SPEKTROSKOPIA MRJ BIAŁEK MIĘŚNIOWYCH

Transkrypt

1 SPEKTROSKOPIA MRJ BIAŁEK MIĘŚNIOWYCH Genowefa Ślósarek Zakład Biofizyki Molekularnej, Instytut Fizyki Uniwersytet im. A Mickiewicza ul Umultowska 85, Poznań Badania podstawowe nad mięśniami prowadzone metodami naukowymi miały swój początek w drugiej połowie siedemnastego wieku [1]. W 1682 r holenderski przyrodnik Antony van Leeuwenhoek ( ) badając tkanki mięśni szkieletowych pod mikroskopem odkrył ich poprzeczne prążki. Dalszy rozwój tej dziedziny badań był jednak dość złożony [ 1,2] Na uwagę zasługuje między innymi fakt, że wiele ciekawych obserwacji dotyczących mięśni, a opisanych w XIX wieku, uległo zapomnieniu. Były one potem odkrywane ponownie w XX wieku, po Drugiej Wojnie Światowej. Ilość zebranych danych doświadczalnych jakimi dysponujemy obecnie jest ogromna. Mimo to, do dzisiejszego dnia mechanizm skurczu mięśnia nie został opisany na poziomie atomowym. Intensywne prace prowadzone w oparciu o najnowsze techniki badawcze, jak mikroskopia elektronowa, nowoczesna krystalografia i spektroskopia magnetycznego rezonansu jądrowego, pozwolą zapewne na osiągnięcie tego celu już w niedalekiej przyszłości. Budowa mięśni szkieletowych [3] Tkanka mięśni szkieletowych zbudowana jest z włókien mięśniowych Przy czym pojedyncze włókno mięśniowe to jedna komórka powstała z połączenia szeregu mioblastów. W związku z tym zawiera ona dużą liczbę jąder komórkowych rozłożonych na powierzchni, tuż pod błoną. Większą część komórki zajmuje natomiast wyspecjalizowany układ białek mięśniowych odpowiedzialny za skurcz mięśnia. Białka te tworzą formy włókniste zwane miofibrylami. Rozciągają się one wzdłuż całej komórki mięśniowej. Elementami strukturalnymi miofibryli są sarkotnery. Pasma jasne w prążkowanym wzorze miofibrylu znajdują się na obu końcach pojedynczego sarkomeru. Przedziela je linia Z, która stanowi jednocześnie granicę mrędzy dwoma sąsiadującymi sarkomerami. Na środku pasma ciemnego, znajdującego się w środkowej części sarkomeru biegnie linia M. Podstawowymi elementami tworzącymi sarkomer i pośrednio odpowiedzialnymi za zróżnicowanie pasm jasnych i ciemnych są odpowiednio filamenty cienkie i filamenty grube Filamenty cienkie połączone są między sobą na linii Z i biegną wzdłuż osi sarkomeru, w kierunku linii M. Filamenty grube połączone są ze sobą na linii M i biegną równolegle do osi sarkomeru, w kierunku linii Z. Postawowym składnikiem filamentu grubego jest miozyna ( m.cz. 510 kda ), natomiast podstawowym składnikiem filamentu cienkiego jest aktyna ( racz 42 kda ). Obe białka występują w komórce mięśniowej w postaci polimerów. Szczegółowa analiza wykazuje jednak, że budowa filamentów jest bardzo złożona. Dla przykładu w filamencie cienkim polimery' aktyny oplecione są przez łańcuchy tropomiozyny ( m.cz. 64 kda ), a co siedem jednostek aktyny pojawia się kompleks trzech białek troponiny ( Tn-T m.cz. 30 kda, Tn-1 m cz. 30 kda i Tn-C in.cz 18 kda ). Kompleks troponiny, a w szczególności troponina C, spełnia bardzo ważną rolę w procesie skurczu mięśnia. W chwili gdy cząsteczka troponiny C przyłącza jony Ca 2 " wstrzykiwane do wnętrza komórki mięśniowej, mają miejsce złożone przemiany strukturalne w filamencie cienkim. Powodują one między innymi przesunięcie tropomiozyny względem aktyny Mmożliwe jest wtedy bezpośrednie oddziaływanie aktyny z 203 Il llllllllll PL

2 miozyną, co stanowi podstawę mechanizmu skurczu mięśnia. W wyniku tego oddziaływania, połączonego z hydrolizą ATP, filamenty - gruby i cienki - przesuwają się wzajemnie względem siebie powodując w ten sposób wydłużanie lub skracanie komórki mięśniowej. Analiza strukturalna białek mięśniowych Już na podstawie tego bardzo uproszczonego i bardzo zwięzłego opisu komórki mięśniowej widać, ze mamy tu do czynienia ze zbiorem białek o dużych masach cząsteczkowych Tworzą one jednocześnie złożone układy supramolekularne, uwikłane w skomplikowane procesy wzajemnego oddziaływania Analiza strukturalna na poziomie atomowym jest więc zagadnieniem bardzo skomplikowanym. Największe osiągnięcia zanotowano tu posługując się metodami analizy rentgenograficznej. Rozwiązana została między innymi struktura krystaliczna troponiny C [4], aktyny w kompleksie z DNasą I [5] oraz w kompleksie z gelsoliną [6], a także struktura fragmentu Sl miozyny [7] Zastosowanie spektroskopii magnetycznego rezonansu jądrowego jest bardzo utrudnione ze względu na dużą masę cząsteczkową analizowanych makrocząsteczek Posługując się znaną procedurą analizy strukturalnej, przedstawioną schematycznie na rysunku ( Rys 1 ), możemy prowadzić badania dla białek o masie cząsteczkowej nie przekraczającej IcDa. Przy zastosowaniu skomplikowanej techniki znakowania izotopowego granicę tę można przesunąć do około 20 kda. Tym samym badania nad białkami mięśniowymi przy wykorzystaniu spektroskopii MRJ są z konieczności fragmentaryczne Oznacza to, że przedmiotem badań są fragmenty łańcuchów peptydowych poszczególnych białek lub tez w pomiarach wykorzystywane są różnego rodzaju sondy molekularne umożliwiające rejestrację sygnałów od jąder rzadkich ( np. jąder 19 F ). Mimo tych trudności badania przy użyciu spektroskopii MRJ są prowadzone już od wielu lat [8]. Analiza dynamiki molekularnej polimeru aktyny Przykładem analizy strukturalnej białek mięśniowych, prowadzonej przy wykorzystaniu spektroskopii MRJ, mogą być wykonane przez nas ostatnio badania dynamiki molekularnej polimeru aktyny Celem tych badań było określenie wpływu jonu metalu dwuwartościowego na dynamikę molekularną białka Aktyna zbudowana jest z jednego łańcucha polipeptydowego (374 aminokwasy ). Pojedyncza cząsteczka tego białka ma formę globularną. Tradycyjnie możemy tu wyróżnić cztery domeny. W środkowej części białka, w otoczeniu czterech wyróżnionych domen znajduje się kompleks ATP z jonem metalu dwuwartościowego - Mg 2 " lub Ca 2 ", W formie spolimeryzowanej białka w miejscu tym występuje kompleks metalu z ADP [9], Widmo 'H MRJ aktyny w formie globularnej ( aktyny G ) i w formie spolimeryzowanej ( aktyny F ) przedstawione jest na rysunku ( Rys.2 ). Na podstawie analizy dużej ilości tego typu widm zarejestrowanych w różnych warunkach polimeryzacji białka stwierdziliśmy, że polimery aktyny z kompleksem ABPCa 3 * mają znacznie sztywniejszą strukturę niż odpowiednie polimery z kompleksem ADPMg 2 ' Stosunkowo wąskie linie rezonansowe 'H MRJ, jakie udało się nam zarejestrować na widmach aktyny F-Mg, przypisaliśmy fragmentowi lub fragmentom łańcucha polipeptydowego o strukturze statystycznego kłębka Na podstawie widm TOCSY ( Rys 3 ), zarejestrowanych dla aktyny F-Mg udało się określić rodzaj aminokwasów i odszukać odpowiedni fragment w sekwencji białka Mieści się on w domenie 2 aktyny Wynik ten znajduje swoje potwierdzenie między innymi w analizie komputerowej obrazów z mikroskopu elektronowego [10] oraz w komputerowej analizie drgań normalnych cząsteczki aktyny [11] Związek między rodzajem jonu metalu w kompleksie z ADP a dynamiką domeny 2 na

3 spektroskopia ID ustawienie optymalnych warunków pomiaru ph, temperatura, stężenie, zakres widma spektroskopia 2D COSY, IOCSY, NOESY ROESY, pomiar w H2O i DjO sekwencyjne oznaczenie linii rezonansowych _L wyznaczenie mapy kontaktów między protonami obliczenie struktury przy pomocy wybranej procedury obliczenie widm NOES Y" na podstawie wyliczonej struktury przestrzennej Rys. 1. Uproszczony schemat procedury analizy strukturalnej białek prowadzonej metodą magnetycznego rezonansu jądrowego przy wykorzystaniu spektroskopii dwuwymiarowej. 206

4 206 aktyna G-Ca aktyna G-Mg aktyna F-Mg Rys.2. Widma ID aktyny G i aktyny F. Dla aktyny G-Ca stężenie 124 p.m; bufor : 1 mm NajHPO,,, 0.2 mm ATP, 0.1 mm CaCI 2, ph 8; dla aktyny G-Mg stężenie 75 ujvi; bufor: 1 mm N^HPO,, 0.2 mm ATP, 0.1 mm MgCIj, 0.2 mm EGTA, ph 8; dla aktyny F-Mg - do buforu dodano 30 mm KCI; pomiary wykonano w temperaturze 278 K. AK-A TOCSY O AK-B QQJXX 40 ms temp.-278 K < Thr-B Olx-A _. Al«-B OU.D Al-r^l Tbr-A LCU-A V UU-D ^ PtwO An- -* n J2 ;. Rys.3. Fragment widma TOCSY aktyny F-Mg; stężenie 250 nm, bufor : 0.2 mm ATP, 0.1 mm MgCl 2, 0.2 mm EGTA, 30 mm KCI, 1 mm Na,HPO 4, ph 7.1; temperatura K.

5 powierzchni polimeru wynika, według naszego modelu, z różnicy w koordynacji jonów Mg 2t i Ca 2 '. Przedstawione w tej pracy pomiary MRJ polimerów aktyny i analiza ich dynamiki molekularnej zostały przeprowadzone w Zakładzie Biofizyki Instytutu Badań Medycznych Maxa Plancka w Heidelbergu Literatura 1. D M Needham " Machina Carnis. The biochemistry of muscular contraction in its historical development", Cambridge University Press, A Huxley " Reflections on muscle ", Liverpool University Press, B.Alberts, D Bray, J.Lewis. M.Raff, K.Roberts, J.D.Watson " Molecular biology of the cell" Garland Publishing Inc., New York, London, O.Herzberg, M.N.G. James. Nature 313, , (1985) 5. W.Kabsch, H.G.Mannherz, D.Suck, E.F.Pai, K.C Holmes Nature 347, 37-44( 1990) 6. P J.McLaughlin, J.T.Gooch, H.G.Mannherz, A.G.Weeds Nature 364, (1993) 7. I.Rayment, W.R.Rypniewski, K.Schmidt-Base, R.Smith, D.R.Tomchick, M M.Benning, D A.Winkelmann, G.Wesenberg, H.M.Holden Science 261, (1993) 8. A.Ribeiro, J Parello, O.Jardetzky Prog.Biophys mol Biol 43, (1984) 9. E.D.Korn, M F.Carlier, D.Pantaloni Science 238, (1987) 10. A.Orlova, E H Egelman J.Mol.Biol. 232, (1993) 11. MM Tinon, D.benAvraham J.Mol.Biol. 230, (1993) 20/