Do stosowania w diagnostyce in vitro. P0215(02) Do stosowania z systemem BD MAX Polski

MAX Cdiff 442555 Do stosowania w diagnostyce in vitro P0215(02) Do stosowania z systemem BD MAX 2017-01 Polski PRZEZNACZENIE Oznaczenie BD MAX Cdiff przeznaczone do użytku w systemie BD MAX jest zautomatyzowanym testem diagnostycznym in vitro służącym do bezpośredniego, jakościowego wykrywania genu toksyny B Clostridium difficile (tcdb) w próbkach płynnego lub miękkiego stolca pobranych od pacjentów z podejrzeniem zakażenia Clostridium difficile (CDI). Oznaczenie jest wykonywane bezpośrednio na próbkach i wykorzystywana jest w nim reakcja łańcuchowa polimerazy (PCR) w czasie rzeczywistym do amplifikacji DNA genu toksyny B Clostridium difficile i fluorogennych swoistych sond hybrydyzacyjnych do wykrywania amplifikowanego DNA. Oznaczenie BD MAX Cdiff służy do wspomagania diagnozy CDI. STRESZCZENIE I OBJAŚNIENIE PROCEDURY Clostridium difficile to gatunek beztlenowych, Gram-dodatnich bakterii z rodzaju Bacillus, które stanowią wiodącą przyczynę biegunek związanych z antybiotykoterapią i rzekomobłoniastych zapaleń jelit w placówkach opieki zdrowotnej. 1,2 Zapadalność na CDI rośnie, a przypadki ciężkie zdarzają się coraz częściej. 3,4,5 Objawy CDI mogą przybrać postać od łagodnej biegunki do ciężkiego zapalenia jelita; może dojść nawet do perforacji jelita i zgonu. Najczęściej spotykanym czynnikiem ryzyka jest ekspozycja na antybiotyki. 6 Rozpoznanie zakażenia Clostridium difficile dokonywane jest na podstawie klinicznych objawów przedmiotowych i podmiotowych, takich jak biegunka oraz wyniki testów laboratoryjnych lub histopatologicznych. Diagnoza laboratoryjna toksygennego Clostridium difficile obejmuje hodowlę bakterii beztlenowych, a następnie wykrywanie toksyny lub genu (genów) lub enzymu (enzymów) toksyny w kale. 7 Wydaje się, że do rozwinięcia się CDI konieczna jest obecność toksyny B. 8 Badanie cytotoksyczności hodowli tkankowej wykonywane bezpośrednio na próbce kału lub na wyizolowanym szczepie Clostridium difficile jest pracochłonne i czasochłonne, a wyniki uzyskuje się dopiero po 24 96 godzinach. Obecnie w większości laboratoriów klinicznych do wykrywania toksyn A i B oraz dehydrogenazy glutaminianowej (GDH), enzymu obecnego we wszystkich szczepach Clostridium difficile, stosuje się test immunoenzymatyczny (EIA), ponieważ wyniki dostępne są tego samego dnia, a test jest łatwy do przeprowadzenia i względnie niedrogi. Jednak czułość tych testów jest niska, zwłaszcza jeśli chodzi o toksyny, co może prowadzić do uzyskania wyników fałszywie ujemnych. 7 W ostatnim czasie opracowano metodę wykrywania toksyny A i toksyny B przy pomocy PCR, charakteryzującą się dużą czułością i swoistością w porównaniu z badaniem cytotoksyczności komórkowej i testami immunologicznymi. 9 Ponadto testy te można wykonać w czasie krótszym niż 3 godziny. Połączenie tych charakterystyk może pozwolić na szybkie, ukierunkowane leczenie pacjentów z CDI, a dzięki temu uzyskanie potencjalnie lepszych efektów, krótszego okresu zdrowienia i lepszej kontroli nad rozprzestrzenianiem się infekcji. ZASADY PROCEDURY Pobrane próbki płynnego lub miękkiego stolca przesyłane są do laboratorium. W celu przeprowadzenia testu jednorazową ezą do inokulacji o pojemności 10 µl pobiera się kał z próbki i umieszcza w BD MAX Cdiff Sample Buffer Tube (probówce na bufor próbki). Probówkę na bufor próbki zamyka się korkiem z przegrodą i worteksuje. Tworzona jest lista robocza i probówka na bufor próbki, BD MAX Cdiff Unitized Reagent Strip (scalony pasek z odczynnikami) oraz BD MAX PCR Cartridge (kaseta do PCR) umieszczane są w systemie BD MAX. System BD MAX automatyzuje przygotowanie próbki, w tym lizę organizmów docelowych, ekstrakcję i zatężanie DNA, ponowne nawodnienie odczynników oraz amplifikację i wykrywanie docelowych sekwencji kwasów nukleinowych przy wykorzystaniu reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR) w czasie rzeczywistym. Interpretacja wyników w systemie BD MAX jest automatyczna. Test zawiera również próbkę kontrolną znajdującą się w probówce ekstrakcyjnej. Zastosowanie próbki kontrolnej pozwala na monitorowanie etapów ekstrakcji DNA, etapów cyklu termicznego, integralności odczynników i obecności inhibitorów. 1

Po enzymatycznej lizie komórek uwolnione kwasy nukleinowe są wychwytywane na koralikach magnetycznych. Koraliki wraz z przyczepionymi do nich kwasami nukleinowymi są płukane z użyciem bufora do płukania, a kwasy nukleinowe ulegają wymywaniu w buforze elucyjnym pod wpływem wysokiej temperatury. Wymyte cząsteczki DNA neutralizuje się buforem zobojętniającym i przenosi do probówek z mieszaniną wzorcową w celu nawodnienia odczynników do PCR. Po rekonstytucji system BD MAX przenosi stałą objętość gotowego do analizy PCR roztworu zawierającego wyekstrahowane kwasy nukleinowe do kasety do PCR BD MAX. Mikrozastawki w kasecie do PCR BD MAX są zamykane przed rozpoczęciem PCR, aby zabezpieczyć mieszaninę amplifikacyjną przed parowaniem i skażeniem. Docelowe sekwencje DNA po amplifikacji wykrywane są przy pomocy sond hydrolitycznych (TaqMan) znakowanych z jednej strony fluorescencyjnym barwnikiem sygnałowym (fluoroforem), a z drugiej grupą wygaszającą. Do wykrywania amplikonów tcdb oraz amplikonów próbki kontrolnej w dwóch różnych kanałach optycznych systemu BD MAX wykorzystywane są sondy znakowane różnymi fluoroforami. Gdy sondy są w stanie natywnym, fluorofor jest wygaszony wskutek bliskości grupy wygaszającej. Jednak w obecności docelowego DNA sondy hybrydyzują do swoich sekwencji komplementarnych i ulegają hydrolizie w wyniku aktywności egzonukleazy 5 3, jaką wykazuje polimeraza DNA, gdy syntetyzuje powstającą nić wzdłuż istniejącej nici DNA. W efekcie fluorofory pozostają odseparowane od cząsteczek wygaszających i emitowana jest fluorescencja. Intensywność fluorescencji zarejestrowanej w dwóch kanałach optycznych wykorzystywanych w oznaczeniu BD MAX Cdiff jest wprost proporcjonalna do ilości cząsteczek odpowiedniej sondy ulegających hydrolizie. System BD MAX monitoruje te sygnały w każdym cyklu PCR i na zakończenie programu interpretuje dane, dostarczając wynik końcowy. ODCZYNNIKI I MATERIAŁY NR KAT. Zawartość Ilość BD MAX Cdiff Master Mix Sucha mieszanina wzorcowa do PCR zawierająca sondę molekularną swoistą wobec 24 testy tcdb i primery oraz sondę molekularną swoistą wobec próbki kontrolnej. BD MAX Cdiff Strips Scalone paski z odczynnikami zawierające wszystkie ciekłe odczynniki oraz 24 testy 442555 jednorazowe końcówki pipet potrzebne do przetwarzania próbki i ekstrakcji DNA. BD MAX Cdiff Extraction Tube Liofilizowany osad zawierający koraliki magnetyczne z powinowactwem do DNA, 24 testy achromopeptydazę oraz próbkę kontrolną. BD MAX Cdiff Sample Buffer Tube 24 testy Korki z przegrodą 25 SPRZĘT I MATERIAŁY WYMAGANE, ALE NIEZNAJDUJĄCE SIĘ W ZESTAWIE BD MAX PCR Cartridges (kasety do PCR) (nr kat. BD Diagnostic Systems 437519) VWR Multi-Tube Vortexer (mieszadło wieloprobówkowe) (VWR, nr kat. 58816-115) Vortex Genie 2 (mieszadło) (VWR, nr kat. 58815-234) lub równoważne NALGENE Cryogenic Vial Holder (stojak do probówek kriogenicznych) (VWR, nr kat. 66008-783) Jednorazowe ezy do inokulacji (10 µl) Rękawiczki jednorazowe, bez talku Suche, czyste pojemniki do zbierania próbek kału miękkiego lub płynnego Jeśli dla zewnętrznych próbek kontrolnych prowadzona jest hodowla: wstępnie zredukowana płytka agarowa przeznaczona do organizmów beztlenowych (np. płytka Brucella Agar zawierająca 5% krwi owczej, heminę i witaminę K1, nr kat. BBL 221547) OSTRZE ENIA I ŚRODKI OSTRO NOŚCI Test BD MAX Cdiff przeznaczony jest do stosowania w diagnostyce in vitro. Produkt może być używany tylko w systemie BD MAX. Nie stosować przeterminowanych odczynników ani materiałów. Nie używać zestawu, jeśli w chwili dostarczenia etykieta stanowiąca zamknięcie zewnętrznego pudełka jest uszkodzona. Nie używać odczynników, jeśli w chwili dostarczenia woreczki ochronne są otwarte lub uszkodzone. Nie używać odczynników, jeśli brak środka osuszającego lub jeśli jest on otwarty wewnątrz woreczka z odczynnikiem. Nie wyjmować środka osuszającego z woreczka z odczynnikiem. Po każdym użyciu odczynnika niezwłocznie szczelnie zamykać woreczki ochronne. Przed zamknięciem woreczka usunąć nadmiar powietrza. Chronić odczynniki przed wysoką temperaturą i wilgotnością. Przedłużone narażenie na działanie wilgotnego środowiska wpływa na działanie produktu. Nie używać odczynników, jeśli folia jest przerwana lub uszkodzona. Nie mieszać odczynników z różnych woreczków, zestawów lub serii. Nie należy zamieniać ani ponownie używać korków, gdyż może to spowodować ich zanieczyszczenie i negatywnie wpłynąć na wyniki testu. Odpowiednie napełnienie płynami można sprawdzić na scalonych paskach z odczynnikami (należy dopilnować, by płyny znajdowały się na dnie probówek [patrz Rysunek 1]). Sprawdzić na scalonych paskach z odczynnikami, czy wszystkie końcówki pipet są obecne (patrz Rysunek 1). 2

Zachować ostrożność przy używaniu roztworów chemicznych, ponieważ kody kreskowe dla mieszaniny wzorcowej i probówki ekstrakcyjnej mogą stać się nieczytelne. Dla odpowiedniego działania tego testu zasadnicze znaczenie ma zachowanie dobrych praktyk laboratoryjnych. Z uwagi na wysoką czułość analityczną tego testu należy dołożyć szczególnych starań w kierunku zachowania czystości wszystkich materiałów i odczynników. Jeśli w tym samym obszarze laboratorium wykonywane są inne testy PCR, należy dopilnować, aby test BD MAX Cdiff, dodatkowe odczynniki potrzebne do badania ani system BD MAX nie uległy skażeniu. Należy bezwzględnie unikać skażenia odczynników mikroorganizmami i deoksyrybonukleazą (DNazą). Przed manipulacjami odczynnikami i kasetami konieczna jest zmiana rękawiczek. Aby uniknąć skażenia otoczenia amplikonami, nie otwierać kaset do PCR BD MAX po ich użyciu. Uszczelnienia kaset do PCR BD MAX zaprojektowane są tak, by zapobiegać skażeniu. W laboratorium należy rutynowo przeprowadzać monitorowanie środowiska w celu zminimalizowania ryzyka skażenia krzyżowego. Kasety mikroprzepływowe BD MAX przeznaczone są do użycia w maksymalnie dwóch cyklach. Wykonanie oznaczenia BD MAX Cdiff poza zalecanymi ramami czasowymi może dać nieprawidłowe wyniki. Oznaczenia niewykonane w określonych ramach czasowych należy powtórzyć. W zależności od wytycznych lub wymogów wynikających z przepisów lokalnych, stanowych, wojewódzkich lub federalnych lub zaleceń organizacji akredytujących można zbadać dodatkowe próbki kontrolne. Należy zawsze postępować z próbkami jak z materiałem zakaźnym, zgodnie z wytycznymi dotyczącymi bezpiecznych procedur laboratoryjnych, takimi jak opisane w dokumentach CLSI M29 10 oraz Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories. 11 Pracując z odczynnikami, zawsze nosić odzież ochronną i rękawiczki jednorazowe. Po wykonaniu oznaczenia dokładnie umyć ręce. Nie pipetować ustami. Nie palić papierosów, nie spożywać płynów, nie jeść ani nie żuć w strefach pracy z próbkami lub odczynnikami zestawu. Niewykorzystane odczynniki i odpady zutylizować zgodnie z przepisami miejscowymi, stanowymi, wojewódzkimi lub ogólnokrajowymi. Dodatkowe ostrzeżenia, środki ostrożności i procedury można znaleźć w podręczniku użytkownika systemu BD MAX. 12 PRZECHOWYWANIE I STABILNOŚĆ Podczas transportu pobrane próbki powinny być przechowywane w temperaturze do 2 C do 25 C. Chronić przed ich zamrożeniem i zbyt wysoką temperaturą. Próbki przed badaniem można przechowywać przez okres do 5 dni w temperaturze 2 8 C lub do 48 godzin w temperaturze 2 25 C. Składniki testu BD MAX Cdiff są stabilne w temperaturze 2 25 C do upływu podanego terminu ważności. Nie należy używać odczynników i elementów, których termin ważności upłynął. Probówki z mieszaniną wzorcową BD MAX Cdiff oraz probówki ekstrakcyjne dostarczane są w zamkniętych woreczkach. Aby chronić produkt przed działaniem wilgoci, należy niezwłocznie zamknąć woreczek ponownie po jego otwarciu. Probówki z odczynnikami są stabilne przez okres do 7 dni w temperaturze 2 25 C po otwarciu i ponownym zamknięciu. INSTRUKCJE STOSOWANIA Pobieranie/transport próbek W celu uzyskania próbki materiału odpowiedniej jakości należy ściśle przestrzegać zasad dotyczących pobierania próbek. Próbki kału płynnego lub miękkiego pobiera się przy użyciu suchego, czystego pojemnika zgodnie z następującą procedurą: 1. Przenieść do pojemnika płynny lub miękki stolec (lecz nie mocz). Unikać mieszania próbki z papierem toaletowym, wodą lub mydłem. 2. Nakleić etykietę na pojemnik. 3. Przesłać pojemnik do laboratorium zgodnie ze standardową procedurą postępowania w szpitalu (patrz część Przechowywanie i stabilność). Przygotowanie próbek UWAGA: jedna (1) probówka na bufor próbki, jeden (1) korek z przegrodą, jedna (1) probówka z mieszaniną wzorcową, jedna (1) probówka ekstrakcyjna oraz jeden (1) scalony pasek z odczynnikami to materiały wymagane do przetestowania każdej próbki i każdej zewnętrznej próbki kontrolnej. Wyjąć wymagane materiały w odpowiedniej liczbie z woreczków ochronnych lub pudełek. Z otwartych woreczków z mieszaniną wzorcową lub probówkami ekstrakcyjnymi w celu ich przechowywania usunąć nadmiar powietrza i zamknąć szczelnie woreczki. 1. Oznakować probówkę na bufor próbki (z bezbarwnym korkiem) z etykietą z kodem kreskowym danymi identyfikacyjnymi próbki tak, by nie zasłonić kodów kreskowych, nie pisać na nich ani ich nie zaklejać. 2. Próbkę kału worteksować z dużą prędkością przez 15 sekund i zanurzyć w niej ezę do inokulacji o pojemności 10 µl. W przypadku próbek kału miękkiego usunąć nadmiar materiału na zewnętrznej stronie ezy, tak by pobrać około 10 µl. 3. Zdjąć korek z probówki na bufor próbki i umieścić ezę w cieczy. Obracając ezę w palcach, umieścić próbkę w probówce. 4. Zamknąć probówkę korkiem z przegrodą. 5. Umieścić probówkę na bufor próbki w stojaku do probówek kriogenicznych NALGENE. 6. Powtarzając kroki 1-5, przygotować ewentualne dodatkowe próbki do badania, a następnie przejść od razu do kroku 7. 7. Wszystkie przygotowane próbki worteksować jednocześnie z maksymalną prędkością przez 1 (jedną) minutę mieszadłem wieloprobówkowym. Oznaczenie BD MAX Cdiff należy przeprowadzić niezwłocznie po worteksowaniu. 3

Obsługa systemu BD MAX UWAGA: szczegółowe instrukcje znajdują się w podręczniku użytkownika systemu BD MAX 12 (patrz część Obsługa ). UWAGA: test BD MAX Cdiff należy przeprowadzić niezwłocznie po wykonaniu wyżej wymienionego kroku worteksowania (Przygotowanie próbek, krok 7). W razie konieczności ponownego wykonania testu należy ponownie wykonać worteksowanie próbek. 1. Włączyć system BD MAX (jeśli nie jest już włączony) i zalogować się, wprowadzając <user name> (nazwę użytkownika) i <password> (hasło). 2. Przed manipulacjami odczynnikami i kasetami konieczna jest zmiana rękawiczek. 3. Wyjąć pożądaną liczbę scalonych pasków z odczynnikami z zestawu BD MAX Cdiff. Delikatnie postukać każdym paskiem o twardą powierzchnię, tak aby wszystkie porcje płynu znalazły się na dnie probówek. 4. Wyjąć pożądaną liczbę probówek ekstrakcyjnych i probówek z mieszaniną wzorcową z woreczków zabezpieczających. Usunąć nadmiar powietrza i zamknąć szczelnie woreczki. 5. Dla każdej badanej próbki umieścić 1 (jeden) scalony pasek z odczynnikami w statywie systemu BD MAX, zaczynając od pozycji 1 na statywie A. 6. Wcisnąć 1 (jedną) probówkę ekstrakcyjną (biała folia) do każdego scalonego paska z odczynnikami w pozycję 1, jak pokazano na Rysunku 1. 7. Wcisnąć 1 (jedną) probówkę z mieszaniną wzorcową (zielona folia) do każdego scalonego paska z odczynnikami w pozycję 2, jak pokazano na Rysunku 1. Rysunek 1: Wcisnąć probówki ekstrakcyjne z zestawu BD MAX Cdiff i probówki z mieszaniną wzorcową do scalonego paska z odczynnikami. 8. Kliknąć ikonę Run (Uruchom) i wprowadzić numer serii zestawu BD MAX Cdiff (do celów śledzenia serii), skanując kod paskowy albo ręcznie. UWAGA: krok 8 powtarzać za każdym razem, gdy używana jest nowa partia zestawów. 9. Przejść do Worklist (Listy roboczej). Z menu rozwijanego wybrać <BD MAX Cdiff 56>. 10. Wprowadzić identyfikator probówki na bufor próbki, identyfikator pacjenta i numer akcesyjny (jeśli ma zastosowanie) do Worklist (Listy roboczej), odczytując kod paskowy skanerem lub ręcznie. 11. Wybrać odpowiedni numer serii zestawu (znajdujący się na zewnętrznym pudełku) z menu rozwijanego. 12. Powtórzyć kroki 9 11 dla wszystkich pozostałych probówek na bufor próbki. 13. Umieścić probówki na bufor próbki w statywach systemu BD MAX odpowiadających scalonym paskom z odczynnikami zebranym w krokach 5 do 7. UWAGA: umieścić probówki na bufor próbki w statywie na próbki etykietą z kodem paskowym 1D na zewnątrz (ułatwia to skanowanie probówek na bufor próbki podczas rejestracji próbki). 14. Umieścić wymaganą liczbę kaset do PCR BD MAX w systemie BD MAX (patrz Rysunek 2). Każda kaseta przeznaczona jest do wykonania dwóch cykli dla maksymalnie 12 próbek, łącznie umożliwiając przebadanie 24 próbek. System BD MAX automatycznie wybierze pozycję i rząd na kasecie do PCR dla każdego cyklu. Kaset do PCR BD MAX można używać wielokrotnie, do wykorzystania wszystkich ścieżek. Aby zmaksymalizować wykorzystanie kaset do PCR BD MAX przy użyciu trybu 2000 Sample Mode, wybrać Run Wizard (Uruchom kreator) z karty Worklist (Lista robocza) do zadań dla ścieżki. Więcej informacji można znaleźć w podręczniku użytkownika systemu BD MAX. 4

15. Wkładanie statywów do systemu BD MAX (Rysunek 3). Rysunek 2: Wkładanie kaset do PCR BD MAX Strona A Strona B Rysunek 3: Wkładanie statywów do systemu BD MAX. 16. Zamknąć pokrywę systemu BD MAX i kliknąć <Start>, aby rozpocząć przetwarzanie. 17. Pod koniec cyklu można sprawdzić wyniki od razu lub przechowywać probówki na bufor próbki w temperaturze 2 8 C do 5 dni LUB w temperaturze 25 ± 2 C przez maksymalnie 5 godzin do sprawdzenia wyników. UWAGA: w razie uszkodzenia korka z przegrodą podczas cyklu należy wymienić go na nowy przed odłożeniem próbki do przechowywania. UWAGA: przygotowane probówki na bufor próbki BD MAX Cdiff można przechowywać w temperaturze 2 8 C przez maksymalnie 120 godzin (5 dni) LUB w temperaturze 25 ± 2 C przez maksymalnie 5 godzin po umieszczeniu próbki w probówce na bufor próbki. W razie uzyskania wyniku nieokreślonego (IND), nierozstrzygającego (UNR) lub niepełnego (INC) lub w razie niepowodzenia testu zewnętrznej próbki kontrolnej test materiału z probówki na bufor próbki musi być powtórzony w tych ramach czasowych (patrz część Procedura powtarzania testu). KONTROLA JAKOŚCI Procedury kontroli jakości służą do monitorowania działania oznaczenia. Laboratoria ustalają liczbę, rodzaj i częstotliwość wykonywania testów materiałów kontrolnych zgodnie z wytycznymi lub wymogami przepisów lokalnych, wojewódzkich, stanowych, federalnych lub krajowych lub organizacji akredytujących, w celu monitorowania skuteczności całej procedury analitycznej. W zakresie ogólnych wytycznych dotyczących kontroli jakości użytkownik może odnieść się do dokumentów CLSI MM03 i EP12. 13,14 1. Materiały do zewnętrznych próbek kontrolnych nie są dostarczane przez BD. Zewnętrzne próbki kontrolne dodatnie i ujemne nie są wykorzystywane przez oprogramowanie systemu BD MAX do celów interpretacji wyniku badania próbki. Zewnętrzne próbki kontrolne traktowane są tak, jak próbki pochodzące od pacjentów. (W kwestii interpretacji wyników badania zewnętrznych próbek kontrolnych należy odnieść się do Tabeli 1 w części Interpretacja wyników). 2. W każdym laboratorium należy co najmniej raz dziennie wykonywać badanie 1 (jednej) zewnętrznej próbki kontrolnej dodatniej i 1 (jednej) zewnętrznej próbki kontrolnej ujemnej, do momentu uzyskania odpowiedniej walidacji procesu wykonywanego przy użyciu systemu BD MAX. Częstotliwość testów kontrolnych można zmniejszyć zgodnie z mającymi zastosowanie przepisami. Celem badania zewnętrznych próbek kontrolnych dodatnich jest monitorowanie pod kątem znacząco nieprawidłowego działania odczynników. Celem badania zewnętrznych próbek kontrolnych ujemnych jest wykrywanie skażenia odczynników lub otoczenia docelowymi kwasami nukleinowymi (lub ich przeniesienia na próbkę). 5

3. Zaleca się stosowanie różnych rodzajów zewnętrznych próbek kontrolnych, aby umożliwić użytkownikowi wybranie najbardziej odpowiednich dla programu kontroli jakości w danym laboratorium. a. Zewnętrzna kontrola ujemna: Materiał kontrolny dostępny w sprzedaży [np. nietoksygenny szczep Clostridium difficile (ATCC 700057)] lub uprzednio scharakteryzowana próbka, o której wiadomo, że nie jest toksygenna lub nie zawiera toksygennego Clostridium difficile. Firma BD zaleca przygotowanie zewnętrznej próbki kontrolnej ujemnej przed zewnętrzną próbką kontrolną dodatnią, aby zmniejszyć ryzyko skażenia podczas przygotowywania próbki kontrolnej. b. Zewnętrzna kontrola dodatnia: Materiał kontrolny dostępny w sprzedaży [np. szczep Clostridium difficile z genem tcdb (ATCC 43255)] lub uprzednio scharakteryzowana próbka, o której wiadomo, że jest toksygenna lub zawiera toksygenny szczep Clostridium difficile. Zaleca się, aby do przygotowania zawiesiny próbki kontrolnej zewnętrznej przeprowadzić izolaty ponownie w zawiesinę w soli fizjologicznej do uzyskania mętności 0,5 w skali McFarlanda (~1 X 10 7 CFU/mL). Przygotować serię rozcieńczeń w soli fizjologicznej, aby uzyskać ostateczną zawiesinę o mętności ~3,3 X 10 5 CFU/mL i inokulować odpowiednią probówkę na bufor próbki ezą zawierającą 10 µl zawiesiny bakteryjnej. Przetwarzać i testować jak próbkę (patrz części Przygotowanie próbek i Obsługa systemu BD MAX). 4. Wszystkie zewnętrzne próbki kontrolne powinny dawać oczekiwane wyniki (dodatnie dla zewnętrznej kontroli dodatniej, ujemne dla zewnętrznej kontroli ujemnej) i nie powinny wystąpić niepowodzenia kontroli zewnętrznej (wyniki nierozstrzygające lub nieokreślone). 5. Jeśli dla zewnętrznej kontroli ujemnej wynik testu okaże się dodatni, oznacza to nieprawidłowości lub skażenie przy przygotowywaniu próbki. Należy sprawdzić technikę manipulacji próbką tak, by uniknąć pomyłek i skażenia. Jeśli dla zewnętrznej dodatniej próbki kontrolnej wynik testu okaże się ujemny, oznacza to nieprawidłowości przy manipulacji lub przygotowaniu próbki. Należy sprawdzić technikę manipulacji próbką i jej przygotowania. 6. Nierozstrzygający, nieokreślony lub niepełny wynik testu dla zewnętrznej próbki kontrolnej wskazuje na nieprawidłowości w odczynnikach lub w działaniu systemu BD MAX. Sprawdzić, czy na monitorze systemu BD MAX nie ma komunikatów o błędach. Informacje dotyczące interpretacji kodów ostrzeżeń i błędów można znaleźć w części System Error Summary (Podsumowanie błędów systemowych) podręcznika użytkownika systemu BD MAX. 12 Jeśli problem powtarza się, należy użyć odczynników z nieotwartego woreczka lub nowego zestawu testowego. 7. Każda probówka ekstrakcyjna zawiera próbkę kontrolną będącą plazmidem zawierającym syntetyczną sekwencję DNA docelowego. Próbkę kontrolną poddaje się ekstrakcji, wymywaniu i amplifikacji wraz z DNA obecnym w przetwarzanej próbce, co ma zapewnić przewidywalność wyników oznaczenia. Próbka kontrolna służy do monitorowania skuteczności wychwytywania DNA, jego płukania i wymywania podczas przetwarzania próbki, jak również skuteczności amplifikacji i wykrywania DNA podczas analizy PCR. Jeśli wynik badania dla próbki kontrolnej nie spełni kryteriów dopuszczalności, wynik badania dla próbki zostanie podany jako nierozstrzygający; jednak wyniki dodatnie (POS) oznaczenia zostaną również podane, a ponadto żadna z próbek nie dostanie kwalifikacji ujemnej (NEG). Wynik nierozstrzygający wskazuje na obecność inhibitorów w próbce lub nieprawidłowe działanie odczynnika. Testy dla wszelkich próbek, dla których podano wyniki nierozstrzygające, należy powtórzyć zgodnie z Procedurą powtarzania testu podaną poniżej. INTERPRETACJA WYNIKÓW Wyniki są dostępne na karcie Results (Wyniki) w okienku Results na monitorze systemu BD MAX. Oprogramowanie BD MAX automatycznie interpretuje wyniki testu. Wynik testu może być NEG (negative ujemny), POS (positive dodatni) lub UNR (unresolved nierozstrzygający) w zależności od statusu substancji docelowej po amplifikacji i próbki kontrolnej. Wyniki IND (indeterminate nieokreślony) lub INC (incomplete niepełny) związane są z nieprawidłowym działaniem systemu BD MAX. Wyniki są interpretowane na podstawie poniższego algorytmu decyzyjnego. Podany wynik oznaczenia Cdiff POS Cdiff NEG Cdiff UNR IND INC Tabela 1: Interpretacja wyników testu BD MAX Cdiff Interpretacja wyniku a Wykryto DNA tcdb Nie wykryto DNA tcdb Wynik nierozstrzygający brak amplifikacji organizmów docelowych lub próbki kontrolnej, obecność inhibitorów w próbce lub nieprawidłowe działanie odczynnika Wynik nieokreślony w związku z nieprawidłowym działaniem systemu BD MAX (z kodami ostrzeżeń lub błędów b ) Niepełny cykl (z kodami ostrzeżeń lub błędów b ) a Wyniki testu BD MAX Cdiff można wykorzystać do określenia poziomu zachowywanych środków ostrożności zgodnie z programami i praktyką w danej instytucji. b Informacje dotyczące interpretacji kodów ostrzeżeń i błędów można znaleźć w części Rozwiązywanie problemów podręcznika użytkownika systemu BD MAX. 12 6

PROCEDURA POWTARZANIA TESTU UWAGA: w probówce na bufor próbki znajduje się objętość wystarczająca na wykonanie jednego powtórzenia testu w systemie BD MAX. Jeśli probówki na bufor próbki były przechowywane w temperaturze pokojowej, ponowne badanie należy wykonać w ciągu 5 godzin po zakończeniu cyklu. Jeśli jednak probówki na bufor próbki były przechowywane w temperaturze 2 8 C, ponowne badanie należy wykonać w ciągu 120 godzin (5 dni). Pozostałą próbkę kału można również wykorzystać do powtórzenia badania w ciągu 5 dni od pobrania, jeśli była przechowywana w temperaturze 2 8 C, lub 48 godzin, jeśli była przechowywana w temperaturze 2 25 C. UWAGA: nowe próbki można przetestować w tym samym cyklu, co próbki badane ponownie. WYNIK NIEROZSTRZYGAJĄCY Wynik nierozstrzygający uzyskuje się w przypadku, gdy obecność inhibitora w próbce lub nieprawidłowe działanie odczynnika uniemożliwia odpowiednią amplifikację substancji docelowej lub próbki kontrolnej. Testy dla próbek można powtórzyć przy użyciu materiału pozostałego w odpowiednich probówkach na bufor próbki w czasie określonym powyżej. Próbki należy worteksować przez 1 (jedną) minutę i wykonać test ponownie, postępując zgodnie z częścią Obsługa systemu BD MAX. Pozostałą próbkę kału można również wykorzystać do powtórzenia testu w czasie określonym powyżej. Należy wykonać test ponownie, zaczynając od części Przygotowanie próbek. WYNIK NIEOKREŚLONY Wynik nieokreślony można uzyskać w przypadku nieprawidłowego działania systemu. Testy dla próbek można powtórzyć przy użyciu materiału pozostałego w odpowiednich probówkach na bufor próbki w czasie określonym powyżej. Próbki należy worteksować przez 1 (jedną) minutę i wykonać test ponownie, postępując zgodnie z częścią Obsługa systemu BD MAX. Pozostałą próbkę kału można również wykorzystać do powtórzenia testu w czasie określonym powyżej. Należy wykonać test ponownie, zaczynając od części Przygotowanie próbek. Informacje dotyczące interpretacji kodów ostrzeżeń i błędów można znaleźć w podręczniku użytkownika systemu BD MAX, 12 (część Rozwiązywanie problemów ). WYNIK NIEPEŁNY Wynik niepełny można uzyskać w przypadku, gdy procedura przygotowania próbki lub PCR nie zakończy się w oczekiwanym czasie. Testy dla próbek można powtórzyć przy użyciu materiału pozostałego w odpowiednich probówkach na bufor próbki w czasie określonym powyżej. Próbki należy worteksować przez 1 (jedną) minutę i wykonać test ponownie, postępując zgodnie z częścią Obsługa systemu BD MAX. Pozostałą próbkę kału można również wykorzystać do powtórzenia testu w czasie określonym powyżej. Należy wykonać test ponownie, zaczynając od części Przygotowanie próbek. Informacje dotyczące interpretacji kodów ostrzeżeń i błędów można znaleźć w podręczniku użytkownika systemu BD MAX 12 (część Rozwiązywanie problemów ). NIEPOWODZENIE TESTU ZEWNĘTRZNEJ PRÓBKI KONTROLNEJ Wyniki testu dla zewnętrznej próbki kontrolnej powinny być zgodne z oczekiwanymi. Jeśli badanie dla próbek trzeba powtórzyć z powodu nieprawidłowego wyniku testu dla kontroli zewnętrznej, należy wykonać ponowne testy próbek, korzystając z materiału w probówce na bufor próbki oraz świeżo przygotowanych zewnętrznych próbek kontrolnych w wyżej zdefiniowanych ramach czasowych. Próbki należy worteksować przez 1 (jedną) minutę i wykonać test ponownie, postępując zgodnie z częścią Obsługa systemu BD MAX. Pozostałą próbkę kału można również wykorzystać do powtórzenia testu w czasie określonym powyżej. Należy wykonać test ponownie, zaczynając od części Przygotowanie próbek. POSIEW PRÓBEK KLINICZNYCH Aby zidentyfikować gatunki bezpośrednio z próbki kału, można przeprowadzić hodowlę z próbek zgodnie z procedurami szpitalnymi. OGRANICZENIA PROCEDURY Ten produkt jest przeznaczony do stosowania tylko z niekonserwowanymi próbkami płynnego lub miękkiego kału; charakterystyka skuteczności dla innych rodzajów próbek klinicznych nie została ustalona. Produkt może być używany tylko w systemie BD MAX. Wystąpienie nieprawidłowych wyników testu może także być spowodowane nieprawidłowym pobieraniem próbki, obchodzeniem się z nią lub jej przechowywaniem, obecnością inhibitorów, błędem technicznym, wymieszaniem próbki lub liczbą drobnoustrojów w próbce poniżej czułości analitycznej testu. Aby uniknąć uzyskania błędnych wyników, należy starannie przestrzegać instrukcji podanych na ulotce dołączonej do opakowania oraz w podręczniku użytkownika systemu BD MAX 12. Dodatni wynik oznaczenia BD MAX Cdiff nie oznacza obecności organizmów żywych. Wskazuje jednak na obecność genu tcdb i pozwala na domniemanie wykrycia toksygennego organizmu Clostridium difficile. Oznaczenie BD MAX Cdiff nie może być stosowane do identyfikacji gatunku, ponieważ nie zawiera primerów i sond swoistych dla Clostridium difficile. Podobnie jak w przypadku wszystkich testów diagnostycznych in vitro opartych na PCR, przy bardzo niskim stężeniu substancji docelowej poniżej granicy wykrywalności oznaczenia substancja może być wykryta, ale wyniki mogą nie być powtarzalne. Zastosowanie mesalazyny w postaci zawiesiny doodbytniczej lub preparatu Gynol II* może spowodować lekką inhibicję testu BD MAX Cdiff (więcej informacji podano w części Substancje zakłócające). Zastosowanie preparatów Tums* i Maalox* w płynie może spowodować inhibicję testu BD MAX Cdiff (więcej informacji podano w części Substancje zakłócające). Fałszywie ujemne wyniki mogą wystąpić z powodu utraty kwasów nukleinowych wskutek nieodpowiedniego sposobu pobrania, transportu lub przechowywania próbek lub niewystarczającej lizy komórek bakterii. Test zawiera próbkę kontrolną mającą na celu wspomaganie identyfikacji próbek zawierających inhibitory amplifikacji PCR. Badanie próbki kontrolnej nie pozwala na ustalenie, czy doszło do utraty kwasów nukleinowych wskutek nieodpowiedniej techniki pobrania, transportu lub przechowywania próbek, czy też komórki bakterii nie uległy lizie w odpowiednim stopniu. 7

Wyniki oznaczenia BD MAX Cdiff mogą czasami być nierozstrzygające z powodu nieprawidłowego wyniku dla próbki kontrolnej, lub też nieokreślone albo niepełne z powodu usterki systemu; wymaga to ponownego przeprowadzenia testu, co może spowodować opóźnienie uzyskania ostatecznych wyników. Mutacje lub polimorfizm primera lub regionów wiązania sondy mogą ujemnie wpływać na wykrywanie nowych lub nieznanych odmian genu tcdb Clostridium difficile, co prowadzi do uzyskania wyników fałszywie ujemnych w teście BD MAX Cdiff. Toksygenne odmiany Clostridium difficile bez genu tcdb lub z niefunkcjonalnym białkiem toksyny B są bardzo rzadkie. 15-18 Oznaczenie BD MAX Cdiff ukierunkowane jest na gen tcdb i nie wiadomo, czy pozwoliłoby na wykrycie szczepów wytwarzających toksynę A, a niewytwarzających toksyny B. Nadmierna ilość kału może spowodować inhibicję oznaczenia BD MAX Cdiff. Podobnie jak w przypadku wszystkich testów diagnostycznych in vitro, przewidywalne wartości dodatnie i ujemne zależą w dużym stopniu od częstości występowania. Skuteczność oznaczenia BD MAX Cdiff może być różna w zależności od częstości występowania i badanej populacji. CHARAKTERYSTYKA WYDAJNOŚCIOWA Charakterystykę kliniczną działania testu BD MAX Cdiff określono w drodze wieloośrodkowego, prospektywnego badania klinicznego. W badaniu wzięło udział 6 (sześć) ośrodków badawczych. Próbki zakwalifikowane do badania musiały pochodzić od pacjentów, u których podejrzewano zakażenie Clostridium difficile i dla których wskazane i zlecone były testy diagnostyczne. Badaniem objęto tylko próbki kału miękkiego lub płynnego; badano tylko jedną próbkę od każdego pacjenta. Metodą referencyjnego badania porównawczego było użycie hodowli toksygennej definiowanej jako hodowla bakterii beztlenowych, z której wyizolowano szczep Clostridium difficile, a następnie, w razie stwierdzenia obecności tego szczepu, ocena toksygenności izolatu przy zastosowaniu testu cytotoksyczności hodowli tkankowej. Hodowlę w warunkach beztlenowych przeprowadzono na płytkach ze zmodyfikowanym agarem cykloserynowo-cefoksytynowo-fruktozowym. Oceniono pod kątem toksygenności kolonie bakterii morfologicznie przypominających Clostridium difficile, z dodatnim wynikiem barwienia metodą Grama, o charakterystycznym zapachu obornika, z dodatnim wynikiem testu Pro-disk (z L-proliną) oraz stwierdzoną nietolerancją powietrza na płytce z agarem czekoladowym. Toksygenność wyznaczono przy użyciu testu toksyna/antytoksyna przeprowadzonego na filtratach bulionu odżywczego z dodatkiem glukozy (CMG), zgodnie z zaleceniami producenta. Testem BD MAX Cdiff przebadano łącznie 1881 próbek kału miękkiego lub płynnego zawierającego bakterie toksygenne. 1628 próbek spełniało wymagania; uzyskano 1607 wyników nadających się do analizy (Tabela 2). W porównaniu z hodowlą toksygenną, w teście BD MAX Cdiff zidentyfikowano 96,3% próbek zawierających toksygenne szczepy Clostridium difficile oraz 92,4% próbek niezawierających toksygennych szczepów Clostridium difficile (Tabela 3). Tabela 2: Wyniki uzyskane w oznaczeniu BD MAX Cdiff w porównaniu z hodowlą toksygenną Wszystkie ośrodki Oznaczenie BD MAX Cdiff Hodowla toksygenna + - Łącznie + 158 110 268-6 1333 1339 Łącznie 164 1443 1607 Tabela 3: Wyniki uzyskane przy użyciu oznaczenia BD MAX Cdiff w porównaniu z hodowlą toksygenną Ośrodki kliniczne Częstość występowania Czułość z 95% CI a Swoistość z 95% CI a Ośrodek 1 4,3% (9/210) Ośrodek 2 10,0% (26/261) Ośrodek 3 8,0% (28/352) Ośrodek 4 3,5% (17/487) Ośrodek 5 14,4% (21/146) Ośrodek 6 18,3% (73/399) Ogółem 9,4% (174/1855) a CI: Przedziały ufności 87,5% (7/8) (52,9%, 97,8%) 100% (26/26) (87,1%, 100%) 96% (24/25) (80,5%, 99,3%) 90,9% (10/11) (62,3%, 98,4%) 95,2% (20/21) (77,3%, 99,2%) 97,3% (71/73) (90,5%, 99,2%) 96,3% (158/164) (92,2%, 98,3%) 94,4% (152/161) (89,7%, 97%) 90,6% (213/235) (86,2%, 93,7%) 93,9% (276/294) (90,5%, 96,1%) 90,9% (279/307) (87,1%, 93,6%) 94,3% (115/122) (88,6%, 97,2%) 92%(298/324) (88,5%, 94,5%) 92,4% (1333/1443) (90,9%, 93,6%) 8

Spośród 1635 próbek kału miękkiego lub płynnego zbadanych za pomocą oznaczenia BD MAX Cdiff dla 47 (2,9%) wyniki były początkowo nierozstrzygające. Dla 34 (trzydziestu czterech) spośród nich powtórzono oznaczenie; dla 26 uzyskano wynik rozstrzygający po ponownym zbadaniu. Łącznie dla 0,5% próbek wyniki pozostały nierozstrzygające po powtórzeniu testu. Czułość analityczna Czułość analityczną (granicę wykrywalności, LoD) testu BD MAX Cdiff określono następująco: Aby przygotować symulowane próbki dodatnie, zanurzono ezy do inokulacji w szeregu scharakteryzowanych ilościowo zawiesin Clostridium difficile o różnych stężeniach, przygotowanych z hodowli czterech szczepów Clostridium difficile reprezentujących trzy toksynotypy (0, III, VIII). Każdą ezę przeniesiono następnie do probówki na bufor próbki zawierającej nośnik kałowy o ujemnym wyniku badania pod kątem toksygennego Clostridium difficile. Każdy szczep Clostridium difficile był badany w 24 powtórzeniach na stężenie przez dwóch różnych operatorów przy użyciu trzech różnych partii oznaczenia BD MAX Cdiff. Czułość analityczna (Limit of Detection, LoD granica wykrywalności), zdefiniowana jako najniższe stężenie, przy którym oczekuje się, że dla nie mniej niż 95% wszystkich powtórzeń testu uzyskany zostanie wynik dodatni, mieściła się w zakresie 125 265 CFU na ezę (Tabela 4). Szczep Clostridium difficile a CI: przedział ufności Tabela 4: Granica wykrywalności (LoD) dla testu BD MAX Cdiff Toksynotyp LoD (CFU/eza [95% CI a ]) ATCC 43255 0 265 [140, 502] ATCC 9689 0 156 [82, 298] ATCC BAA-1805 III 205 [102, 412] ATCC 43598 VIII 125 [66, 235] Zakres analityczny W badaniu uwzględniono szereg toksygennych szczepów Clostridium difficile, biorąc pod uwagę pochodzenie geograficzne, toksynotypy, epidemie NAP1/027/BI oraz pochodzenie z różnych okresów. Przebadano 64 (sześćdziesiąt cztery) szczepy o 23 toksynotypach 19-21 z 21 krajów, w tym pochodzące ze zbiorów publicznych oraz dobrze scharakteryzowane szczepy wyizolowane w praktyce klinicznej. Przy użyciu oznaczenia prawidłowo zidentyfikowano wszystkie badane toksygenne szczepy Clostridium difficile. Swoistość analityczna Oznaczenie BD MAX Cdiff wykonano na próbkach zawierających gatunki spokrewnione filogenetycznie (Clostridium inne niż toksygenne Clostridium difficile) oraz inne organizmy (bakterie, wirusy), jakie mogą się znajdować w próbkach kału. Dla 6 (sześciu) z 6 szczepów Clostridium difficile bez genu tcdb, badanych przy stężeniach 1 X 10 8 CFU/mL, w oznaczeniu BD MAX Cdiff uzyskano wyniki ujemne. Dla 30 (trzydziestu) z 30 szczepów Clostridium innych niż Clostridium difficile (w tym czterech szczepów Clostridium sordellii), badanych przy stężeniach 1 X 10 8 CFU/mL, w oznaczeniu BD MAX Cdiff uzyskano wyniki ujemne. Dla 98 (dziewięćdziesięciu ośmiu) z 98 innych szczepów bakterii (należących do 93 gatunków i podgatunków), badanych przy stężeniach 1 X 10 8 CFU/mL (lub ~ 1 X 10 8 kopii genomowego DNA/mL lub 1 X 10 8 ciałek elementarnych/ml), w oznaczeniu BD MAX Cdiff uzyskano wyniki ujemne. Dla 7 (siedmiu) z 7 wirusów, badanych przy stężeniach 1 X 10 5 PFU/mL, w oznaczeniu BD MAX Cdiff uzyskano wyniki ujemne. Substancje zakłócające 25 (dwadzieścia pięć) substancji biologicznych i chemicznych, jakie mogą być użyte lub występować w próbkach pobranych z okolic odbytu, z odbytu lub próbkach kału, oceniono pod kątem potencjalnego zakłócania testu BD MAX Cdiff. Przetestowano również 2 (dwa) organizmy (Escherichia coli ATCC 25922 oraz nietoksygenny szczep Clostridium difficile ATCC 700057) przy dużym stężeniu w celu oceny zakłócania przez bakterie. Przebadano próbki ujemne pod względem toksygennego Clostridium difficile oraz dodatnie pod względem toksygennego Clostridium difficile przy 2 3X LoD z użyciem największej ilości każdego ze związków, jakie mogą prawdopodobnie występować w próbkach, lub z organizmami zakłócającymi (1 X 10 8 CFU/mL każdego ze szczepów). Substancje potencjalnie zakłócające obejmują węglan wapnia (Tums*) oraz wodorotlenki magnezu i glinu (Maalox* w płynie). Nie stwierdzono obserwowalnego zakłócania przez inne badane substancje, z wyjątkiem mesalazyny stosowanej w postaci zawiesiny doodbytniczej lub preparatu Gynol II*, dla których stwierdzono lekką inhibicję (opóźnienie SDPA [Second Derivative Peak Abscissa]) testu BD MAX Cdiff, jednak uzyskano oczekiwane wyniki oznaczenia (Tabela 5). 9

Tabela 5: Substancje endogenne i dostępne w sprzedaży substancje egzogenne przebadane wraz z oznaczeniem BD MAX Cdiff Nazwa handlowa lub opis Wynik Nazwa handlowa lub opis Wynik Nystatyna NI Pepto Bismol* NI Hyderm* krem z hydrokortyzonem NI Ex-Lax* NI Czopki glicerynowe NI Metronidazol NI Pasta Ihle s NI Wankomycyna NI Anusol* Plus NI Polysporin* NI Preparation H* z kremem Bio-Dyne* NI Naproksen NI Major Prep* z fenylefryną NI Gaziki myjące Tucks* NI Tums* I Mieszanina trójglicerydów (C2-C10) NI Płyn Maalox* I Kwas palmitynowy NI Mesalazyna w postaci zawiesiny doodbytniczej a Kwas stearynowy NI Fleet* wlew doodbytniczy z olejem mineralnym NI Krew NI Gynol II* dopochwowy środek antykoncepcyjny (zawiera nonoksynol-9) a Śluz NI Imodium AD* NI Escherichia coli + nietoksygenne Clostridium difficile NI I: zakłócanie działania oznaczenia BD MAX Cdiff. NI: nie odnotowano zakłócania działania testu BD Cdiff. a Dla mesalazyny stosowanej w postaci zawiesiny doodbytniczej i preparatu Gynol II* (zawierającego nonoksynol-9) stwierdzono lekką inhibicję (opóźnienie SDPA [Second Derivative Peak Abscissa]) testu BD MAX Cdiff, jednak uzyskano oczekiwane wyniki oznaczenia. Powtarzalność Panel badania powtarzalności składał się z pięciu następujących kategorii próbek: Odczyn umiarkowanie dodatni (moderate positive, MP): 2 5X LoD Odczyn słabo dodatni (low positive, LP): 1 2X LoD Odczyn wysoce ujemny 1:10 (high negative, HN1:10): 10-krotne rozcieńczenie 1X LoD Odczyn wysoce ujemny 1:100 (HN1:100): 100-krotne rozcieńczenie 1X LoD Prawdziwie ujemne Próbki w każdej kategorii oznaczano potrójnie w ciągu 5 różnych dni; każdego dnia 2 technologów badało 2 panele w 3 ośrodkach, używając 1 serii odczynników (powtarzalność pomiędzy ośrodkami). Łączna zgodność procentowa wynosiła 100% w przypadku kategorii MP, LP i Neg, ze zgodnością wyników ujemnych 92,2% i 50,0% odpowiednio dla kategorii HN1:100 i HN1:10 (Tabela 6). Jako dodatkowa metoda oceny powtarzalności oznaczenia zostało wybrane kryterium wewnętrzne stosowane do ustalenia końcowego wyniku oznaczenia, SDPA (Second Derivative Peak Abscissa odcięta szczytu drugiej pochodnej). Ogólne średnie wartości SDPA z elementami wariancji (SD i %CV) wykazane są w Tabeli 6. Kategoria Tabela 6: Wyniki badania powtarzalności w różnych ośrodkach stosując jedną serię OŚRODEK Ośrodek 1 Ośrodek 2 Ośrodek 3 % zgodności % zgodności % zgodności Łączna zgodność procentowa Średnia ogólna Wartości SDPA a Odchylenie standardowe Neg a 30/30 100,0% 30/30 100,0% 30/30 100,0% 100,0% (95,9%, 100,0%) 28,7 0,30 1,1 HN1:100 a,b 28/30 93,3% 25/30 83,3% 30/30 100,0% 92,2% (84,8%, 96,2%) 28,8 0,39 1,4 HN1:10 a,b 17/30 56,7% 8/30 26,7% 20/30 66,7% 50,0% (39,9%, 60,1%) 28,8 0,36 1,2 LP 30/30 100,0% 30/30 100,0% 30/30 100,0% 100,0% (95,9%, 100,0%) 32,5 0,77 2,4 MP 30/30 100,0% 30/30 100,0% 30/30 100,0% 100,0% (95,9%, 100,0%) 31,6 0,82 2,6 a W kategoriach Ujemne i Wysoce ujemne podane wartości SDPA dotyczą próbki kontrolnej. W pozostałych kategoriach podane wartości SDPA dotyczą toksygennych organizmów docelowych Clostridium difficile. b W kategoriach Wysoce ujemnych oczekiwanym wynikiem testu był wynik ujemny. Procentową zgodność obliczono zatem dla wyników ujemnych. %CV 10

Przeniesienie / skażenie krzyżowe Przeprowadzono badanie przenoszenia organizmów docelowych w ramach jednego cyklu i pomiędzy cyklami podczas przetwarzania próbek o dużym stężeniu toksygennych Clostridium difficile w teście BD MAX Cdiff. Do przygotowania szeregu próbek użyto panelu składającego się z jednego elementu o odczynie wysoce dodatnim i jednego o odczynie ujemnym. Jako elementu panelu Clostridium difficile o odczynie wysoce dodatnim użyto szczepu Clostridium difficile (Tox 0, ATCC 9689) (~3 x 10 8 CFU/mL). Element o odczynie ujemnym nie zawierał żadnego analitu docelowego. W każdym cyklu wykonano 12 (dwanaście) powtórzeń testu dla elementu panelu o odczynie silnie dodatnim i 12 powtórzeń testu dla elementu o odczynie ujemnym, wykonując oznaczenia na przemian dla próbek ujemnych i dodatnich. Trzy następujące po sobie cykle testów wykonało 3 (trzech) operatorów, łącznie 9 cykli obejmujących 24 próbki. Nie uzyskano wyników fałszywie dodatnich wskutek przeniesienia skażenia. PIŚMIENNICTWO 1. Dubberke ER, Wertheimer AI. Review of current literature on the economic burden of Clostridium difficile infection. Infect Control Hosp Epidemiol 2009; 30:57-66. 2. Poutanen SM, Simor AE. Clostridium difficile-associated diarrhea in adults. Can Med Assoc J 2004;171:51-8. 3. Redelings MD, Sorvillo F, Mascola L. Increase in Clostridium difficile-related mortality rates, United States, 1999-2004. Emerg Infect Dis 2007;13:1417-9. 4. McDonald LC, Owing M, Jernigan DB. Clostridium difficile Infection in Patients Discharged from US Short-Stay hospitals, 1996 2003. Emerging Infectious Diseases, 2006, 12 (3):409-415. 5. Pepin J, Valiquettte L, Alary ME. Clostridium difficile associated diarrhea in a region of Quebec from 1991 to 2003: a changing pattern of disease severity. CMAJ. 2004;171:466 72. 6. Bignardi GE. Risk factors for Clostridium difficile infection. J Hosp Infect 1998; 40:1-15. 7. Peterson LR, Robicsek A. Does my patient have Clostridium difficile infection? Ann Intern Med 2009;151:176-9. 8. Lyras D, O Connor JR, Howarth PM, et al. Toxin B is essential for virulence of Clostridium difficile. Nature 2009;458:1176-9. 9. Delmee M. Laboratory diagnosis of Clostridium difficile disease. Clin Microbiol Infect. 2001 Aug;7(8):411-6. 10. Clinical and Laboratory Standards Institute. Protection of laboratory workers from occupationally acquired infections; Approved Guideline. Document M29 (Refer to the latest edition). 11. Centers for Disease Control and Prevention, and National Institutes of Health. Biosafety in microbiological and biomedical laboratories. Chosewood L.C. and Wilson D.E. (eds) (2009). HHS Publication number (CDC) 93-8395. 12. BD MAX System User s Manual (Refer to the latest version) BD Life Sciences, Sparks, MD, USA. 13. Clinical and Laboratory Standards Institute. Molecular Diagnostic Methods for Infectious Diseases; Approved Guideline, document MM03 (Refer to the latest edition). 14. Clinical and Laboratory Standards Institute. User Protocol for Evaluation of Qualitative Test Performance; Approved Guideline. Document EP12 (Refer to the latest edition). 15. Cohen SH et al. (1998) Isolation of a Toxin B-deficient mutant strain of Clostridium difficile in a case of recurrent Clostridium difficile Associated Diarrhea, Clin. Infect. Dis. 26: 410-412. 16. Cohen SH et al. (2000) Analysis of the pathogenicity locus in Clostridium difficile strains, J. Infect. Dis. 181: 659-63. 17. MacCannell D. et al. (2006) Characterization of a novel, tcdb-deficient, NPA1 variant strain of Clostridium difficile, 46th Annual ICAAC, San Francisco, Sept. 2006. 18. McFarland, L.V., et al., Implications of the changing face of Clostridium difficile disease for health care practitioners. Am J Infect Control, 2007. 35(4): p. 237-53. 19. Rupnik M. et al. A novel toxinotyping scheme and correlation of toxinotypes with serogroups of Clostridium difficile isolates, J Clin Microbiol, 1998, 36 (8): 2240-2247. 20. Rupnik M. et al. Comparison of toxinotyping and PCR ribotyping of Clostridium difficile strains and description of novel toxinotypes, Microbiology 2001, 147, 439-447. 21. Rupnik M. et al. New types of Toxin A-Negative, Toxin B-Positive strains among Clostridium difficile isolates from Asia, J Clin Microbiol, 2003, 41(3): 1118-1125. 11

Manufacturer / Производител / Výrobce / Fabrikant / Hersteller / Κατασκευαστής / Fabricante / Tootja / Fabricant / Proizvođać / Gyártó / Fabbricante / Атқарушы / 제조업체 / Gamintojas / Ražotājs / Tilvirker / Producent / Producător / Производитель / Výrobca / Proizvođač / Tillverkare / Üretici / Виробник / 生产厂商 Use by / Използвайте до / Spotřebujte do / Brug før / Verwendbar bis / Χρήση έως / Usar antes de / Kasutada enne / Date de péremption / 사용기한 / Upotrijebiti do / Felhasználhatóság dátuma / Usare entro / Дейін пайдалануға / Naudokite iki / Izlietot līdz / Houdbaar tot / Brukes for / Stosować do / Prazo de validade / A se utiliza până la / Использовать до / Použite do / Upotrebiti do / Använd före / Son kullanma tarihi / Використати до\line / 使用截止日期 YYYY-MM-DD / YYYY-MM (MM = end of month) ГГГГ-ММ-ДД / ГГГГ-ММ (ММ = края на месеца) RRRR-MM-DD / RRRR-MM (MM = konec měsíce) ÅÅÅÅ-MM-DD / ÅÅÅÅ-MM (MM = slutning af måned) JJJJ-MM-TT / JJJJ-MM (MM = Monatsende) ΕΕΕΕ-MM-HH / ΕΕΕΕ-MM (MM = τέλος του μήνα) AAAA-MM-DD / AAAA-MM (MM = fin del mes) AAAA-KK-PP / AAAA-KK (KK = kuu lõpp) AAAA-MM-JJ / AAAA-MM (MM = fin du mois) GGGG-MM-DD / GGGG-MM (MM = kraj mjeseca) ÉÉÉÉ-HH-NN / ÉÉÉÉ-HH (HH = hónap utolsó napja) AAAA-MM-GG / AAAA-MM (MM = fine mese) ЖЖЖЖ-АА-КК / ЖЖЖЖ-АА / (АА = айдың соңы) YYYY-MM-DD/YYYY-MM(MM = 월말 ) MMMM-MM-DD / MMMM-MM (MM = mėnesio pabaiga) GGGG-MM-DD/GGGG-MM (MM = mēneša beigas) JJJJ-MM-DD / JJJJ-MM (MM = einde maand) ÅÅÅÅ-MM-DD / ÅÅÅÅ-MM (MM = slutten av måneden) RRRR-MM-DD / RRRR-MM (MM = koniec miesiąca) AAAA-MM-DD / AAAA-MM (MM = fim do mês) AAAA-LL-ZZ / AAAA-LL (LL = sfârşitul lunii) ГГГГ-ММ-ДД / ГГГГ-ММ (ММ = конец месяца) RRRR-MM-DD / RRRR-MM (MM = koniec mesiaca) GGGG-MM-DD / GGGG-MM (MM = kraj meseca) ÅÅÅÅ-MM-DD / ÅÅÅÅ-MM (MM = slutet av månaden) YYYY-AA-GG / YYYY-AA (AA = ayın sonu) РРРР-MM-ДД / РРРР-MM (MM = кінець місяця) YYYY-MM-DD / YYYY-MM (MM = 月末 ) Catalog number / Каталожен номер / Katalogové číslo / Katalognummer / Αριθμός καταλόγου / Número de catálogo / Katalooginumber / Numéro catalogue / Kataloški broj / Katalógusszám / Numero di catalogo / Каталог нөмірі / 카탈로그번호 / Katalogo / numeris / Kataloga numurs / Catalogus nummer / Numer katalogowy / Număr de catalog / Номер по каталогу / Katalógové číslo / Kataloški broj / Katalog numarası / Номер за каталогом / 目录号 Authorized Representative in the European Community / Оторизиран представител в Европейската общност / Autorizovaný zástupce pro Evropském společenství / Autoriseret repræsentant i De Europæiske Fællesskaber / Autorisierter Vertreter in der Europäischen Gemeinschaft / Εξουσιοδοτημένος αντιπρόσωπος στην Ευρωπαϊκή Κοινότητα / Representante autorizado en la Comunidad Europea / Volitatud esindaja Euroopa Nõukogus / Représentant autorisé pour la Communauté européenne / Autorizuirani predstavnik u Europskoj uniji / Meghatalmazott képviselő az Európai Közösségben / Rappresentante autorizzato nella Comunità Europea / Европа қауымдастығындағы уәкілетті өкіл / 유럽공동체의위임대표 / Įgaliotasis atstovas Europos Bendrijoje / Pilnvarotais pārstāvis Eiropas Kopienā / Bevoegde vertegenwoordiger in de Europese Gemeenschap / Autorisert representant i EU / Autoryzowane przedstawicielstwo we Wspólnocie Europejskiej / Representante autorizado na Comunidade Europeia / Reprezentantul autorizat pentru Comunitatea Europeană / Уполномоченный представитель в Европейском сообществе / Autorizovaný zástupca v Európskom spoločenstve / Autorizovano predstavništvo u Evropskoj uniji / Auktoriserad representant i Europeiska gemenskapen / Avrupa Topluluğu Yetkili Temsilcisi / Уповноважений представник у країнах ЄС / 欧洲共同体授权代表 In Vitro Diagnostic Medical Device / Медицински уред за диагностика ин витро / Lékařské zařízení určené pro diagnostiku in vitro / In vitro diagnostisk medicinsk anordning / Medizinisches In-vitro-Diagnostikum / In vitro διαγνωστική ιατρική συσκευή / Dispositivo médico para diagnóstico in vitro / In vitro diagnostika meditsiiniaparatuur / Dispositif médical de diagnostic in vitro / Medicinska pomagala za In Vitro Dijagnostiku / In vitro diagnosztikai orvosi eszköz / Dispositivo medicale per diagnostica in vitro / Жасанды жағдайда жүргізетін медициналық диагностика аспабы / In Vitro Diagnostic 의료기기 / In vitro diagnostikos prietaisas / Medicīnas ierīces, ko lieto in vitro diagnostikā / Medisch hulpmiddel voor in-vitro diagnostiek / In vitro diagnostisk medisinsk utstyr / Urządzenie medyczne do diagnostyki in vitro / Dispositivo médico para diagnóstico in vitro / Dispozitiv medical pentru diagnostic in vitro / Медицинский прибор для диагностики in vitro / Medicínska pomôcka na diagnostiku in vitro / Medicinski uređaj za in vitro dijagnostiku / Medicinteknisk produkt för in vitro-diagnostik / İn Vitro Diyagnostik Tıbbi Cihaz / Медичний пристрій для діагностики in vitro / 体外诊断医疗设备 Temperature limitation / Температурни ограничения / Teplotní omezení / Temperaturbegrænsning / Temperaturbegrenzung / Περιορισμοί θερμοκρασίας / Limitación de temperatura / Temperatuuri piirang / Limites de température / Dozvoljena temperatura / Hőmérsékleti határ / Limiti di temperatura / Температураны шектеу / 온도제한 / Laikymo temperatūra / Temperatūras ierobežojumi / Temperatuurlimiet / Temperaturbegrensning / Ograniczenie temperatury / Limites de temperatura / Limite de temperatură / Ограничение температуры / Ohraničenie teploty / Ograničenje temperature / Temperaturgräns / Sıcaklık sınırlaması / Обмеження температури / 温度限制 Batch Code (Lot) / Код на партидата / Kód (číslo) šarže / Batch-kode (lot) / Batch-Code (Charge) / Κωδικός παρτίδας (παρτίδα) / Código de lote (lote) / Partii kood / Numéro de lot / Lot (kod) / Tétel száma (Lot) / Codice batch (lotto) / Топтама коды / 배치코드 ( 로트 ) / Partijos numeris (LOT) / Partijas kods (laidiens) / Lot nummer / Batch-kode (parti) / Kod partii (seria) / Código do lote / Cod de serie (Lot) / Код партии (лот) / Kód série (šarža) / Kod serije / Partinummer (Lot) / Parti Kodu (Lot) / Код партії / 批号 ( 亚批 ) Contains sufficient for <n> tests / Съдържанието е достатъчно за <n> теста / Dostatečné množství pro <n> testů / Indeholder tilstrækkeligt til <n> tests / Ausreichend für <n> Tests / Περιέχει επαρκή ποσότητα για <n> εξετάσεις / Contenido suficiente para <n> pruebas / Küllaldane <n> testide jaoks / Contenu suffisant pour <n> tests / Sadržaj za <n> testova / <n> teszthez elegendő / Contenuto sufficiente per <n> test / <п> тесттері үшін жеткілікті / <n> 테스트가충분히포함됨 / Pakankamas kiekis atlikti <n> testų / Satur pietiekami <n> pārbaudēm / Inhoud voldoende voor n testen / Innholder tilstrekkelig til <n> tester / Zawiera ilość wystarczającą do <n> testów / Conteúdo suficiente para <n> testes / Conţinut suficient pentru <n> teste / Достаточно для <n> тестов(а) / Obsah vystačí na <n> testov / Sadržaj dovoljan za <n> testova / Innehåller tillräckligt för <n> analyser / <n> test için yeterli malzeme içerir / Вистачить для аналізів: <n> / 足够进行 <n> 次检测 Consult Instructions for Use / Направете справка в инструкциите за употреба / Prostudujte pokyny k použití / Se brugsanvisningen / Gebrauchsanweisung beachten / Συμβουλευτείτε τις οδηγίες χρήσης / Consultar las instrucciones de uso / Lugeda kasutusjuhendit / Consulter la notice d emploi / Koristi upute za upotrebu / Olvassa el a használati utasítást / Consultare le istruzioni per l uso / Пайдалану нұсқаулығымен танысып алыңыз / 사용지침참조 / Skaitykite naudojimo instrukcijas / Skatīt lietošanas pamācību / Raadpleeg de gebruiksaanwijzing / Se i bruksanvisningen / Zobacz instrukcja użytkowania / Consultar as instruções de utilização / Consultaţi instrucţiunile de utilizare / См. руководство по эксплуатации / Pozri Pokyny na používanie / Pogledajte uputstvo za upotrebu / Se bruksanvisningen / Kullanım Talimatları na başvurun / Див. інструкції з використання / 请参阅使用说明 Do not reuse / Не използвайте отново / Nepoužívejte opakovaně / Ikke til genbrug / Nicht wiederverwenden / Μην επαναχρησιμοποιείτε / No reutilizar / Mitte kasutada korduvalt / Ne pas réutiliser / Ne koristiti ponovo / Egyszer használatos / Non riutilizzare / Пайдаланбаңыз / 재사용금지 / Tik vienkartiniam naudojimui / Nelietot atkārtoti / Niet opnieuw gebruiken / Kun til engangsbruk / Nie stosować powtórnie / Não reutilize / Nu refolosiţi / Не использовать повторно / Nepoužívajte opakovane / Ne upotrebljavajte ponovo / Får ej återanvändas / Tekrar kullanmayın / Не використовувати повторно / 请勿重复使用 Serial number / Сериен номер / Sériové číslo / Serienummer / Seriennummer / Σειριακός αριθμός / Nº de serie / Seerianumber / Numéro de série / Serijski broj / Sorozatszám / Numero di serie / Топтамалық нөмірі / 일련번호 / Serijos numeris / Sērijas numurs / Serie nummer / Numer seryjny /Número de série / Număr de serie / Серийный номер / Seri numarası / Номер серії / 序列号 For IVD Performance evaluation only / Само за оценка качеството на работа на IVD / Pouze pro vyhodnocení výkonu IVD / Kun til evaluering af IVD ydelse / Nur für IVD-Leistungsbewertungszwecke / Mόνο για αξιολόγηση απόδοσης IVD / Sólo para la evaluación del rendimiento en diagnóstico in vitro / Ainult IVD seadme hindamiseks / Réservé à l évaluation des performances IVD / Samo u znanstvene svrhe za In Vitro Dijagnostiku / Kizárólag in vitro diagnosztikához / Solo per valutazione delle prestazioni IVD / Жасанды жағдайда «пробирка ішінде»,диагностикада тек жұмысты бағалау үшін / IVD 성능평가에대해서만사용 / Tik IVD prietaisų veikimo charakteristikoms tikrinti / Vienīgi IVD darbības novērtēšanai /Uitsluitend voor doeltreffendheidsonderzoek / Kun for evaluering av IVD-ytelse / Tylko do oceny wydajności IVD / Uso exclusivo para avaliação de IVD / Numai pentru evaluarea performanţei IVD / Только для оценки качества диагностики in vitro / Určené iba na diagnostiku in vitro / Samo za procenu učinka u in vitro dijagnostici / Endast för utvärdering av diagnostisk användning in vitro / Yalnızca IVD Performans değerlendirmesi için / Тільки для оцінювання якості діагностики in vitro / 仅限 IVD 性能评估 For US: For Investigational Use Only Lower limit of temperature / Долен лимит на температурата / Dolní hranice teploty / Nedre temperaturgrænse / Temperaturuntergrenze / Κατώτερο όριο θερμοκρασίας / Límite inferior de temperatura / Alumine temperatuuripiir / Limite inférieure de température / Najniža dozvoljena temperatura / Alsó hőmérsékleti határ / Limite inferiore di temperatura / Температураның төменгі руқсат шегі / 하한온도 / Žemiausia laikymo temperatūra / Temperatūras zemākā robeža /Laagste temperatuurlimiet / Nedre temperaturgrense / Dolna granica temperatury / Limite minimo de temperatura / Limită minimă de temperatură / Нижний предел температуры / Spodná hranica teploty / Donja granica temperature / Nedre temperaturgräns / Sıcaklık alt sınırı / Мінімальна температура / 温度下限 Control / Контролно / Kontrola / Kontrol / Kontrolle / Μάρτυρας / Kontroll / Contrôle / Controllo / Бақылау / 컨트롤 / Kontrolė / Kontrole / Controle / Controlo / Контроль / kontroll / Контроль / 对照 Positive control / Положителен контрол / Pozitivní kontrola / Positiv kontrol / Positive Kontrolle / Θετικός μάρτυρας / Control positivo / Positiivne kontroll / Contrôle positif / Pozitivna kontrola / Pozitív kontroll / Controllo positivo / Оң бақылау / 양성컨트롤 / Teigiama kontrolė / Pozitīvā kontrole / Positieve controle / Kontrola dodatnia / Controlo positivo / Control pozitiv / Положительный контроль / Pozitif kontrol / Позитивний контроль / 阳性对照试剂 Negative control / Отрицателен контрол / Negativní kontrola / Negativ kontrol / Negative Kontrolle / Αρνητικός μάρτυρας / Control negativo / Negatiivne kontroll / Contrôle négatif / Negativna kontrola / Negatív kontroll / Controllo negativo / Негативтік бақылау / 음성컨트롤 / Neigiama kontrolė / Negatīvā kontrole / Negatieve controle / Kontrola ujemna / Controlo negativo / Control negativ / Отрицательный контроль / Negatif kontrol / Негативний контроль / 阴性对照试剂 12