Do stosowania w diagnostyce in vitro. P0205(02) Do stosowania z systemem BD MAX Polski

Transkrypt

1 MAX MRSA XT Do stosowania w diagnostyce in vitro P0205(02) Do stosowania z systemem BD MAX Polski PRZEZNACZENIE Oznaczenie BD MAX MRSA XT służące do przeprowadzania testów z użyciem systemu BD MAX to zautomatyzowany test diagnostyczny in vitro do bezpośredniego jakościowego wykrywania DNA Staphylococcus aureus (gronkowca złocistego) opornego na metycylinę (MRSA) w wymazach z nosa u pacjentów zagrożonych kolonizacją nosa. W teście wykorzystywana jest reakcja łańcuchowa polimerazy (PCR) w czasie rzeczywistym do amplifikacji DNA MRSA oraz fluorogenne swoiste dla substancji docelowych sondy hybrydyzacyjne do wykrywania amplifikowanego DNA. Oznaczenie BD MAX MRSA XT służy do pomocy w zapobieganiu zakażeniom MRSA w placówkach opieki zdrowotnej i kontrolowaniu ich. Nie służy ono do diagnozowania zakażeń MRSA ani wspomagania czy monitorowania leczenia zakażeń MRSA. Ujemny wynik badania nie wyklucza możliwości kolonizacji nosa. Jednoczesne prowadzenie hodowli jest niezbędne, aby uzyskać organizmy do typowania epidemiologicznego lub dalszych badań wrażliwości. STRESZCZENIE I OBJAŚNIENIE PROCEDURY MRSA jest główną przyczyną zakażeń w placówkach opieki zdrowotnej. Bakterię tę przenoszą na dłoniach pracownicy placówek opieki zdrowotnej; jest ona również przenoszona w środowisku przez pacjentów zakażonych MRSA. Choć MRSA może wywoływać infekcje z objawami klinicznymi od krost po posocznicę i zgon, 1 to może on znajdować się także w nosie lub na skórze osób będących bezobjawowymi nosicielami. Leczenie zakażeń MRSA jest niezwykle trudne, ponieważ gronkowiec ten jest często oporny na wiele różnych środków przeciwdrobnoustrojowych. Szczepy Staphylococcus aureus oporne na metycylinę są często spotykane w placówkach opieki zdrowotnej i w niektórych szpitalach Ameryki Północnej stanowią ponad 50% izolatów Staphylococcus aureus pozyskanych od osób zarażonych w szpitalach. Czynnikami ryzyka zakażenia MRSA w placówkach opieki zdrowotnej są między innymi: przedłużająca się hospitalizacja, bliskość pacjentów zakażonych bądź skolonizowanych MRSA, kolonizacja innymi opornymi organizmami, takimi jak Enterococci oporne na wankomycynę (VRE) i Clostridium difficile, liczne lub przedłużające się cykle leczenia antybiotykami o szerokim spektrum działania, przebywanie w obszarach zagrożonych występowaniem MRSA w placówce opieki zdrowotnej, a także wcześniejsze zakażenie MRSA lub bycie nosicielem (z kolonizacją nosa). Wczesne wykrywanie pacjentów z nosowym nosicielstwem MRSA może stanowić element programu skutecznego zapobiegania zakażeniom MRSA. Wykrywanie MRSA w hodowlach wymaga izolacji czystych kolonii, poddawanych następnie badaniom wrażliwości na oksacylinę lub cefoksytynę, badaniom pod kątem obecności genu meca lub białka wiążącego penicylinę (PBP 2a) kodowanego przez gen meca. Proces identyfikacji MRSA oparty na hodowli trwa co najmniej 24 godziny (mediana do uzyskania wyniku to niemal 48 godzin). Ze względu na szybkość rozprzestrzeniania się zakażeń MRSA, szczególnie w placówkach opieki zdrowotnej, w których często znajdują się nosiciele, uzyskiwanie wyników nosicielstwa nosowego MRSA w dniu pobrania próbki stanowi zaletę, jeśli chodzi o programy zapobiegania zakażeniom. Sprawdzoną strategią ograniczenia przenoszenia zakażeń w placówkach opieki zdrowotnej i zapobiegania zakażeniom u pacjentów wrażliwych jest aktywna obserwacja przy użyciu testów molekularnych do szybkiego wykrywania MRSA. Nieprawidłowości w wykrywaniu mogą prowadzić do niekontrolowanego przenoszenia MRSA i niewłaściwego wykorzystania zasobów opieki zdrowotnej. 2 Inne dostępne w sprzedaży oznaczenia dają do 17,9% wyników dodatnich na obecność MRSA, które są nieprawidłowe z uwagi na nieobecność genu meca organizmy te zwane są dropout mutants, mutantami niezawierającymi genu docelowego. 3 Te fałszywie dodatnie wyniki mogą prowadzić do niepotrzebnej, kosztownej izolacji i leczenia pacjentów. 1 Szczepy MRSA z nowo wykrytym genem mecc odpowiadają za 3 4% wszystkich nowych przypadków MRSA, 4 ale nie są wykrywane w oznaczeniach nieukierunkowanych na gen mecc. 5 Niewykrywanie genu mecc może prowadzić do uzyskania fałszywie ujemnych wyników, które mogą przyczyniać się do niekontrolowanego rozprzestrzeniania się niewykrytych szczepów MRSA. Sposób działania oznaczenia ma krytyczne znaczenie dla poprawnego wykrywania MRSA i zagwarantowania odpowiedniej interwencji mającej na celu kontrolę zakażeń. W oznaczeniu BD MAX MRSA XT wykorzystywana jest rozszerzona kombinacja primerów i sond w celu wykrywania nowych szczepów MRSA, w tym szczepów z genami meca lub mecc, i zmniejszenia liczby fałszywie dodatnich wyników dla organizmów pozbawionych genów meca lub mecc. 1

2 Wymaz z nosa jest pobierany i transportowany do laboratorium z wykorzystaniem zalecanej wymazówki [patrz części Equipment (Sprzęt) i Materials Required But Not Provided (Materiały wymagane, ale niedostarczane)]. Wymazówkę umieszcza się w probówce na bufor próbki BD MAX MRSA XT. Probówka na bufor próbki jest worteksowana w celu przeniesienia komórek z wymazówki do buforu. Probówkę na bufor próbki umieszcza się w systemie BD MAX i zachodzą następujące zautomatyzowane czynności: komórki bakterii są poddawane lizie, DNA jest ekstrahowane na koralikach magnetycznych i zatężane, a następnie podpróbkę wymytego DNA dodaje się do odczynników do PCR zawierających swoiste dla MRSA primery służące do amplifikacji genów docelowych, o ile są obecne. Test zawiera również próbkę kontrolną. Próbka kontrolna znajduje się w probówce ekstrakcyjnej; przeprowadzane są na niej etapy ekstrakcji, zatężania i amplifikacji w celu wykrycia inhibitorów jak również braku wydajności procesu z powodu nieprawidłowości w działaniu aparatów lub odczynników. Po umieszczeniu w systemie BD MAX próbki klinicznej oraz BD MAX Unitized Reagent Strip (scalonego paska z odczynnikami) i BD MAX PCR Cartridge (kasety do PCR) interwencja operatora nie jest już potrzebna. System BD MAX umożliwia automatyzację lizy próbki, ekstrakcji i zatężania DNA, ponownego nawadniania odczynników, amplifikacji kwasów nukleinowych oraz wykrywania docelowych sekwencji kwasów nukleinowych przy wykorzystaniu reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR) w czasie rzeczywistym. Docelowe związki po amplifikacji wykrywane są sondami hydrolizy znakowanymi wygaszonymi fluoroforami. Amplifikacja, wykrywanie i interpretacja sygnałów zachodzą w systemie BD MAX automatycznie. ZASADY PROCEDURY W systemie BD MAX wykorzystywana jest kombinacja odczynników litycznych i ekstrakcyjnych w celu przeprowadzenia lizy komórek i ekstrakcji DNA. Po enzymatycznej lizie komórek w podwyższonej temperaturze uwolnione kwasy nukleinowe są wychwytywane na koralikach magnetycznych. Koraliki wraz z przyczepionymi do nich kwasami nukleinowymi są płukane, a kwasy nukleinowe ulegają wymywaniu w buforze do wymywania pod wpływem wysokiej temperatury. Wymyte cząsteczki DNA neutralizuje się z wykorzystaniem bufora zobojętniającego i przenosi do probówki z mieszaniną wzorcową w celu nawodnienia odczynników do PCR. Rekonstytuowane odczynniki do amplifikacji umieszcza się w kasecie do PCR BD MAX. Mikrozastawki w kasecie do PCR BD MAX są zamykane przez system przed rozpoczęciem PCR, aby zapobiec parowaniu i skażeniu amplikonów. Docelowe sekwencje DNA po amplifikacji wykrywane są przy pomocy sond hydrolitycznych (TaqMan) znakowanych z jednej strony fluorescencyjnym barwnikiem sygnałowym (fluoroforem), a z drugiej - grupą wygaszającą. Do wykrywania swoistego amplikonu połączenia prawego ramienia SCCmec (MREJ) i genów oporności na metycylinę meca i mecc, w trzech różnych kanałach optycznych systemu BD MAX wykorzystywane są sondy znakowane różnymi fluoroforami. Amplikony w połączeniu prawego ramienia SCCmec (MREJ) wykrywane są w kanale 475/520, amplikony genów oporności na metycylinę meca i mecc wykrywane są w kanale 585/630, a amplikony próbki kontrolnej wykrywane są w kanale 680/715. Gdy sondy są w stanie natywnym, fluorofor jest wygaszony wskutek bliskości grupy wygaszającej. Jednak w obecności docelowego DNA sondy hybrydyzują do swoich sekwencji komplementarnych i ulegają hydrolizie w wyniku aktywności egzonukleazy 5 3, jaką wykazuje polimeraza DNA, gdy syntetyzuje powstającą nić wzdłuż istniejącej nici DNA. W efekcie fluorofory pozostają odseparowane od cząsteczek wygaszających i emitowana jest fluorescencja. Intensywność fluorescencji zarejestrowanej w trzech kanałach optycznych wykorzystywanych w oznaczeniu BD MAX MRSA XT jest wprost proporcjonalna do ilości cząsteczek odpowiedniej sondy ulegających hydrolizie. W systemie BD MAX sygnały te są mierzone pod koniec każdego cyklu amplifikacji i na podstawie interpretacji danych podawany jest wynik. ODCZYNNIKI NR KAT. Zawartość Ilość BD MAX MRSA XT Master Mix (C7) (mieszanina wzorcowa) Sucha mieszanina wzorcowa do PCR zawierająca polimerazę, nukleotydy, swoiste sondy molekularne i primery 24 testy oraz sondę molekularną swoistą wobec próbki kontrolnej. BD MAX MRSA XT Unitized Reagent Strip (scalony pasek z odczynnikami) Scalony pasek z odczynnikami zawierający wszystkie ciekłe odczynniki oraz jednorazowe końcówki pipet 24 testy potrzebne do przetwarzania próbki i ekstrakcji DNA. BD MAX MRSA XT Extraction Tube (B8) (probówka ekstrakcyjna) Suchy odczynnik ekstrakcyjny zawierający koraliki magnetyczne z powinowactwem do DNA, achromopeptydazę 24 testy oraz próbkę kontrolną. BD MAX MRSA XT Sample Buffer Tube (probówka na bufor próbki) 24 testy (z 25 korkami z przegrodą) SPRZĘT I MATERIAŁY WYMAGANE, ALE NIEZNAJDUJĄCE SIĘ W ZESTAWIE Wymazówka BD BBL CultureSwab Liquid Stuart pojedyncza lub podwójna (BD, nr kat lub ), wymazówka Copan (Venturi) Transystem* Liquid Stuart pojedyncza lub podwójna (Copan, nr kat. 141C lub 139C) VWR Multi-Tube Vortexer (mieszadło wieloprobówkowe) (VWR, nr kat ) NALGENE Cryogenic Vial Holder (stojak do probówek kriogenicznych) (VWR, nr kat ) Rękawiczki jednorazowe, bez talku Sterylne nożyczki (opcjonalne) Sterylne gaziki Stoper lub czasomierz BD MAX PCR Cartridges (kasety do PCR) (nr kat. BD ) 2

3 OSTRZE ENIA I ŚRODKI OSTRO NOŚCI Oznaczenie BD MAX MRSA XT przeznaczone jest do stosowania w diagnostyce in vitro. Produkt może być używany tylko w systemie BD MAX. Nie stosować przeterminowanych odczynników ani materiałów. Nie używać zestawu, jeśli w chwili dostarczenia etykieta stanowiąca zamknięcie zewnętrznego pudełka jest uszkodzona. Nie używać odczynników, jeśli w chwili dostarczenia woreczki ochronne są otwarte lub uszkodzone. Nie używać odczynników, jeśli brak środka osuszającego lub jeśli jest on otwarty wewnątrz woreczka z odczynnikiem. Nie wyjmować środka osuszającego z woreczka z odczynnikiem. Po każdym użyciu odczynnika niezwłocznie szczelnie zamykać woreczki ochronne. Przed zamknięciem woreczka usunąć nadmiar powietrza. Chronić odczynniki przed wysoką temperaturą i wilgotnością. Przedłużone narażenie na działanie wilgotnego środowiska wpływa na działanie produktu. Nie używać odczynników, jeśli folia jest przerwana lub uszkodzona. Nie mieszać odczynników z różnych woreczków, zestawów lub serii. Nie należy zamieniać ani ponownie używać korków, gdyż może to spowodować ich zanieczyszczenie i negatywnie wpłynąć na wyniki testu. Odpowiednie napełnienie płynami można sprawdzić na scalonych paskach z odczynnikami (należy dopilnować, by płyny znajdowały się na dnie probówek [patrz Rysunek 1]). Sprawdzić na scalonych paskach z odczynnikami, czy wszystkie końcówki pipet są obecne (patrz Rysunek 1). Zachować ostrożność przy używaniu roztworów chemicznych, ponieważ kody kreskowe dla mieszaniny wzorcowej i probówki ekstrakcyjnej mogą stać się nieczytelne. Dla odpowiedniego działania tego testu zasadnicze znaczenie ma zachowanie dobrych praktyk laboratoryjnych. Z uwagi na wysoką czułość analityczną tego testu należy dołożyć szczególnych starań w kierunku zachowania czystości wszystkich materiałów i odczynników. Jeśli w tych samych obszarach laboratorium wykonywane są inne testy PCR, należy dopilnować, aby zestaw oznaczenia BD MAX MRSA XT, wszelkie dodatkowe odczynniki potrzebne do badania oraz system BD MAX nie uległy skażeniu. Należy bezwzględnie unikać skażenia odczynników mikroorganizmami i deoksyrybonukleazą (DNazą). Przed manipulacjami odczynnikami i kasetami konieczna jest zmiana rękawiczek. Aby uniknąć skażenia otoczenia amplikonami, nie otwierać kaset do PCR BD MAX po ich użyciu. Uszczelnienia kaset do PCR BD MAX zaprojektowane są tak, by zapobiegać skażeniu. W laboratorium należy rutynowo przeprowadzać monitorowanie środowiska w celu zminimalizowania ryzyka skażenia krzyżowego. Kasety mikroprzepływowe BD MAX przeznaczone są do użycia w maksymalnie dwóch cyklach. Wykonanie oznaczenia BD MAX MRSA XT poza zalecanymi ramami czasowymi może dać nieprawidłowe wyniki. Oznaczenia niewykonane w określonych ramach czasowych należy powtórzyć. W zależności od wytycznych lub wymogów wynikających z przepisów lokalnych, stanowych, wojewódzkich lub federalnych lub zaleceń organizacji akredytujących można zbadać dodatkowe próbki kontrolne. Należy zawsze postępować z próbkami jak z materiałem zakaźnym, zgodnie z wytycznymi dotyczącymi bezpiecznych procedur laboratoryjnych, takimi jak opisane w dokumentach CLSI M29 6 oraz Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories. 7 Pracując z odczynnikami, zawsze nosić odzież ochronną i rękawiczki jednorazowe. Po wykonaniu oznaczenia dokładnie umyć ręce. Nie pipetować ustami. Nie palić papierosów, nie spożywać płynów, nie jeść ani nie żuć w strefach pracy z próbkami lub odczynnikami zestawu. Niewykorzystane odczynniki i odpady zutylizować zgodnie z przepisami miejscowymi, stanowymi, wojewódzkimi lub ogólnokrajowymi. Dodatkowe ostrzeżenia, środki ostrożności i procedury można znaleźć w podręczniku użytkownika systemu BD MAX. 10 PRZECHOWYWANIE I STABILNOŚĆ Podczas transportu próbki powinny być przechowywane w temperaturze do 2 C do 2 C. Chronić przed ich zamrożeniem i zbyt wysoką temperaturą. Próbki można przechowywać w temperaturze 25 ± 2 C przez maksymalnie 48 godzin lub w temperaturze 2 8 C przez maksymalnie 120 godzin (5 dni) przed badaniem. Odczynniki i elementy testu BD MAX MRSA XT pozostają stabilne w temperaturze 2 25 C do upływu podanego terminu ważności. Nie należy używać odczynników i elementów, których termin ważności upłynął. Probówki z mieszaniną wzorcową BD MAX MRSA XT oraz probówki ekstrakcyjne dostarczane są w zamkniętych woreczkach. Aby chronić produkt przed działaniem wilgoci, należy niezwłocznie zamknąć woreczek ponownie po jego otwarciu. Probówki z odczynnikami są stabilne przez okres do 14 dni w temperaturze 2 25 C po otwarciu i ponownym zamknięciu woreczka. Nierekonstytuowane probówki z odczynnikami ekstrakcyjnymi i mieszaniny wzorcowej są stabilne do 5 godzin w temperaturze 2 25 C po ich wyjęciu z woreczka ochronnego. 3

4 INSTRUKCJE STOSOWANIA Pobieranie/transport próbek Używając zalecanych urządzeń do transportu wymazówek, (patrz część Materiały wymagane, lecz niedostarczane) wymazy z nosa należy pobrać zgodnie ze standardową procedurą postępowania w instytucji i laboratorium lub: 1. Zwilżyć wymazówki dwiema kroplami (około 50 µl) jałowej soli fizjologicznej lub pozostawić suche. 2. Ostrożnie wprowadzić wymazówki do nozdrza pacjenta [koniec wymazówki powinien być wprowadzony na głębokość do 2,5 cm (1 cala) od brzegu nozdrza]. 3. Obrócić wymazówkę wzdłuż błony śluzowej wewnątrz nozdrza pięciokrotnie. 4. Wprowadzić tę samą wymazówkę do drugiego nozdrza i powtórzyć kroki 2 i Umieścić wymazówki w probówce transportowej. 6. Oznaczyć etykietę na probówkę transportową. 7. Przetransportować wymazówki do laboratorium zgodnie ze standardową procedurą postępowania w instytucji i laboratorium (patrz część Przechowywanie i stabilność). Przygotowanie próbek UWAGA: jedna (1) probówka na bufor próbki, jeden (1) korek z przegrodą, jedna (1) probówka z mieszaniną wzorcową (C7), jedna (1) probówka ekstrakcyjna (B8) oraz jeden (1) scalony pasek z odczynnikami to materiały wymagane do przetestowania każdej próbki i każdej zewnętrznej próbki kontrolnej. UWAGA: w kwestii wykonywania posiewu z próbek klinicznych przed wykonaniem oznaczenia BD MAX MRSA XT należy odnieść się do części Posiew próbek materiałów klinicznych. 1. Pozyskać taką liczbę probówek na bufor próbki (z bezbarwnym korkiem), jaka odpowiada liczbie próbek i próbek kontrolnych, które mają być przebadane. 2. Oznakować każdą probówkę na bufor próbki odpowiednimi danymi pacjenta, dopilnowując, aby nie zasłonić kodu kreskowego, nie pisać na nim ani nie nakleić na nim etykiety. 3. Zdjąć korek z probówki na bufor próbki. 4. Wyjąć wymazówkę z próbówki do transportu próbki i umieścić wymazówkę w odpowiedniej probówce na bufor próbki. 5. Trzymać wymazówkę za patyczek w pobliżu brzegu probówki na bufor próbki (użyć sterylnego gazika, aby zminimalizować ryzyko skażenia). Unieść wymazówkę o około 1 (jeden) centymetr z dna probówki na bufor próbki i zagiąć patyczek na krawędzi probówki, aby go złamać. Metoda alternatywna: do odcięcia patyczka użyć sterylnych nożyczek. 6. Zamknąć probówkę na bufor próbki korkiem z przegrodą. 7. Umieścić probówkę na bufor próbki w statywie do próbówek kriogenicznych NALGENE i worteksować z maksymalną prędkością przez 1 (jedną) minutę mieszadłem wieloprobówkowym. W mieszadle wieloprobówkowym można przetwarzać jednocześnie do 24 probówek. Obsługa systemu BD MAX UWAGA: szczegółowe instrukcje znajdują się w podręczniku użytkownika systemu BD MAX (patrz część Obsługa ). UWAGA: oznaczenie BD MAX MRSA XT należy przeprowadzić niezwłocznie po wyżej wymienionym kroku worteksowania (patrz Przygotowanie próbek, krok 7). W razie konieczności ponownego wykonania testu należy ponownie wykonać worteksowanie próbek. 1. Włączyć system BD MAX (jeśli nie jest już włączony) i zalogować się, wprowadzając <user name> (nazwę użytkownika) i <password> (hasło). 2. Przed manipulacjami odczynnikami i kasetami konieczna jest zmiana rękawiczek. 3. Wyjąć pożądaną liczbę scalonych pasków z odczynnikami z zestawu BD MAX MRSA XT. Delikatnie postukać każdym scalonym paskiem z odczynnikami o twardą powierzchnię, tak aby wszystkie porcje płynu znalazły się na dnie probówek. 4. Wyjąć pożądaną liczbę probówek ekstrakcyjnych i probówek z mieszaniną wzorcową z woreczków zabezpieczających. Usunąć nadmiar powietrza i zamknąć szczelnie woreczki. 5. Dla każdej badanej próbki umieścić 1 (jeden) scalony pasek z odczynnikami w statywie systemu BD MAX, zaczynając od pozycji 1 na statywie A. 6. Wcisnąć 1 (jedną) probówkę ekstrakcyjną (biała folia) do każdego scalonego paska z odczynnikami w pozycję 1, jak pokazano na Rysunku Wcisnąć 1 (jedną) probówkę z mieszaniną wzorcową (zielona folia) do każdego scalonego paska z odczynnikami w pozycję 2, jak pokazano na Rysunku 1. 4

5 Rysunek 1: Wcisnąć probówki ekstrakcyjne z zestawu BD MAX MRSA XTi probówki z mieszaniną wzorcową do scalonych pasków z odczynnikami. 8. Kliknąć ikonę Run (Uruchom) i wprowadzić numer serii zestawu BD MAX MRSA XT (do celów śledzenia serii), skanując kod kreskowy (znajdujący się na zewnętrznym pudełku) albo ręcznie. UWAGA: krok 8 powtarzać za każdym razem, gdy używana jest nowa partia zestawów. 9. Przejść do Worklist (Listy roboczej). Z menu rozwijanego wybrać <BD MAX MRSA XT 54>. 10. Wprowadzić identyfikator probówki na bufor próbki, identyfikator pacjenta i numer akcesyjny (jeśli ma zastosowanie) do Worklist (Listy roboczej), odczytując kod kreskowy skanerem lub ręcznie. 11. Wybrać odpowiedni numer serii zestawu (znajdujący się na zewnętrznym pudełku) z menu rozwijanego. 12. Powtórzyć kroki 9 11 dla wszystkich pozostałych probówek na bufor próbki. 13. Umieścić probówki na bufor próbki w statywach systemu BD MAX odpowiadających scalonym paskom z odczynnikami zebranym w krokach 5 do 7. UWAGA: umieścić probówki na bufor próbki w statywie na próbki etykietą z kodem kreskowym 1D na zewnątrz (ułatwia to skanowanie probówek na bufor próbki podczas rejestracji próbki). 14. Umieścić wymaganą liczbę kaset do PCR BD MAX w systemie BD MAX (patrz Rysunek 2). Każda kaseta do mieści maksymalnie 24 próbki. System BD MAX automatycznie wybierze pozycję i rząd na kasecie do PCR BD MAX dla każdego cyklu. Kaset do PCR BD MAX można używać wielokrotnie, do wykorzystania wszystkich ścieżek. Aby zmaksymalizować wykorzystanie kaset do PCR BD MAX przy użyciu trybu 2000 Sample Mode, wybrać Run Wizard (Uruchom kreator) z karty Worklist (Lista robocza) do zadań dla ścieżki. Więcej informacji można znaleźć w podręczniku użytkownika systemu BD MAX. 10 Rysunek 2: Wkładanie kaset do PCR BD MAX 5

6 15. Umieścić statywy w systemie BD MAX (patrz Rysunek 3). Strona A Strona B Rysunek 3: Wkładanie statywów do systemu BD MAX 16. Zamknąć pokrywę systemu BD MAX i kliknąć <Start>, aby rozpocząć przetwarzanie. 17. Pod koniec cyklu można sprawdzić wyniki od razu lub przechowywać probówki na bufor próbki w temperaturze 2 8 C do 5 dni LUB w temperaturze 25 ± 2 C przez maksymalnie 48 godzin do sprawdzenia wyników. UWAGA: w razie uszkodzenia korka z przegrodą podczas cyklu należy wymienić go na nowy przed odłożeniem próbki do przechowywania. UWAGA: przygotowane probówki na bufor próbki oznaczenia BD MAX MRSA XT można przechowywać w temperaturze 2 8 C przez maksymalnie 120 godzin (5 dni) LUB w temperaturze 25 ± 2 C przez maksymalnie 36 godzin po umieszczeniu próbki w probówce na bufor próbki. W razie uzyskania wyniku nieokreślonego (IND), nierozstrzygającego (UNR) lub niepełnego (INC) lub w razie niepowodzenia testu zewnętrznej próbki kontrolnej test materiału z probówki na bufor próbki musi być powtórzony w tych ramach czasowych (patrz część Procedura powtarzania testu). KONTROLA JAKOŚCI Procedury kontroli jakości służą do monitorowania działania oznaczenia. Laboratoria ustalają liczbę, rodzaj i częstotliwość wykonywania testów materiałów kontrolnych zgodnie z wytycznymi lub wymogami przepisów lokalnych, wojewódzkich, stanowych, federalnych lub krajowych lub organizacji akredytujących. W zakresie ogólnych wytycznych dotyczących kontroli jakości użytkownik może odnieść się do dokumentów CLSI MM3 i EP12. 8,9 1. Materiały do zewnętrznych próbek kontrolnych nie są dostarczane przez BD. Zewnętrzne próbki kontrolne dodatnie i ujemne nie są wykorzystywane przez oprogramowanie systemu BD MAX do celów interpretacji wyniku badania próbki. Zewnętrzne próbki kontrolne traktowane są tak, jak próbki pochodzące od pacjentów. (W kwestii interpretacji wyników badania zewnętrznych próbek kontrolnych należy odnieść się do tabeli w części Interpretacja wyników). 2. W każdym laboratorium należy co najmniej raz dziennie wykonywać badanie 1 (jednej) zewnętrznej próbki kontrolnej dodatniej i 1 (jednej) zewnętrznej próbki kontrolnej ujemnej, do momentu uzyskania odpowiedniej walidacji procesu wykonywanego przy użyciu systemu BD MAX. Częstotliwość testów kontrolnych można zmniejszyć zgodnie z mającymi zastosowanie przepisami. 3. Celem badania zewnętrznych próbek kontrolnych dodatnich jest monitorowanie pod kątem znacząco nieprawidłowego działania odczynników. Celem badania zewnętrznych próbek kontrolnych ujemnych jest wykrywanie skażenia odczynników lub otoczenia docelowymi kwasami nukleinowymi (lub ich przeniesienia na próbkę). 4. Szczepy kontrolne należy badać zgodnie z wytycznymi lub wymogami przepisów lokalnych, stanowych lub federalnych lub organizacji akredytujących, w celu monitorowania skuteczności całej procedury analitycznej. 5. Zaleca się stosowanie różnych rodzajów zewnętrznych próbek kontrolnych, aby umożliwić użytkownikowi wybranie najbardziej odpowiednich dla programu kontroli jakości w danym laboratorium. a. Zewnętrzna kontrola ujemna: Materiał kontrolny dostępny w sprzedaży [np. szczep Staphylococcus epidermidis (ATCC 12228)] lub uprzednio scharakteryzowana próbka ujemna. Firma BD zaleca przygotowanie zewnętrznej próbki kontrolnej ujemnej przed zewnętrzną próbką kontrolną dodatnią, aby zmniejszyć ryzyko skażenia podczas przygotowywania próbki kontrolnej. b. Zewnętrzna kontrola dodatnia: Materiały kontrolne dostępne w sprzedaży [np. szczep referencyjny MRSA (ATCC 43300)] lub uprzednio scharakteryzowana próbka dodatnia. W celu przygotowania zawiesin próbek kontrolnych zewnętrznych przeprowadzić izolaty ponownie w zawiesinę w soli fizjologicznej do uzyskania mętności 0,5 w skali McFarlanda (~1 X 10 8 CFU/mL). Przygotować serię rozcieńczeń w soli fizjologicznej, aby uzyskać ostateczną zawiesinę o mętności ~1,0 x 10 4 CFU/mL. Zanurzyć wymazówkę w rozcieńczonej zawiesinie bakteryjnej, odcisnąć nadmiar płynu i umieścić wymazówkę w odpowiedniej probówce na bufor próbki. Przetwarzać i testować jak próbkę (patrz części Przygotowanie próbek i Obsługa systemu BD MAX). 6. Wszystkie zewnętrzne próbki kontrolne powinny dawać oczekiwane wyniki (dodatnie dla zewnętrznej kontroli dodatniej, ujemne dla zewnętrznej kontroli ujemnej) i nie powinny wystąpić niepowodzenia kontroli zewnętrznej (wyniki nierozstrzygające lub nieokreślone). 6

7 7. Jeśli dla zewnętrznej kontroli ujemnej wynik testu okaże się dodatni, oznacza to nieprawidłowości lub skażenie przy przygotowywaniu próbki. Należy sprawdzić technikę manipulacji próbką tak, by uniknąć pomyłek i skażenia. Jeśli dla zewnętrznej dodatniej próbki kontrolnej wynik testu okaże się ujemny, oznacza to nieprawidłowości przy manipulacji lub przygotowaniu próbki. Należy sprawdzić technikę manipulacji próbką i jej przygotowania. 8. Nierozstrzygający, nieokreślony lub niepełny wynik testu dla zewnętrznej próbki kontrolnej wskazuje na nieprawidłowości w odczynnikach lub w działaniu systemu BD MAX. Sprawdzić, czy na monitorze systemu BD MAX nie ma komunikatów o błędach. Informacje dotyczące interpretacji kodów ostrzeżeń i błędów można znaleźć w części Podsumowanie błędów systemowych podręcznika użytkownika systemu BD MAX. 10 Jeśli problem powtarza się, należy użyć odczynników z nieotwartego woreczka lub nowego zestawu testowego. 9. Każda probówka ekstrakcyjna zawiera próbkę kontrolną będącą plazmidem zawierającym syntetyczną sekwencję DNA docelowego. Próbka kontrolna służy do monitorowania skuteczności wychwytywania DNA, jego płukania i wymywania podczas przetwarzania próbki, jak również skuteczności amplifikacji i wykrywania DNA podczas analizy PCR. Jeśli wynik badania dla próbki kontrolnej nie spełni kryteriów dopuszczalności, wynik badania dla próbki zostanie podany jako nierozstrzygający; jednak wyniki dodatnie (POS) oznaczenia zostaną również podane, a ponadto żadna z próbek nie dostanie kwalifikacji ujemnej (NEG). Wynik nierozstrzygający wskazuje na obecność inhibitorów w próbce lub nieprawidłowe działanie odczynnika. Testy dla wszelkich próbek, dla których podano wyniki nierozstrzygające, należy powtórzyć zgodnie z Procedurą powtarzania testu. INTERPRETACJA WYNIKÓW Wyniki są dostępne na karcie Results (Wyniki) w okienku Results na monitorze systemu BD MAX. Oprogramowanie BD MAX automatycznie interpretuje wyniki testu. Wynik testu może być MRSA NEG (negative ujemny), MRSA POS (positive dodatni) lub MRSA UNR (unresolved nierozstrzygający) w zależności od statusu substancji docelowej po amplifikacji i próbki kontrolnej. Wyniki IND (indeterminate nieokreślony) lub INC (incomplete niepełny) związane są z nieprawidłowym działaniem systemu BD MAX. Wyniki są interpretowane na podstawie poniższego algorytmu decyzyjnego. Tabela 1: Interpretacja wyników testu BD MAX MRSA XT Podany wynik oznaczenia MRSA POS MRSA NEG MRSA UNR IND INC Interpretacja wyniku Wykryto DNA MRSA Nie wykryto DNA MRSA Wynik nierozstrzygający obecność inhibitorów w próbce lub nieprawidłowe działanie odczynnika, brak amplifikacji organizmów docelowych lub próbki kontrolnej Wynik nieokreślony w związku z nieprawidłowym działaniem systemu BD MAX (z kodami ostrzeżeń lub błędów a ) Niepełny cykl (z kodami ostrzeżeń lub błędów a ) a Informacje dotyczące interpretacji kodów ostrzeżeń i błędów można znaleźć w części Rozwiązywanie problemów podręcznika użytkownika systemu BD MAX. 10 MRSA POS (wykryto DNA MRSA) Wykryto sygnał fluorescencji zarówno dla MREJ (swoisty dla Staphylococcus aureus) i genów docelowych meca lub mecc oraz Próbka kontrolna jest ignorowana, ponieważ amplifikacja docelowego MRSA jest nadrzędna wobec tej procedury kontrolnej. MRSA NEG (nie wykryto DNA MRSA) Nie wykryto sygnału fluorescencji w oznaczeniu BD MAX MRSA XT dla żadnego genu docelowego (meca, mecc ani MREJ) oraz wykryto sygnał fluorescencji dla próbki kontrolnej lub Wykryto sygnał fluorescencji tylko dla genu meca lub mecc [geny meca i mecc nie występują tylko w Staphylococcus aureus; są obecne również w innych bakteriach (np. S.epidermidis)] lub Wykryto sygnał fluorescencji tylko dla MREJ (organizm pozbawiony genów meca lub mecc). MRSA UNR (wynik nierozstrzygający) Nie wykryto sygnału fluorescencji dla genu docelowego meca, mecc ani MREJ oraz Nie wykryto sygnału fluorescencji dla próbki kontrolnej (obecność inhibitorów lub nieprawidłowe działanie odczynnika). IND (Wynik nieokreślony) Błąd systemu BD MAX z kodami ostrzeżeń lub błędów. Informacje dotyczące interpretacji kodów ostrzeżeń i błędów można znaleźć w części Rozwiązywanie problemów podręcznika użytkownika systemu BD MAX. 10 INC (niepełny cykl) Błąd systemu BD MAX z kodami ostrzeżeń lub błędów. Informacje dotyczące interpretacji kodów ostrzeżeń i błędów można znaleźć w części Rozwiązywanie problemów podręcznika użytkownika systemu BD MAX. 10 PROCEDURA POWTARZANIA TESTU UWAGA: w probówce na bufor próbki znajduje się objętość wystarczająca na wykonanie jednego powtórzenia testu. Jeśli probówki na bufor próbki były przechowywane w temperaturze 25 ± 2 C, ponowne badanie należy wykonać w ciągu 36 godzin po wykonaniu kroków opisanych w części Przygotowanie próbek. Jeśli jednak probówki na bufor próbki były przechowywane w temperaturze 2 8 C, ponowne badanie należy wykonać w ciągu 120 godzin (5 dni) po wykonaniu kroków opisanych w części Przygotowanie próbek. 7

8 UWAGA: nowe próbki można przetestować w tym samym cyklu, co próbki badane ponownie. Wynik nierozstrzygający Wynik nierozstrzygający uzyskuje się w przypadku, gdy obecność inhibitora w próbce lub nieprawidłowe działanie odczynnika uniemożliwia odpowiednią amplifikację substancji docelowej lub próbki kontrolnej. Testy dla próbek można powtórzyć przy użyciu materiału pozostałego w odpowiednich probówkach na bufor próbki w czasie określonym powyżej. Próbki należy worteksować przez 1 (jedną) minutę i wykonać test ponownie, postępując zgodnie z częścią Obsługa systemu BD MAX. Wynik nieokreślony Wynik nieokreślony można uzyskać w przypadku nieprawidłowego działania systemu. Testy dla próbek można powtórzyć przy użyciu materiału pozostałego w odpowiednich probówkach na bufor próbki w czasie określonym powyżej. Próbki należy worteksować przez 1 (jedną) minutę i wykonać test ponownie, postępując zgodnie z częścią Obsługa systemu BD MAX. Informacje dotyczące interpretacji kodów ostrzeżeń i błędów można znaleźć w podręczniku użytkownika systemu BD MAX, 10 (część Rozwiązywanie problemów ). Wynik niepełny Wyniki niepełne można uzyskać w przypadku wystąpienia ostrzeżenia powodującego przerwanie testu lub kodu błędu lub w przypadku, gdy procedura przygotowywania próbki lub PCR nie zakończy się w oczekiwanym czasie. Wyniki niepełne mogą dotyczyć cyklu lub ścieżki. Testy dla próbek można powtórzyć przy użyciu materiału pozostałego w odpowiednich probówkach na bufor próbki w czasie określonym powyżej. Próbki należy worteksować przez 1 (jedną) minutę i wykonać test ponownie, postępując zgodnie z częścią Obsługa systemu BD MAX. Informacje dotyczące interpretacji kodów ostrzeżeń i błędów można znaleźć w podręczniku użytkownika systemu BD MAX, 10 część Rozwiązywanie problemów. Niepowodzenie testu zewnętrznej próbki kontrolnej Wyniki testu dla zewnętrznej próbki kontrolnej powinny być zgodne z oczekiwanymi. Jeśli badanie dla próbek należy powtórzyć z powodu nieprawidłowego wyniku testu dla kontroli zewnętrznej, należy wykonać ponowne testy próbek, korzystając z materiału w probówkach na bufor próbki oraz świeżo przygotowanych zewnętrznych próbek kontrolnych w wyżej zdefiniowanych ramach czasowych. Próbki należy worteksować przez 1 (jedną) minutę i wykonać test ponownie, postępując zgodnie z częścią Obsługa systemu BD MAX. POSIEW PRÓBEK KLINICZNYCH Aby wykonać testy wrażliwości na leczenie przeciwdrobnoustrojowe lub typowanie epidemiologiczne, posiew z próbek klinicznych można wykonać z wyrobu do pobierania (wymazówki) przed procedurą przygotowywania próbki (z wykorzystaniem metody Streak- Plate) lub po procedurze przygotowywania próbki (z wykorzystaniem metody Enrichment-Broth). Bezpośrednio po zakończeniu wstępnego cyklu PCR wymazówki można przechowywać w temperaturze 2 8 C przez maksymalne 36 godzin w probówkach na bufor próbki przed przeprowadzeniem posiewu, zgodnie z procedurami obowiązującymi w szpitalu. OGRANICZENIA PROCEDURY Produkt jest przeznaczony do użycia z wymazami z nosa pobranymi za pomocą wyrobów do pobierania i transportu próbek wymienionych w części Sprzęt i materiały wymagane, lecz niedostarczone. Nie oceniono działania oznaczenia BD MAX MRSA XT przy użyciu wyrobu do transportu pojedynczych lub podwójnych wymazówek Liquid Amies. Produktu należy używać tylko z systemem BD MAX. Wystąpienie nieprawidłowych wyników testu może także być spowodowane nieprawidłowym pobieraniem próbki, obchodzeniem się z nią lub jej przechowywaniem, obecnością inhibitorów, błędem technicznym, wymieszaniem próbki lub liczbą drobnoustrojów w próbce poniżej czułości analitycznej testu. Aby uniknąć uzyskania błędnych wyników, należy starannie przestrzegać instrukcji podanych na ulotce dołączonej do opakowania oraz w podręczniku użytkownika systemu BD MAX. 10 Badania przesiewowe określają status kolonizacji w danym momencie. Kolonizacja zależy od sposobu leczenia pacjenta (np. schematu leczenia mającego na celu dekolonizację), stanu pacjenta (np. przejściowa kolonizacja MRSA) lub narażenia na przebywanie w środowisku o podwyższonym ryzyku (np. kontakt z nosicielem MRSA lub przedłużająca się hospitalizacja). Status kolonizacji należy monitorować zgodnie z zasadami obwiązującymi w instytucji. Wynik dodatni w teście BD MAX MRSA XT nie musi oznaczać niepowodzenia leczenia mającego na celu usunięcie MRSA, ponieważ DNA może się utrzymywać w ustroju. Wynik ujemny po uprzednim uzyskaniu dodatniego wyniku testu może wskazywać na powodzenie leczenia mającego na celu wyeliminowanie bakterii lub może być wynikiem przejściowej kolonizacji. Dodatni wynik oznaczenia niekoniecznie wskazuje obecność żywych drobnoustrojów. Wynik dodatni wskazuje na obecność DNA MRSA. W oznaczeniu BD MAX MRSA XT jednocześnie wykrywany jest gen meca lub mecc w kasecie SCCmec oraz sekwencja swoista dla Staphylococcus aureus znajdująca się na połączeniu kasety SCCmec z genem orfx (MREJ). Oznaczenie BD MAX MRSA XT opracowane jest do wykrywania genotypów MREJ i, ii, iii, iv, v, vi, vii, ix, xiii, xiv i xxi, które reprezentują większość szczepów MRSA z genami meca i mecc (należących do różnych typów SCCmec/MREJ), które stanowią ponad 98% szczepów na świecie przebadanych dotąd przez BD. Nieznana jest zdolność oznaczenia BD MAX MRSA XT do wykrywania innych genotypów MREJ. W oznaczeniu BD MAX MRSA XT nie jest wykrywany gronkowiec złocisty o zwiększonej oporności na oksacylinę [Borderline Oxacillin Resistant Staphylococcus aureus (BORSA)] (podanym wynikiem będzie NEG). Mechanizm oporności na oksacylinę w szczepach BORSA związany jest ze zwiększoną produkcją β-laktamaz, nie z obecnością genu meca czy mecc. Szczepy BORSA występują rzadko. Nie jest znana skuteczność oznaczenia BD MAX MRSA XT w wykrywaniu zmodyfikowanych szczepów Staphylococcus aureus (MOD-SA), ponieważ szczepy te nie były oceniane. Mechanizm oporności szczepów MOD-SA na oksacylinę związany jest ze zmianami powinowactwa do oksacyliny białek wiążących penicylinę. Szczepy MOD-SA występują rzadko. 8

9 W oznaczeniu BD MAX MRSA XT wynik testu pod kątem MRSA będzie fałszywie dodatni, jeśli badana będzie próbka z nosa z jednoczesną kolonizacją, zawierająca zarówno koagulazoujemny, oporny na metycylinę szczep Staphylococcus (MRCoNS), jak i wariant SA z pustą kasetą podatny na metycylinę. Jednoczesna kolonizacja MRCoNS i wrażliwym na metycylinę wariantem SA z pustą kasetą występuje rzadko. Podobnie jak w przypadku wszystkich testów diagnostycznych in vitro opartych na PCR, przy bardzo niskim stężeniu substancji docelowej poniżej LoD (granicy wykrywalności) oznaczenia substancja może być wykryta, ale wyniki mogą nie być powtarzalne. Tobramycyna może zakłócać działanie oznaczenia BD MAX MRSA XT (więcej informacji podano w części Substancje zakłócające). Fałszywie ujemne wyniki mogą wystąpić z powodu utraty kwasów nukleinowych wskutek nieodpowiedniego sposobu pobrania, transportu lub przechowywania próbek lub niewystarczającej lizy komórek bakterii. Test zawiera próbkę kontrolną mającą na celu wspomaganie identyfikacji próbek zawierających inhibitory amplifikacji PCR oraz kontrolę prawidłowego składu odczynników i działania systemu oznaczenia jako całości. Badanie próbki kontrolnej nie pozwala na ustalenie, czy doszło do utraty kwasów nukleinowych wskutek nieodpowiedniej techniki pobrania, transportu lub przechowywania próbek, czy też komórki bakterii nie uległy lizie w odpowiednim stopniu. W przypadku hodowli mieszanej skuteczność wykrywania MRSA jest zmienna w obecności dużych stężeń MRSE. Zaobserwowano zakłócanie kompetycyjne ze strony MRSE przy stosunku MRSA:MRSE 1: 1x10 2. W przypadku hodowli mieszanej skuteczność wykrywania MRSA jest zmienna w obecności dużych stężeń MSSA. Zaobserwowano zakłócanie kompetycyjne ze strony MSSA przy stosunku MRSA:MSSA 1: 1x10 3. Wyniki oznaczenia BD MAX MRSA XT mogą czasami być nierozstrzygające z powodu nieprawidłowego wyniku dla próbki kontrolnej, lub też nieokreślone albo niepełne z powodu usterki aparatu; wymaga to ponownego przeprowadzenia testu, co może spowodować opóźnienie uzyskania ostatecznych wyników. Mutacje lub polimorfizm w regionie wiążącym primer lub sondę mogą wpłynąć na wykrywanie nowych lub nieznanych wariantów MRSA, co może spowodować fałszywie ujemny wynik badania w oznaczeniu BD MAX MRSA XT. Podobnie jak w przypadku wszystkich testów diagnostycznych in vitro, przewidywalne wartości dodatnie i ujemne zależą w dużym stopniu od częstości występowania. Skuteczność oznaczenia BD MAX MRSA XT może być różna w zależności od częstości występowania i badanej populacji. Oznaczenie BD MAX MRSA XT oznaczeń wymaga użycia 3 (trzech) kanałów optycznych systemu BD MAX: kanału 475/520, kanału 585/630 oraz kanału 680/715. Działania pozostałego kanału optycznego nie określono w tym oznaczeniu. WARTOŚCI OCZEKIWANE W badaniu klinicznym oznaczenia BD MAX MRSA XT uzyskano łącznie 2391 wyniki nadające się do analizy w 3 ośrodkach o różnym położeniu geograficznym w testach próbek spełniających wymogi badania co do próbek oraz co do wyniku PCR i porównano z hodowlą bezpośrednią oraz wzbogaconą. Badaną populację podzielono na kategorie pacjentów hospitalizowanych i ambulatoryjnych. Liczbę i odsetek przypadków z dodatnim wynikiem badania przy użyciu oznaczenia BD MAX MRSA XT podano w Tabeli 2. Tabela 2: Zestawienie włączonych do badania, spełniających kryteria próbek według grupy pacjentów Grupa Liczba próbek łącznie a Liczba wyników dodatnich w kierunku MRSA Pacjenci hospitalizowani Pacjenci ambulatoryjni Łącznie a a Łączna liczba próbek w oparciu o zgodne wyniki PCR. Odsetek wyników dodatnich względem MRSA 10,2% (172/1681) 3,9% (28/710) 8,4% (200/2391) CHARAKTERYSTYKA WYDAJNOŚCIOWA Wydajność kliniczna Charakterystykę kliniczną działania testu BD MAX MRSA XT określono w drodze wieloośrodkowego, prospektywnego badania klinicznego. W badaniu uczestniczyły 3 (trzy) ośrodki badawcze. Próbki zakwalifikowane do badania musiały pochodzić od pacjentów kwalifikujących się do badania pod kątem MRSA zgodnie z zasadami w danej instytucji. Wymogi kwalifikacji do badań przesiewowych zgodnie z zasadami w danych ośrodkach klinicznych obejmowały między innymi: pacjenci przyjęci do konkretnej placówki medycznej; pacjenci przyjęci na oddział intensywnej terapii; pacjenci przeniesieni na oddział intensywnej terapii; pacjenci oczekujący na planową operację oraz pacjenci przyjęci z placówek zapewniających długotrwałą opiekę. Próbki pochodzące od pacjentów wcześniej włączonych do badania wykluczono. Referencyjna metoda porównawcza obejmowała bezpośrednią hodowlę uzupełnioną przez hodowlę wzbogaconą. Dla wszystkich próbek, dla których stwierdzono wynik ujemny badania na obecność MRSA w wyniku hodowli bezpośredniej, przeprowadzono analizę hodowli wzbogaconej. Z domniemanych kolonii Staphylococcus aureus obserwowanych na selektywnym (dla Staphylococcus aureus) podłożu chromogennym przeprowadzono hodowle pochodne na agarze z krwią (BA). Identyfikację potwierdzono za testem aglutynacji, a oporność na metycylinę badaniem wrażliwości polegającym na dyfuzji krążka cefoksytyny (30 μg). W przypadku niepotwierdzenia MRSA we wstępnej hodowli bezpośredniej przeprowadzono wzbogacanie w bulionie tryptozowo-sojowym z dodatkiem 6,5% NaCl (TSB 6,5% NaCl). Mętnego bulionu TSB zawierający NaCl w stężeniu 6,5% użyto do inokulacji dodatkowego podłoża chromogennego i płytek BA; obecność MRSA potwierdzono zgodnie z opisem powyżej. 9

10 Wyniki uzyskane w oznaczeniu BD MAX MRSA XT w porównaniu z metodą referencyjną Do badania włączono 2451 próbek. Spośród nich 94 próbki uznano za niespełniające kryteriów protokołu, a dla 6 (sześciu) próbek w pełni spełniających te kryteria uzyskano wyniki PCR nienadające się do analizy. Do oceny skuteczności klinicznej oznaczenia BD MAX MRSA XT w porównaniu z metodą referencyjną użyto łącznie wyników dla 2351 próbek (Tabela 3). W porównaniu do metody referencyjnej (hodowla bezpośrednia/wzbogacona) w oznaczeniu BD MAX MRSA XT zidentyfikowano 93,1% próbek dodatnich względem MRSA i 97,8% próbek ujemnych względem MRSA (Tabela 4). W badanej populacji daje to ujemną wartość predykcyjną (NPV) 99,5% i dodatnią wartość predykcyjną (PPV) 75,4%. Tabela 3: Wyniki dla MRSA uzyskane w oznaczeniu BD MAX MRSA XT w porównaniu z metodą referencyjną Wszystkie ośrodki Oznaczenie BD MAX MRSA XT Metoda referencyjna MRSA Dodatnie Ujemne Łącznie Dodatnie a 197 Ujemne 11 a Łącznie Czułość: 93,1% (149/160) (95% CI: 88,1%, 96,1%) Swoistość: 97,8% (2143/2191) (95% CI: 97,1%, 98,3%) PPV: 75,4% (95% CI: 70,0%, 80,5%) NPV: 99,5% (95% CI: 99,1%, 99,7%) a Dla próbek, dla których uzyskano rozbieżne wyniki w badaniu metodą referencyjną i w oznaczeniu BD MAX MRSA XT, przeprowadzono dalsze testy. Dla 11 z 48 wyników fałszywie dodatnich w oznaczeniu BD MAX MRSA XT uzyskano wynik MRSA POS po powtórzeniu badania metodą referencyjną. Dla 5 z 11 wyników fałszywie ujemnych w oznaczeniu BD MAX MRSA XT uzyskano wynik MRSA NEG po powtórzeniu badania metodą referencyjną. Tabela 4: Wyniki dla MRSA uzyskane w poszczególnych ośrodkach w oznaczeniu BD MAX MRSA XT w porównaniu z metodą referencyjną Ośrodki kliniczne Częstość występowania a Czułość (95% CI) b Swoistość (95% CI) b Ośrodek 1 4,3% (41/960) Ośrodek 2 5,8% (38/650) Ośrodek 3 10,6% (81/765) Ogółem 6,7% (160/2375 c ) a Częstość występowania w oparciu o samą metodę refrencyjną b Przedział ufności c 2375 spełniało wymogi protokołu w badaniu metodą referencyjną 92,7% (38/41) (80,6%, 97,5%) 86,8% (33/38) (72,7%, 94,2%) 96,3% (78/81) (89,7%, 98,7%) 93,1% (149/160) (88,1%, 96,1%) 99,0% (908/917) (98,1%, 99,5%) 98,6% (583/591) (97,4%, 99,3%) 95,5% (652/683) (93,6%, 96,8%) 97,8% (2143/2193) (97,1%, 98,3%) Wyniki uzyskane w oznaczeniu BD MAX MRSA XT w porównaniu z hodowlą bezpośrednią Do badania włączono 2451 próbek. Spośród nich 54 wymazy z nosa uznano za niespełniające kryteriów protokołu, a dla 8 (ośmiu) próbek w pełni spełniających te kryteria uzyskano wyniki PCR nienadające się do analizy. Do oceny zgodności procentowej dodatniej i ujemnej oznaczenia BD MAX MRSA XT w porównaniu z hodowlą bezpośrednią użyto łącznie wyników dla 2389 próbek (Tabela 5). W porównaniu do hodowli bezpośredniej w oznaczeniu BD MAX MRSA XT zidentyfikowano 96,5% próbek dodatnich względem MRSA i 97,2% próbek ujemnych względem MRSA (Tabela 6). Tabela 5: Wyniki dla MRSA uzyskane w oznaczeniu BD MAX MRSA XT w porównaniu z hodowlą bezpośrednią Wszystkie ośrodki Oznaczenie BD MAX MRSA XT Hodowla bezpośrednia Dodatnie Ujemne Łącznie Dodatnie Ujemne Łącznie Odsetek zgodności wyników dodatnich: 96,5% (137/142) (95% CI: 92,0%, 98,5%) Odsetek zgodności wyników ujemnych: 97,2% (2184/2247) (95% CI: 96,4%, 97,8%) 10

11 Tabela 6: Wyniki dla MRSA uzyskane w poszczególnych ośrodkach w oznaczeniu BD MAX MRSA XT w porównaniu z hodowlą bezpośrednią Ośrodki kliniczne Dodatnia zgodność procentowa z 95% CI a Ujemna zgodność procentowa z 95% CI a Ośrodek 1 Ośrodek 2 Ośrodek 3 Ogółem a Przedział ufności 100% (35/35) (90,1%, 100%) 93,5% (29/31) (79,3%, 98,2%) 96,1% (73/76) (89,0%, 98,6%) 96,5% (137/142) (92,0%, 98,5%) 98,7% (911/923) (97,7%, 99,3%) 98,0% (586/598) (96,5%, 98,8%) 94,6% (687/726) (92,7%, 96,0%) 97,2% (2184/2247) (96,4%, 97,8%) Spośród 2399 wymazów z nosa spełniających wymogi badania co do próbek oraz co do wyniku PCR, przebadanych przy użyciu oznaczenia BD MAX MRSA XT, dla 18 (0,8%) po wstępnym badaniu uzyskano wynik nierozstrzygający. Odsetek wyników nierozstrzygających po powtórzeniu badania wynosił 0,1% (2/2396) (patrz Tabela 7; [dla jednej próbki nie powtórzono testu]). Odsetek początkowych wyników nierozstrzygających 0,8% (18/2399) a (95% CI: 0,5%, 1,2%) Tabela 7: Odsetek wyników nierozstrzygających Odsetek końcowych wyników nierozstrzygających uzyskanych po powtórzeniu testu 0,1% (2/2396) (95% CI: 0%, 0,3%) a Liczba łączna na podstawie liczby próbek spełniających wymogi protokołu i wyników oznaczenia BD MAX MRSA XT Spośród 2399 wymazów z nosa zbadanych za pomocą oznaczenia BD MAX MRSA XT dla 14 (0,6%) wyniki były początkowo nieokreślone. Żaden z wyników nie pozostał nieokreślony po powtórzeniu testu (dla dwóch próbek nie powtórzono testu). Dla 8 (ośmiu) (0,3%) wyniki były początkowo niepełne. Po powtórzeniu badania nie odnotowano wyników niepełnych (dla jednej próbki nie powtórzono testu). Warianty z pustą kasetą Aby próbkę można było zidentyfikować jako dodatnią względem MRSA w oznaczeniu BD MAX MRSA XT, wynik musi być dodatni zarówno dla MREJ, jak i meca lub mecc. Próbka zawierająca organizmy z MREJ, ale niemające genów ani meca, ani mecc, jest ujemna względem MRSA, ponieważ organizmy te są wrażliwe na metycylinę. Sytuacja ta ma miejsce, kiedy gen meca lub mecc zostanie wyeliminowany z kasety chromosomowej SCCmec, ale skrajny prawy fragment (MREJ) pozostanie, co prowadzi do uzyskania dodatniego wyniku w kierunku MREJ. Tego rodzaju próbki czasem określa się jako wariant z pustą kasetą. Dzięki możliwości wykrywania genów meca i mecc w oznaczeniu BD MAX MRSA XT można poprawnie odróżnić i zidentyfikować ten wariant jako MRSA NEG. Spośród 2351 kwalifikujących się do badania próbek testowanych w ramach określania działania klinicznego łącznie 10 pasowało do profilu pustej kasety dawały wynik dodatni względem MREJ, ale nie wykryto w nich genów meca ani mecc. Dla tych 10 próbek uzyskano wynik prawdziwie ujemny (true negative, TN) względem MRSA w badaniach metodą referencyjną. Czułość analityczna Czułość analityczną (granicę wykrywalności, LoD) testu BD MAX MRSA XT określono następująco: próbki dodatnie przygotowano poprzez namaczanie wymazówek w wielu różnych zawiesinach bakterii MRSA przygotowanych z hodowli i scharakteryzowanych ilościowo. Badane szczepy obejmowały 11 szczepów MRSA reprezentujących 11 genotypów MREJ (i, ii, iii, iv, v, vi, vii, ix, xiii, xiv i xxi) odpowiadających 5 typom SCCmec (I, II, III, IV i XI). Wymazy zostały następnie wymyte w symulowanej wzorcowej wydzielinie z nosa. Każdy szczep MRSA był badany w 24 powtórzeniach na stężenie przez dwóch różnych operatorów przy użyciu trzech różnych serii oznaczenia BD MAX MRSA XT. Czułość analityczna (Limit of Detection, LoD granica wykrywalności) dla szczepów MRSA, zdefiniowana jako najniższe stężenie, przy którym oczekuje się, że dla nie mniej niż 95% wszystkich powtórzeń testu uzyskany zostanie wynik dodatni, mieściła się w zakresie od 71 do 454 CFU/wymaz (Tabela 8). 11

12 Tabela 8: Granica wykrywalności genotypów MRSA w oznaczeniu BD MAX MRSA XT Szczep MRSA Genotyp MREJ Typ SCCmec a Stężenie LoD [CFU/wymaz (95% CI b )] 1 Typ i I 91 (55, 150) 2 Typ ii II 110 (68, 176) 3 Typ iii III 181 (102, 322) 4 Typ iv III 81 (48, 136) 5 Typ v IV 128 (74, 224) 6 Typ vi ND c 454 (246, 839) 7 Typ vii II 269 (134, 538) 8 Typ ix ND c 199 (111, 356) 9 Typ xiii ND c 71 (41, 121) 10 Typ xiv ND c 96 (57, 163) 11 Typ xxi d XI 108 (64, 183) a Typ SCCmec nie koreluje z typem MREJ są to dwie różne metody typowania. b Cl: Przedziały ufności c ND = not determined (nieokreślony) d Szczepy MRSA zawierające mecc (zwane również szczepem meca LGA251 ) Zakres analityczny Przeprowadzono badanie zakresu analitycznego przy użyciu różnych szczepów MRSA, biorąc pod uwagę położenie geograficzne, genotyp MREJ (szczepy dzikie i mutanty), typ SCCmec, typ PFGE (Pulsed-Field Gel Electrophoresis elektroforeza żelowa pulsacyjna), pochodzenie z różnych okresów oraz wzorzec wrażliwości. Przebadano 77 (siedemdziesiąt siedem) szczepów MRSA z 27 krajów, w tym pochodzące ze zbiorów publicznych oraz dobrze scharakteryzowane izolaty kliniczne, w tym szczepy Staphylococcus aureus oporne na wankomycynę (VRSA) i Staphylococcus aureus częściowo wrażliwe na wankomycynę (VISA). W oznaczeniu BD MAX MRSA XT wykrywano MREJ typu i, ii, iii, iv, v, vi, vii, ix, xiii, xiv oraz xxi przy małym stężeniu bakterii (2 3 x LoD). W oznaczeniu BD MAX MRSA XT wykrywano MRSA SCCmec typu I, II, III, IV, V, VI, VII, VIII oraz XI, jak również typy MRSA PFGE USA od 100 do 800, 1000 i 1100 przy 2 3 x LoD. Wykryto również wszystkie szczepy MRSA wykazujące dodatkową oporność na wankomycynę (VRSA i VISA). Ocena dobrze scharakteryzowanego panelu szczepów do testu prowokacji Przeprowadzono dodatkową analizę w celu oceny skuteczności analitycznej oznaczenia BD MAX MRSA XT przy użyciu dobrze scharakteryzowanego panelu szczepów do testu prowokacji: Dla 17 (siedemnastu) spośród 17 szczepów MRSA charakteryzujących się dużymi i małymi minimalnymi stężeniami hamującymi (MIC) oksacyliny, w tym typów PFGE USA od 100 do 800 i 1000, typu PFGE IV/IBERIAN oraz wariantu mecc (szczep LGA251 Staphylococcus aureus zawierający meca) przebadanych przy stężeniu 2 3 x LoD uzyskano wyniki MRSA POS. Dla 4 (czterech) z 4 szczepów BORSA (Staphylococcus aureus o zwiększonej oporności na oksacylinę) przebadanych przy stężeniu 10 6 CFU/wymaz uzyskano wyniki MRSA NEG. Dla 5 (pięciu) z 5 szczepów MSSA przebadanych przy stężeniu 10 6 CFU/wymaz uzyskano wyniki MRSA NEG. Dla 1 (jednego) z 1 szczepu Staphylococcus epidermidis opornego na metycylinę (MRSE) przebadanego przy stężeniu 10 6 CFU/wymaz uzyskano wynik MRSA NEG. Swoistość analityczna Oznaczenie BD MAX XT przeprowadzono na próbkach zawierających duże stężenie organizmów innych niż docelowe w systemie BD MAX, aby wykazać swoistość badania w zakresie wykrywania MRSA. Dla 57 (pięćdziesięciu siedmiu) z 57 szczepów różnych gatunków innych niż gronkowce przebadanych przy stężeniach 10 6 CFU/ ml (z wyjątkiem Cryptococcus neoformans, przebadanego przy stężeniu 3x10 5 CFU/wymaz) uzyskano wynik MRSA NEG. 45 (czterdzieści pięć) szczepów gronkowca koagulazoujemnych (CoNS) i koagulazododatnich (CoPS) reprezentujących 28 gatunków przebadano przy stężeniu odpowiadającym 0,5 w skali McFarlanda, używając oznaczenia BD MAX XT. Dla 45 (czterdziestu pięciu) z 45 szczepów uzyskano wyniki MRSA NEG. Dla 65 (sześćdziesięciu pięciu) szczepów MSSA (w tym 15 wariantów MSSA z pustą kasetą ) przy dużych stężeniach ( 10 6 CFU/wymaz) uzyskano wynik MRSA NEG. Przebadano 17 (siedemnaście) wirusów reprezentujących 12 różnych gatunków wirusowych przy stężeniu 10 5 PFU/mL. Dla wszystkich 17 wirusów uzyskano wynik MRSA NEG. 12