(12) TŁUMACZENIE PATENTU EUROPEJSKIEGO (19) PL (11) PL/EP (96) Data i numer zgłoszenia patentu europejskiego:

Transkrypt

1 RZECZPOSPOLITA POLSKA (12) TŁUMACZENIE PATENTU EUROPEJSKIEGO (19) PL (11) PL/EP Urząd Patentowy Rzeczypospolitej Polskiej (96) Data i numer zgłoszenia patentu europejskiego: (97) O udzieleniu patentu europejskiego ogłoszono: Europejski Biuletyn Patentowy 2016/24 EP B1 (13) (51) T3 Int.Cl. A61K 35/74 ( ) A61P 31/12 ( ) C12N 1/20 ( ) C12R 1/225 ( ) C12R 1/25 ( ) A23C 9/123 ( ) A23L 2/52 ( ) A61K 35/747 ( ) A21D 2/26 ( ) A21D 8/04 ( ) A21D 13/00 ( ) (54) Tytuł wynalazku: ZASTOSOWANIE LACTOBACILLUS DO LECZENIA INFEKCJI WIRUSOWYCH (30) Pierwszeństwo: SE SE (43) Zgłoszenie ogłoszono: w Europejskim Biuletynie Patentowym nr 2008/32 (45) O złożeniu tłumaczenia patentu ogłoszono: Wiadomości Urzędu Patentowego 2016/12 (73) Uprawniony z patentu: PROBI AB, Lund, SE (72) Twórca(y) wynalazku: PL/EP T3 JAN ALENFALL, Lomma, SE ANNA BERGGREN, Flyinge, SE CAROLA RASK, Bunkeflostrand, SE AGNES WOLD, Göteborg, SE (74) Pełnomocnik: rzecz. pat. Małgorzata Kaczmarczyk SULIMA GRABOWSKA SIERZPUTOWSKA BIURO PATENTÓW I ZNAKÓW TOWAROWYCH SP.J. Skr. poczt Warszawa 10 Uwaga: W ciągu dziewięciu miesięcy od publikacji informacji o udzieleniu patentu europejskiego, każda osoba może wnieść do Europejskiego Urzędu Patentowego sprzeciw dotyczący udzielonego patentu europejskiego. Sprzeciw wnosi się w formie uzasadnionego na piśmie oświadczenia. Uważa się go za wniesiony dopiero z chwilą wniesienia opłaty za sprzeciw (Art. 99 (1) Konwencji o udzielaniu patentów europejskich).

2 SGS-8718/VAL EP B1 Opis Dziedzina wynalazku [0001] Niniejszy wynalazek dotyczy zastosowania co najmniej jednego szczepu bakterii probiotycznych wybranych spośród Lactobacillus do wytwarzania kompozycji farmaceutycznej do leczenia i/lub profilaktyki infekcji wirusowej. Stan techniki [0002] Bakterie probiotyczne definiuje się jako żywe mikroorganizmy, które gdy są podawane w odpowiednich ilościach, korzystnie wpływają na gospodarza. Pałeczki kwasu mlekowego i bifidobakterie są najczęściej stosowanymi bakteriami w produktach probiotycznych. Bakterie te są na ogół bezpieczne, tak jak i probiotyki na bazie tych organizmów. Brak patogenności rozciąga się na wszystkie grupy wiekowe i osobników z obniżoną odpornością. Wykazano, że przyjmowanie różnych bakterii probiotycznych ma korzyści kliniczne w różnych sytuacjach fizjologicznych lub patologicznych. Najwyraźniejsze działanie wykazano w przypadku biegunki powodowanej przez antybiotykoterapię lub infekcję rotawirusem. Istnieją również badania wykazujące pozytywne efekty kliniczne po przyjęciu bakterii probiotycznych w chorobach zapalnych jelit, atopowym zapaleniu skóry i hipercholesterolemii. Mechanizm, w jakim bakterie probiotyczne przyczyniają się do tych popraw klinicznych, nie jest jasny. Badania in vitro na ludziach, jak również na zwierzętach, zarówno in vivo, jak i in vitro, wykazały, że różne gatunki pałeczek kwasu mlekowego wpływają na wrodzoną i nabytą składową układu odpornościowego na wiele różnych sposobów. Badania kliniczne wykazały głównie pobudzanie wrodzonej, komórkowej składowej układu odpornościowego i wzmocnienie humoralnych odpowiedzi immunologicznych na naturalne infekcje i układową lub doustną immunizację. Odnośnie do wpływu na wrodzoną składową układu odpornościowego, opisano zwiększoną aktywność fagocytarną komórek wielojądrzastych (PMN) i zwiększoną aktywność komórek NK w zabijaniu komórek nowotworowych. Według naszej wiedzy, nie ma badań klinicznych wykazujących wpływ na swoistą, komórkową składową układu odpornościowego po przyjęciu bakterii probiotycznych. [0003] Według niniejszego wynalazku, dokładnie zbadano wpływ na wrodzoną i nabytą składową układu odpornościowego po codziennym przyjmowaniu pałeczek kwasu mlekowego lub bakterii Gram-ujemnych P. lundensis. Co ciekawe, zaobserwowano aktywację swoistej, komórkowej składowej układu odpornościowego u osobników otrzymujących L. plantarum i jej oznaki u osobników otrzymujących L. paracasei. Ponadto u osobników otrzymujących różne gatunki pałeczek kwasu mlekowego zaobserwowano wzmacniający odporność wpływ na wrodzoną składową układu odpornościowego, taki jak powiększanie populacji komórek NKT i zwiększoną aktywność fagocytarną. Przyjmowanie bakterii Gram-ujemnych P. lundensis nie miało żadnego wpływu na różne parametry odpornościowe mierzone według opisanych tu doświadczeń. [0004] Rozwój odporności na antybiotyki i niepowodzenia w różnych sposobach leczenia infekcji spowodowały zwiększone zainteresowanie probiotykami jako narzędziem alternatywnym. Może istnieć zapotrzebowanie na probiotyczny funkcjonalny produkt żywnościowy ukierunkowany na problem przeziębienia. Jest to oczywiste pod względem wysokiej liczby częstości występowania infekcji przeziębieniowych każdego roku. Zazwyczaj w ramach próby zmniejszenia częstości występowania przeziębienia przyjmuje się żywność o wysokich poziomach witaminy C. Na rynku jest wiele różnych produktów, co do których twierdzi się, że mają pewien wpływ na układ odpornościowy. [0005] Niniejsze zgłoszenie ma na celu zbadanie, czy probiotyczny funkcjonalny produkt żywnościowy po regularnym podawaniu może wpływać na objawy przeziębienia w po-

3 dobny sposób, a więc może być alternatywnym rozwiązaniem tego problemu w ogólnej społeczności. Streszczenie wynalazku [0006] Niniejszy wynalazek dostarcza zastosowanie co najmniej jednego szczepu bakterii probiotycznych, jak zastrzeżono w załączonych zastrzeżeniach. [0007] Niniejszy wynalazek dostarcza również szczep bakterii probiotycznych, jak zastrzeżono w załączonych zastrzeżeniach. Krótki opis figur [0008] Figura 1 przedstawia liczby ochotników zgłaszających jakiekolwiek niewielkie działania niepożądane ze strony układu pokarmowego podczas badania. Figura 2 przedstawia wyjściowe liczby (dzień 0) różnych limfocytów na ml krwi (średnia ± (błąd standardowy średniej (SEM))). Figura 3 przedstawia wyjściowe (dzień 0) odsetki lub GMFI (średnia ± (SEM)) limfocytów dodatnich pod kątem różnych markerów aktywacji komórek i pamięci. Figura 4. Osobników losowo przypisano do dziewięciu różnych grup badania. Badanie rozpoczęto od okresu wypłukiwania trwającego dwa tygodnie. Potem następował okres aktywnego badania. Podczas tego okresu osobnicy spożywali jedną dawkę badanego produktu na dobę przez 14 (grupy L. plantarum Heal 19, L. fermentum, L. paracasei, L. gasseri, L. rhamnosus, P. lundensis) lub 35 dni (grupa L. plantarum 299v i placebo). Każda dawka zawierała jednostek tworzących kolonie (CFU) (grupy pałeczek kwasu mlekowego) lub 10 9 CFU bakterii (grupa P. lundensis). Figura 5. Odsetki limfocytów eksprymujących fenotypy aktywacyjne CD8CD25, CD8HLA-DR, CD4CD25 i CD4HLA-DR analizowano za pomocą cytometrii przepływowej. Przedstawiono średnie dla grup (±SEM) na podstawie osobniczych stosunków, dzień 14/dzień 0 i dzień 35/dzień 0 (jedynie dla grupy L. plantarum i placebo). Figura 6. Odsetki limfocytów eksprymujących fenotypy pamięci CD8CD45RO i CD4CD45RO analizowano za pomocą cytometrii przepływowej. Przedstawiono średnie dla grup (±SEM) na podstawie osobniczych stosunków, dzień 14/dzień 0 i dzień 35/dzień 0 (jedynie dla grupy L. plantarum i placebo). Figura 7. Odsetki limfocytów dodatnich pod kątem markerów komórek NKT (CD56CD16CD3) analizowano za pomocą cytometrii przepływowej. Obliczenia dla grup opierają się na osobniczych stosunkach (dzień 14/dzień 0). Figura 8. Aktywność fagocytarną neutrofilów analizowano przez inkubację komórek krwi pełnej z E. coli lub S. aureus znakowanymi FITC. Stosunek między średnimi wartościami fluorescencji uzyskanymi w dniu 14 i dniu 0 określono pojedynczo i na tej figurze przedstawiono obliczenia dla grup. Figura 9 przedstawia stosunek limfocytów eksprymujących fenotypy aktywacji CD4CD25 z doświadczenia 2. Figura 10 przedstawia stosunek limfocytów eksprymujących fenotypy aktywacji CD4 + CD25 ++ z doświadczenia 2. Figura 11 przedstawia stosunek limfocytów eksprymujących fenotypy aktywacji CD8 + HLA-DR + z doświadczenia 2. Figura 12 przedstawia stosunek limfocytów eksprymujących fenotypy aktywacji CD8 + CD25 + z doświadczenia 2. Figura 13 przedstawia stosunek limfocytów eksprymujących fenotypy aktywacji CD4CD45RO z doświadczenia 2. Szczegółowy opis wynalazku [0009] Lactobacillus stosowane zgodnie z wynalazkiem są wybrane z grupy obejmującej Lactobacillus plantarum 299, DSM 6595, Lactobacillus plantarum 299v, DSM 9843, Lactobacillus plantarum HEAL 9, DSM 15312, Lactobacillus plantarum HEAL 19, DSM

4 , Lactobacillus plantarum HEAL 99, DSM 15316, Lactobacillus paracasei 8700:2, DSM i Lactobacillus paracasei 02A, DSM [0010] W pewnej postaci wynalazku w kompozycji farmaceutycznej stosuje się co najmniej dwa szczepy bakterii probiotycznych. W zamierzeniu wspomniane co najmniej dwa szczepy podaje się kolejno lub równocześnie. Zatem, szczepy można podawać w mieszaninie w jednej kompozycji lub można je podawać w pewnej kolejności oddzielnie w różnych kompozycjach. [0011] Według wynalazku możliwe jest leczenie infekcji wirusowych wybranych z grupy obejmującej wirusa przeziębienia, rinowirusa, adenowirusa, wirusa paragrypy, syncytialnego wirusa oddechowego, enterowirusa i koronawirusa. [0012] W niniejszym kontekście określenie leczenie i/lub profilaktyka obejmuje profilaktyczne leczenie osobnika, tj. leczenie bakteriami probiotycznymi rozpoczyna się przed rozwinięciem się choroby lub infekcji wirusowej, aby zapobiec chorobie/infekcji, jak również leczenie choroby/infekcji, która już rozwinęła się u osobnika. W ostatnim przypadku na przykład oczekuje się złagodzenia objawów lub wzmacnia się ogólny stan pacjenta, lub pacjent szybciej zostaje wyleczony z choroby/infekcji. I tak, osobnikiem może być osoba narażona na ryzyko rozwinięcia się infekcji lub nie, lub u pacjenta infekcja już się rozwinęła. [0013] W pewnej postaci wynalazku każdy ze wspomnianego(-ych) szczepu(-ów) jest obecny w kompozycji farmaceutycznej w ilości wynoszącej, lecz nie wyłącznie, od około 1x10 6 do około 1x10 14 CFU, korzystnie od około 1x10 8 do około 1x10 12, a korzystniej od około 1x10 9 do około 1x [0014] Kompozycję farmaceutyczną według wynalazku może stanowić np. ciekły preparat lub stały preparat. [0015] Gdy kompozycję farmaceutyczną stanowi stały preparat, może być on sformułowany w postaci tabletki, tabletki do ssania, cukierka, tabletki do rozgryzania i żucia, gumy do żucia, kapsułki, saszetki, proszku, granulki, powlekanej cząstki, powlekanej tabletki, tabletki z powłoczką dojelitową, kapsułki z powłoczką dojelitową, topliwego paska lub lamelki. [0016] Gdy kompozycję farmaceutyczną stanowi ciekły preparat, może być on sformułowany w postaci roztworu doustnego, zawiesiny, emulsji lub syropu. Wspomniana kompozycja może ponadto zawierać materiał nośnikowy niezależnie wybrany z, lecz nie wyłącznie, grupy obejmującej kleik owsiany, żywność poddaną fermentacji kwasu mlekowego, oporną skrobię, błonniki pokarmowe, węglowodany, białka i glikozylowane białka. [0017] W pewnej postaci wynalazku wspomnianą kompozycję farmaceutyczną stanowi żywność medyczna, żywność funkcjonalna, suplement diety, produkt odżywczy lub preparat żywnościowy. [0018] Kompozycja farmaceutyczna według wynalazku, stosowana zgodnie z wynalazkiem lub wytwarzana zgodnie z wynalazkiem, może również zawierać inne substancje, takie jak obojętne podłoże lub farmaceutycznie dopuszczalne środki pomocnicze, nośniki, środki konserwujące itd., które są dobrze znane specjalistom w dziedzinie. [0019] Określenie kompozycja farmaceutyczna niekoniecznie musi oznaczać kompozycję farmaceutyczną w jej normalnym znaczeniu, lecz można ją formułować jako kompozycję żywnościową, suplement diety, żywność funkcjonalną, żywność medyczną lub produkt odżywczy, dopóki osiąga się wymagany efekt, tj. leczenie lub profilaktykę infekcji wirusowych. Wspomnianą kompozycję żywnościową można wybrać z grupy obejmującej napoje, jogurty, soki, lody, pieczywo, herbatniki, płatki, zdrowe batoniki, produkty do smarowania i produkty odżywcze. Kompozycja żywnościowa może ponadto zawierać materiał nośnikowy, przy czym wspomniany materiał nośnikowy jest wybrany z grupy obejmującej kleik owsiany, żywność poddaną fermentacji kwasu mlekowego, oporną skrobię, błonniki pokarmowe, węglowodany, białka i glikozylowane białka.

5 [0020] Zatem, zastosowanie kompozycji według wynalazku może być bardzo korzystne w takim sensie, że jest użyteczne profilaktycznie, tj. przed rozwinięciem się infekcji wirusowej. Ponieważ stosowaną kompozycję farmaceutyczną niekoniecznie stanowi kompozycja farmaceutyczna w jej normalnym znaczeniu, lecz może być to również suplement diety lub żywność funkcjonalna, profilaktyczne przyjmowanie kompozycji według wynalazku jest bardzo wygodne dla normalnego zdrowego osobnika. Przykłady Przykład 1 Osobnicy i kryteria badania [0021] Do tego badania prowadzonego metodą ślepej próby i z kontrolą przy użyciu placebo wybrano pięćdziesięciu siedmiu widocznie zdrowych ochotników w przedziale wiekowym lat (mediana 26 lat). Osobników losowo przypisano do ośmiu grup, otrzymujących jedną z następujących bakterii Gram-dodatnich, L. plantarum 299v (n=7), L. plantarum Heal 19 (n=7), L. fermentum 35D (n=7), L. paracasei 8700:2 (n=7), L. gasseri VPG44 (n=7), L. rhamnosus 271 (n=7), lub bakterii Gram-ujemnych, P. lundensis (n=7) lub placebo (n=10). Dawka bakterii wynosiła bakterii/dobę dla pałeczek kwasu mlekowego i 10 9 bakterii/dobę dla P. lundensis. Grupa kontrolna przyjmowała odtłuszczone mleko w proszku (1 g). W zależności od grupy, okres trwania badania wynosił 6 lub 9 tygodni, na co składał się dwutygodniowy okres wypłukiwania, 2 lub 5 tygodni okresu aktywnego badania i 2 tygodnie okresu obserwacji (Fig. 4). Każdemu osobnikowi dostarczono wykaz produktów zawierających produkty probiotyczne, których nie powinien spożywać podczas całego okresu badania. Od osobników pobierano próbki krwi obwodowej przez nakłucie żyły w dwóch lub trzech punktach czasowych, w dniu 0, dniu 14 i dniu 35. Podczas badania prowadzono dziennik, w którym każdy osobnik zapisywał działania niepożądane, stan zdrowia i potwierdzone przyjęcie badanego produktu. Cytometria przepływowa [0022] Analizę fenotypową limfocytów w krwi pełnej przeprowadzono za pomocą cytometrii przepływowej. Następujące przeciwludzkie przeciwciała monoklonalne zastosowano jako markery powierzchniowe dla różnych populacji komórek: CD3 FITC (SK7), CD4 APC (SK3), CD8 PerCP (SKI), CD19 PerCP (SJ25C1), CD56 PE (MY31), CD16 PE (B73.1) i CD5 FITC (L17F12). Następujące przeciwludzkie przeciwciała monoklonalne zastosowano do wykrywania różnych markerów aktywacji i pamięci: CD25 FITC (2A3), HLA-DR PE (L243), CD45RO PE (UCHL-1), CD38 PE (HB7), CD27 PE (L128) i CD11b PE (D12). Wszystkie przeciwciała zakupiono od Becton-Dickinson (Erembodegum, Belgia). Krew pełną (100 µl) inkubowano z przeciwciałami (10 µl/przeciwciało) przez 30 min w temperaturze 4 C w ciemności. Następnie dodano 2 ml roztworu do lizy FACS (Becton- Dickinson) i inkubowano przez 15 min w temperaturze 20 C w ciemności. Komórki przemyto przez dodanie 3 ml FACSFlow i wirowano przy 300 x g przez 5 min. Przemyte komórki ponownie przeprowadzono w zawiesinę w 200 µl FACSFlow i analizowano na FacsCalibur (Becton-Dickinson) za pomocą oprogramowania CellQuest. Test fagocytozy [0023] Aktywność fagocytarną granulocytów i monocytów oznaczono ilościowo za pomocą PHAGOTEST (Orpegen Pharma, Heidelberg, Niemcy) według instrukcji producenta z pewnymi modyfikacjami. W skrócie, 20 x10 6 E. coli znakowanych FITC lub S. aureus znakowanych FITC dodano do wcześniej ochłodzonej krwi pełnej (100 µl). Komórki krwi i bakterie inkubowano w 37 C przez 10 FacsCalibur za pomocą oprogramowania CellQuest. Obliczenia [0024] Osobnicze zmiany w zakresie różnych parametrów odpornościowych określono przez obliczenie stosunku między osobniczymi wartościami uzyskanymi w dniu 14 i dniu 0 lub wartościami w dniu 35 i dniu 0. Stosunki te zastosowano do wszystkich obliczeń dla grup i statystyk.

6 Statystyki [0025] Wszystkie analizy statystyczne przeprowadzono z zastosowaniem Stat-view. Do porównania różnych grup zastosowano test U Manna-Whitneya. Wyniki Obserwacje kliniczne [0026] Pięćdziesięciu czterech z pięćdziesięciu siedmiu ochotników ukończyło badanie. Dwie osoby wykluczono ze względu na infekcję i leczenie antybiotykiem (jedną w grupie placebo i jedną w grupie otrzymującej P. lundensis). Jedną osobę wykluczono w dniu 16 ze względu na ciążę (grupa placebo). Odnotowano jedynie łagodne niepożądane działania uboczne ze strony układu pokarmowego po przyjęciu badanych produktów (Fig. 1). Przyjmowanie pałeczek kwasu mlekowego aktywuje komórki T [0027] Istniały duże wyjściowe różnice osobnicze (dzień 0) odnośnie markerów aktywacji komórek T CD4 + i CD8 +. Wyjściowe odsetki komórek eksprymujących różne markery powierzchniowe komórek przedstawiono na Fig. 2. Nie zaobserwowano żadnych istotnych różnic między różnymi grupami w tym punkcie czasowym. Ponieważ zaobserwowano ogromne różnice międzyosobnicze, wybrano porównanie wartości stosunków dnia 14 i dnia 35 w porównaniu z dniem 0 dla każdego osobnika. Wszystkie obliczenia i porównania wykonano na tych wartościach stosunków (dzień 14/dzień 0 i dzień 35/dzień 0). Po 14 dniach przyjmowania badanego produktu zawierającego L. plantarum 299v nastąpiło w przybliżeniu dwukrotne zwiększenie ekspresji markera aktywacji CD25 na komórkach T CD8 + (p=0,01) (fig. 5). Wystąpiła również silna, chociaż nie istotna (p=0,12), oznaka zwiększenia poziomu HLA-DR na komórkach CD8 + po przyjęciu L. plantarum 299v. Dodatkowo, zaobserwowano tendencję w kierunku aktywacji komórek T CD4+ po przyjęciu L. plantarum 299v. Przyjmowanie innych gatunków pałeczek kwasu mlekowego włączonych do tego badania, jak również bakterii Gram-ujemnych P. lundensis nie aktywowało ani komórek T CD8 +, ani CD4 +. Jednak wystąpiła taka tendencja, że przyjmowanie L. paracasei zwiększyło ekspresję HLA-DR na komórkach T CD4 + (P=0,18). Przyjmowanie pałeczek kwasu mlekowego powoduje fenotyp pamięci komórek T CD4+ [0028] Średnie geometryczne intensywności fluorescencji (GMFI) ekspresji CD45RO na komórkach T CD4+ i CD8+ porównano między grupami otrzymującymi różne badane produkty. Jak powyżej, obliczenia dla grup na podstawie osobniczych wartości stosunków (dzień 14/dzień 0 i dzień 35/dzień 0) zastosowano dla porównań. Po 35 dniach przyjmowania badanego produktu zawierającego L. plantarum 299v, GMFI dla CD45RO na komórkach T CD4+ zwiększyła się istotnie (p=0,03). Wystąpiła również tendencja w kierunku zwiększonej ekspresji CD45RO na komórkach T CD8+ po przyjęciu L. plantarum (Fig. 6). Ponadto, wydaje się że przyjmowanie L. paracasei ma pozytywny wpływ na zwiększenie poziomu CD45RO na komórkach T CD8+ (p=0,10) (Fig. 6). Wpływ na różne populacje komórek po przyjęciu badanego produktu [0029] Po przyjęciu L. pararcasei zwiększał się odsetek limfocytów identyfikowanych jako komórki NKT (P=0,06) (Fig. 7). Względnego zwiększenia/zmniejszenia w porównaniu z dniem 0 nie można było wykryć pod względem innych populacji komórek, takich jak komórki T CD4+, komórki T CD8+, komórki B, komórki B-1 (CD19+CD5+), komórki NK, granulocyty i monocyty. Aktywność fagocytarna [0030] Granulocyty i monocyty zidentyfikowano na wykresie FSC-SSC. Badano zdolność tych komórek do fagocytozy znakowanych FITC bakterii Gram-dodatnich lub Gramujemnych. Jak przedstawiono na fig. 8, granulocyty od ochotników, którym podawano L. plantarum 299v (p=0,064), L. plantarum Heal 19 (p=0,064), L. fermentum (p=0,064) lub L. paracasei (p=0,05) były bardziej wydajne pod względem fagocytozy bakterii Gramujemnych E. coli niż granulocyty od ochotników leczonych placebo. Jednak nie było różnicy między grupami pod względem fagocytozy bakterii Gram-dodatniej S. aureus. Nie

7 można było wykryć żadnych różnic w aktywności fagocytarnej monocytów (dane nieprzedstawione). Omówienie [0031] Podstawowym zadaniem układu odpornościowego jest szybkie i gwałtowne reagowanie na mikroorganizmy, tym samym zapobiegając infekcjom i lecząc je. W zabijaniu mikroorganizmów uczestniczą potężne mechanizmy, które szkodzą również naszym własnym tkankom. Zatem konieczne jest, aby nie reagowały one na nasze własne tkanki, ani na nieszkodliwe substancje obecne w środowisku. Zatem układ odpornościowy wykształca i utrzymuje tolerancję zarówno na składniki naszego własnego organizmu, jak i na żywność i wdychane białka. Jeśli to się nie udaje, mogą rozwinąć się liczne choroby. Środki do wykształcenia swoistej tolerancji immunologicznej są zasadniczym zadaniem układu odpornościowego. [0032] Główną rolę we wszystkich reakcjach immunologicznych odgrywa komórka T pomocnicza. Gdy komórka T pomocnicza zostanie aktywowana przez jej swoisty antygen, staje się aktywna, dzieli się, dojrzewa i wytwarza szereg cytokin, które kierują działaniem innych typów komórek w układzie odpornościowym, takich jak cytotoksyczne komórki T i komórki B. Aktywacja komórek T pomocniczych jest konieczna, aby wywołać większość typów reakcji immunologicznych, w tym wytwarzanie przeciwciał. Przeciwnie, jeśli zapobiega się aktywacji komórek T pomocniczych, większość typów reakcji immunologicznych jest sparaliżowana. [0033] Istnieje kilka mechanizmów, które zapewniają aktywację komórek T pomocniczych i utrzymanie tolerancji. Jednym mechanizmem jest usunięcie z grasicy komórek T o zdolności do rozpoznawania i reagowania na własną tkankę. Jednak, usunięcie to nie jest całkowite, a ponadto musimy również wykształcić swoistą tolerancję immunologiczną na egzogenne antygeny. W przeciwnym razie reagowalibyśmy gwałtownie na wszystkie typy wdychanych i połykanych substancji, co prowadziłoby do silnego stanu zapalnego i zmarnowanych zasobów odpornościowych. [0034] Typem komórki, który jest kluczowy dla utrzymania tolerancji, jest komórka T regulatorowa. Ten typ komórek można rozpoznać za pomocą pewnych markerów, takich jak powierzchniowa ekspresja CD4 i CD25, obecność wewnątrzkomórkowego CTLA-4 i transkrypcja białka jądrowego Foxp3. Komórki T regulatorowe są zdolne do zapobiegania aktywacji innych komórek T, gdy napotykają nieszkodliwe substancje, a zatem zapobiegania wszystkim typom niepożądanych reakcji immunologicznych. [0035] W niniejszym kontekście, symbol + w połączeniu z pewnym markerem, tak jak CD4+ i CD25+, oznacza, że marker ulega ekspresji na komórce T. Przykładowo komórkami T CD4+CD25+ są komórki T eksprymujące na swojej powierzchni zarówno marker CD4, jak i marker CD25. Jednak nie mówi to nic o ilości markera, który ulega ekspresji, a jedynie że jest obecny. W niniejszym kontekście, symbol ++ w połączeniu z markerem, tak jak CD4++ i CD25++, oznacza, że marker ulega ekspresji w dużej ilości. Komórki T regulatorowe są tymi komórkami z dużą ilością CD25 na powierzchni, tj. komórkami CD4+CD25++. Z drugiej strony, komórki T CD4+CD25+ są jednie aktywowanymi komórkami T. Czasami nie stosuje się specyficznych symboli + i ++, np. tylko CD4CD25, i oznacza to, że komórki są aktywowane, tak jak komórki CD4+CD25+. Zatem, CD4CD25 oznacza to samo co CD4+CD25+. Gdy mowa o komórkach T regulatorowych, zawsze stosuje się zapis komórki CD4+CD25++. [0036] To badanie prowadzone metodą ślepej próby i z kontrolą przy użyciu placebo jest wyjątkowe pod tym względem, że jest pierwszym badaniem porównującym wpływ kilku parametrów odpornościowych po przyjmowaniu różnych Gram-dodatnich pałeczek kwasu mlekowego lub bakterii Gram-ujemnych P. lundensis. Co ciekawe, przyjmowanie P. lundensis nie wpłynęło na żaden z mierzonych parametrów. Z kolei przyjmowanie pałeczek kwasu mlekowego wpłynęło na różne składniki zarówno swoistej, jak i wrodzonej składowej układu odpornościowego. Nowym odkryciem w tym badaniu było to, że przyjmowa-

8 nie L. plantarum miało wyraźny pozytywny wpływ na aktywację i indukcję komórek pamięci w populacjach komórek T. Wystąpiło istotne zwiększenie poziomu łańcucha α receptora IL-2 (CD25) i silna tendencja w kierunku zwiększenia poziomu HLA-DR na cytotoksycznych komórkach T. Tendencję w kierunku zwiększenia poziomu tych markerów aktywacji zaobserwowano również na komórkach T pomocniczych po przyjmowaniu L. plantarum. Ekspresja markerów aktywacji wskazuje, że komórki T rozpoczęły proliferację w odpowiedzi na bodźce swoiste antygenowo lub nieswoiste i że komórki te łatwiej pełnią swoje funkcje efektorowe w porównaniu ze spoczynkowymi komórkami T. W mechanizmach odpowiedzialnych za aktywację komórek T indukowaną L. plantarum mogą brać udział komórki prezentujące antygen, które są aktywowane przez receptory toll-podobne wiążące się ze związkami z mikroorganizmów. Aktywacja komórek prezentujących antygen czyni je skuteczniejszymi w prezentowaniu antygenu komórkom T. Dodatkowo, zarówno komórki T pomocnicze, jak i cytotoksyczne wykazują różne poziomy ekspresji receptorów toll-podobnych, które prawdopodobnie sprawiają, że te komórki są wrażliwe na nieswoistą aktywację przez składniki i produkty mikrobiologiczne. [0037] Analogicznie do kompartmentu komórek T pomocniczych, wydaje się, że ekspresja CD25RO zaznacza populację pamięci również wśród komórek T cytotoksycznych. Stwierdzono istotne zwiększenie w ekspresji tego markera komórki pamięci na komórkach T pomocniczych i tendencję w kierunku zwiększenia poziomu na cytotoksycznych komórkach T po 35 dniach przyjmowania L. plantarum. Dodatkowo, przyjmowanie L. paracasei również wykazało tendencję w kierunku zwiększenia poziomu CD45RO na cytotoksycznych komórkach T. Względem naiwnych komórek T, komórki T CD45RO+ mogą wydzielać szerokie spektrum cytokin. Ponadto, komórki T CD45RO+ mogą proliferować i wytwarzać IL-2, gdy kompleks CD3-TCR ulega stymulacji w warunkach suboptymalnych, podczas gdy naiwne komórki T wymagają silnego bodźca CD3-TCR, aby pełnić te funkcje. Tworzenie komórek T pamięci jest ważne dla wywołania skutecznej odpowiedzi immunologicznej po infekcji i szczepieniu. [0038] Przyjmowanie bakterii probiotycznych wpływa również na wrodzoną, komórkową składową układu odpornościowego. Wykazano, że populacja komórek T natural killer (NKT) powiększyła się po przyjęciu L. paracasei. Komórki NKT stanowią subpopulację limfocytów, która koeksprymuje marker komórek NK CD56 i kompleks marker komórek T CD3-receptor komórek T. Badania zarówno na ludziach, jak i na myszach wykazały, że komórki NKT odgrywają główną rolę w regulacji chorób autoimmunologicznych, takich jak stwardnienie rozsiane, cukrzyca typu I i toczeń układowy. Komórki NKT pełnią również funkcje efektorowe przeciwko komórkom nowotworowym i zakażonym wirusem. Zatem, komórki NKT są plejotropowe pod względem swej funkcji. Inne badania kliniczne oceniające skutki immunologiczne bakterii probiotycznych wykazały, że przyjmowanie L. rhamnosus HN001 i Bifidobacterium lactis HN019 wzmacnia aktywność komórek NK (w tym NKT) zabijania komórek nowotworowych, komórek K562. W badaniu tym potwierdzono również obserwację innych, że aktywność fagocytarna komórek wielojądrzastych zwiększa się po przyjmowaniu różnych pałeczek kwasu mlekowego. Konsekwencją obserwowanego wpływu na różne parametry immunologiczne w niniejszym badaniu jest to, że można spekulować, że równoczesna aktywacja komórek T cytotoksycznych i namnożenie komórek NKT wskazuje na wzmocnioną obronę immunologiczną przed infekcjami wirusowymi i/lub nowotworami. Odkrycie in vitro, że pałeczki kwasu mlekowego indukują komórki jednojądrzaste do wydzielania IL-12 i IL-18, stanowi poparcie dla teorii, że przyjmowanie tych bakterii stymuluje aktywność komórkową. [0039] Zgodnie z niniejszym wynalazkiem, wywnioskowano się, że przyjmowanie L. plantarum i L. paracasei ma silny wpływ na swoistą i wrodzoną, komórkową składową układu odpornościowego. Jednak, zwiększenie w funkcji odpornościowej tu wykazane trudno obecnie skorelować z udowodnioną korzyścią zdrowotną u ludzi. Aby zająć się tą specyficzną kwestią, należy wykonać dalsze badania kliniczne u osobników cierpiących, np. na

9 infekcje wirusowe lub nowotwory. W takich badaniach przedmiotem szczególnego zainteresowania byłoby porównanie wpływu podawania L. plantarum i L. paracasei oddzielnie lub w połączeniu. Przykład 2 [0040] Celem tego przykładu było zbadanie wpływu na układ odpornościowy przez podawanie tego samego gatunku pałeczek kwasu mlekowego przez dłuższy okres w porównaniu z kilkoma pałeczkami kwasu mlekowego (różne gatunki) podawanymi w pewnej kolejności jeden po drugim. [0041] Ochotnikom podawano proszek z liofilizowanymi bakteriami przez 14 lub 35 dni. Jako bakterie Gram-dodatnie stosuje się bakterie probiotyczne Lactobacillus plantarum 299v samodzielnie lub w połączeniu z L. rhamnosus, L. fermentum, L. paracasei i L. gasseri. Jako bakterie Gram-ujemne podaje się Psedomonas lundensis. [0042] Badano następujące grupy. 1) Lactobacillus plantarum 35 dni 2) L. plantarum 7 dni, L. rhamnosus 7 dni, L. fermentum 7 dni, L paracasei 7 dni, L. gasseri 7 dni. Łącznie 35 dni. (Sekwencja) 3) Mieszanina L. plantarum, L. rhamnosus, L. fermentum, L. paracasei, L. gasseri. Łącznie 14 dni 4) L. rhamnosus 14 dni 5) L. fermentum 14 dni 6) L. paracasei 14 dni 7) L. gasseri 14 dni 8) Pseudomonas lundensis 14 dni Grupa kontrolna 1) placebo 35 dni Grupa kontrolna 2) placebo 14 dni [0043] Próbki krwi pobierano w dniu 0, 14 i 35. Ilość komórek T pomocniczych (CD4+) eksprymujących wysokie ilości CD25 zdefiniowano w każdej grupie za pomocą cytometrii przepływowej, jak wyjaśniono powyżej w doświadczeniu 1. Wyniki [0044] W dniu 14 wystąpiła graniczna istotność namnażania się komórek T CD4+CD25++ u osobników spożywających sekwencję pięciu różnych szczepów pałeczek kwasu mlekowego. Omówienie [0045] Wykazano, że komórki T pomocnicze (CD4+) eksprymujące cząsteczkę CD25 z wysoką gęstością (CD4+CD25++) są ważne dla ochrony przed chorobami autoimmunologicznymi, alergiami i chorobami zapalnymi jelit. Stwierdzenie, że komórki te namnażają się po przyjmowaniu sekwencji różnych pałeczek kwasu mlekowego wskazuje, że przyjmowanie tych bakterii może być korzystne dla osobnika, którego dotyczy ryzyko rozwinięcia powyżej wspomnianych chorób. Doświadczenie 3 [0046] Celem niniejszego badania jest zbadanie, czy przyjmowanie bakterii kwasu mlekowego w preparacie liofilizowanym/funkcjonalnym produkcie żywnościowym podczas co najmniej 3 miesięcy wpływa na nasilenie objawów oraz częstość występowania oraz czas trwania przeziębienia. [0047] Ważne jest, aby przeprowadzać je in vivo u ludzi, ponieważ ani badania in vitro, ani badania na zwierzętach nie odzwierciedlą stopnia skuteczności w przypadku podawania ludziom. Zdolność tych bakterii do osiedlenia w jelicie, gdy podaje się je bezpośrednio po hodowli, udokumentowano we wcześniejszych badaniach. [0048] Zatem, celem jest badanie, czy spożywanie mieszaniny Lactobacillus plantarum 299v (DSM 9843) i Lactobacillus paracasei 8700:2 (DSM 13434) (1x10 9 cfu/dobę) może zmniejszyć ryzyko przeziębienia.

10 [0049] Badanie będzie odbywało się przez 90 dni i w badaniu weźmie udział 500 osobników. 250 osobników otrzyma aktywny produkt, a 250 osobnikom będzie podane placebo. [0050] Badanie będzie randomizowane, prowadzone metodą podwójnie ślepej próby i z kontrolą przy użyciu placebo, z dwoma równoległymi ramionami. [0051] Kryteria wykluczenia są następujące: Znana nietolerancja lub alergia na którykolwiek składnik zawarty w preparatach; alergia leczona farmakologicznie; obecne leczenie na ciężkie zaburzenia układu pokarmowego; ciąża lub laktacja; szczepienie przeciw grypie w ciągu ostatnich 12 miesięcy; i palacze. [0052] Podawane probiotyki: Liofilizowane Lactobacillus plantarum 299v i Lactobacillus paracasei 8700; 2. Jako krioprotektanty dodaje się sacharozę, maltodekstrynę i hydrolizowaną żelatynę. Dawkowanie będzie polegało na codziennym przyjmowaniu 1 g liofilizowanych pałeczek kwasu mlekowego (w przybliżeniu 1x10 9 cfu/dobę). Dawka będzie przyjmowana ze śniadaniem. [0053] Produkty będą wytwarzane, pakowane i znakowane przez Probi AB, Lund, Szwecja. Jakość produktu również sprawdzi Probi AB. Każda saszetka będzie oznakowana nazwą badania, terminem ważności, sposobem przechowywania, nazwą producenta, nazwiskiem odpowiedzialnego badacza i jej/jego numerem telefonu. Oprócz powyższych informacji, na drugim opakowaniu dodana będzie liczba oznaczająca osobnika. Do drugiego opakowania będzie włożona szczegółowa instrukcja dotycząca rozpuszczania i przyjmowania. Produkt zostanie dostarczony w saszetkach. [0054] Od dnia -14 do dnia 104 osobnik nie może przyjmować produktów zawierających bakterie probiotyczne. Osobnikowi będzie dostarczony wykaz produktów probiotycznych, których spożywania nie zezwala się podczas okresu badania. [0055] Próbki kału mają być oddane w dniu 1 (przed przyjęciem badanego produktu), 15 (po przyjęciu) i 104 (po przyjęciu). Próbki powinno pobierać się do dwóch probówek nie więcej niż 18 godzin przed przekazaniem do analizy i podczas tego okresu przechowuje się je w lodówce. Próbki będą analizowane pod kątem pałeczek kwasu mlekowego. [0056] Próbki krwi mają być pobierane w dniu 1 i 15. Próbki będą analizowane pod kątem CD4+ i CD8+. [0057] W świetle doświadczeń 1 i 2 oczekuje się, że wzmocniona ochrona przeciwko przeziębieniu będzie widoczna u osobników przyjmujących mieszaninę probiotyczną w porównaniu z grupą placebo. Zastrzeżenia patentowe Zastosowanie co najmniej jednego szczepu bakterii probiotycznych Lactobacillus wybranego z grupy obejmującej Lactobacillus plantarum 299, DSM 6595, Lactobacillus plantarum 299v, DSM 9843, Lactobacillus plantarum HEAL 9, DSM 15312, Lactobacillus plantarum HEAL 19, DSM 15313, Lactobacillus plantarum HEAL 99, DSM 15316, Lactobacillus paracasei 8700:2, DSM i Lactobacillus paracasei 02A, DSM do wytwarzania kompozycji farmaceutycznej do leczenia i/lub profilaktyki infekcji wirusowej wybranej z grupy obejmującej wirusa przeziębienia, rinowirusa, adenowirsa, wirusa paragrypy, syncytialnego wirusa oddechowego, enterowirusa i koronawirusa. 2. Zastosowanie według zastrzeżenia 1, w którym stosuje się co najmniej dwa szczepy bakterii probiotycznych. 3. Zastosowanie według zastrzeżenia 2, w którym wspomniane co najmniej dwa szczepy podaje się kolejno lub równocześnie. 4. Zastosowanie według któregokolwiek z zastrzeżeń 1-3, przy czym wspomnianą kompozycję farmaceutyczną stanowi ciekły preparat lub stały preparat. 5. Zastosowanie według zastrzeżenia 4, przy czym stały preparat jest wybrany z grupy obejmującej tabletki, tabletki do ssania, cukierki, tabletki do rozgryzania i żucia, gumy

11 do żucia, kapsułki, saszetki, proszki, granulki, cząstki powlekane i tabletki powlekane, tabletki i kapsułki z powłoczką dojelitową i topliwe paski i lamelki. 6. Zastosowanie według zastrzeżenia 4, przy czym wspomniany ciekły preparat wybrano z grupy obejmującej roztwory doustne, zawiesiny, emulsje i syropy. 7. Zastosowanie według któregokolwiek z zastrzeżeń 1-4, przy czym wspomniana kompozycja farmaceutyczna zawiera materiał nośnikowy. 8. Zastosowanie według któregokolwiek z zastrzeżeń 1-4, przy czym wspomnianą kompozycję farmaceutyczną stanowi żywność medyczna, żywność funkcjonalna, suplement diety, produkt odżywczy lub preparat żywnościowy. 9. Zastosowanie według zastrzeżenia 7, przy czym wspomniany materiał nośnikowy jest niezależnie wybrany z grupy obejmującej skrobię oporną, błonniki pokarmowe, węglowodany, białka i glikozylowane białka. 10. Zastosowanie według zastrzeżenia 8, przy czym wspomniany preparat żywnościowy jest wybrany z grupy obejmującej napoje, jogurty, soki, lody, pieczywo, herbatniki, płatki, zdrowe batoniki i produkty do smarowania. 11. Zastosowanie według któregokolwiek z zastrzeżeń 1-10, przy czym każdy szczep jest obecny w kompozycji w ilości wynoszącej od 1x10 6 do 1x10 14 CFU, korzystnie od 1x10 8 do 1 x 10 12, a korzystniej od 1 x10 9 do 1 x Szczep bakterii probiotycznych Lactobacillus wybrany z grupy obejmującej Lactobacillus plantarum 299, DSM 6595, Lactobacillus plantarum 299v, DSM 9843, Lactobacillus plantarum HEAL 9, DSM 15312, Lactobacillus plantarum HEAL 19, DSM 15313, Lactobacillus plantarum HEAL 99, DSM 15316, Lactobacillus paracasei 8700:2, DSM i Lactobacillus paracasei 02A, DSM do zastosowania w leczeniu i/lub profilaktyce infekcji wirusowej wybranej z grupy obejmującej wirusa przeziębienia, rinowirusa, adenowirusa, wirusa paragrypy, syncytialnego wirusa oddechowego, enterowirusa i koronawirusa. 13. Szczep do zastosowania według zastrzeżenia 12, przy czym stosuje się co najmniej dwa szczepy bakterii probiotycznych. 14. Szczep do zastosowania według zastrzeżenia 13, przy czym wspomniane co najmniej dwa szczepy podaje się kolejno lub równocześnie. Uprawniony: PROBI AB Pełnomocnik: mgr inż. Małgorzata Kaczmarczyk Rzecznik patentowy

12 11

13 12

14 13

15 14

16 15

17 16

18 17

19 18

20 19

21 20

22 21

23 22

24 23