptyd miał czystość 99%. Immunizacja [0051] EAE indukowano jak opisano wcześniej u samic myszy C57BL/6. Pokrótce, kaŝde zwierzę immunizowano pod znieczuleniem izofluranem, przez podskórne wstrzyknięcie w bok 100 µl emulsji 1:1 200 µg of MOG 35-55 w PBS i CFA [kompletny adiuwant Freunda] zawierającego Mycobacterium tuberculosis H37Ra (Difco, Detroit, MI). Bezpośrednio potem i 48 godz. po immunizacji myszom podawano wstrzyknięcie śródotrzewnowe 0,1 ml 4 µg/ml toksyny krztuśca (Sigma). Ocena kliniczna [0052] Oznaki kliniczne EAE oceniano punktowo według skali od 0 do 8 jak następuje: 0, brak oznak klinicznych choroby; 1, osłabienie ogona; 2, poraŝenie ogona; 3, niedowład kończyny tylnej i zaburzenia chodu; 4, poraŝenie jednej kończyny tylnej; 5, całkowite poraŝenie kończyny tylnej z niedowładem tylnej części ciała, mysz jest aktywna i przemieszcza się za pomocą kończyn przednich; 6, całkowite poraŝenie kończyny tylnej z niedowładem tylnej części ciała, i powaŝnie osłabiona mobilność; 7, poraŝenie czterokończynowe, brak mobilności, stan konania; 8, zgon. Szczepy bakteryjne i leczenie [0053] L. plantarum HEAL 9 i L. paracasei 8700:2 otrzymywano z Probi AB (Ideon, Lund, Szwecja). Bakterie zbierano przez wirowanie, jednokrotnie odmywano, i zawieszano ponownie w wodzie wodociągowej, do stęŝenia końcowego 2x10 9 jednostek tworzących kolonię (CFU)/100 ml w butelce. Trzecią butelkę otrzymywano przy uŝyciu mieszaniny zarówno L. plantarum HEAL 9, jak i L. paracasei 8700:2 w stęŝeniu końcowym 2x10 9 CFU/100 ml. Butelki przemywano, a zaróbki, w tym bakterie otrzymywano codziennie. Doświadczenia prowadzono na dziesięciu myszach w kaŝdej grupie leczenia. KaŜde zwierzę wypijało 4-5 ml zaróbki/dziennie, zawierającej w przybliŝeniu 10 8 CFU. Zwierzęta kontrolne otrzymywały wodę wodociągową. Wyniki Leczenie probiotykami hamowało rozwój EAE indukowanego przez MOG [0054] Dla zbadania efektu przeciwzapalnego probiotyków, trzy grupy zwierząt traktowano wstępnie probiotykami, L. plantarum HEAL 9, L. paracasei 8700:2 i mieszaniną L. plantarum HEAL 9 i L. paracasei 8700:2, przez dwanaście dni i immunizowano pod kątem EAE emulsją CFA i MOG 35-55 w dniu 0. Zwierzęta następnie poddawano leczeniu przez cały okres doświadczenia (aŝ do dnia 24). Czwarta grupa zwierząt otrzymywała jedynie wodę wodociągową, jako kontrolę. Jak pokazano na Fig. 10 leczenie L. plantarum HEAL 9 lub L. paracasei 8700:2 z powodzeniem zapobiegało rozwinięciu się przewlekłego EAE przez 10 dni w porównaniu z myszami kontrolnymi, u których obserwowano powaŝne EAE, rozpoczynające się w dniu 11. Myszy traktowane mieszaniną bakterii wykazywały równieŝ opóźnienie wystąpienia o około pięć dni w porównaniu z kontrolą. U tych myszy rozwinęło się EAE o cięŝszej postaci, w porównaniu z myszami traktowanymi pojedyn-
12 5 10 15 20 25 30 35 40 czymi bakteriami [= z jednego gatunku]. W dniu 24, częstość występowania choroby u zwierząt uległa znaczącemu obniŝeniu, o 14% u zwierząt traktowanych pojedynczymi bakteriami, w porównaniu z 91% u myszy kontrolnych. Częstość występowania u zwierząt otrzymujących mieszaninę bakterii wynosiła 60%. Przy analizowaniu zmian w wadze zwierząt podczas doświadczenia z zaskoczeniem zaobserwowano, Ŝe leczenie mieszaniną dwóch [gatunków] bakterii hamowało spadek wagi, do którego dochodziło zazwyczaj przed wystąpieniem choroby (Fig. 9). Zwierzęta traktowane pojedynczymi bakteriami wykazywały spadek wagi jak myszy kontrolne pomimo tego, Ŝe nie wykazywały oznak pora- Ŝenia. Leczenie profilaktyczne EAE [0055] Zwierzęta traktowano probiotykami 12 dni przed immunizacją i przez całe doświadczenie. [0056] 100 ml wody do picia zawierającej róŝne bakterie przygotowywano codziennie na świeŝo. [0057] W przybliŝeniu 1,108 bakterii/mysz/dziennie. Myszy kontrolne otrzymywały jedynie wodę. Wyniki pokazano na Fig. 9. N Plantarum =7, N Paracasei =7, N mieszanina =10, N kontrola =11 Leczenie terapeutyczne przewlekłego stanu zapalnego w EAE [0058] Leczenie doustne probiotykami [rozpoczynano] jeden dzień po wystąpieniu EAE. Zwierzęta traktowano indywidualnie, za pomocą igły do karmienia. [0059] W przybliŝeniu 1,108 bakterii/mysz/dziennie. Myszy kontrolne otrzymywały jałowe NaCl 9 mg/ml. [0060] Wyniki pokazano na Fig. 10. Doświadczenie 4 N Plantarum =6, N Paracasei =6, N mieszanina =8, N kontrol a=8 Hamowanie przewlekłego stanu zapalnego w ośrodkowym układzie nerwowym przez podawanie doustne Lactobacillus Paracasei i Lactobacillus Plantarum [0061] Celem tego badania była analiza, czy probiotyki mogą wpływać na regulowany przez komórki T przewlekły stan zapalny w ośrodkowym układzie nerwowym. Zaproponowano hipotezę, Ŝe leczenie doustne probiotykami wywołuje działanie przeciwzapalne dzięki modulacji immunologicznej patogennych efektorów komórek T. Materiał i sposoby Model zwierzęcy [0062] Doświadczalne autoimmunologiczne zapalenie mózgu i rdzenia (EAE), zwierzęcy model choroby stwardnienia rozsianego, będzie indukowany przez immunizację peptydem glikoproteiny mieliny oligodendrocytów (MOG), 35-55, w kompletnym adiuwancie Freunda. Wstrzykiwano równieŝ toksynę krztuśca, w powiązaniu z immunizacją, aby dodatkowo pogłębić reakcje zapalne. Zwierzęta zaczynały prezentować objawy kliniczne po dwóch tygodniach. Oznaki EAE punktowano, z rozdziałem na osiem kategorii: 0 brak oznak klinicznych choroby; 1 osłabienie ogona; 2 poraŝenie ogona; 3 niedowład i za-
13 5 10 15 20 25 30 35 40 burzenie chodu; 4 poraŝenie jednej kończyny; 5 poraŝenie dwóch kończyn; 6 poraŝenie dwóch kończyn i niedowład trzeciej kończyny, mysz jest nadal zdolna do przemieszczania się do przodu; 7 poraŝenie czterokończynowe, brak mobilności, stan konania; 8 zgon. Szczepy bakterii probiotycznych [0063] Lactobacillus Paracasei 8700:2, Lactobacillus Paracasei defacti, Lactobacillus Plantarum Heal 9, Lactobacillus Plantarum Heal 19, Lactobacillus Plantarum 299v i Lactobacillus Delbrueckii otrzymywano z firmy Probi AB. Protokoły leczenia [0064] Leczenie profilaktyczne; 100 ml wody do picia zawierającej 1,10 9-1,10 10 róŝnych bakterii przygotowywano codziennie na świeŝo. KaŜda mysz wypijała ok. 5 ml ~1,10 8-1,10 9 bakterii/mysz/dziennie. Zwierzęta traktowano przez 7-14 dni przed immunizacją i przez cały okres doświadczenia. Myszy kontrolne otrzymywały jedynie wodę. W naszym niedawnym doświadczeniu, zwierzęta traktowano igłami do karmienia przez 10 dni po immunizacji, co drugi dzień, przez cały okres doświadczenia. Leczenie terapeutyczne; dziesięć dni po wystąpieniu choroby kaŝde zwierzę otrzymywało 1,10 9 bakterii, z leczeniem indywidualnym, przez igły do karmienia, co drugi dzień przez cały okres doświadczenia. Myszy kontrolne otrzymywały sól fizjologiczną. Metotreksat (MTX); podawano MTX śródotrzewnowo, w stęŝeniu końcowym 2,5 mg/kg, co drugi dzień przez cały okres doświadczenia. Analiza [0065] Izolowano róŝne narządy i materiały ze zwierząt, do dalszych badań; mózg, rdzeń kręgowy, śledzionę, węzły chłonne (krezkowe, pachwinowe), jelito (region, w tym kępki Peyera) i krew. Niektóre narządy traktowano izopentanem, do analiz immunohistochemicznych. Niektóre komórki śledziony i węzłów chłonnych analizowano za pomocą cytometrii przepływowej (FACS) lub umieszczano w kulturach i stymulowano peptydem MOG, anty-cd3 i LPS do dalszych badań cytokin za pomocą ELISA. Wyniki Leczenie profilaktyczne [0066] Zwierzęta traktowano 1,10 8 Lactobacillus Paracasei 8700:2 lub Lactobacillus Plantarum Heal 19 przez siedem dni przed immunizacją. EAE ulegało znaczącemu hamowaniu przez krótki okres. [0067] Zwierzęta traktowano 1,10 9 Lactobacillus Paracasei 8700:2 lub Lactobacillus Plantarum Heal 9 przez dwanaście dni przed immunizacją. Wystąpienie EAE ulegało opóźnieniu o ponad tydzień i uzyskiwano łagodniejszy rozwój EAE (zob. Fig. 11 i 12). [0068] Immunohistochemiczna analiza rdzenia kręgowego wykazała znacząco niŝsze ilości zapalnych komórek T u zwierząt traktowanych probiotykami. Oznaczenie proliferacji splenocytów in vitro ujawniło równą, swoistą dla MOG proliferację komórek T, ale, co interesujące wytwarzały one znacząco mniejsze ilości zapalnych cytokin TNF-α i IFN-γ i większe ilości IL-4 i IL-10. Traktowane Paracasei zwierzęta prezentowały wyŝsze poziomy całkowite przeciwciał IgG i IgA w osoczu. Analiza FACS krezkowych węzłów chłonnych wykazywała zwiększenie ilości komórek T CD4 + CD25 +. Immunohistochemiczna analiza śledziony wykazała zwiększenie ilości komórek Foxp3 + (T reg ).
14 5 10 15 20 25 Badanie przesiewowe 1: [0069] Badano przesiewowo pięć róŝnych pałeczek kwasu mlekowego (Lactobacillus Paracasei 8700:2, Lactobacillus Paracasei defacti, Lactobacillus Plantarum Heal 9, Lactobacillus Plantarum Heal 19 i Lactobacillus Plantarum 299v) pod kątem hamowania EAE dla protokołu leczenia profilaktycznego. Najlepsze hamowanie osiągano przy uŝyciu Lactobacillus Paracasei 8700:2, Lactobacillus Plantarum Heal.9 i Lactobacillus Plantarum 299v. Przenoszenie 1; [0070] Zwierzęta traktowano Lactobacillus Paracasei8700:2, Lactobacillus Plantarum Heal 9, lub mieszaniną obydwu szczepów, przez dwa tygodnie. Następnie zbierano komórki krezkowych węzłów chłonnych i przenoszono do biorców (i.v. doŝylnie), których immunizowano pod kątem EAE jeden dzień po przeniesieniu. EAE podlegało znaczącemu hamowaniu przez komórki od zwierząt traktowanych mieszaniną dwóch szczepów. Efekt hamowania był zakłócany przez usunięcie komórek T CD4+ (zob. Fig 13). [0071] To doświadczenie powtarzano ponownie, z uwzględnieniem grupy zwierząt traktowanych mieszaniną trzech szczepów, w tym Lacto bacillus Paracasei 8700:2, Lactobacillus Plantarum Heal 9 i Lactobacillus Plantarum Heal 19. [0072] Zwierzęta immunizowano pod kątem EAE. 10 dni po wystąpieniu EAE, traktowano je indywidualnie mieszaniną Lactobacillus Paracasei 8700:2, Lactobacillus Plantarum Heal 9 i Lactobacillus Plantarum Heal 19. Ustabilizowanie choroby EAE podlegało znaczącemu hamowaniu w porównaniu do kontroli otrzymujących sól fizjologiczną. To doświadczenie z powodzeniem powtarzano, uzyskując podobny wynik. Leczenie nieswoistymi bakteriami Lactobacillus Delbrueckii lub Metotreksatem (jako ogólnym lekiem przeciwzapalnym) było nieskuteczne, wykazując wyjątkowy efekt terapeutyczny tego protokołu. [0073] Przeciwzapalne mechanizmy działania tej terapii są nadal nieznane, ale nasz wynik wyraźnie pokazuje kluczową rolę CD4 + CD25 + Foxp3 + populacji regulatorowych komórek T (zob. fig. 14). 30 35 40 ZastrzeŜenia patentowe 1. Zastosowanie co najmniej jednego szczepu bakterii probiotycznych Lactobacillus wybranych z grupy składającej się z Lactobacillus plantarum 299, DSM 6595, Lactobacillus plantarum 299v, DSM 9843, Lactobacillus plantarum HEAL 9, DSM 15312, Lactobacillus plantarum HEAL 19, DSM 15313 i Lactobacillus plantarum HEAL 99, DSM 15316, Lactobacillus paracasei 8700:2, DSM 13434, i Lactobacillus paracasei, 02A, DSM13432, do wytwarzania kompozycji farmaceutycznej do leczenia i/lub zapobiegania chorobom autoimmunologicznym, przy czym choroba autoimmunologiczna oznacza autoimmunizację swoistą dla narządu, wybraną spośród stwardnienia rozsianego (MS), łuszczycy, reumatoidalnego zapalenia stawów, cukrzycy typu I lub tocznia układowego. 2. Zastosowanie według zastrzeŝenia 1, przy czym stosuje się co najmniej dwa szczepy probiotyczne do leczenia i/lub zapobiegania chorobie autoimmunologicznej. 3. Zastosowanie według zastrzeŝenia 2, przy czym, z załoŝenia, co najmniej dwa szczepy mają być podawane kolejno lub równocześnie.
15 5 10 15 20 25 30 4. Zastosowanie według któregokolwiek z zastrzeŝeń 1-3, przy czym kompozycja farmaceutyczna oznacza formulację ciekłą lub formulację stałą. 5. Zastosowanie według zastrzeŝenia 4, przy czym formulacja stała jest wybrana z grupy składającej się z tabletek, tabletek do ssania, słodyczy, tabletek do Ŝucia, gum do Ŝucia, kapsułek, saszetek, proszków, granulek, cząstek powlekanych i tabletek powlekanych, tabletek i kapsułek powlekanych dojelitowych, i rozpuszczających się pasków i błon. 6. Zastosowanie według zastrzeŝenia 4, przy czym formulacja ciekła jest wybrana z grupy składającej się z roztworów doustnych, zawiesin, emulsji i syropów. 7. Zastosowanie według któregokolwiek z zastrzeŝeń 1-6, przy czym kompozycja zawiera materiał nośnikowy. 8. Zastosowanie według któregokolwiek z zastrzeŝeń 1-6, przy czym kompozycja farmaceutyczna oznacza Ŝywność medyczną, suplement diety lub produkt odŝywczy. 9. Zastosowanie według zastrzeŝenia 7 albo 8, przy czym materiał nośnikowy jest niezaleŝnie wybrany z grupy składającej się ze skrobi opornej, błonnika pokarmowego, węglowodanów, białek i białek glikozylowanych. 10. Zastosowanie według któregokolwiek z zastrzeŝeń 1-9, przy czym kaŝdy ze szczepów jest obecny w kompozycji w ilości około 1x10 6 do około 1x10 14 CFU, korzystnie od około 1x10 8 do około 1x10 12 i bardziej korzystnie od około 1x10 9 do około 1x10 11. 11. Bakterie probiotyczne Lactobacillus wybrane z grupy składającej się z Lactobacillus plantarum 299, DSM 6595, Lactobacillus plantarum 299v, DSM 9843, Lactobacillus plantarum HEAL 9, DSM 15312, Lactobacillus plantarum HEAL 19, DSM 15313, i Lactobacillus plantarum HEAL 99, DSM 15316, Lactobacillus paracasei 8700:2, DSM 1 3434, i Lactobacillus paracasei 02A, DSM13432, do stosowania w leczeniu i/lub zapobieganiu chorobom autoimmunologicznym, przy czym choroba autoimmunologiczna oznacza swoistą dla narządu autoimmunizację wybraną spośród stwardnienia rozsianego (MS), łuszczycy, reumatoidalnego zapalenia stawów, cukrzycy typu I lub tocznia układowego. 12. Bakterie probiotyczne do stosowania według zastrzeŝenia 11, przy czym stosuje się co najmniej dwa szczepy probiotyczne do leczenia i/lub zapobiegania chorobie autoimmunologicznej. 13. Bakterie probiotyczne do stosowania według zastrzeŝenia 12, przy czym, z załoŝenia, co najmniej dwa szczepy mają być podawane kolejno lub równocześnie. Uprawniony: PROBI AB Pełnomocnik: mgr Katarzyna Rudnicka Rzecznik patentowy
16
17
18
19
20
21
22
23
24
25
26
27
28
29
30
31
32
33
34