Aktyna to wielofunkcyjne białko występujące we wszystkich komórkach eukariotycznych,

Funkcjonalne zróżnicowanie cytoplazmatycznych izoform aktyny Streszczenie Aktyna to wielofunkcyjne białko występujące we wszystkich komórkach eukariotycznych, wykazujące zdolność do polimeryzacji. Dynamiczna reorganizacja tworzonych przez nią mikrofilamentów jest siłą napędową ruchu komórki, prowadzącą do zmiany kształtu błony komórkowej i powstania wypustek migracyjnych. Cytoszkielet aktynowy pełni w komórce funkcję strukturalną, uczestniczy w procesie jej podziału, wewnątrzkomórkowym przepływie informacji i ruchu organelli. U kręgowców obecnych jest 6 izoform aktyny, z czego dwie, cytoplazmatyczne β i γ obecne są we wszystkich komórkach. Poziom ekspresji genów izoform cytoplazmatycznych jest odmienny w różnych tkankach. Ponadto zmienia się on w niektórych stanach chorobowych. Wewnątrzkomórkowa lokalizacja aktyn β i γ oraz pełnione przez nie funkcje pozostają ciągle w sferze badań. Prace doświadczalne ostatnich lat, polegające na wywoływaniu zmian ekspresji genów cytoplazmatycznych izoform aktyny, pozwalają na coraz pełniejsze poznanie roli jaką białka te pełnią w komórkach. W niniejszym artykule zostały omówione współczesne poglądy na ten temat. Wprowadzenie Aktyna występuje powszechnie w organizmach eukariotycznych. Jej obecność odnotowano w cytoplazmie i jądrze komórkowym, gdzie uczestniczy w organizacji struktury jądra, procesie transkrypcji oraz przekazywaniu sygnałów [1,2]. Główną cechą aktyny jest jej zdolność do polimeryzacji. Najwcześniej poznaną funkcją aktyny jest jej udział w skurczu mięśni. System mikrofilamentów jest ponadto zaangażowany w wiele niezbędnych do życia procesów. Współtworzy on szkielet komórki, bierze udział w wewnątrzkomórkowym ruchu organelli i chromosomów, przekazywaniu sygnału i wydzielaniu. Uczestniczy również w procesie migracji i tworzeniu pierścienia kurczliwego w trakcie cytokinezy [3]. Aktyna jest białkiem o sekwencji zachowanej w ewolucji, wykazującym jednakże heterogenność molekularną. U człowieka występuje w postaci sześciu izoform. Dwie z nich są obecne w mięśniach poprzecznie prążkowanych, aktyna α z mięśni szkieletowych i aktyna α z mięśnia sercowego, dwie kolejne w mięśniach gładkich, aktyny α (naczyniowa) i γ (jelitowa) oraz dwie we wszystkich komórkach, cytoplazmatyczne aktyny β i γ [4]. Izoformy aktyny są produktami odrębnych genów, jednak istnieje pomiędzy nimi wysoki stopień homologii. Różnice występują głównie w najbardziej zmiennym, acetylowanym regionie końca aminowego (N-końca) łańcucha polipeptydowego. Wpływają one na wartość punktu izoelektrycznego izoaktyn, który waha się w granicach od 5,2 do 5,7 [5]. W przypadku aktyn cytoplazmatycznych jest nieznacznie przesunięty w kierunku alkalicznym w stosunku do aktyn mięśniowych [4]. Izoformy aktyny wykazują specyficzność tkankową, ale nie gatunkową. Większą liczbę różnic w składzie aminokwasowym można zaobserwować w przypadku aktyn pochodzących z różnych tkanek tego samego gatunku niż w przypadku aktyn z tej samej tkanki odległych ewolucyjnie organizmów [3]. Aleksandra Simiczyjew Maria Malicka-Błaszkiewicz Dorota Nowak Zakład Patologii Komórki, Wydział Biotechnologii, Uniwersytet Wrocławski, Wrocław Zakład Patologii Komórki, Wydział Biotechnologii, Uniwersytet Wrocławski, ul. Przybyszewskiego 63/77, 51-148 Wrocław; tel.: (71) 37 56 289, e-mail: dorotan@ibmb.uni.wroc. pl Artykuł otrzymano 24 maja 2012 r. Artykuł zaakceptowano 29 lipca 2013 r. Słowa kluczowe: cytoplazmatyczne izoformy aktyny Wykaz skrótów: ABP (ang. actin binding proteins) białka oddziałujące z aktyną; G aktyna aktyna w formie monomerycznej; F aktyna aktyna filamentarna, SRF (ang. serum response factor) czynnik odpowiedzi na surowicę; ZBP1 (ang. zipcode binding protein 1) białko wiążące sekwencję zipcode Izoformy β i γ różnią się wyłącznie czterema resztami aminokwasowymi. Aktyna β posiada trzy reszty kwasu asparaginowego na N-końcu cząsteczki i resztę waliny w pozycji 10, natomiast aktyna γ posiada w tych samych pozycjach trzy cząsteczki kwasu glutaminowego i resztę izoleucyny [4]. W związku z wymienionymi różnicami izoformy te charakteryzują się odmiennym punktem izoelektrycznym (PI); PI w przypadku aktyny β jest niższy niż w przypadku aktyny γ [6]. Wszystkie izoformy aktyny ulegają procesowi acetylacji kwaśnego N-końca. Acetylowana jest reszta metioniny, która następnie zostaje usunięta, po czym acetylacji (i czasem usunięciu) ulega również kolejna reszta w łańcuchu polipeptydowym aktyny [7]. W wyniku modyfikacji potranslacyjnej zarówno w przypadku aktyny β jak i γ powstaje polipeptyd składający się z 374 reszt aminokwasowych [7]. Postępy Biochemii 59 (3) 2013 285

Charakterystyka aktyn cytoplazmatycznych Jedną z najważniejszych cech aktyny, która pozwala jej pełnić w organizmie wiele tak różnych funkcji, jest jej zdolność do polimeryzacji i oddziaływania z wieloma białkami. Aktyna występuje w komórce w dwóch formach: monomerycznej aktyny globularnej (G) oraz polimerycznej aktyny w formie filamentów (F). W warunkach fizjologicznych obie formy współistnieją ze sobą w dynamicznej równowadze. Cząsteczka aktyny zbudowana jest z dwóch wyraźnie wyodrębnionych strukturalnych domen (historycznie nazywanych małą i dużą ), które rozdzielone są szczeliną, miejscem wiązania nukleotydu (ATP lub ADP) [8]. Trójwymiarową strukturę monomeru przedstawiono na rycinie 1A. Każdą domenę cząsteczki aktyny można podzielić na dwie subdomeny. W domenie małej wyodrębniono subdomenę 1, zawierającą zarówno N- jak i C-koniec cząsteczki (obejmującą reszty aminokwasowe: 1-32, 70-144 i 338-372) i subdomenę 2 (reszty aminokwasowe: 33-69). Subdomena 3 (reszty aminokwasowe: 145-180, 270-337) oraz subdomena 4 (reszty 181-269) budują dużą domenę monomeru aktyny. Stwierdzono ponadto, że monomer aktyny posiada kilka miejsc wiązania kationów dwuwartościowych (zwłaszcza Ca 2+ i Mg 2+ ), które wraz z nukleotydem są odpowiedzialne za utrzymanie natywnej konformacji aktyny [3]. W ściśle określonych warunkach in vitro (w obecności ATP, przy określonym stężeniu jonów Mg 2+, Ca 2+ i K + oraz Rycina 1. A) Struktura przestrzenna aktyny monomerycznej. ADP (kolor niebieski) związane jest w szczelinie pomiędzy dwoma domenami aktyny. Subdomeny oznaczono jako S 1-4. Przygotowano przy użyciu programu RasWin na podstawie sekwencji zdeponowanej w bazie Protein Data Bank. B) Schemat polimeryzacji aktyny. Aktyna występuje w komórce w dwóch formach: monomerycznej, aktyny globularnej (G) oraz polimerycznej, aktyny w formie filamentów (F). W warunkach fizjologicznych obie formy aktyny współistnieją w dynamicznej równowadze. Do asocjacji i dysocjacji monomerów dochodzi na obu końcach rosnącego filamentu, jednak odbywa się to z różną szybkością na skutek różnego powinowactwa monomerów do końców filamentu [3,9]. Szybko rosnący koniec (+) odznacza się wysokim powinowactwem do monomerów aktyny natomiast wolno rosnący koniec ( ), niskim powinowactwem do tych monomerów. W stanie spoczynku komórki liczba monomerów przyłączających się do końca (+) filamentu równoważona jest przez odpowiednią liczbę monomerów odłączających się od końca ( ). Zmodyfikowano na podstawie [9]. przy osiągniętym stężeniu krytycznym monomeru) proces polimeryzacji aktyny zachodzi spontanicznie. Towarzyszy mu hydroliza ATP związanego z monomerem aktyny. Powstały ADP pozostaje związany z aktyną w filamencie, natomiast nieorganiczny fosforan uwalniany jest do roztworu. Filamenty aktynowe wykazują polaryzację, posiadają szybko rosnący koniec (+) o wysokim powinowactwie do monomerów aktyny oraz wolno rosnący koniec ( ), o niskim powinowactwie do tych monomerów. W stanie spoczynku komórki liczba monomerów przyłączających się do końca (+) filamentu równoważona jest przez odpowiednią liczbę monomerów odłączających się od końca ( ). Monomer aktyny przyłączony do końca (+), w miarę postępu polimeryzacji, przesuwa się wzdłuż filamentu, aż do momentu, gdy ulega dysocjacji na jego końcu ( ) [3,9] (Ryc. 1B). W ostatnich latach przeprowadzono badania, z wykorzystaniem aktyn cytoplazmatycznych β i γ uzyskanych za pomocą systemu ekspresji genów w komórkach owadzich z zastosowaniem wektorów bakulowirusowych i stwierdzono, iż izoformy te różnią się od siebie pod względem dynamiki procesu polimeryzacji. Badania wykazały, że w przypadku gdy z aktyną związany był jon wapnia (Ca 2+ ), wymiana ATP w obrębie monomerów izoformy β następowała dwukrotnie szybciej niż w przypadku monomerów izoformy γ. Ponadto aktynę β cechowała większa dynamika polimeryzacji [6]. Autorzy sugerują, iż jeden lub kilka spośród czterech aminokwasów, którymi różnią się te izoformy, może wpływać na aktywność biologiczną tych białek, powodując różnicę w budowie kieszeni wiążącej ATP. Ze względu na to, iż w warunkach fizjologicznych jony Mg 2+ występują w cytoplazmie w zdecydowanie większym stężeniu niż Ca 2+, bardziej powszechna jest sytuacja, w której aktyna związana jest z jonem magnezu (Mg 2+ ). W takim przypadku różnice w polimeryzacji obu izoform nadal występują, aczkolwiek są zdecydowanie mniej znaczące. Należy jednak uwzględnić również fakt, iż w niektórych stanach fizjologicznych i patologicznych komórki stężenie jonów wapnia ulega zmianie. Dla przykładu procesom nowotworowym często towarzyszy zmiana wewnątrzkomórkowego stężenia jonów wapnia, co może powodować większe niż w komórkach prawidłowych (wyższe stężenie Mg 2+ ) zróżnicowanie dynamiki polimeryzacji obu cytoplazmatycznych izoform aktyny. Wykazano również, iż obie izoformy mogą polimeryzować ze sobą, tworząc filament o właściwościach pośrednich pomiędzy tym złożonym wyłącznie z aktyny β lub γ. Być może zróżnicowana szybkość polimeryzacji ma na celu stworzenie w komórce dwóch typów filamentów, różniących się pod względem dynamicznym [6,10]. BIAŁKA ODDZIAŁUJĄCE Z AKTYNĄ Wiele procesów zachodzących w komórce wymaga dynamicznych zmian cytoszkieletu w odpowiedzi na szereg wewnątrz- 286 www.postepybiochemii.pl

i zewnątrz-komórkowych czynników. Reorganizacja filamentów aktynowych zachodzi poprzez szybkie reakcje polimeryzacji i depolimeryzacji. Procesy te regulowane są przez szereg białek wiążących się zarówno do monomerycznej jak i filamentarnej aktyny, tzw. ABP (ang. actin binding proteins). Zidentyfikowano wiele białek należących do tej grupy. Są one klasyfikowane głównie ze względu na funkcje, jakie pełnią w regulacji organizacji aktyny [11]. Wyróżniamy wśród nich białka wiążące monomery aktyny, które mogą zapobiegać jej polimeryzacji (DNaza I, tymozyna β4, profilina), bądź wykazywać aktywność nukleacyjną, czyli brać udział w tworzeniu jąder polimeryzacji (kompleks Arp2/3), jak również czynniki depolimeryzujące filamenty (kofilina) oraz zapobiegające dodawaniu monomerów aktyny na końcu brodatym (+) (CapZ) lub dysocjacji cząsteczek aktyny z końca ostrego ( ) (tropomodulina). Kolejną grupę stanowią białka fragmentujące F-aktynę, poprzez cięcie filamentów na dwa krótsze fragmenty (żelsolina) oraz czynniki sieciujące filamenty, które umożliwiają rozgałęzianie filamentów i tworzenie sieci cytoszkieletu aktynowego (fimbryna, α-aktynina, filaminy, Arp2/3). Z kolei za stabilizację F-aktyny odpowiadają czynniki wiążące się wzdłuż filamentów i tym samym zapobiegające ich dalszej polimeryzacji (tropomiozyna, tropomodulina, kalponina) [11]. Odrębną grupę ABP tworzą białka motoryczne, miozyny. Są one zaangażowane m.in. w generowanie tzw. siły kontrakcyjnej. Konwencjonalne miozyny utożsamiane są przede wszystkim z aparatem skurczu mięśnia, natomiast niekonwencjonalne biorą udział m.in. w transporcie pęcherzyków wzdłuż filamentów [12]. Za wiązanie filamentów aktynowych do błony komórkowej odpowiadają talina, winkulina, filaminy, kateniny, integryny i kadheryny. Są one zaangażowane w przekazywanie sygnałów docierających do komórki ze środowiska. Zapewniają także mechaniczną przyczepność błony, niezbędną w procesie migracji oraz w trakcie tworzenia płytek adhezyjnych [11]. Z uwagi na fakt, iż niektóre spośród ABP mogą wiązać się zarówno z G- jak i F-aktyną, należy je zaliczyć do kilku z wyżej wymienionych grup. Dla przykładu kompleks białek Arp2/3 bierze udział w rozgałęzianiu filamentów aktynowych pod kątem 70º, a także posiada aktywność nukleacyjną stymulowaną przez białka z rodziny NPF (ang. Nucleation Promoting Factor), do których zaliczamy np. WASP, Scar/WAVE. Rekrutują one od jednego do trzech monomerów aktyny i promują zmiany konformacyjne wewnątrz kompleksu Arp2/3. Inne białko kortaktyna, wiążąc się do kompleksu Arp2/3 w miejscach rozgałęzienia, stabilizu- Rycina 2. Model powstawania rozgałęzionej sieci filamentów aktynowych budujących wypustkę migracyjną. Aktyna obecna na krawędzi wiodącej migrujących komórek występuje w postaci rozgałęzionej sieci filamentów, z szybko rosnącymi końcami (+) skierowanymi w stronę błony komórkowej. Proces powstawania wypustki migracyjnej rozpoczyna się od sygnału zewnątrzkomórkowego, który uruchamiając odpowiednią drogę transdukcji sygnału prowadzi do aktywacji białek WASP/Scar. Białka te łączą następnie kompleks Arp2/3 z monomerem aktyny w okolicy istniejącego filamentu, sprawiając, iż powstaje jego rozgałęzienie. Za nukleację i wydłużanie istniejących filamentów odpowiadają również białka z rodziny formin. Szybki wzrost filamentów prowadzi do powstania wypustki błony komórkowej. W kolejnym etapie białka czapeczkujące ograniczają dalszy wzrost filamentu, a kofilina lub ADF odcina oligomery ADP-aktyny i promuje dysocjację ADP-aktyny z końców (-) filamentów. Profilina katalizuje z kolei wymianę związanego z monomerem aktyny ADP na ATP, przywracając tym samym monomer do puli aktyny gotowej do dalszego wydłużania końców (+). Zmodyfikowano na podstawie [9]. Postępy Biochemii 59 (3) 2013 287

je te połączenia i zapobiega zniszczeniu sieci aktyny [13]. W proces powstawania filamentów de novo zaangażowane są wspomniane wcześniej białka z rodziny NPF i kompleks Arp2/3, jak również forminy [13,14]. Te ostatnie odpowiadają nie tylko za nukleację aktyny, ale biorą również udział w wydłużaniu końców (+) filamentów [13]. Stymulują one polimeryzację, po czym pozostają związane z rosnącym końcem filamentu aktynowego, ułatwiając przeniesienie monomeru aktyny z profiliny na koniec (+) filamentu [15]. W ostatnich latach odkryto ponadto serię czynników takich jak Spire, Cobl, VopL, VopF, TARP i Lmod. Zawierają one tandemowe sekwencje wiążące monomer i prowadzą do nukleacji aktyny [14]. Uważa się, że wszystkie trzy systemy nukleacji współpracują lub konkurują ze sobą w tych samych przedziałach komórkowych. Aktyna w formie monomerycznej występuje w kompleksie m.in. z profiliną, która tym samym utrzymuje odpowiedni poziom monomeru w komórce, zapobiegając polimeryzacji. To samo białko dodatkowo katalizuje wymianę ADP na ATP w cząsteczce aktyny, dzięki czemu uzupełnia pulę aktyny zdolnej do polimeryzacji [13]. Po zainicjowaniu tego procesu likwidacji ulega blokada dodatnich końców filamentu poprzez jego przecięcie przez kofilinę. Uwalnia to nowe miejsca, w których może dojść do polimeryzacji. Jednocześnie możliwa jest depolimeryzacja filamentów aktyny przy udziale kofiliny czy profiliny. Białka wiążące aktynę modulują również dynamikę tworzenia i przestrzennego usieciowania filamentów aktynowych budujących wypustki komórkowe niezbędne w procesie migracji (fimbryna, α-aktynina, filaminy i kompleks Arp2/3) (Ryc. 2). Z danych literaturowych wynika, że część białek oddziałujących z aktyną może wiązać się specyficznie tylko do jednej z jej izoform [10]. N-koniec łańcucha polipeptydowego aktyny jest zaangażowany w wiązanie z wieloma spośród ABP [3]. Niektóre z nich, jak: kofilina [16], β CAP73, L-plastyna, tymozyna β4 i profilina rozróżniają aktyny cytoplazmatyczne od mięśniowych [10,16]. Aneksyna Va natomiast preferencyjnie wiążą się do cytoplazmatycznej aktyny γ (a Tabela 1. Proporcje ilościowe aktyny β do γ w wybranych typach komórek i tkanek. nie do aktyny β), zaś ezryna wykazuje przeciwstawną tendencję [10]. Specyficzne oddziaływania tych białek z izoformami aktyny, mogą zmienić dynamikę ich polimeryzacji i wpłynąć na ich lokalizację w komórce [17,18]. Poziom i lokalizacja aktyn cytoplazmatycznych Lokalizacja Stosunek aktyn β/γ Piśmiennictwo Tkanki szczura: Mózg Jądra Wątroba Aorta 1,9:1 1:1 2,5:1 6:1 Komórki włoskowate ucha środkowego 1:2 [20] Płytki krwi człowieka 2:1 [68] Erytrocyty ssaków 1:0 [22] Linie komórkowe: linia ludzkiego nowotworu szyjki macicy HeLa linia fibroblastów z nerki nowonarodzonego chomika BHK linia komórek z nerki kanguroszczura PtK2 fibroblasty z embrionu kurczęcia 2:1 1,7:1 1,9:1 3,5 4,2:1 Fibroblasty ludzkie KD i HuT12 1,7:1 [69] Wciąż niejasna pozostaje odpowiedź na pytanie, dlaczego istnieją dwie, tak do siebie podobne, cytoplazmatyczne izoformy aktyny, czy pełnią one w komórce różne funkcje, jaka jest ich wewnątrzkomórkowa lokalizacja oraz czy zmieniona ekspresja ich genów ma związek z występowaniem w organizmie określonych stanów patologicznych. Różnice w polimeryzacji aktyn cytoplazmatycznych oraz w ich oddziaływaniu z białkami regulującymi ten proces, skłaniają do postawienia hipotezy, iż mogą one pełnić w komórce odmienne funkcje. Wciąż przybywa również doniesień na temat ich zróżnicowanego poziomu w komórkach oraz subkomórkowego rozmieszczenia. Proporcja cytoplazmatycznych izoform aktyny nie jest wartością stałą i ściśle zależy od typu komórek, w których one występują [3,5]. Stosunek izoformy β do γ w różnych tkankach szczura waha w granicach od 1:1 w jądrach, poprzez 2,5:1 w wątrobie aż do 6:1 w aorcie [5]. Zazwyczaj jednak stosunek tych izoform wynosi 2:1 (aktyny β:γ) [6,19]. Istnieją jednak wyjątki od tej reguły. W komórkach włoskowatych ucha środkowego (ang. auditory hair cells) stosunek ten jest odwrotny [20], zaś erytrocyty ssaków zawierają tylko aktynę β [22]. W rozwoju embrionalnym szczura, niezależnie od tkanki, dominują cytoplazmatyczne izoformy aktyny [5]. Sugeruje się, iż w całej puli mrna obecnego na wczesnych etapach oogenezy i w embrionach myszy to mrna kodujące cytoplazmatyczne izoformy aktyny występuje najpowszechniej [23]. Aktyny β i γ to również jedyne izoformy aktyny syntetyzowane w oocytach podczas mejozy wykazują one w tym czasie zróżnicowaną lokalizację i funkcję [24]. W [66] [67] Mysie mioblasty C2 2:1 [56] [67] trakcie różnicowania komórek mięśni gładkich obniża się poziom aktyny β, a α aktyna mięśni gładkich staje się dominującą izoformą. Miogeneza mięśni szkieletowych również charakteryzuje się zmniejszeniem poziomu form niemięśniowych aktyny przy jednoczesnym wzroście poziomu izoform specyficznych dla mięśni [25], przy czym ekspresja genu aktyny β zostaje znacząco zmniejszona, w przeciwieństwie do aktyny γ, która pozostaje zlokalizowana w kostamerach i błonie plazmatycznej komórek dojrzałych mięśni szkieletowych [21,25] (Tab.1). 288 www.postepybiochemii.pl

Tabela 2. Zmiany poziomu aktyn cytoplazmatycznych w różnych typach nowotworów. Typ nowotworu Poziom aktyn β/γ Piśmiennictwo Komórki ludzkiej białaczki obie izoformy w równych proporcjach (komórki prawidłowe nadmiar β w stosunku do γ) [70] Ludzki nowotwór ślinianek obniżenie poziomu aktyny γ [71] Nowotwór jelita grubego inwazyjne sublinie: EB3,3LNLN, 5W podwyższenie poziomu aktyny β [27] Komórki linii MDCK transformowane wirusem MSV (wysokoinwazyjne) podwyższenie poziomu aktyny β [26] Inwazyjny wariant czerniaka T1C1 podwyższenie poziomu aktyny β [28] Linia nowotworu jelita grubego o wysokiej inwazyjności wyselekcjonowana przy udziale paxlitaxelu podwyższenie poziomu aktyny β [29] Zmiana poziomu ekspresji genów izoform aktyny często towarzyszy procesom patologicznym. Lista chorób związanych z jakościowymi i ilościowymi zmianami w obrębie aktyn takimi jak mutacje, zmiana ekspresji genów, poziomu aktyn w komórce czy stanu ich spolimeryzowania, ciągle rośnie. Zwiększony poziom cytoplazmatycznych izoform aktyny towarzyszy wielu typom nowotworów, takim jak: chemicznie indukowany nowotwór skóry, nowotwór wątroby, chłoniak i nowotwór piersi [5]. Poziom aktyny β jest niejednokrotnie podwyższony w komórkach o wysokiej inwazyjności [26,27]. Znaczący wzrost jej stężenia odnotowano w przypadku wyselekcjonowanych, inwazyjnych wariantów nowotworu jelita grubego [27], komórek linii MDCK transformowanych wirusem MSV [26] oraz czerniaka T1C2 [28]. Poziom ekspresji genu tej izoformy jest również podwyższony, w stosunku do linii macierzystej, w bardzo inwazyjnej linii nowotworu jelita grubego wyselekcjonowanej przy użyciu paxlitaxelu [29]. Natomiast mutacja w genie kodującym aktynę γ, powodująca zanik lub zmniejszenie jej syntezy, w komórkach ostrej białaczki limfoblastycznej sprawia, iż komórki te stają się mniej podatne na leki, których celem są mikrotubule [30]. Ponadto limfocyty syntetyzują aktynę β w znaczącym nadmiarze w stosunku do aktyny γ, podczas gdy ich białaczkowe odpowiedniki zawierają obie izoformy w równych proporcjach [31] (Tab. 2). Zaburzenia w poziomie izoform aktyny nie są jednak związane wyłącznie z chorobami nowotworowymi. Mutacja punktowa w obrębie genu aktyny β powoduje, że powstają neutrofile odznaczające się słabszą odpowiedzią chemotaktyczną i zredukowaną zdolnością do tworzenia nadtlenków [32]. Inna mutacja w obrębie tego samego genu (Arg183Trp) sprawia, iż powstające filamenty są tak stabilne, że nie ulegają depolimeryzacji przy udziale kofiliny. Prowadzi to do zniekształceń w trakcie rozwoju płodu, utraty słuchu oraz dystonii [33]. Za utratę słuchu odpowiada również mutacja Thr278Ile w genie kodującym cytoplazmatyczną aktynę γ. Zmiana ta osłabia całe filamenty, zaburzając tym samym proces ich odnowy w obrębie stereociliów [34]. Poziom aktyny γ jest też zmieniony w przypadku dystrofii mięśniowej Duchenne a. W chorobie tej na skutek mutacji w genie kodującym dystrofinę, nie dochodzi do powstania funkcjonalnego białka. W mięśniach prążkowanych, w których nie występuje dystrofina, odnotowano znacznie podwyższony poziom aktyny γ. Jej zadaniem jest prawdopodobnie przynajmniej częściowa kompensacja braku dystrofiny [35] (Tab. 3). Dotychczas wiele prac wskazywało na to, iż aktyna β obecna jest w migrujących komórkach w obszarze podbłonowym i na krawędzi wiodącej komórki, gdzie buduje wypustki komórkowe. Przypisywano jej główną rolę w procesie migracji i gojenia się ran. Natomiast aktynę γ lokalizowano w obrębie włókien naprężeniowych, gdzie miała odpowiadać za utrzymanie kształtu komórki i jej odporność mechaniczną [19,36]. Obecność aktyny γ na krawędzi wiodącej nie była jednak wykluczana. Jej detekcja była przez lata utrudniona ze względu na brak wystarczająco specyficznych przeciwciał. Aktynę tą lokalizowano zatem pośrednio w obszarach komórki wykazujących obecność aktyny w formie filamentów, nie barwiącej się przy użyciu przeciwciał skierowanych przeciwko aktynie β [37]. W ostatnich latach, przy użyciu nowych przeciwciał, skierowanych selektywnie przeciwko poszczególnym izoformom aktyny, stwierdzono jednak, że to β aktyna jest Tabela 3. Wpływ mutacji w genach kodujących cytoplazmatyczne aktyny na organizację cytoszkieletu komórek. Typ mutacji Efekty mutacji Piśmiennictwo Ostra białaczka limfoblastyczna mutacje w obrębie genu kodującego aktynę γ obniżenie poziomu aktyny γ (Val103Leu, Asp187His, Thr162Met, Pro98Leu) Neutrofile mutacja punktowa w genie aktyny β (Glu364Lys) Mutacja punktowa w genie aktyny β (Arg183Trp) Mutacja w genie kodującym aktynę γ (Thr278Ile) zmniejszona podatność na leki skierowane przeciwko mikrotubulom słabsza odpowiedź chemotaktyczna komórek i zdolność do tworzenia nadtlenków, a w konsekwencji: upośledzenie umysłowe, nadwrażliwość na światło, skłonność do infekcji bardzo stabilne filamenty, brak depolimeryzacji, a w konsekwencji: zniekształcenia w trakcie rozwoju płodu, uszkodzenia słuchu, dystonia osłabienie filamentów, zaburzenie odnowy stereociliów, a w konsekwencji utrata słuchu [30] [32] [33] [34] Postępy Biochemii 59 (3) 2013 289

obecna we włóknach naprężeniowych, a aktyna γ pojawia się na wiodącym końcu migrującej komórki [37]. Dugina i wsp. postulują, że w fibroblastach aktyna β obecna jest w wiązkach aktynowych wchodzących w skład włókien naprężeniowych, filopodiów, pierścienia kurczliwego i w obszarze kontaktu komórka komórka. Natomiast aktyna γ buduje sieć aktynową w obszarze podbłonowym i w lamellipodiach [37]. Różnice w wykazanej lokalizacji w stosunku do prac wcześniejszych badaczy są tłumaczone faktem, iż dostępność epitopów w bardzo dużym stopniu zależy od warunków utrwalania i permeabilizacji komórek. W trakcie tego eksperymentu do tworzenia porów w błonie komórkowej używano metanolu, a nie jak wcześniej Tritonu X-100. Pozwoliło to na uwidocznienie wbudowywania aktyny β w wiązki aktynowe (w tym włókna naprężeniowe). Powyższe dane dotyczyły lokalizacji cytoplazmatycznych izoform aktyny w komórkach prawidłowych. W komórkach nowotworowych natomiast wewnątrzkomórkowe rozmieszczenie aktyn β i γ ulega zmianie. Poglądy dotyczące tego zagadnienia są jednak zróżnicowane, w zależności od używanych w badaniach linii komórkowych. Le i wsp. wykazali, iż w transformowanych wirusem MSV komórkach MDCK aktyna β zlokalizowana jest wyłącznie w szczytowych obszarach pseudopodiów, natomiast aktyna γ obecna jest dodatkowo w ciele komórki [26]. Uzyskane przez nas wyniki eksperymentów (w trakcie publikacji), przeprowadzonych na komórkach nowotworu jelita grubego, potwierdziły powyższe obserwacje. Niemniej jednak odnotowano obecność struktur zawierających aktyny β i γ jedynie w obszarze podbłonowym komórki. Z kolei Shum Rycina 3. Schemat przedstawiający rozmieszczenie izoform aktyny β i γ w komórkach nowotworowych. Ukazuje on poglądy na temat lokalizacji tych białek w komórce i pełnionych przez nie funkcji. A) Model zakładający, iż aktyna β obecna jest w migrujących komórkach w obszarze podbłonowym i na krawędzi wiodącej komórki, gdzie buduje wypustki komórkowe i pełni główną rolę w procesie migracji. Natomiast aktynę γ zlokalizowano również w rejonie podbłonowym, a ponadto w ciele komórki, gdzie miała być odpowiedzialna za utrzymanie kształtu komórki i jej odporność mechaniczną [26] B) Model oparty na badaniach własnych (komórki nowotworu jelita grubego) wskazujący, iż zarówno aktyna β, jak i aktyna γ obecne są w obszarze krawędzi wiodącej komórki i lokalizują się w rejonie podbłonowym. W badanych komórkach nie występują włókna naprężeniowe. C) Model zakładający, iż aktyna β jest obecna we włóknach naprężeniowych i wypustkach (gdzie pełni funkcję strukturalną), a aktyna γ dominuje na wiodącym końcu komórki uczestnicząc w procesie migracji [38]. i wsp. dowodzą, iż komórki nowotworowe nerwiaka płodowego zawierają włókna naprężeniowe bogate głównie w aktynę β. Wykazują również obecność aktyny γ w rejonie peryferyjnym, w pobliżu lamelipodium [38] (Ryc. 3). Szereg niejasności pojawił się również przy określeniu lokalizacji izoform w stereociliach komórek słuchowych. Za pomocą immunofluorescencji dowiedziono, iż aktyna γ jest zlokalizowana na ich obrzeżach [39], podczas gdy badanie przy użyciu mikroskopii elektronowej wykazało, że to aktyna β jest zlokalizowana peryferyjnie, a izoforma γ w centralnej części stereociliów [40]. Opisane dane świadczą o tym, iż określenie lokalizacji cytoplazmatycznych izoform aktyny w komórce stanowi wielkie wyzwanie. Niewielkie różnice pomiędzy nimi sprawiają, że do badań niezbędne są przeciwciała o bardzo dużej specyficzności. Jednak nawet jeśli posiadamy dobrej jakości przeciwciała, na wynik eksperymentu w dużej mierze wpływają warunki w jakich został on wykonany - stężenie jonów w cytoplazmie, sposób utrwalania komórek. Ponadto niektóre struktury bogate w aktynę takie jak kostamery, centralny region stereocyliów czy włókna naprężeniowe są z natury trudne do identyfikacji. Wiązki filamentów obecne w stereocyliach lub włóknach naprężeniowych mogą pozostać niewybarwione ze względu na maskowanie epitopu lub ograniczoną penetrację przeciwciała. Ponadto kostamery są strukturami nietrwałymi i łatwo je uszkodzić podczas utrwalania i wizualizacji [10,41]. Istnieje ponadto związek pomiędzy umiejscowieniem izoform aktyny w komórce i lokalizacją kodującego je mrna. Odkryto, że występuje korelacja pomiędzy lokalizacją mrna dla aktyny β w komórce i jej potencjałem migracyjnym [42]. mrna dla aktyny β w wielu typach komórek jest zlokalizowane w pobliżu ich wiodącej krawędzi, co przyczynia się do tworzenia wypustek migracyjnych w sposób dynamiczny i wpływa na kierunek ruchu komórki [43,44]. Wykazano, że przemieszczenie tego mrna z krawędzi wiodącej do wnętrza komórki skutkuje utratą przez nią polarności i zdolności do ukierunkowanego ruchu [18,43,44]. Za właściwą lokalizację mrna odpowiedzialna jest krótka sekwencja zwana zipcode znajdująca się w obrębie regionu 3 UTR (region nie ulegający translacji) [44]. Białko ZBP1 (ang. zipcode binding protein) wiąże się z tą sekwencją w jądrze, wraz z całym mrna kodującym aktynę β przechodzi przez pory jądrowe do cytoplazmy, gdzie przy udziale białek motorycznych dociera do obsza- 290 www.postepybiochemii.pl

ru, w którym powstają zbudowane z aktyny wypustki (lamellipodia, filopodia) [45]. Wiązanie ZBP1 z mrna aktyny β powoduje, iż nie powstaje kompleks białkowy, niezbędny do przeprowadzenia procesu translacji. Zablokowane mrna jest transportowane do miejsca przeznaczenia, gdzie blokada jest znoszona przez fosforylację ZBP1, odbywającą się przy udziale kinazy Src. Modyfikacja ta powoduje dysocjację cząsteczek mrna, złożenie rybosomu i syntezę aktyny β na krawędzi wiodącej [17,46,47]. Ten sam mechanizm powoduje, iż mrna aktyny β jest kierowane do stożka wzrostu komórek nerwowych, gdzie aktyna bierze udział w odpowiedzi komórki nerwowej na sygnały pochodzące ze środowiska [48]. Ponadto białko ZBP1 wspiera tworzenie wypustek migracyjnych poprzez uruchomienie ścieżki molekularnej powodującej wzrost stopnia spolimeryzowania aktyny, co prowadzi do zwiększenia prędkości migracji komórek [49]. Lokalizacja mrna aktyny nie zawsze jednak decyduje o miejscu, w którym białko to występuje po translacji. Dla przykładu w mioblastach, mrna dla aktyny γ zlokalizowane jest w okolicy jądra i w cytoplazmie, a samo białko znajduje się w włóknach naprężeniowych i w okolicy błony komórkowej [50]. Tak więc lokalizacja mrna izoform aktyny nie jest jedynym mechanizmem decydującym o ich późniejszej lokalizacji. W ostatnich latach opisano kolejny mechanizm regulujący lokalizację i funkcjonowanie cytoplazmatycznych izoform aktyny w komórce. Jest nim arginylacja. Procesowi temu ulega zarówno β jak i γ aktyna, jednak γ aktyna wskutek tej modyfikacji staje się dużo mniej stabilna niż aktyna β, zatem szybko ulega ubikwitylacji i degradacji [54]. Proces arginylacji zachodzi przy udziale transferazy białkowej 1 Arg-tRNA (Ate 1), która przenosi resztę argininy na resztę Asp, Glu lub Cys zlokalizowaną w obszarze N-końca łańcucha polipeptydowego. Reszta argininy jest dodawana do N- końca cząsteczki aktyny β, co wpływa na zmianę organizacji jej filamentów. Arginylowana aktyna β polimeryzuje w postaci pojedynczych filamentów, podczas gdy niearginylowana aktyna γ tworzy grube, równoległe wiązki [51]. Stwarza to możliwość utrzymywania dwóch oddzielnych form spolimeryzowanej aktyny w komórce. Przed arginylacją filamenty aktyny β są obdarzone ładunkiem ujemnym ze względu na obecność reszt kwasu asparaginowego i N-końcową resztę acetylową. Dodatek argininy wprowadza dodatkowy ładunek dodatni na powierzchnię filamentu. Co piąty monomer aktyny jest arginylowany, dlatego też tworzenie filamentów z formy acetylowanej i arginylowanej prowadzi do powstania filamentów równomiernie opłaszczonych ładunkiem dodatnim (mniej więcej jedna reszta na pół obrotu helisy filamentu). Takie opłaszczenie zapobiega łączeniu się filamentów w wiązki i agregaty, natomiast brak dodatkowego ładunku powoduje ich agregację [51]. Postuluje się, iż koniec wiodący komórki może zawierać sieć filamentów aktyny tworzoną przez indywidualne filamenty aktyny β, natomiast we wnętrzu komórki przeważają grube filamenty aktyny γ [51-53]. Wywoływanie zmian ekspresji genów aktyny β i γ Istnieje szereg publikacji opisujących efekty wyciszania lub nadekspresji genów kodujących cytoplazmatyczne aktyny [39,55-60], jednak nie dostarczyły one jasnej odpowiedzi na pytanie o ich funkcjonalne zróżnicowanie w komórkach nowotworowych. Opierały się one bowiem na zniesieniu [39,58,59] lub podwyższeniu ekspresji [55] genu tylko jednej z izoform aktyny lub też bazowały na wykorzystaniu wyłącznie prawidłowych komórek, z pominięciem komórek nowotworowych [37,56]. Ponadto efektywność obu tych operacji molekularnych (tj. wyciszania i podwyższania ekspresji genów) zazwyczaj nie była wysoka [37,38,56,61]. Może to być związane z faktem, iż aktyna jest białkiem niezbędnym do prawidłowego funkcjonowania komórek, w związku z czym poziom ekspresji jej genów jest ściśle regulowany. Jeden z mechanizmów regulacyjnych, opierający się na działaniu czynnika SRF (ang. serum response factor) został opisany przez Sotiropoulosa i wsp. [62,63]. SRF, zachowane w ewolucji białko obecne w jądrze komórkowym, jest czynnikiem transkrypcyjnym, pośredniczącym w szybkiej odpowiedzi transkrypcyjnej na czynniki zewnątrzkomórkowe np. czynniki wzrostu [64]. Stwierdzono, że aktyna w formie monomerycznej, pojawiająca się w komórkach, w których podwyższono ekspresję genu aktyny, wpływa na obniżenie poziom SRF, powodując tym samym znaczący spadek ekspresji kontrolowanych przez ten czynnik genów, w tym genów aktyn β i γ [62, 65]. Podwyższenie ekspresji genu aktyny β pociąga za sobą zmianę morfologii komórek, wpływa na ich ruchliwość, podwyższając prędkość migracji niemal dwukrotnie w stosunku do komórek kontrolnych, powodując ponadto zwiększenie obszaru zajmowanego przez wypustki komórkowe [55]. Wzrostowi ekspresji genu aktyny β towarzyszy zmiana poziomu białek z nią oddziałujących, takich jak kofilina i tymozyna β [55]. W wyniku transfekcji mioblastów mysich plazmidami zawierającymi cdna dla aktyn β i γ otrzymano populacje komórek, które w przypadku aktyny β odznaczały się zwiększoną powierzchnią zajmowaną przez komórkę, natomiast w przypadku aktyny γ zmniejszoną. Ponadto komórki transfekowane plazmidem zawierającym cdna dla aktyny β posiadały rozbudowany, dobrze zorganizowany cytoszkielet, natomiast te z cdna aktyny γ wykazywały cechy przeciwne. Prawdopodobnie więc cytoszkielet mioblastu jest wypadkową cech nadawanych mu przez aktyny β i γ [56]. W modelach, w których wyciszono ekspresję genu aktyny β u myszy, zabieg ten okazał się letalny w okresie embrionalnym lub w okresie okołoporodowym [57]. Ta sama operacja wykonana w stosunku do genu aktyny γ powodowała z kolei, iż tylko pewien odsetek myszy dożywał okresu dorosłości; ta znacząca śmiertelność spowodowana była opóźnieniami rozwojowymi. Fibroblasty wyizolowane od badanych myszy miały ograniczoną żywotność, wolniej rosły, częściej ulegały apoptozie i nekrozie [39,58]. Shum i wsp. dowiedli również, iż obniżenie ekspresji genu aktyny γ w komórkach nerwiaka płodowego obniżało tempo ich migracji, badane poprzez test zarastania rysy przez te komórki [38]. Ponadto wykazano, iż komórki z obniżoną, wskutek wyciszenia genu, zawartością aktyny β, zwiększały swoją powierzchnię, wykazywały obecność wielu wypustek i zmniejszoną zawartość włókien naprężeniowych. Postępy Biochemii 59 (3) 2013 291

Tabela 4. Wpływ zmian ekspresji genów aktyn cytoplazmatycznych na właściwości komórek. Typ komórek Mioblasty Mysie mioblasty Szczurze fibroblasty Mysz Mysz Embrionalne fibroblasty myszy Mysz Embrionalne fibroblasty myszy Komórki nerwiaka płodowego (neuroblastoma) Embrionalne fibroblasty myszy Podwyższenie/wyciszanie/ wyłączanie ekspresji genu podwyższenie ekspresji genu aktyny β podwyższenie ekspresji genu aktyny β podwyższenie ekspresji genu aktyny γ obniżenie ekspresji aktyny β obniżenie ekspresji aktyny γ wyłączenie ekspresji genu aktyny γ (knock out) wyłączenie ekspresji genu aktyny γ (knock out) wyłączenie ekspresji genu aktyny β (knock out) obniżenie ekspresji genu aktyny γ wyłączenie ekspresji genu aktyny β (knock out) Wpływ na funkcjonowanie komórki zmiana morfologii komórek podwyższenie prędkości migracji zwiększenie obszaru zajmowanego przez wypustki komórkowe zwiększenie powierzchni komórki rozbudowany, dobrze zorganizowany cytoszkielet zmniejszenie powierzchni komórki mniej uporządkowana organizacja filamentów aktynowych wzrost powierzchni komórki zmniejszenie ilości włókien naprężeniowych obecność większych wypustek komórkowych utrzymanie prędkości migracji komórek fenotyp obkurczony pojawienie się grubych wiązek aktynowych zmniejszony obszar zajmowany przez lamellipodia zmniejszenie tempa migracji komórek zwiększona śmiertelność utrata słuchu większość myszy umierała w ciągu 48h od porodu zaburzenia wzrostu zmniejszona przeżywalność prędkość migracji nie uległa zmianie całkowita śmiertelność embrionów myszy zaburzenia wzrostu komórek zmniejszona dynamika powstawania wypustek zwiększona liczba ognisk adhezyjnych zmniejszenie prędkości migracji podniesienia stopnia polimeryzacji aktyny (F:G) zmniejszenie tempa migracji zmniejszenie prędkości migracji utrata polarności komórek wzrost ilości ognisk adhezyjnych zmieniona morfologia zmniejszone zdolności migracyjne Piśmiennictwo [55] [56] [37] [39] [58] [60] [38] [59] Natomiast te o obniżonej ekspresji genu aktyny γ nabywały fenotyp obkurczony, z grubymi pęczkami aktyny i zmniejszoną powierzchnią struktur typu lamellipodiów. Dane te zdają się być w opozycji w stosunku do wyników uzyskanych w przypadku podwyższenia syntezy cytoplazmatycznych aktyn [55], może to jednak wynikać z faktu, iż w opisanych eksperymentach zastosowano różne modele komórkowe. Ponadto fibroblasty z obniżoną ekspresja genów kodujących obydwie cytoplazmatyczne izoformy wykazywały zmiany w ruchliwości w stosunku do nietransfekowanych komórek kontrolnych (zmniejszenie tempa migracji itd.), co sugeruje, że każda z nich odgrywa specyficzną rolę w procesie migracji [37] (Tab. 4). Podsumowanie Przedstawione wyniki badań nie dają jednoznacznej odpowiedzi na pytanie o celowość istnienia w komórce dwóch cytoplazmatycznych izoform aktyny. Choć wciąż pojawiają się nowe doniesienia dotyczące zmian ich poziomu, lokalizacji i pełnionej przez nie funkcji, nie tworzą one spójnego obrazu roli tych białek w komórce. Proporcja cytoplazmatycznych izoform aktyny nie jest wartością stałą i ściśle zależy od typu komórek, w których one występują. Ponadto zmiana poziomu ekspresji izoform aktyny często towarzyszy procesom patologicznym, w tym procesowi nowotworzenia. Dane dotyczące lokalizacji cytoplazmatycznych izoform aktyny w komórce oraz pełnionej przez nie funkcji w komórkach prawidłowych ulegały zmianie na przestrzeni ostatnich lat. Początkowo aktynę β lokalizowano w obrębie krawędzi wiodącej i przypisywano jej preferencyjny udział w migracji komórki, zaś aktynę γ sytuowano we włóknach naprężeniowych, gdzie miała pełnić funkcję strukturalną. W ostatnich latach pojawiły się odmienne doniesienia wskazujące na podbłonową lokalizację odpowiadającej za migrację komórki aktyny γ, zaś obecność aktyny β wykazano w obrębie wiązek aktynowych wchodzących w skład włókien naprężeniowych i filopodiów. W komórkach nowotworowych natomiast wewnątrzkomórkowe rozmieszczenie aktyn β i γ ulega zmianie. Doświadczenia przeprowadzone przez nas na komórkach nowotworu jelita grubego wykazały, iż obie cytoplazmatyczne izoformy aktyny obecne są w obszarze podbłonowym i uczestniczą w migracji komórki. Z uwagi na funkcję którą aktyna pełni zarówno w normalnych, jak i w nowotworowych komórkach, badania zmian ilościowych i jakościowych tego białka powinny być kontynuowane. Rola aktyny w kształtowaniu morfologii komórki i jej migracji czyni ją bardzo istotnym elementem na drodze do zrozumienia molekularnego mechanizmu wielu chorób, a szczególnie procesu wzrostu i rozprzestrzeniania nowotworów. Zdobywanie kolejnych informacji związanych z ustaleniem szczegółowej roli izoform aktyny w funkcjonowaniu komórki, może prowadzić do odkrycia elementów systemu regulującego reorganizację cytoszkieletu, które mogłyby stanowić cel terapii antynowotworowej. 292 www.postepybiochemii.pl

PIŚMIENNICTWO 1. McDonald D, Carrero G, Andrin C, de Vries G, Hendzel MJ (2006) Nucleoplasmic beta-actin exists in a dynamic equilibrium between low-mobility polymeric species and rapidly diffusing populations. J Cell Biol 172: 541-552 2. Migocka-Patrzałek M, Malicka-Błaszkiewicz M (2009) Aktyna w jądrze komórkowym. Postepy Biochem 55: 232-238 3. Sheterline P, Clayton J, Sparrow JC (1995) Protein Profile. Actin. Oxford University Press 2: 1-103 4. Vandekerckhove J, Weber K (1978) At least s 524 ix different actins are expressed in a higher mammal: an analysis based on the amino acid sequence of the amino-terminaltryptic peptide. J Mol Biol 126: 783-802 5. Nowak D, Malicka-Błaszkiewicz M (1999) Izoformy aktyny. Zróżnicowanie funkcji, zmiany w stanach patologicznych. Postepy Biochem 45: 261-269 6. Bergeron SE, Zhu M, Thiem SM, Friderici KH, Rubenstein PA (2010) Ion-dependent polymerization differences between mammalian betaand gamma-nonmuscle actin isoforms. J Biol Chem 285: 16087-16095 7. Terman JR, Kashina A (2013) Post-translational modification and regulation of actin. Curr Opin Cell Biol 25: 30-38 8. Kabsch W, Mannherz HG, Suck D, Pai EF, Holmes KC (1990) Atomic structure of the actin:dnase I complex. Nature 347: 37-44 9. Pollard TD, Borisy GG (2003) Cellular motility driven by assembly and disassembly of actin filaments. Cell 112 :453-465 10. Perrin BJ, Ervasti JM (2010) The actin gene family: function follows isoform. Cytoskeleton (Hoboken) 67: 630-634 11. Dos Remedios CG, Chhabra D, Kekic M, Dedova IV, Tsubakihara M, Berry DA, Nosworthy NJ (2003) Actin binding proteins: regulation of cytoskeletal microfilaments. Physiol Rev 83:433-473 12. Moraczewska J, Sliwińska M, Redowicz MJ (2012) Udział jonów wapnia w regulacji oddziaływań aktyny z miozyną. Postepy Biochem 58: 437-451 13. Dominguez R (2009) Actin filament nucleation and elongation factors- -structure-function relationships. Crit Rev Biochem Mol Biol 44: 351-366 14. Lambrechts A, Van Troys M, Ampe C (2004) The actin cytoskeleton in normal and pathological cell motility. Int J Biochem Cell Biol 36: 1890-1909 15. Pollard TD, Cooper JA (2009) Actin, a central player in cell shape and movement. Science 326: 1208-1212 16. De La Cruz E (2005) Cofilin binding to muscle and non-muscle actin filaments: isoform-dependent cooperative interactions. J Mol Biol 346: 557-564 17. Khaitlina SY (2007) Mechanisms of Spatial Segregation of Actin Isoforms. Cell Tissue Biol 1: 293-304 18. Popow A, Nowak D, Malicka-Błaszkiewicz M (2006) Actin cytoskeleton and beta-actin expression in correlation with higher invasiveness of selected hepatoma Morris 5123 cells. J Physiol Pharmacol 57 Suppl 7: 111-123 19. Khaitlina SY (2001) Functional specificity of actin isoforms. Int Rev Cytol 202: 35-98 20. Höfer D, Ness W, Drenckhahn D (1997) Sorting of actin isoforms in chicken auditory hair cells. J Cell Sci 110: 765-770 21. Rybakova IN, Patel JR, Ervasti JM (2000) The dystrophin complex forms a mechanically strong link between the sarcolemma and costameric actin. J Cell Biol 150: 1209-1214 22. Pinder JC, Gratzer WB (1983) Structural and dynamic states of actin in the erythrocyte. J Cell Biol 96: 768-775 23. Bachvarova R, Cohen EM, De Leon V, Tokunaga K, Sakiyama S, Paynton BV (1989) Amounts and modulation of actin mrnas in mouse oocytes and embryos. Development 106: 561-565 24. Brockmann C, Huarte J, Dugina V, Challet L, Rey E, Conne B, Swetloff A, Nef S, Chaponnier C, Vassalli JD (2011) Beta- and gamma-cytoplasmic actins are required for meiosis in mouse oocytes. Biol Reprod 85: 1025-1039 25. Lloyd CM, Berendse M, Lloyd DG, Schevzov G, Grounds MD (2004) A novel role for non-muscle gamma-actin in skeletal muscle sarcomere assembly. Exp Cell Res 297: 82-96 26. Le PU, Nguyen TN, Drolet-Savoie P, Leclerc N, Nabi LR (1998) Increased β-actin expression in an invasive Moloney sarcoma virustransformed MDCK cell variant concentrates to the tips of multiple pseudopodia. Cancer Res 58: 1631-1635 27. Nowak D, Skwarek-Maruszewska A, Zemanek-Zboch M, Malicka- Błaszkiewicz M (2005) β-actin in human colon adenocarcinoma cell lines with different metastatic potential. Acta Biochim Pol 52: 461-468 28. Goidin D, Mamessier A, Staquet MJ, Schmitt D, Berthier-Vergnes O (2001) Ribosomal 18S RNA prevails over glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase and beta-actin genes as internal standard for quantitative comparison of mrna levels in invasive and noninvasive human melanoma cell subpopulations. Anal Biochem 295: 17-21 29. Dowling P, Maurya P, Meleady P, Glynn SA, Dowd AJ, Henry M, Clynes M (2007) Purification and identification of a 7.6-kDa protein in media conditioned by superinvasive cancer cells. Anticancer Res 27: 1309-1317 30. Verrills NM, Po uha ST, Liu ML, Liaw TY, Larsen MR, Ivery MT, Marshall GM, Gunning PW, Kavallaris MJ (2006) Alterations in gammaactin and tubulin-targeted drug resistance in childhood leukemia. Natl Cancer Inst 98: 1363-1374 31. Nagata K, Ichikawa Y (1984) Changes in actin during differentiation. Cell Muscle Motil 5: 171-193 32. Nunoi H, Yamazaki T, Tsuchiya H, Kato S, Malech HL, Matsuda I, Kanegasaki S (1999) A heterozygous mutation of beta-actin associated with neutrophil dysfunction and recurrent infection. Proc Natl Acad Sci USA 96: 8693-8698 33. Procaccio V, Salazar G, Ono S, Styers ML, Gearing M, Davila A, Jimenez R, Juncos J, Gutekunst CA, Meroni G, Fontanella B, Sontag E, Sontag JM, Faundez V, Wainer BH (2006) A mutation of beta -actin that alters depolymerization dynamics is associated with autosomal dominant developmental malformations, deafness, and dystonia. Am J Hum Genet 78: 947-960 34. Van Wijk E, Krieger E, Kemperman MH, De Leenheer EM, Huygen PL, Cremers CW, Cremers FP, Kremer H (2003) A mutation in the gamma actin 1 (ACTG1) gene causes autosomal dominant hearing loss (DFNA20/26). J Med Genet 40: 879-884 35. Prins KW, Lowe DA, Ervasti JM (2008) Skeletal muscle-specific ablation of gamma(cyto)-actin does not exacerbate the mdx phenotype. PLoS One 3: e2419 36. Hoock TC, Newcomb PM, Herman IM (1991) Beta actin and its mrna are localized at the plasma membrane and the regions of moving cytoplasm during the cellular response to injury. J Cell Biol 112: 653-664 37. Dugina V, Zwaenepoel I, Gabbiani G, Clement S, Chaponnier C (2009) β and γ cytoplasmic actins display distinct distribution and functional diversity. J Cell Sci 122: 2980-2988 38. Shum MS, Pasquier E, Po uha ST, O Neill GM, Chaponnier C, Gunning PW, Kavallaris M (2011) γ-actin regulates cell migration and modulates the ROCK signaling pathway. FASEB J 25: 4423-4433 39. Belyantseva IA, Perrin BJ, Sonnemann KJ, Zhu M, Stepanyan R, McGee J, Frolenkov GI, Walsh EJ, Friderici KH, Friedman TB (2009) Gamma-actin is required for cytoskeletal maintenance but not development. Proc Natl Acad Sci USA 106: 9703-9708 40. Furness DN, Katori Y, Mahendrasingam S, Hackney CM (2005) Differential distribution of beta- and gamma-actin in guinea-pig cochlear sensory and supporting cells. Hear Res 207: 22-34 41. Franke WW, Stehr S, Stumpp S, Kuhn C, Heid H, Rackwitz HR, Schnölzer M, Baumann R, Holzhausen HJ, Moll R (1996) Specific immunohistochemical detection of cardiac/fetal alpha-actin in human cardiomyocytes and regenerating skeletal muscle cells. Differentiation 60: 245-250 42. Shestakova EA, Wyckoff J, Jones J, Singer RH, Condeelis J (1999) Correlation of beta-actin messenger RNA localization with metastatic potential in rat adenocarcinoma cell lines. Cancer Res 59: 1202-1205 Postępy Biochemii 59 (3) 2013 293

43. Kislauskis EH, Zhu X, Singer RH (1997) beta-actin messenger RNA localization and protein synthesis augment cell motility. J Cell Biol 136: 1263-1270 44. Condeelis J, Singer RH (2005) How and why does beta-actin mrna target? Biol Cell 97: 97-110 45. Oleynikov Y, Singer RH (2003) Real-time visualization of ZBP1 association with beta-actin mrna during transcription and localization. Curr Biol 13: 199-207 46. Hüttelmaier S, Zenklusen D, Lederer M, Dictenberg J, Lorenz M, Meng X, Bassell GJ, Condeelis J, Singer RH (2005) Spatial regulation of beta-actin translation by Src-dependent phosphorylation of ZBP1. Nature 438: 512-515 47. Farina KL, Huttelmaier S, Musunuru K, Darnell R, Singer RH (2003) Two ZBP1 KH domains facilitate beta-actin mrna localization, granule formation, and cytoskeletal attachment. J Cell Biol 160: 77-87 48. Ming GL (2006) Turning by asymmetric actin. Nat Neurosci 9: 1201-1203 49. Stöhr N, Hüttelmaier S (2012) IGF2BP1: a post-transcriptional «driver» of tumor cell migration. Cell Adh Migr 6: 312-318 50. Hill MA, Gunning P (1993) Beta and gamma actin mrnas are differentially located within myoblasts. J Cell Biol 122: 825-832 51. Karakozova M, Kozak M, Wong CC, Bailey AO, Yates JR 3rd, Mogilner A, Zebroski H, Kashina A (2006) Arginylation of beta-actin regulates actin cytoskeleton and cell motility. Science 313: 192-196 52. Kashina AS (2006) Differential arginylation of actin isoforms: the mystery of the actin N-terminus. Trends Cell Biol 16: 610-615 53. Bulinski JC (2006) Cell biology. Actin discrimination. Science 313: 180-181 54. Zhang F, Saha S, Shabalina SA, Kashina A (2010) Differential arginylation of actin isoforms is regulated by coding sequence-dependent degradation. Science 329: 1534-1537 55. Peckham M, Miller G, Wells C (2001) Specific changes to the mechanism of cell locomotion induced by overexpression of β actin. J Cell Sci 114: 1367-1377 56. Schevzov G, Lloyd C, Gunning P (1992) High level expression of transfected beta- and gamma-actin genes differentially impacts on myoblast cytoarchitecture. J Cell Biol 117: 775-785 57. Shmerling D, Danzer CP, Mao X, Boisclair J, Haffner M, Lemaistre M, Schuler V, Kaeslin E, Korn R, Bürki K, Ledermann B, Kinzel B, Müller M (2005) Strong and ubiquitous expression of transgenes targeted into the beta-actin locus by Cre/lox cassette replacement. Genesis 42: 229-235 58. Bunnell TM, Ervasti JM (2010) Delayed embryonic development and impaired cell growth and survival in Actg1 null mice. Cytoskeleton (Hoboken) 67: 564-572 59. Tondeleir D, Lambrechts A, Müller M, Jonckheere V, Doll T, Vandamme D, Bakkali K, Waterschoot D, Lemaistre M, Debeir O, Decaestecker C, Hinz B, Staes A, Timmerman E, Colaert N, Gevaert K, Vandekerckhove J, Ampe C (2012) Cells lacking β-actin are genetically reprogrammed and maintain conditional migratory capacity. Mol Cell Proteomics 11: 255-271 60. Bunnell TM, Burbach BJ, Shimizu Y, Ervasti JM (2011) β-actin specifically controls cell growth, migration and the G-actin pool. Mol Biol Cell 22: 4047-4058 61. Choidas A, Jungbluth A, Sechi A, Murphy J, Ullrich A, Marriott G (1998) The suitability and application of a GFP-actin fusion protein for long-term imaging of the organization and dynamics of the cytoskeleton in mammalian cells. Eur J Cell Biol 77: 81-90 62. Sotiropoulos A, Gineitis D, Copeland J, Treisman R (1999) Signal-regulated activation of serum response factor is mediated by changes in actin dynamics. Cell 98: 159-169 63. Posern G, Treisman R (2006) Actin together: serum response factor, its cofactors and the link to signal transduction. Trends Cell Biol 16: 588-596 64. Arsenian S, Weinhold B, Oelgeschläger M, Rüther U, Nordheim A (1998) Serum response factor is essential for mesoderm formation during mouse embryogenesis. EMBO J 17: 6289-6299 65. Posern G, Sotiropoulos A, Treisman R (2002) Mutant actins demonstrate a role for unpolymerized actin in control of transcription by serum response factor. Mol Biol Cell 13: 4167-4178 66. Otey CA, Kalnoski MH, Bulinski JC. (1987) Identification and quantification of actin isoforms in vertebrate cells and tissues. J Cell Biochem 34: 113-124 67. Vandekerckhove J, Weber K (1981) Actin Typing on Total Cellular Extracts. A Highly Sensitive Protein chemical Procedure Able to Distinguish Different Actins. Eur J Biochem 113: 395-403 68. Gordon DJ, Boyer JL, Korn ED (1977) Comparative biochemistry of non-muscle actins. J Biol Chem 252: 8300-8309 69. Leavitt J, Ng SY, Aebi U, Varma M, Latter G, Burbeck S, Kedes L, Gunning P (1987) Expression of transfected mutant β-actin genes: alterations in cell morphology and evidence for autoregulation in actin pool. Mol Cell Biol 7: 2457-2466 70. Leavitt J, Leavitt A, Attallah AM (1980) Dissimilar modes of expression of beta- and gamma-actin in normal and leukemic human T lymphocytes. J Biol Chem 255: 4984-4987 71. Suzuki H, Nagata H, Shimada Y, Konno A (1998) Decrease in gamma- -actin expression, disruption of actin microfilaments and alterations in cell adhesion systems associated with acquisition of metastatic capacity in human salivary gland adenocarcinoma cell clones. Int J Oncol 12: 1079-1084 Functional diversification of cytoplasmic actin isoforms Aleksandra Simiczyjew, Maria Malicka-Błaszkiewicz, Dorota Nowak Department of Cell Pathology, Faculty of Biotechnology, University of Wroclaw, 63/77 Przybyszewskiego St., 51-148 Wrocław, Poland e-mail:dorotan@ibmb.uni.wroc.pl Key words: cytoplasmic actin isoforms ABSTRACT The actin family consists of highly conservative proteins, abundant in all eukaryotic cells. Actin plays different roles in cell functioning including cell motility, maintenance of cell shape, signal transduction and transcription. The β and γ cytoplasmic actins are ubiquitously present in all cell types and are essential for cell survival. They differ only by four amino acids located at the N-terminus of the polypeptide chain. The proportion of cytoplasmic actins varies and depends on the cell type. In addition, it changes in pathological conditions. There is also some evidence that β and γ actins are located in different cytoplasmic areas, what suggests functional differences between them. Studies conducted in recent years, demonstrating the increase or reduction of cytoplasmic actin isoforms expression allow for better understanding of the role of these proteins in cell functioning. In this article, we present contemporary view on this subject. 294 www.postepybiochemii.pl