diagnostyka laboratoryjna Journal of Laboratory Diagnostics 2009 Volume 45 Number 3 241-245 Praca oryginalna Original Article Jaka jest przydatność diagnostyczna oznaczeń prokalcytoniny u chorych z podejrzeniem ostrego zapalenia wyrostka robaczkowego? Beata Kuśnierz-Cabala 1, Ryszard Anielski 2, Krystyna Szafraniec 3, Bogdan Solnica 1 1 Zakład Diagnostyki Katedry Biochemii Klinicznej; 2 III Katedra i Klinika Chirurgii Ogólnej; 3 Zakład Epidemiologii i Badań Populacyjnych Collegium Medicum Uniwersytetu Jagiellońskiego Streszczenie Cel: Celem pracy była ocena przydatności diagnostycznej oznaczeń prokalcytoniny (PCT) u chorych z podejrzeniem OZWR. Materiał i metody: Badaniami objęto 61 chorych (K: 28; M: 33) w średnim wieku 35,0±17,3 lat, hospitalizowanych i leczonych operacyjnie w III Klinice Chirurgii Ogólnej z rozpoznaniem OZWR. Oznaczanie PCT wykonano przy pomocy metody immunoluminometrycznej (ILMA). Wyniki: Średnie stężenie PCT w chwili rozpoznania OZWR wynosiło 0,76±3,60 ng/ml, natomiast całkowita liczba leukocytów 13,22±4,45x103/μl. Dodatni wynik badania USG na etapie wstępnej diagnostyki w stosunku do rozpoznania końcowego wynosił średnio 55%, wyrostek zmieniony w USG wykazano u 37,2% chorych z postacią zgorzelinową oraz u 50% z ropowiczą postacią OZWR. Wnioski: Oznaczanie PCT posiada ograniczoną przydatność w rozpoznawaniu OZWR. Jej stężenie mieściło się u 87% chorych w zakresie wartości prawidłowych. Nie wykazano również zależności pomiędzy zmianą stężenia PCT oraz długością trwania dolegliwości bólowych poprzedzających rozpoznanie. How looks diagnostics usefulness of procalcitonin serum determination in patients with suspected acute appendicitis? Summary Aim: The aim of the study was to evaluate diagnostic utility of procalcitonin (PCT) in suspected acute appendicitis (AA). Material and methods: The study included 61 patients (female: 28, male: 33), mean age 35,0±17,3, emergency admitted to the 3-rd Surgical Department of Jagiellonian University Medical Collage in Cracow with diagnosis of AA. PCT concentration was measured using immunoluminometric (ILMA) assay. Results: After admission to emergency unit, mean PCT concentration was 0,76±3,60 ng/ml and total leukocyte count: 13,22±4,45x103/μl. About 55% of all study patients have positive ultrasonography results after admission to the hospital, including 37,2% of patients with gangrenous form (and perforation) and 50% of patients with phlegmonous form of AA. Conclusions: PCT determination in patients with suspected AA has limited usefulness for diagnosis and about 87% of patients had PCT values in range for healthy population. Similarly there is no relation between PCT determination and duration of pain before admission to hospital. Słowa kluczowe: prokalcytonina, ostre zapalenie wyrostka robaczkowego (OZWR), leukocytoza Key words: procalcitonin, acute appendicitis (AA), leukocytosis Wstęp Ostre zapalenie wyrostka robaczkowego (OZWR) stanowi jedną z najczęstszych przyczyn doraźnej interwencji chirurgicznej, a ustalenie właściwego rozpoznania nadal napotyka na trudności. Trafność diagnostyczna klinicznego rozpoznania OZWR waha się od 76 do 92% [3, 11]. Decyzja o podjęciu operacji u chorych z podejrzeniem OZWR stanowi swoistego rodzaju konsensus i oparta jest przede wszystkim na wywiadzie chorobowym, badaniu fizykalnym oraz doświadczeniu chirurga. W ostatnich latach obserwujemy coraz powszechniejsze wykorzystanie w diagnostyce OZWR technik obrazowych, przede wszystkim ultrasonografii oraz tomografii komputerowej, wspomaganych dodatkowymi badaniami biochemicznymi [3, 4, 21]. 241
Jaka jest przydatność diagnostyczna oznaczeń prokalcytoniny u chorych z podejrzeniem ostrego zapalenia... Pomimo rozwoju techniki medycznej, prawidłowe i wczesne rozpoznanie OZWR nadal sprawia trudności diagnostyczne, szczególnie u chorych bez objawów zapalenia otrzewnej, przy nietypowych lokalizacjach wyrostka oraz u ludzi starszych, kiedy objawy mogą być mało charakterystyczne i słabo nasilone [22]. Konsekwencje tych trudności są różne, począwszy od pewnego odsetka niepotrzebnych operacji, po wydłużenie czasu pobytu chorego w szpitalu czy zwiększenie odsetka powikłań, które prowadzą do wzrostu całkowitych kosztów leczenia. Odsetek fałszywie dodatnich rozpoznań OZWR może sięgać 20%, a u kobiet w wieku rozrodczym dochodzi nawet do 40% [4]. W świetle aktualnie dostępnego piśmiennictwa wykorzystywanie nowych metod diagnostycznych sprawia, że odsetek fałszywie dodatnich rozpoznań w grupie chorych potrzebnie poddanych operacji można obniżyć do 8-10% [23]. Chociaż nadal brak przekonujących danych na temat przydatności diagnostycznej badań laboratoryjnych w rozpoznawaniu OZWR, uwaga badaczy koncentruje się na poszukiwaniu nowych wskaźników. Oznaczanie prokalcytoniny w surowicy krwi chorych pozwala na różnicowanie infekcji pochodzenia bakteryjnego od niebakteryjnego, stąd ocena tego markera pod kątem ewentualnej użyteczności diagnostycznej w rozpoznawaniu OZWR [4, 15, 18, 24]. Prokalcytonina (PCT) pod względem biochemicznym jest glikoproteiną zbudowaną z 116 aminokwasów o masie cząsteczkowej 13 kda, produkowaną w warunkach fizjologicznych przez komórki okołopęcherzykowe C gruczołu tarczowego [13, 14]. Przypuszcza się jednak, że PCT wydzielana do krwi w stanie zapalnym nie pochodzi z tarczycy, a prawdopodobne miejsca produkcji tego białka mogą być zlokalizowane w komórkach neuroendokrynnych jelit, płuc i wątroby [5, 6, 9, 10, 13, 19, 20]. Wczesne badania nad rolą PCT podkreślają wyraźny wzrost jej stężenia w przebiegu ostrego uogólnionego procesu zapalnego o podłożu bakteryjnym, oraz znacznie mniejszą amplitudę zmian w przypadku etiologii wirusowej, schorzeń o podłożu autoimmunizacyjnym czy po transplantacji narządów. W oparciu o aktualny stan wiedzy z zakresu patobiochemii PCT wykazano, że może ona być indukowana poprzez działanie endotoksyn bakteryjnych, jak również przez cytokiny prozapalne oraz czynniki niezapalne, takie jak: uraz, oparzenie czy wstrząs kardiogenny [13, 14, 17, 18, 20]. Na podstawie tych obserwacji stworzono hipotezę, że zwiększone uwalnianie PCT występuje w następstwie upośledzenia układu immunologicznego i zaburzeń mikrokrążenia (np. po rozległych zabiegach operacyjnych w obrębie jamy brzusznej, torakochirurgicznych) [4, 14, 15]. Oznaczanie PCT znalazło się w wielu zaleceniach dla klinicystów i wykorzystywane jest do monitorowania ciężkości uogólnionego procesu zapalnego, w szczególności w oddziałach intensywnej terapii jako parametr dodatkowy obok pomiaru temperatury, całkowitej liczby leukocytów wraz z obrazem odsetkowym, badania OB (opad krwinek czerwonych) czy stężenia CRP [4, 8, 9, 14, 16, 18, 20, 23]. W przypadku ograniczonego lokalnie procesu zapalnego czy braku powikłań w okresie pooperacyjnym, poziom PCT nie przekracza na ogół zakresu wyznaczonego dla zdrowej populacji dorosłych [14, 15]. Celem niniejszej pracy była ocena przydatności diagnostycznej oznaczeń prokalcytoniny w przedoperacyjnym rozpoznawaniu OZWR. Materiał i metody Badaniem objęto łącznie 61 chorych z wstępnym rozpoznaniem ostrego zapalenia wyrostka robaczkowego zgłaszających się do izby przyjęć III Katedry i Kliniki Chirurgii Ogólnej CMUJ w Krakowie, których w oparciu o obraz kliniczny zakwalifikowano do doraźnego leczenia operacyjnego. Grupę badaną stanowiło 28 (45,9%) kobiet oraz 33 (54,1%) mężczyzn w wieku od 15 do 74 lat (średnia 35,0±17,3). U wszystkich operowanych, wstępne rozpoznanie OZWR zostało potwierdzone w pooperacyjnym badaniu histopatologicznym usuniętych wyrostków robaczkowych. Badanie ultrasonograficzne przeprowadzone zostało w III Klinice Chirurgii Ogólnej CMUJ, podstawowe badania laboratoryjne w pracowni Miejskiego Szpitala im. G. Narutowicza, natomiast oznaczanie PCT w surowicy wykonywano w Zakładzie Diagnostyki Katedry Biochemii Klinicznej CMUJ w Krakowie. Do pomiaru stężenia PCT wykorzystano surowice pochodzące z próbek krwi pobranych do celów diagnostycznych podczas obserwacji w izbie przyjęć. W tej sytuacji, udział pacjentów w badaniu nie stanowił dla nich dodatkowych niedogodności związanych z pobieraniem krwi i każdorazowo odbywał się po uzyskaniu pisemnej zgody. Próbki surowic wykorzystywane do oznaczeń PCT przechowywano w Zakładzie Diagnostyki, w temp. -70 C do czasu przeprowadzenia badania. Pomiar PCT wykonywano przy użyciu metody immunoluminometrycznej (ILMA) na aparacie luminometr LB 9507 firmy EG&G Berthold, wykorzystując zestaw odczynników LUMItest PCT firmy Brahms Diagnostica (Niemcy). Czułość analityczna testu wynosiła 0,08 ng/ml, natomiast czułość funkcjonalna testu (współczynnik Tabela I Charakterystyka grupy badanej. Parametry analizowane Grupa badana (n=61) Wiek (średnia ± SD) [lata] 35,0±17,3 Mężczyźni [n; %] Kobiety [n; %] 33 (54,1%) 28 (45,9%) Czas trwania dolegliwości bólowych [h] 35,0±36,8 Dodatni wynik USG w chwili rozpoznania [%] Średnia liczba WBC [x10 3 /μl] 13,76±4,29 54 PCT [ng/ml] 0,76±3,60 USG ultrasonografia; WBC całkowita liczba krwinek białych; PCT prokalcytonina 242
B. Kuśnierz-Cabala i inni zmienności 20%) ok. 0,3 ng/ml. Zakres wartości prawidłowych u dorosłych zdrowych ochotników nie przekraczał 0,5 ng/ml. Wszystkie oznaczenia wykonywano w duplikatach. Do oszacowania przydatności diagnostycznej PCT wykorzystano analizę krzywych ROC, natomiast punkty odcięcia wyznaczono w oparciu o przyjęcie optymalnych wartości czułości i swoistości diagnostycznej. Uzupełnieniem charakterystyki diagnostycznej PCT było określenie wartości predykcyjnej wyniku ujemnego (NPV) i dodatniego PPV oraz ilorazów prawdopodobieństwa (LR+; LR-), nazywanych również wskaźnikami wiarygodności. Za istotny statystycznie przyjęto poziom p<0,05. Wyniki Średnia wartość stężenia PCT w grupie chorych z potwierdzonym pooperacyjnie rozpoznaniem OZWR wynosiła 0,76±3,60 ng/ml i u 87% chorych mieściła się w zakresie wartości prawidłowych. W celu analizy wartości diagnostycznej PCT wyznaczono punkty odcięcia dla trzech przedziałów czasowych trwania dolegliwości bólowych: krócej niż 12 godzin (0,14 ng/ml), od 12 do 24 (0,15 ng/ml) (ryc. 1) oraz powyżej 24 godzin (0,17 ng/ml) (tab. II). Wyznaczone dla kolejnych punktów odcięcia wartości czułości i swoistości diagnostycznej oraz wartości NPV i PPV przedstawiono w tabeli II. Wartości punktów odcięcia mieściły się w dolnym przedziale wartości prawidłowych dla PCT, poniżej 0,3 ng/ml. Stwierdzono niskie wartości LR+, z maksymalną wartością 3,0, a dla LR- najniższa wartość wynosiła 0,31. Nie odnotowano również przydatności diagnostycznej oznaczania PCT w zależności od wieku pacjenta (<40. r.ż oraz >40. r.ż) (tab. II). Dyskusja W diagnostyce OZWR, z natury rzeczy pilnej, klinicyści stają przed dylematem związanym z postawieniem właściwego rozpoznania choroby i właściwą klasyfikacją do niezbędnego zabiegu. Niekiedy w efekcie fałszywie dodatniego rozpoznania choroby w trakcie niepotrzebnej operacji usunięty zostaje zdrowy wyrostek. Z kolei przy braku charakterystycznego obrazu klinicznego, opóźnienie operacji łączy się z zagrożeniem związanym z perforacją wyrostka [5, 9, 12]. W III Klinice Chirurgicznej CM UJ w okresie 1989-1998 odsetek błędnych rozpoznań wynosił 11,6% i był 4-krotnie większy u kobiet niż u mężczyzn (odpowiednio 19,2 i 5,7%) [2]. W prowadzonych aktualnie badaniach wyniósł on 9,8%, u kobiet 17,4% i 9,5% u mężczyzn. Z upływem czasu nie nastąpiła więc istotna poprawa trafności rozpoznawania OZWR, co można m.in. tłumaczyć ciągle tym samym instrumentarium diagnostycznym. Najczęstszą przyczyną fałszy- Rycina 1 Analiza krzywych ROC dla prokalcytoniny u chorych z podejrzeniem ostrego zapalenia wyrostka robaczkowego pomiędzy 12 i 24 godziną od pojawienia się dolegliwości bólowych (wartość odcięcia 0,15 ng/ml; czułość diagnostyczna 81,4%; swoistość diagnostyczna 54,5%; AUC=0,710). Tabela II Wartości odcięcia dla prokalcytoniny (PCT) u chorych z podejrzeniem ostrego zapalenia wyrostka robaczkowego (OZWR) w zależności od wieku pacjentów oraz czasu trwania dolegliwości bólowych. Czynnik dyskryminujący Wartość Czułość Swoistość PPV NPV odcięcia PCT diagnostyczna diagnostyczna +LR -LR (%) (%) (ng/ml) (%) (%) AUC Czas trwania dolegliwości 0,14 50,0 83,3 3,0 0,60 87,5 41,7 0,653 bólowych <12 h Czas trwania dolegliwości 0,15 81,4 54,5 1,79 0,34 80,7 55,6 0,710 bólowych pomiędzy 12-24 h Czas trwania dolegliwości 0,17 80,8 62,5 2,15 0,31 83,4 58,2 0,726 bólowych >24 h Chorzy <40. r.ż 0,21 57,1 63,6 1,57 0,67 78,6 38,9 0,596 Chorzy >40. r.ż 0,15 77,3 66,7 2,32 0,34 84,4 55,7 0,636 PCT prokalcytonina; +LR, -LR likelihood ratios (iloraz prawdopodobieństwa); PPV positive predictive value (prawdopodobieństwo dodatniego wyniku testu); NPV negative predictive value (prawdopodobieństwo uzyskania ujemnego wyniku testu); AUC area under curve (pole powierzchni pod krzywą) 243
Jaka jest przydatność diagnostyczna oznaczeń prokalcytoniny u chorych z podejrzeniem ostrego zapalenia... wie dodatnich rozpoznań OZWR były schorzenia narządu rodnego (61,5% wszystkich negatywnych appendektomii). W celu minimalizacji tego typu konsekwencji, do bieżącej diagnostyki w wielu ośrodkach wprowadzono strategię polegającą na łączeniu nowoczesnych metod diagnostycznych, gdzie obok badań obrazowych, oznaczane są dodatkowo markery zapalne, np. prokalcytonina, CRP czy osoczowe białko amyloidowe (SAA) [7, 11, 19, 20, 21]. Wobec trudności diagnostycznych, jakie napotyka chirurg na etapie wczesnego formułowania diagnozy, przydatność badań USG jest niewielka, stąd też próby uzupełnienia procedury diagnostycznej badaniami laboratoryjnymi budzą zrozumiałe zainteresowanie [7, 13, 23]. Inne podejście prezentują w swoich badaniach Birkhahn i wsp. [3], którzy sugerują, aby do powszechnego użycia wprowadzić model ALM (ang. Appendicitis Likelihood Model), który wobec braku większej przydatności badań obrazowych i laboratoryjnych na etapie wstępnego rozpoznania rekomenduje określanie prawdopodobieństwa OZWR w oparciu o obecność dolegliwości bólowych w prawym dole biodrowym u wszystkich chorych z podejrzeniem OZWR zgłaszających się do izby przyjęć (określanie prawdopodobieństwa rozpoznania OZWR przed wykonaniem testu: ang. pre-test probability) [3]. Powstaje jednak pytanie: jak należy postępować w przypadku, gdy prawdopodobieństwo choroby nie jest wystarczające dla podjęcia określonej decyzji terapeutycznej? Większość dostępnych dotychczas danych literaturowych oraz opinii klinicystów skłania się w kierunku oznaczania całkowitej liczby leukocytów wraz z udziałem procentowym neutrofili, uznając je za uzupełnienie diagnostyki OZWR [1, 8, 21, 23]. Począwszy od 1990 roku, kiedy wykazano związek pomiędzy wzrostem stężenia PCT oraz sepsą, oznaczenie to stało się szeroko rekomendowane w diagnostyce uogólnionego stanu zapalnego, szczególnie w grupie chorych z podejrzeniem zakażenia. W niniejszej pracy stwierdzono, dla punktu odcięcia PCT w chwili zgłoszenia się chorego równego 0,14 ng/ml, czułość diagnostyczna wynosi zaledwie 50% przy swoistości diagnostycznej 83,3% i PPV= 87,5%. Podobne wartości dla punktu odcięcia 0,2 ng/ml (czułość diagnostyczna 62%, swoistość diagnostyczna 88%) wykazali Hausfater i wsp. [9]. W kolejnych godzinach obserwacji pogorszeniu ulegała także swoistość diagnostyczna oznaczeń PCT, podobnie jak wartości współczynników prawdopodobieństwa LR+ i LR- (tab. II). Jednocześnie podkreślenia wymaga fakt, że stężenia PCT obserwowane u chorych z podejrzeniem OZWR, zarówno w niniejszym badaniu, jak i Hausfater i wsp. [9], oscylowały wokół 0,2 ng/ml, podczas gdy wartość odcięcia w ocenie ryzyka sepsy wynosi 0,5 ng/ml. Niskie stężenia PCT u chorych przyjmowanych do izby przyjęć mogą również wynikać z kinetyki jej wydzielania. Zwykle poziom PCT bywa mierzalny dopiero po upływie 3-4 godzin od zapoczątkowania syntezy, jej okres półtrwania wynosi średnio ok. 19-24 godziny, natomiast większość pacjentów zgłasza się do oddziałów chirurgicznych ze znacznym opóźnieniem w stosunku do czasu pojawienia się pierwszych symptomów OZWR [4, 5, 9, 16, 20]. W najwcześniejszej z biologicznego punktu widzenia fazie zapalenia obserwujemy zwykle niewielki wzrost stężenia PCT, a dodatkowym czynnikiem obniżającym poziom PCT może być wdrożenie antybiotykoterapii [8, 9, 10]. Wnioski Należy stwierdzić, że oznaczanie prokalcytoniny posiada ograniczoną przydatność w rozpoznawaniu ostrego zapalenia wyrostka robaczkowego. Nie wykazano również związku między stężeniem PCT a czasem trwania dolegliwości bólowych w przebiegu OZWR. Piśmiennictwo 1. Andersson M, Andersson RE. The appendicitis inflammatory response score: a tool for the diagnosis of acute appendicitis that outperforms the Alvorado score. World J Surg 2008; 32(18): 1843-1849. 2. Anielski R, Barczyński M, Cichoń S i wsp. Acute appendicitis in Cracow population [Ostre zapalenie wyrostka robaczkowego w populacji Krakowa]. Przegl Lek 2001; 58(12): 1034-1037. 3. Birkhahn RH, Briggs M, Datillo PA i wsp. Classifying patients suspected of appendicitis with regard to likelihood. Am J Surg 2006; 191: 497-502. 4. Chakhunashvili L, Samkharadze J, Chkhaidze I. Procalcitonin as the biomarker of inflammation in diagnostics of pediatric appendicitis and for prevention of unnecessary appendectomy. Annals Bomedic Research Education 2005; 5(1): 6-9. 5. Chirouze C, Schuhmacher H, Rabaud C i wsp. Low serum procalcitonin level accurately predicts the absence of bacteremia in adult patients with acute fever. Clin Infectious Dis 2002; 35: 156-161. 6. Christ-Crain M, Muller B. Procalcitonin in bacterial infectionshype, hope, more or less? Swiss Med WKLY 2005; 135: 451-460. 7. Flum DR, McClure T, Morris A i wsp. Misdiagnosis of appendicitis and the use of diagnostic imaging. J Am Coll Surg 2005; 201: 933-939. 8. Hatherill M, Tibby SM, Sykes K i wsp. Diagnostic markers of infection: comparison of procalcitonin with C reactive protein and leucocyte count. Arch Dis Child 1999; 81: 417-421. 9. Hausfater P, Garric S, Ayed SB i wsp. Usefulness of procalcitonin as a marker of systemic infection in emergency department patients: a prospective study. CID 2002; 34: 895-901. 10. Kafetzis DA, Velissariou IM, Nikolaides P i wsp. Procalcitonin as a predictor of severe appendicitis in children. Eur J Clin Microbiol Infect Dis 2005; 24: 484-487. 11. Kim-Choy N, Shih-Wei L. Clinical analysis of the related factors in acute appendicitis. Yale J Biol Med 2002; 75: 41-45. 12. Kang JY, Hoare J, Majeed A i wsp. Decline in admission rates for acute appendicitis in England. Br J Surg 2003; 90: 1586-1592. 13. Kuśnierz-Cabala B, Galicka-Latała D. Wartość diagnostyczna oznaczeń prokalcytoniny (PCT). Przegląd Lekarski 2004; 61 (9): 978-980. 14. Meisner M. Pathobiochemistry and clinical use of procalcitonin. Clin Chem Acta 2002; 323: 17-29. 15. Meisner M, Tschaikowsky K, Hutzler A i wsp. Postoperative plasma concentrations of procalcitonin after different types of surgery. Intensive Care Med 1998; 24: 680-684. 16. Meisner M, Reinhart K. Is procalcitonin really a marker of sepsis? Intern J Intensive Care 2001; 8(1): 15-24. 17. Nijsten MW, Olinga P, Hoekstra HJ. In vitro and in vivo stimulation of procalcitonin by TNFα and IL-6. J Anasthesie Intensivbehadlung 2001; 2: 58-60. 244
B. Kuśnierz-Cabala i inni 18. Reith HB, Mittelkotter U, Wagner R i wsp. Procalcitonin (PCT) in patients with abdominal sepsis. Intensive Care Med 2000; 26: 165-169. 19. Shimetani N, Shimetani K, Mori M. Clinical evaluation of the measurement of serum procalcitonin: comparative study of procalcitonin and serum amyloid A protein in patients with high and low concentrations of serum C-reactive protein. Scand J Clin Lab Invest 2004; 64: 469-474. 20. Simon L, Gauvin F, Amre DK i wsp. Serum procalcitonin and C-reactive protein levels as markers of bacterial infection: a systematic review and meta-analysis. Clin Infect Dis 2004; 39: 206-216. 21. Tepel J, Sommerfeld A, Klomp HJ i wsp. Prospective evaluation of diagnostic modalities in suspected acute appendicitis. Arch Surg 2004; 389: 219-224. 22. Todd RD, Sarosi GA, Nwariaku F i wsp. Incidence and predictors of appendical tumors in elderly males presenting with sign and symptoms of acute appendicitis. Am J Surg 2004; 188: 500-504. 23. Tzanakis NE, Efstathiou SP, Danulidis K i wsp. A new approach to accurate diagnosis of the appendicitis. World J Surg 2005; 29: 1151-1156. 24. Velissariou I, Kafetzis D, Nikolaides P i wsp. Procalcitonin as a predictor of severe appendicitis in children. Pediatrics 2008; 121: S 164. Adres Autorów: Zakład Diagnostyki Katedra Biochemii Klinicznej Collegium Medicum Uniwersytet Jagielloński ul. Kopernika 15a 31-501 Kraków tel./faks: (012) 424 83 65, 424 83 66 e-mail: mbkusnie@cyf-kr.edu.pl (Praca wpłynęła do Redakcji: 2009-09-08) (Praca przekazana do opublikowania: 2009-10-05) 245