Historia zmian. MAX Enteric Viral Panel. Wersja/Data Sekcja Raport podsumowania zmian

Transkrypt

1 MAX Enteric Viral Panel P0231(03) Polski Historia zmian Wersja/Data Sekcja Raport podsumowania zmian (03) Spis treści Zasady procedury Tabela odczynników i materiałów Ostrzeżenia i środki ostrożności Instrukcja użytkowania/ Przygotowanie próbek Interpretacja wyników Zakres analityczny Tabela 10 Strona 16 30/tłumaczenie na hiszpański: Dodano spis treści EN i ES. Zaktualizowano opis ezy zgodnie z etykietą na opakowaniu. Zaktualizowano opis ezy zgodnie z etykietą na opakowaniu. Dodano Wymagane do użytku z oznaczeniem. Dodano nowy drugi punkt. Zaktualizowano opis ezy zgodnie z etykietą na opakowaniu. Objaśnienie interpretacji częściowego wyniku UNR. Poprawiona wartość graniczna LoD dla badanych szczepów. Poprawiono nagłówki kolumn. Dodano tłumaczenie na hiszpański. 1

2 MAX Enteric Viral Panel P0231(03) Do stosowania w diagnostyce in vitro Do stosowania z systemem BD MAX Polski 4 I PRZEZNACZENIE BD MAX Enteric Viral Panel (panel enterowirusów) służący do przeprowadzania testów z użyciem systemu BD MAX to zautomatyzowany test diagnostyczny in vitro do bezpośredniego jakościowego wykrywania i różnicowania patogenów enterowirusowych. Przy pomocy panelu enterowirusów BD MAX można wykryć kwasy nukleinowe pochodzące od: norowirusów GI i GII; rotawirusa A; adenowirusa F40/41; sapowirusa (grupy genotypów I, II, III, IV); ludzkiego astrowirusa (hastro). Test przeprowadza się na niekonserwowanych próbkach kału miękkiego lub biegunkowego lub próbkach kału zakonserwowanych w podłożu Cary-Blair, pobranych od pacjentów z objawami i podejrzeniem ostrego zapalenia żołądka i jelit, zapalenia jelit lub zapalenia okrężnicy. Test przeprowadza się bezpośrednio na próbce z wykorzystaniem reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR) w czasie rzeczywistym w celu amplifikacji odpowiednich docelowych DNA/RNA. W teście wykorzystuje się fluorogenne, swoiste dla danych genów sondy hybrydyzacyjne do wykrywania amplifikowanego DNA. Test ten, w połączeniu z objawami klinicznymi, wynikami badań laboratoryjnych i danymi epidemiologicznymi, ma pełnić rolę pomocniczą w rozpoznaniu różnicowym zakażeń norowirusami GI i GII, rotawirusem A, adenowirusem F40/41, sapowirusem (grupy genotypów I, II, III, IV) i wirusem hastro. Wyniki testu nie powinny stanowić wyłącznej podstawy do rozpoznania, leczenia ani innych decyzji dotyczących postępowania. Dodatni wynik nie wyklucza współistniejącego zakażenia innymi organizmami, które nie są wykrywane w tym teście, i może nie być jedyną ani ostateczną przyczyną choroby pacjenta. Wynik ujemny przy występujących objawach klinicznych spójnych z obrazem zapalenia żołądka i jelit może być związany z tym, że mamy do czynienia z zakażeniem patogenami niewykrywanymi w tym teście lub z przyczynami innymi niż zakażenie, takimi jak wrzodziejące zapalenie jelita grubego, zespół jelita drażliwego lub choroba Leśniowskiego-Crohna. STRESZCZENIE I OBJAŚNIENIE PROCEDURY Organizmy powodujące choroby jelit odpowiadają za znaczną część przypadków zachorowań i zgonów na świecie. Patogeny jelitowe przedostają się do organizmu przez przewód pokarmowy i zazwyczaj przenoszą się przez skażoną żywność i wodę lub przez kontakt z wymiocinami lub odchodami. Ośrodki Zwalczania Chorób i Profilaktyki (CDC, Centers for Disease Control and Prevention) szacują, że każdego roku w USA dochodzi do 48 milionów przypadków zakażeń przenoszonych przez żywność, prowadząc do hospitalizacji i zgonów. 1 W krajach rozwijających się choroby te powodują około 2 milionów zgonów rocznie wśród małych dzieci. 2 Każdy z patogenów chorobotwórczych może dawać nieco inne objawy, takie jak skurcze lub ból brzucha, utrata apetytu, mdłości lub wymioty; jednak wszystkie te zakażenia charakteryzują się biegunką. 3 Powtarzające się napady biegunki i utrzymujące się stany biegunkowe powodują zaburzenie czynności jelit i wchłaniania, co u dzieci może prowadzić do niedożywienia i zahamowania wzrostu. 4 2

3 Panel enterowirusów BD MAX służący do przeprowadzania testów z użyciem systemu BD MAX pozwala na uzyskanie wyników badania na obecność wymienionych wirusów dla 24 próbek w ciągu około 3 godzin. W panelu enterowirusów BD MAX wykrywane są jednocześnie patogeny odpowiedzialne za zapalenie żołądka i jelit spowodowane norowirusami GI i GII, rotawirusem A, adenowirusem F40/41, sapowirusem (grupy genotypów I, II, III, IV) i wirusem hastro. Test zawiera próbkę kontrolną. Panel enterowirusów BD MAX pozwala na automatyzację procedury testu i ograniczenie do minimum interwencji operatora od momentu umieszczenia próbki w systemie BD MAX aż do uzyskania wyników. Pobraną próbkę kału miękkiego lub biegunkowego transportuje się do laboratorium, gdzie jest ona homogenizowana i przenoszona ezą do Sample Buffer Tube (probówki na bufor próbki) panelu enterowirusów BD MAX. Probówkę na bufor próbki umieszcza się w systemie BD MAX i zachodzą następujące zautomatyzowane czynności: liza kapsydów wirusowych, ekstrakcja DNA/RNA na koralikach magnetycznych i jego zatężanie; następnie podpróbkę wymytego DNA/RNA dodaje się do odczynników do PCR zawierających swoiste dla danych genów primery służące do amplifikacji genów docelowych w BD MAX PCR Cartridge (kasecie do PCR), o ile są obecne. Test zawiera również próbkę kontrolną. Próbka kontrolna znajduje się w probówce ekstrakcyjnej; przeprowadzane są na niej etapy ekstrakcji, zatężania i amplifikacji w celu wykrycia inhibitorów lub nieprawidłowości w działaniu aparatów lub odczynników. Po umieszczeniu w systemie BD MAX próbki klinicznej oraz BD MAX Unitized Reagent Strip (scalonego paska z odczynnikami) i kasety do PCR interwencja operatora nie jest już potrzebna. System BD MAX umożliwia automatyzację lizy próbki, ekstrakcji i zatężania DNA/RNA, ponownego nawodnienia odczynników, amplifikacji kwasów nukleinowych oraz wykrywania docelowych sekwencji kwasów nukleinowych przy wykorzystaniu reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR) w czasie rzeczywistym. Docelowe związki po amplifikacji wykrywane są sondami hydrolizy znakowanymi wygaszonymi fluoroforami. Amplifikacja, wykrywanie i interpretacja sygnałów zachodzą w systemie BD MAX automatycznie. ZASADY PROCEDURY Próbki kału pobiera się od pacjentów i transportuje do laboratorium bez ich konserwowania w czystym pojemniku lub po konserwacji w podłożu transportowym Cary-Blair. Ezę wprowadza się na całą długość pętli do próbki i ruchem okrężnym przenosi się do probówki na bufor próbki BD MAX znajdującej się w zestawie panelu enterowirusów BD MAX. Probówkę na bufor próbki zamyka się korkiem z przegrodą, worteksuje i przenosi do systemu BD MAX. Po wygenerowaniu listy roboczej i umieszczeniu próbki w aparacie BD MAX wraz ze scalonym paskiem z odczynnikami oraz kasetą do PCR panelu enterowirusów BD MAX rozpoczyna się analiza i nie jest już wymagana interwencja operatora. System BD MAX automatyzuje przygotowanie próbki, w tym lizę organizmów docelowych, ekstrakcję i zatężanie DNA/RNA, ponowne nawodnienie odczynników oraz amplifikację i wykrywanie docelowych sekwencji kwasów nukleinowych przy wykorzystaniu reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR) w czasie rzeczywistym. System BD MAX przeprowadza też automatyczną interpretację sygnałów. Test zawiera również próbkę kontrolną, znajdującą się w probówce ekstrakcyjnej i poddawaną ekstrakcji, zatężaniu i amplifikacji. Zastosowanie próbki kontrolnej pozwala na monitorowanie obecności potencjalnych inhibitorów oraz na wykrycie nieprawidłowego działania systemu lub odczynników. Po enzymatycznej lizie komórek wirusa w podwyższonej temperaturze uwolnione kwasy nukleinowe są wychwytywane na koralikach magnetycznych. Koraliki wraz z przyczepionymi do nich kwasami nukleinowymi są płukane, a kwasy nukleinowe ulegają wymywaniu. Wymyte cząsteczki DNA/RNA neutralizuje się i przenosi do probówek z mieszaniną wzorcową w celu nawodnienia odczynników do PCR. Po nawodnieniu system BD MAX przenosi stałą objętość roztworu gotowego do analizy PCR do kasety do PCR BD MAX. Mikrozastawki w kasecie do PCR BD MAX są zamykane, aby zapobiec parowaniu i zanieczyszczeniu przy amplifikacji przed rozpoczęciem PCR z odwrotną transkryptazą w celu przekształcenia RNA w cdna, a następnie przeprowadzenia PCR w czasie rzeczywistym. Docelowe sekwencje DNA po amplifikacji wykrywane są przy pomocy sond hydrolitycznych (TaqMan) znakowanych z jednej strony fluorescencyjnym barwnikiem sygnałowym (fluoroforem), a z drugiej grupą wygaszającą. Sondy znakowane różnymi fluoroforami wykorzystywane są do wykrywania amplikonów docelowych sekwencji wirusowych (norowirusów GI i GII, rotawirusa A, adenowirusa F40/41, sapowirusa (grupy genotypów I, II, III, IV) oraz hastro) oraz amplikonów próbki kontrolnej w czterech różnych kanałach optycznych systemu BD MAX. Gdy sondy są w stanie natywnym, fluorofor jest wygaszony wskutek bliskości grupy wygaszającej. Jednak w obecności docelowego DNA sondy hybrydyzują do swoich sekwencji komplementarnych i ulegają hydrolizie w wyniku aktywności egzonukleazy 5 3, jaką wykazuje polimeraza DNA, gdy syntetyzuje powstającą nić wzdłuż istniejącej nici cdna. W efekcie fluorofory pozostają odseparowane od cząsteczek wygaszających i emitowana jest fluorescencja. System BD MAX monitoruje te sygnały w każdym cyklu i na zakończenie programu interpretuje dane do raportu końcowego. 3

4 ODCZYNNIKI I MATERIAŁY NR KAT. Zawartość Ilość BD MAX Enteric Viral Panel Master Mix (mieszanina wzorcowa) (D6) Sucha mieszanina wzorcowa do PCR zawierająca polimerazę DNA, nukleotydy, substancje docelowe oraz sondy i primery do próbki kontrolnej. BD MAX Enteric Viral Panel Master Mix (mieszanina wzorcowa) (D5) Sucha mieszanina wzorcowa do PCR zawierająca polimerazę DNA, nukleotydy, substancje docelowe oraz sondy i primery do próbki kontrolnej. BD MAX Enteric Viral Panel Unitized Reagent Strips (scalone paski z odczynnikami) Paski z odczynnikami zawierające wszystkie ciekłe odczynniki oraz jednorazowe końcówki pipet potrzebne do przetwarzania próbki i ekstrakcji DNA/RNA. BD MAX Enteric Viral Panel Extraction Tube (probówka ekstrakcyjna) (D4) Suchy odczynnik ekstrakcyjny zawierający koraliki magnetyczne z powinowactwem do DNA/ RNA, proteinazę K oraz próbkę kontrolną BD MAX Enteric Viral Panel Sample Buffer Tube (probówka na bufor próbki) BD MAX Disposable Inoculation Loops (jednorazowe ezy do inokulacji) (wymagane do użytku z oznaczeniem) 24 testy (2 x 12 probówek) 24 testy (2 x 12 probówek) 24 testy 24 testy (2 x 12 probówek) 24 testy (2 x 12 probówek) Korki z przegrodą 25 SPRZĘT I MATERIAŁY WYMAGANE, ALE NIEZNAJDUJĄCE SIĘ W ZESTAWIE BD MAX PCR Cartridges (kasety do PCR) (nr kat. BD Diagnostic Systems ) VWR Multi-Tube Vortexer (mieszadło wieloprobówkowe) lub równoważny (VWR, nr kat ) Vortex Genie 2 (mieszadło) lub równoważne (VWR, nr kat ) Nalgene Cryogenic Vial Holder (stojak do probówek kriogenicznych) (VWR, nr kat ) Statyw pasujący do mieszadła wieloprobówkowego (np. Cryogenic Vial Holder lub równoważny) Fartuch laboratoryjny i rękawiczki jednorazowe bez talku Stoper lub czasomierz Dla niekonserwowanych próbek kału: Suche, czyste pojemniki do zbierania próbek kału miękkiego lub płynnego. Dla konserwowanych próbek kału: Podłoże transportowe Cary-Blair (15 ml). OSTRZEŻENIA I ŚRODKI OSTROŻNOŚCI Niebezpieczeństwo H360 Może działać szkodliwie na płodność lub na dziecko w łonie matki. P280 Stosować rękawice ochronne/odzież ochronną/ochronę oczu/ochronę twarzy. P201 Przed użyciem zapoznać się ze specjalnymi środkami ostrożności. P202 Nie używać przed zapoznaniem się i zrozumieniem wszystkich środków bezpieczeństwa. P308+P313 W przypadku narażenia lub styczności: Zasięgnąć porady/zgłosić się pod opiekę lekarza. P405 Przechowywać pod zamknięciem. P501 Zawartość/pojemnik usuwać zgodnie z lokalnymi/regionalnymi/krajowymi/międzynarodowymi przepisami. Panel enterowirusów BD MAX przeznaczony jest wyłącznie do stosowania w diagnostyce in vitro. Do stosowania z panelem enterowirusów BD MAX wymagane są BD MAX Disposable Inoculation Loops (jednorazowe ezy do inokulacji) dołączone do zestawu testowego. Nie zaleca się używania ez ogólnego przeznaczenia, niezależnie od ich typu i objętości; wyniki panelu enterowirusów BD MAX uzyskane przy użyciu takich ez nie są zwalidowane. Lokalne, stanowe i federalne przepisy w zakresie powiadamiania o chorobach podlegających zgłaszaniu są aktualizowane na bieżąco i obejmują szereg organizmów, które są istotne dla nadzoru i badania epidemii. 5,6 Laboratoria mają obowiązek przestrzegania stanowych i lokalnych przepisów odnoszących się do patogenów podlegających zgłaszaniu i powinny konsultować się z lokalnymi lub stanowymi stacjami sanitarno-epidemiologicznymi w sprawie wytycznych dotyczących izolowania i przesyłania próbek klinicznych. Produkt może być używany tylko w systemie BD MAX. Nie stosować przeterminowanych odczynników ani materiałów. Nie używać zestawu, jeśli w chwili dostarczenia etykieta stanowiąca zamknięcie zewnętrznego pudełka jest uszkodzona. Nie używać odczynników, jeśli w chwili dostarczenia woreczki ochronne są otwarte lub uszkodzone. Nie używać odczynników, jeśli brak środka osuszającego lub jeśli jest on otwarty wewnątrz woreczka z odczynnikiem. Nie wyjmować środka osuszającego z woreczka z odczynnikiem. Po każdym użyciu odczynnika niezwłocznie szczelnie zamykać woreczki ochronne. Przed zamknięciem woreczka usunąć nadmiar powietrza. 30 4

5 Chronić odczynniki przed wysoką temperaturą i wilgotnością. Przedłużone narażenie na działanie wilgotnego środowiska może wpłynąć na działanie produktu. Nie używać odczynników, jeśli folia jest przerwana lub uszkodzona. Nie mieszać odczynników z różnych woreczków, zestawów lub serii. Nie należy zamieniać ani ponownie używać korków, gdyż może to spowodować ich zanieczyszczenie i negatywnie wpłynąć na wyniki testu. Odpowiednie napełnienie płynami można sprawdzić na scalonych paskach z odczynnikami (należy dopilnować, by płyny znajdowały się na dnie probówek [patrz Rys. 1]). Sprawdzić na scalonych paskach z odczynnikami, czy wszystkie końcówki pipet są obecne (patrz Rys. 1). Zachować ostrożność przy użyciu roztworów chemicznych, ponieważ kody paskowe dla mieszaniny wzorcowej i probówki ekstrakcyjnej mogą stać się nieczytelne. Dla odpowiedniego działania tego testu zasadnicze znaczenie ma zachowanie dobrych praktyk laboratoryjnych. Z uwagi na wysoką czułość analityczną tego testu należy dołożyć szczególnych starań w kierunku zachowania czystości wszystkich materiałów i odczynników. Jeśli w tym samym obszarze laboratorium wykonywane są inne testy PCR, należy dopilnować, aby panel enterowirusów BD MAX, wszelkie dodatkowe odczynniki potrzebne do badania oraz system BD MAX nie uległy skażeniu. Należy bezwzględnie unikać skażenia odczynników mikroorganizmami, deoksyrybonukleazą (DNazą) i rybonukleazą (RNazą). Przed manipulacjami odczynnikami i kasetą konieczna jest zmiana rękawiczek. Aby uniknąć skażenia otoczenia amplikonami docelowymi, nie otwierać kasety do PCR BD MAX po jej użyciu. Uszczelnienia kaset do PCR BD MAX zaprojektowane są tak, by zapobiegać skażeniu. W laboratorium należy rutynowo przeprowadzać monitorowanie środowiska w celu zminimalizowania ryzyka skażenia krzyżowego. Wykonywanie badania przy użyciu panelu enterowirusów BD MAX w warunkach wykraczających poza zalecane ramy czasowe i zakres temperatury dla transportu i przechowywania próbek może doprowadzić do uzyskania niepoprawnych wyników. Oznaczenia wykonane w warunkach wykraczających poza określone ramy czasowe i zakres temperatury należy powtórzyć. W zależności od wytycznych lub wymogów wynikających z przepisów lokalnych, stanowych, wojewódzkich lub federalnych lub zaleceń organizacji akredytujących można zbadać dodatkowe próbki kontrolne. Należy zawsze postępować z próbkami jak z materiałem zakaźnym, zgodnie z wytycznymi dotyczącymi bezpiecznych procedur laboratoryjnych, takimi jak opisane w dokumentach CLSI M29 7 oraz Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories. 8 Pracując z odczynnikami, zawsze nosić odzież ochronną i rękawiczki jednorazowe. Po wykonaniu oznaczenia dokładnie umyć ręce. Nie pipetować ustami. Nie palić papierosów, nie spożywać płynów ani nie jeść w strefach pracy z próbkami lub odczynnikami zestawu. Niewykorzystane odczynniki i odpady zutylizować zgodnie z przepisami krajowymi, federalnymi, wojewódzkimi, ogólnokrajowymi lub lokalnymi. Dodatkowe ostrzeżenia, środki ostrożności i procedury można znaleźć w podręczniku użytkownika BD MAX System User s Manual. 9 PRZECHOWYWANIE I STABILNOŚĆ Pobrane próbki kału niekonserwowane lub przechowywane w 15 ml podłoża transportowego Cary-Blair należy przechowywać podczas transportu w temperaturze od 2 C do 25 C. Chronić przed narażeniem na zbyt wysoką temperaturę. Próbki przed badaniem można przechowywać przez okres do 120 godzin (5 dni) w temperaturze 2 8 C lub do 48 godzin w temperaturze do 2 25 C. Mieszanina wzorcowa panelu enterowirusów BD MAX jest stabilna w temperaturze 2 25 C do upływu podanego terminu ważności. Nie należy używać odczynników i elementów, których termin ważności upłynął. Probówki z mieszaniną wzorcową panelu enterowirusów BD MAX dostarczane są w zamkniętych woreczkach. Aby chronić produkt przed działaniem wilgoci, należy niezwłocznie zamknąć woreczek ponownie po jego otwarciu. Mieszanina wzorcowa w probówkach jest stabilna przez okres do 14 dni w temperaturze 2 25 C po otwarciu i ponownym zamknięciu woreczka. INSTRUKCJE STOSOWANIA Pobieranie/transport próbek W celu uzyskania próbki materiału odpowiedniej jakości, należy ściśle przestrzegać zasad dotyczących pobierania próbek. Próbki kału płynnego lub miękkiego pobiera się przy użyciu suchego, czystego pojemnika zgodnie z następującą procedurą: 1. Próbki niekonserwowane: Przenieść próbkę płynnego lub miękkiego kału do suchego, czystego pojemnika. Unikać zanieczyszczenia wodą lub moczem i zmieszania papieru toaletowego lub mydła z próbką. Oznaczyć pojemnik etykietą i przetransportować do laboratorium zgodnie ze standardową procedurą postępowania w instytucji (patrz część Przechowywanie i stabilność). 2. Próbki konserwowane w podłożu Cary-Blair: Przenieść próbkę płynnego lub miękkiego kału do pojemnika transportowego 15 ml zgodnie z instrukcją producenta. Unikać zanieczyszczenia wodą lub moczem i zmieszania papieru toaletowego lub mydła z próbką. Oznaczyć pojemnik etykietą i przetransportować do laboratorium zgodnie ze standardową procedurą postępowania w instytucji (patrz część Przechowywanie i stabilność). 5

6 Przygotowanie próbek UWAGA: Jedna (1) probówka na bufor próbki, jeden (1) korekz przegrodą, dwie (2) probówki z mieszaniną wzorcową (D6 i D5), jedna (1) probówka ekstrakcyjna (D4) oraz jeden (1) scalony pasek z odczynnikami to materiały wymagane do przetestowania każdej próbki i każdej zewnętrznej próbki kontrolnej. Wyjąć wymagane materiały w odpowiedniej liczbie z woreczków ochronnych lub pudełek. Z otwartych woreczków z mieszaniną wzorcową lub probówkami ekstrakcyjnymi w celu ich przechowywania usunąć nadmiar powietrza i zamknąć szczelnie woreczek. 1. Oznakować określającą próbkę etykietą probówkę na bufor próbki BD MAX (z bezbarwnym korkiem) z kodem kreskowym. Nie zasłaniać kodu kreskowego 2D, nie pisać na nim ani nie zaklejać go etykietą. 2. Próbki niekonserwowane lub konserwowane w podłożu Cary-Blair worteksować z dużą prędkością przez 15 sekund. 3. Zdjąć bezbarwny korek z probówki na bufor próbki i poddać inokulacji zgodnie z następującą procedurą: a. Wprowadzić jednorazową ezę do inokulacji, aż cała część z pętlą będzie zanurzona w próbce. Nie wprowadzać poza pętlę, ponieważ obecność dodatkowego kału na trzonie może spowodować przeciążenie reakcji PCR. b. Wprowadzić napełnioną pętlę do probówki na bufor próbki i wprowadzić próbkę ruchem okrężnym. UWAGA: Nie ma konieczności usuwania całej próbki z ezy. Wynikowy roztwór znajdujący się w probówce na bufor próbki powinien mieć kolor herbaciany. 4. Zamknąć inokulowaną probówkę na bufor próbki korkiem z przegrodą. 5. Umieścić probówkę na bufor próbki w statywie pasującym do mieszadła wieloprobówkowego, jeśli jest dostępny (np. statywie na probówki kriogeniczne lub równoważnym). 6. Powtarzając kroki 1 5, przygotować dodatkowe próbki do badania, dopilnowując, aby przed manipulacjami kolejnymi próbkami rękawiczki były czyste. 7. Wszystkie przygotowane próbki worteksować jednocześnie z maksymalną prędkością przez 1 (jedną) minutę mieszadłem wieloprobówkowym. 8. Aby wykonać panel enterowirusów BD MAX w systemie BD MAX, przejść do części Obsługa systemu BD MAX. Obsługa systemu BD MAX UWAGA: Szczegółowe instrukcje znajdują się w podręczniku użytkownika BD MAX System User s Manual 9 (patrz Operation section [Obsługa]). UWAGA: Test przy pomocy panelu enterowirusów BD MAX należy przeprowadzić niezwłocznie po wyżej wymienionym kroku worteksowania (patrz Przygotowanie próbek, krok 7). W razie konieczności ponownego wykonania testu należy ponownie wykonać worteksowanie próbek. 1. Włączyć system BD MAX (jeśli nie jest już włączony) i zalogować się, wprowadzając <user name> (nazwę użytkownika) i <password> (hasło). 2. Przed manipulacjami odczynnikami i kasetami konieczna jest zmiana rękawiczek. 3. Wyjąć pożądaną liczbę scalonych pasków z odczynnikami z zestawu panelu enterowirusów BD MAX. Delikatnie postukać każdym scalonym paskiem z odczynnikami o twardą powierzchnię, tak aby wszystkie porcje płynu znalazły się na dnie probówek. 4. Wyjąć z woreczków ochronnych pożądaną liczbę probówek ekstrakcyjnych i probówek z mieszaniną wzorcową z zestawu panelu enterowirusów BD MAX. 5. Usunąć nadmiar powietrza i zamknąć szczelnie woreczki. 6. Dla każdej badanej próbki umieścić 1 (jeden) scalony pasek z odczynnikami w statywie systemu BD MAX, zaczynając od pozycji 1 na statywie A. 7. Wcisnąć 1 (jedną) probówkę ekstrakcyjną (D4) (biała folia) do każdego scalonego paska z odczynnikami w pozycję 1, jak pokazano na Rysunku Wcisnąć 1 (jedną) probówkę z mieszaniną wzorcową panelu enterowirusów BD MAX (D6) (zielona folia) do każdego scalonego paska z odczynnikami w pozycję 2, jak pokazano na Rysunku Wcisnąć 1 (jedną) probówkę z mieszaniną wzorcową panelu enterowirusów BD MAX (D5) (niebieska folia) do każdego scalonego paska z odczynnikami w pozycję 4, jak pokazano na Rysunku 1. 6

7 Rysunek 1: Wcisnąć probówki ekstrakcyjne panelu enterowirusów BD MAX i probówki z mieszaniną wzorcową panelu enterowirusów BD MAX do scalonych pasków z odczynnikami 10. Kliknąć kartę Run (Uruchom), a następnie podkartę Inventory (Zawartość); wprowadzić numer serii zestawu panelu enterowirusów BD MAX i numer serii mieszaniny wzorcowej panelu enterowirusów BD MAX (do celów śledzenia serii), skanując kod paskowy albo ręcznie. UWAGA: Krok 10 powtarzać za każdym razem, gdy używana jest nowa partia zestawów. 11. Przejść do Worklist (Listy roboczej). Z menu rozwijanego wybrać <BD MAX ENT VIR 49>. 12. Wybrać odpowiedni numer serii zestawu (znajdujący się na zewnętrznym pudełku panelu enterowirusów BD MAX) i numer serii mieszaniny wzorcowej dla panelu enterowirusów BD MAX z menu rozwijanego. 13. Wprowadzić identyfikator probówki na bufor próbki panelu enterowirusów BD MAX, identyfikator pacjenta i numer badania (jeśli ma zastosowanie) do Worklist (Listy roboczej), odczytując kod paskowy skanerem lub ręcznie. 14. Powtórzyć krok 13 dla wszystkich pozostałych probówek na bufor próbki. 15. Umieścić probówki na bufor próbki w staywach systemu BD MAX odpowiadających scalonym paskom z odczynnikami zebranym w krokach 6 do 9. UWAGA: Umieścić probówki na bufor próbki w statywie na próbki etykietą z kodem paskowym 1D na zewnątrz (ułatwia to skanowanie probówek na bufor próbki podczas rejestracji próbki). 16. Umieścić wymaganą liczbę kaset do PCR BD MAX w systemie BD MAX (patrz Rysunek 2): Każda kaseta do PCR BD MAX przeznaczona jest do wykonania jednego cyklu dla maksymalnie 12 próbek, łącznie umożliwiając przebadanie 12 próbek. System BD MAX automatycznie wybierze pozycję i rząd na kasecie do PCR BD MAX dla każdego cyklu. Kasety do PCR BD MAX używane są w jednym cyklu ORAZ dla jednego statywu (jeden cykl na kasetę, jedna kaseta na statyw). Aby zmaksymalizować wykorzystanie kaset do PCR BD MAX przy użyciu trybu 2000 Sample Mode, wybrać Run Wizard (Uruchom kreator) z karty Worklist (Lista robocza) do zadań dla ścieżki. Więcej informacji można znaleźć w podręczniku użytkownika BD MAX System User s Manual. 9 Rysunek 2: Wkładanie kaset do PCR BD MAX 7

8 17. Umieścić statywy w systemie BD MAX (patrz Rysunek 3). Strona A Strona B Rysunek 3: Wkładanie statywów do systemu BD MAX 18. Zamknąć pokrywę systemu BD MAX i kliknąć <Start>, aby rozpocząć przetwarzanie. 19. Pod koniec cyklu można sprawdzić wyniki od razu lub przechowywać probówki na bufor próbki w temperaturze 2 8 C do 5 dni (120 godzin) LUB w temperaturze 2 25 C przez maksymalnie 48 godzin do sprawdzenia wyników. UWAGA: W razie uszkodzenia korka z przegrodą podczas cyklu należy wymienić go na nowy przed odłożeniem próbki do przechowywania. UWAGA: Przygotowane probówki na bufor próbki BD MAX można przechowywać w temperaturze 2 8 C przez maksymalnie 120 godzin (5 dni) LUB w temperaturze 2 25 C przez maksymalnie 48 godzin. W razie uzyskania wyniku nieokreślonego (IND), nierozstrzygającego (UNR) lub niepełnego (INC) lub w razie niepowodzenia testu zewnętrznej próbki kontrolnej test materiału z probówki na bufor próbki musi być powtórzony w tych ramach czasowych (patrz część Procedura powtarzania testu). KONTROLA JAKOŚCI Procedury kontroli jakości służą do monitorowania działania oznaczenia. Laboratoria ustalają liczbę, rodzaj i częstotliwość wykonywania testów materiałów kontrolnych zgodnie z wytycznymi lub wymogami przepisów lokalnych, wojewódzkich, stanowych, federalnych lub krajowych lub organizacji akredytujących, w celu monitorowania skuteczności całej procedury analitycznej. W zakresie ogólnych wytycznych dotyczących kontroli jakości użytkownik może odnieść się do dokumentów MM3 10 i EP12 11 Clinical Laboratory Standards Institute. 1. Materiały do zewnętrznych próbek kontrolnych nie są dostarczane przez BD. Zewnętrzne kontrole dodatnie i ujemne nie są wykorzystywane przez oprogramowanie systemu BD MAX do celów interpretacji wyniku badania próbki. Zewnętrzne próbki kontrolne traktowane są tak, jak próbki pochodzące od pacjentów. (W kwestii interpretacji wyników badania zewnętrznych próbek kontrolnych należy odnieść się do Tabeli 2). 2. W każdym laboratorium należy co najmniej raz dziennie wykonywać badanie 1 (jednej) zewnętrznej próbki kontrolnej dodatniej i 1 (jednej) zewnętrznej próbki kontrolnej ujemnej, do momentu uzyskania odpowiedniej walidacji procesu wykonywanego przy użyciu systemu BD MAX. Częstotliwość testów kontrolnych można zmniejszyć zgodnie z mającymi zastosowanie przepisami. 3. Celem badania zewnętrznych próbek kontrolnych dodatnich jest monitorowanie pod kątem znacząco nieprawidłowego działania odczynników. Celem badania zewnętrznych próbek kontrolnych ujemnych jest wykrywanie skażenia odczynników lub otoczenia docelowymi kwasami nukleinowymi (lub ich przeniesienia na próbkę). 4. Zaleca się stosowanie różnych rodzajów zewnętrznych próbek kontrolnych, aby umożliwić użytkownikowi wybranie najbardziej odpowiednich dla programu kontroli jakości w danym laboratorium. a. Zewnętrzna kontrola ujemna: Materiał kontrolny dostępny w sprzedaży lub uprzednio scharakteryzowana próbka, o której wiadomo, że nie zawiera docelowego DNA. Firma BD zaleca przygotowanie zewnętrznej próbki kontrolnej ujemnej przed zewnętrzną próbką kontrolną dodatnią, aby zmniejszyć ryzyko skażenia podczas przygotowywania próbki kontrolnej. b. Zewnętrzna kontrola dodatnia: Materiały kontrolne dostępne w sprzedaży, takie jak szczepy ZeptoMetrix wymienione poniżej (patrz Tabela 1) lub uprzednio scharakteryzowane próbki o znanym wyniku dodatnim. Tabela 1: Dostępne w sprzedaży szczepy do zewnętrznej kontroli dodatniej Szczep do zewnętrznej kontroli dodatniej Recombinant Norovirus GI lub GII Rotavirus A Adenovirus F40 lub F41 Human Astrovirus Type 4 lub Type 8 Numer części ZeptoMetrix 0886CF lub 0887CF ZeptoMetrix 0841CF lub CF ZeptoMetrix 0884CF lub 885CF ZeptoMetrix CF lub CF 8

9 Zaleca się, aby do przygotowania zawiesiny kontroli zewnętrznej każdą kulturę wirusową rozcieńczyć w stosunku 1:10 buforem TE. Inokulować 5 μl zawiesiny wirusowej do odpowiedniej probówki na bufor próbki. Przetwarzać i testować jak próbkę (patrz części Przygotowanie próbek i Obsługa systemu BD MAX). 5. Wszystkie zewnętrzne próbki kontrolne powinny dawać oczekiwane wyniki (dodatnie dla zewnętrznej kontroli dodatniej, ujemne dla zewnętrznej kontroli ujemnej) i nie powinny wystąpić niepowodzenia kontroli zewnętrznej (wyniki nierozstrzygające, nieokreślone lub niepełne). 6. Jeśli dla zewnętrznej kontroli ujemnej wynik testu okaże się dodatni, oznacza to nieprawidłowości lub skażenie przy przygotowywaniu próbki. Należy sprawdzić technikę manipulacji próbką tak, by uniknąć pomyłek i skażenia. Jeśli dla zewnętrznej kontroli dodatniej wynik testu okaże się ujemny, oznacza to nieprawidłowości przy manipulacji lub przygotowaniu próbki. Należy sprawdzić technikę manipulacji próbką i jej przygotowania. 7. Nierozstrzygający, nieokreślony lub niepełny wynik testu dla zewnętrznej próbki kontrolnej wskazuje na nieprawidłowości w odczynnikach lub w działaniu systemu BD MAX. Sprawdzić, czy na monitorze systemu BD MAX nie ma komunikatów o błędach. Informacje dotyczące interpretacji kodów ostrzeżeń i błędów można znaleźć w części System Error Summary (Podsumowanie błędów systemowych) podręcznika użytkownika BD MAX System User s Manual. 9 Jeśli problem powtarza się, należy użyć odczynników z nieotwartego woreczka lub nowego zestawu panelu enterowirusów BD MAX. 8. Każda probówka ekstrakcyjna panelu enterowirusów BD MAX zawiera próbkę kontrolną będącą tzw. konstruktem Armored RNA (zabezpieczone RNA) zawierającym syntetyczną sekwencję RNA docelowego. Próbkę kontrolną poddaje się ekstrakcji, wymywaniu i amplifikacji wraz z DNA/RNA obecnymi w przetwarzanej próbce, co ma zapewnić przewidywalność wyników oznaczenia. Próbka kontrolna służy do monitorowania skuteczności wychwytywania DNA/RNA, jego płukania i wymywania podczas przetwarzania próbki, jak również skuteczności konwersji RNA do DNA oraz amplifikacji i wykrywania docelowego DNA podczas analizy PCR. Jeśli wynik badania dla próbki kontrolnej nie spełni kryteriów dopuszczalności, wynik badania dla próbki zostanie podany jako nierozstrzygający; jednak wyniki dodatnie (POS) oznaczenia zostaną również podane, a ponadto żadna z próbek nie dostanie kwalifikacji ujemnej (NEG). Raporty sporządzane są osobno dla każdej mieszaniny wzorcowej. Wynik nierozstrzygający wskazuje na obecność inhibitorów w próbce lub nieprawidłowe działanie odczynnika. Testy dla wszelkich próbek, dla których podano wyniki nierozstrzygające, należy powtórzyć zgodnie z Procedurą powtarzania testu poniżej. INTERPRETACJA WYNIKÓW Wyniki są dostępne na karcie <Results> (Wyniki) w okienku <Results> na monitorze systemu BD MAX. Oprogramowanie BD MAX automatycznie interpretuje wyniki testu. Wyniki podawane są dla każdego analitu oraz dla próbki kontrolnej. Wynik testu może być NEG (negative ujemny), POS (positive dodatni) lub UNR (unresolved nierozstrzygający) w zależności od statusu substancji docelowej po amplifikacji i próbki kontrolnej. Wyniki IND (indeterminate nieokreślony) lub INC (incomplete niepełny) związane są z nieprawidłowym działaniem systemu BD MAX. W przypadku częściowego wyniku UNR, gdzie dla jednej lub większej liczby próbek uzyskano wynik POS, a dla wszystkich pozostałych wynik UNR, próbkom z wynikiem UNR nie będą przypisywane wyniki NEG. Wynik ten zostanie podany oddzielnie dla każdej mieszaniny wzorcowej. 9

10 Interpretację wyników panelu enterowirusów BD MAX opisano poniżej w Tabeli 2. PODANY WYNIK OZNACZENIA NoV POS RoV POS AdV POS hastv POS SaV POS NoV NEG RoV NEG AdV NEG hastv NEG SaV NEG NoV UNR RoV UNR AdV UNR hastv UNR SaV UNR Nieokreślony (IND) Niepełny (INC) Tabela 2: Interpretacja wyników panelu enterowirusów BD MAX INTERPRETACJA WYNIKU Wykryto RNA norowirusa GI lub GII Wykryto RNA rotawirusa A Wykryto DNA adenowirusa F40/F41 Wykryto RNA wirusa hastro Wykryto RNA sapowirusa grupy genotypów I, II, III lub IV Nie wykryto RNA norowirusa; wykryto próbkę kontrolną Nie wykryto RNA rotawirusa A; wykryto próbkę kontrolną Nie wykryto DNA adenowirusa F40/F41; wykryto próbkę kontrolną Nie wykryto RNA wirusa hastro; wykryto próbkę kontrolną Nie wykryto RNA sapowirusa grupy genotypów I, II, III ani IV; wykryto próbkę kontrolną. Nie wykryto RNA norowirusa GI lub GII; nie wykryto próbki kontrolnej (wskazuje to na obecność inhibitorów w próbce lub nieprawidłowe działanie odczynnika) Nie wykryto RNA rotawirusa A; nie wykryto próbki kontrolnej (wskazuje to na obecność inhibitorów w próbce lub nieprawidłowe działanie odczynnika) Nie wykryto DNA adenowirusa F40/F41; nie wykryto próbki kontrolnej (wskazuje to na obecność inhibitorów w próbce lub nieprawidłowe działanie odczynnika) Nie wykryto RNA wirusa hastro; nie wykryto próbki kontrolnej (wskazuje to na obecność inhibitorów w próbce lub nieprawidłowe działanie odczynnika) Nie wykryto RNA sapowirusa grupy genotypów I, II, III ani IV; nie wykryto próbki kontrolnej Wynik nieokreślony w związku z nieprawidłowym działaniem systemu BD MAX (z kodami ostrzeżeń lub błędów a ) Niepełny cykl (z kodami ostrzeżeń lub błędów a ) a Informacje dotyczące interpretacji kodów ostrzeżeń i błędów można znaleźć w części Troubleshooting (Rozwiązywanie problemów) podręcznika użytkownika BD MAX System User s Manual. 9 PROCEDURA POWTARZANIA TESTU UWAGA: W probówce na bufor próbki znajduje się objętość wystarczająca na wykonanie jednego powtórzenia testu. Jeśli probówki na bufor próbki były przechowywane w temperaturze 2 25 C, ponowne badanie należy wykonać w ciągu 48 godzin po pierwotnej inokulacji probówki na bufor próbki. Jeśli jednak probówki na bufor próbki były przechowywane w temperaturze 2 8 C, ponowne badanie można wykonać w ciągu 120 godzin (5 dni) po pierwotnej inokulacji probówki na bufor próbki. Pozostałą próbkę kału można również wykorzystać do powtórzenia badania w ciągu 120 godzin (5 dni) od pobrania, jeśli była przechowywana w temperaturze 2 8 C, lub 48 godzin, jeśli była przechowywana w temperaturze 2 25 C. UWAGA: Nowe próbki można przetestować w tym samym cyklu, co próbki badane ponownie. WYNIK NIEROZSTRZYGAJĄCY Wynik nierozstrzygający uzyskuje się w przypadku, gdy obecność inhibitora w próbce lub nieprawidłowe działanie odczynnika uniemożliwia odpowiednią amplifikację substancji docelowej lub próbki kontrolnej. Jeśli substancja w próbce kontrolnej nie ulegnie amplifikacji, dla próbki podany zostanie wynik UNR; jednak wyniki dodatnie (POS) oznaczenia zostaną również podane, a dla pozostałych próbek wynikiem będzie UNR. System BD MAX podaje wynik testu oddzielnie dla każdej substancji docelowej; wynik UNR może pojawić się dla jednej lub więcej substancji docelowych panelu enterowirusów BD MAX. W przypadku pełnego UNR, gdy dla wszystkich próbek odnotowano wynik nierozstrzygający, konieczne jest powtórzenie testu. W przypadku częściowego wyniku UNR panelu enterowirusów BD MAX, gdy dla niektórych próbek odnotowano wynik POS, a dla pozostałych UNR, test należy powtórzyć zgodnie z wyżej opisaną procedurą. W rzadkich przypadkach można uzyskać sprzeczne wyniki po wykonaniu ponownego testu dla próbek, dla których odnotowano początkowy wynik POS. W takim przypadku wyniki dodatnie pozostają w mocy. Testy dla próbek można powtórzyć przy użyciu materiału pozostałego w odpowiednich probówkach na bufor próbki w czasie określonym powyżej. Próbki należy worteksować przez 1 (jedną) minutę i wykonać test ponownie, zaczynając od części Obsługa systemu BD MAX. Pozostałą próbkę kału można również wykorzystać do powtórzenia testu przy użyciu nowej probówki na bufor próbki w czasie określonym powyżej. Należy wykonać test ponownie, zaczynając od części Przygotowanie próbek. 10

11 WYNIK NIEOKREŚLONY Wynik nieokreślony można uzyskać w przypadku nieprawidłowego działania systemu. Testy dla próbek można powtórzyć przy użyciu materiału pozostałego w odpowiednich probówkach na bufor próbki w czasie określonym powyżej. Próbki należy worteksować przez 1 (jedną) minutę i wykonać test ponownie, postępując zgodnie z częścią Obsługa systemu BD MAX. Pozostałą próbkę kału, przy użyciu nowej probówki na bufor próbki, można również wykorzystać do powtórzenia testu w czasie określonym powyżej. Należy wykonać test ponownie, zaczynając od części Przygotowanie próbek. Informacje dotyczące interpretacji kodów ostrzeżeń i błędów można znaleźć w podręczniku użytkownika BD MAX System User s Manual, 9 część Troubleshooting (Rozwiązywanie problemów). WYNIK NIEPEŁNY Wynik niepełny można uzyskać w przypadku, gdy procedura przygotowania próbki lub PCR nie zakończą się. Testy dla próbek można powtórzyć przy użyciu materiału pozostałego w odpowiednich probówkach na bufor próbki w czasie określonym powyżej. Próbki należy worteksować przez 1 (jedną) minutę i wykonać test ponownie, postępując zgodnie z częścią Obsługa systemu BD MAX. Pozostałą próbkę kału, przy użyciu nowej probówki na bufor próbki, można również wykorzystać do powtórzenia testu w czasie określonym powyżej. Należy wykonać test ponownie, zaczynając od części Przygotowanie próbek. Informacje dotyczące interpretacji kodów ostrzeżeń i błędów można znaleźć w podręczniku użytkownika BD MAX System User s Manual, 9 część Troubleshooting (Rozwiązywanie problemów). NIEPOWODZENIE TESTU ZEWNĘTRZNEJ PRÓBKI KONTROLNEJ Wyniki testu dla zewnętrznej próbki kontrolnej powinny być zgodne z oczekiwanymi. Jeśli badanie dla próbek należy powtórzyć z powodu nieprawidłowego wyniku testu dla kontroli zewnętrznej, należy wykonać ponowne testy próbek, korzystając z materiału w probówkach na bufor próbki oraz świeżo przygotowanych zewnętrznych próbek kontrolnych w wyżej zdefiniowanych ramach czasowych. Próbki należy worteksować przez 1 (jedną) minutę i wykonać test ponownie, postępując zgodnie z częścią Obsługa systemu BD MAX. POSIEW PRÓBEK Posiew i identyfikację organizmów z próbek o dodatnim wyniku testu należy wykonać zgodnie z procedurami laboratoryjnymi. OGRANICZENIA PROCEDURY Produktu należy używać tylko z systemem BD MAX. Produkt jest przeznaczony do używania tylko z niekonserwowanymi lub konserwowanymi w podłożu Cary-Blair próbkami kału ludzkiego. Panel enterowirusów BD MAX nie jest zwalidowany do badania próbek kału pochodzących z wymazu z odbytu lub z kału twardego. Przyczyną uzyskania błędnych wyników może być nieodpowiednia technika pobrania próbki lub manipulacji nią, nieprawidłowe przechowywanie, błąd techniczny, pomylenie próbek lub liczba organizmów w próbce poniżej czułości analitycznej testu. Jeśli w panelu enterowirusów BD MAX uzyskany zostanie wynik IND, INC lub UNR (dla jednej lub większej liczby próbek), test należy powtórzyć. Dodatni wynik w panelu enterowirusów BD MAX nie oznacza obecności organizmów żywych. Wskazuje on jednak na obecność docelowego DNA/RNA. Mutacje lub polimorfizm w regionie wiążącym primer lub sondę mogą wpłynąć na wykrywanie nowych lub nieznanych wariantów organizmów docelowych, co może spowodować fałszywie ujemny wynik badania w panelu enterowirusów BD MAX. Panel enterowirusów BD MAX wykrywa norowirusy GI i GII jednocześnie i nie rozróżnia między tymi gatunkami. Panel enterowirusów BD MAX wykrywa adenowirusy F40/F41 jednocześnie i nie rozróżnia między tymi gatunkami. Panel enterowirusów BD MAX wykrywa sapowirusy z grup genotypów I, II, III i IV jednocześnie i nie rozróżnia między tymi gatunkami. Podobnie jak w przypadku wszystkich testów opartych na PCR, przy bardzo niskim stężeniu substancji docelowej poniżej LoD (granicy wykrywalności) oznaczenia substancja może być wykryta, ale wyniki mogą nie być powtarzalne. Fałszywie ujemne wyniki mogą wystąpić z powodu utraty kwasów nukleinowych wskutek nieodpowiedniego sposobu pobrania, przechowywania lub przechowywania próbek lub niewystarczającej lizy wirusów. Test zawiera próbkę kontrolną mającą na celu wspomaganie identyfikacji próbek zawierających inhibitory amplifikacji PCR oraz kontrolę prawidłowego składu odczynników i działania systemu oznaczenia jako całości. Próbka kontrolna nie pozwala na ustalenie, czy doszło do utraty kwasów nukleinowych wskutek nieodpowiedniej techniki pobrania, transportu lub przechowywania próbek, czy też kapsydy wirusowe nie uległy odpowiedniej lizie. Wyniki panelu enterowirusów BD MAX powinny pełnić rolę pomocniczą względem obserwacji klinicznych i innych danych dostępnych lekarzowi. Podobnie jak w przypadku wszystkich testów diagnostycznych in vitro, przewidywalne wartości dodatnie i ujemne zależą w dużym stopniu od częstości występowania. Skuteczność stosowania panelu enterowirusów BD MAX może być różna w zależności od częstości występowania i badanej populacji. Na wyniki panelu enterowirusów BD MAX może ale nie musi mieć wpływ bieżące leczenie, które może doprowadzić do zmniejszenia ilości substancji docelowych. Probówki na bufor próbki nie są zaprojektowane pod kątem podtrzymywania żywotności organizmów. Jeśli konieczne jest wykonanie posiewu, należy go zrobić z pierwotnej próbki. Nie ustalono skuteczności testu w monitorowaniu leczenia zakażeń norowirusami GI i GII, rotawirusem A, adenowirusem F40/41, sapowirusem (grupy genotypów I, II, III, IV) ani hastro. Test ma charakter jakościowy i nie daje informacji ilościowych ani nie wskazuje na ilość obecnych organizmów. 11

12 Nie oceniono skuteczności testu w przypadku osób z obniżoną odpornością ani osób, u których nie występują objawy zakażenia układu pokarmowego. Efekt substancji zakłócających oceniono tylko dla substancji wymienionych w niniejszej ulotce. Nie oceniono zakłócającego wpływu substancji innych niż opisane poniżej w części Zakłócenia. Zakłócenia ze strony substancji innych niż opisane w części Zakłócenia poniżej mogą prowadzić do uzyskania błędnych wyników. Wykazano, że adenowirus typu 1 związany z zakażeniami u ludzi może potencjalnie reagować krzyżowo z panelem enterowirusów BD MAX. Nie oceniono reaktywności krzyżowej z organizmami innymi niż wymienione poniżej w części Swoistość analityczna. CHARAKTERYSTYKA WYDAJNOŚCIOWA Charakterystykę wydajnościową panelu enterowirusów BD MAX określono w drodze wewnętrznego, symulowanego badania klinicznego z użyciem próbek uzyskanych prospektywnie i retrospektywnie w warunkach klinicznych. Badanie kliniczne obejmowało próbek, w tym niekonserwowanych i konserwowanych w podłożu Cary-Blair. Wyniki symulowanego badania klinicznego w zakresie wydajności przedstawiono poniżej w Tabelach 3 7 dla każdego organizmu docelowego. Tabela 3: Wydajność dla norowirusa: Typy próbek łącznie Metoda referencyjna BD MAX Łącznie P N P N Łącznie PPA : 93,8% (88,7%, 96,7%) NPA : 99,5% (98,9%, 99,7%) Tabela 4: Wydajność dla rotawirusa: Typy próbek łącznie Metoda referencyjna BD MAX Łącznie P N P N Łącznie PPA : % (96,5%, %) NPA : 99,5% (99,0%, 99,8%) Tabela 5: Wydajność dla adenowirusa: Typy próbek łącznie Metoda referencyjna BD MAX Łącznie P N P N Łącznie PPA : % (88,3%, %) NPA : % (99,7%, %) Tabela 6: Wydajność dla sapowirusa: Typy próbek łącznie Metoda referencyjna BD MAX Łącznie P N P N Łącznie PPA : 87,5% (77,2%, 93,5%) NPA : 99,3% (98,7%, 99,6%) 12

13 Tabela 7: Wydajność dla ludzkiego astrowirusa: Typy próbek łącznie Metoda referencyjna BD MAX Łącznie P N P N Łącznie PPA : 92,9% (83,0%, 97,2%) NPA : 99,8% (99,4%, 99,9%) Odsetek wyników nienadających się do analizy Odsetek wyników wstępnie nierozstrzygających spośród próbek prospektywnych ocenionych w badaniu wynosił 0,9% dla próbek zakonserwowanych w podłożu Cary-Blair i 2,2% dla próbek niekonserwowanych. Odsetek wyników nierozstrzygających po prawidłowym powtórzeniu testu wynosił zaledwie 0,1% dla próbek zakonserwowanych w podłożu Cary-Blair i 1,3% dla próbek niekonserwowanych (patrz Tabela 8). Spośród próbek prospektywnych ocenionych w badaniu dla 0,5% próbek zakonserwowanych w podłożu Cary-Blair i 1,6% dla próbek niekonserwowanych uzyskano wynik nieokreślony. Po wykonaniu prawidłowego powtórzenia testu odsetek wyników nieokreślonych wynosił 0,1% dla próbek zakonserwowanych w podłożu Cary-Blair i zero dla próbek niekonserwowanych (patrz Tabela 8). Spośród próbek prospektywnych ocenionych w badaniu dla 0,1% próbek zakonserwowanych w podłożu Cary-Blair i 0,4% dla próbek niekonserwowanych uzyskano wynik niepełny. Po wykonaniu prawidłowego powtórzenia testu odsetek wyników niepełnych wynosił 0,1% dla próbek zakonserwowanych w podłożu Cary-Blair i zero dla próbek niekonserwowanych (patrz Tabela 8). Organizmy docelowe łącznie Typ próbki Próbki konserwowane w podłożu Cary-Blair Próbki niekonserwowane Tabela 8: Odsetek wyników nienadających się do analizy dla wszystkich organizmów docelowych (łącznie) Odsetek wyników nierozstrzygających EVP w pierwszym teście 0,9 9/952 (0,5, 1,8) 2,2 17/772 (1,4, 3,5) Połączone 1,5 26/1 724 (1,0, 2,2) EVP końcowe 0,1 1/943 (0,0, 0,6) 1,3 10/762 (0,7, 2,4) 0,6 11/1 705 (0,4, 1,2) Odsetek wyników nieokreślonych EVP w pierwszym teście 0,5 5/952 (0,2, 1,2) 1,6 12/772 (0,9, 2,7) 1,0 17/1 724 (0,6, 1,6) EVP końcowe 0,1 1/943 (0,0, 0,6) 0,0 0/762 (0,0, 0,5) 0,1 1/1 705 (0,0, 0,3) Odsetek wyników niepełnych EVP w pierwszym teście 0,1 1/952 (0,0, 0,6) 0,4 3/772 (0,1, 1,1) 0,2 4/1 724 (0,1, 0,6) EVP końcowe 0,1 1/943 (0,0, 0,6) 0,0 0/762 (0,0, 0,5) 0,1 1/1 705 (0,0, 0,3) Odsetek łącznie EVP w pierwszym teście 1,6 15/952 (1,0, 2,6) 4,1 32/772 (3,0, 5,8) 2,7 47/1 724 (2,1, 3,6) EVP końcowe 0,3 3/943 (0,1, 0,9) 1,3 10/762 (0,7, 2,4) 0,8 13/1 705 (0,4, 1,3) Zakres analityczny W badaniu uwzględniono szereg szczepów docelowych panelu enterowirusów BD MAX. Kryteria wyboru szczepów obejmowały częstość występowania, typ serologiczny i w stosownych przypadkach czynniki geograficzne. Przebadano 58 (pięćdziesiąt osiem) szczepów, w tym pochodzące ze zbiorów publicznych oraz dobrze scharakteryzowane szczepy wyizolowane w praktyce klinicznej. Badanie zakresu analitycznego obejmowało 22 szczepy norowirusa GI i GII, 5 szczepów rotawirusa, 10 szczepów adenowirusa F40/F41, 11 szczepów sapowirusa i 10 szczepów wirusa hastro. Szczepy testowano przy stężeniu 3x LoD (granicy wykrywalności) odpowiedniego szczepu w niekonserwowanym nośniku kałowym. Przy użyciu panelu enterowirusów BD MAX poprawnie zidentyfikowano wszystkie 58 szczepów w pierwszym teście. 13

14 Czułość analityczna Czułość analityczną (granicę wykrywalności, LoD) panelu enterowirusów BD MAX określono następująco: Dla każdego organizmu docelowego sporządzono preparat i zbadano go ilościowo przed włączeniem do badania. W każdym z preparatów organizmów zanurzono oddzielne ezy, które przeniesiono do probówki na bufor próbki zawierającej nośnik kałowy (konserwowany lub niekonserwowany), co do którego stwierdzono uprzednio ujemny wynik badania na obecność wszystkich organizmów docelowych wykrywanych w panelu enterowirusów BD MAX. Dla każdego organizmu zostało wykonanych co najmniej 20 powtórzeń testu dla każdego rodzaju próbki (konserwowanej lub niekonserwowanej) przez dwóch operatorów i przy użyciu trzech różnych serii produkcyjnych panelu enterowirusów BD MAX. LoD dla danego organizmu potwierdzono, wykonując co najmniej 20 dodatkowych powtórzeń testu przy wyznaczonym stężeniu LoD. Czułość analityczna (LoD), zdefiniowana jako najniższe stężenie, przy którym oczekuje się, że dla nie mniej niż 95% wszystkich powtórzeń testu uzyskany zostanie wynik dodatni (patrz Tabela 9). Tabela 9: Granica wykrywalności panelu enterowirusów BD MAX dla poszczególnych organizmów docelowych Organizm docelowy Norowirus Rotawirus Adenowirus Ludzki astrowirus Sapowirus Szczep LoD dla próbek niekonserwowanych (kopii/ml kału) LoD dla próbek konserwowanych w podłożu Cary-Blair (kopii/ml kału) GI 6,28E+06 4,71E+06 GII 2,49E+05 2,49E+05 WA 6,46E+03 1,29E+04 Va70 1,16E+04 5,82E+03 F40 6,89E+04 2,75E+05 F41 8,16E+04 1,22E+05 Typ 4 1,75E+07 3,49E+07 Typ 8 5,23E+06 2,09E+07 GI 6,51E+07 6,51E+07 GII 1,94E+06 1,94E+06 Swoistość analityczna (reaktywność krzyżowa i wyłączone organizmy) Panel enterowirusów BD MAX wykonano na próbkach zawierających gatunki spokrewnione filogenetycznie oraz inne organizmy (bakterie, wirusy, pasożyty i drożdże), jakie mogą się znajdować w próbkach kału. Komórki bakterii, drożdży i wirusów przetestowano w probówkach na bufor próbki przy stężeniu 10 6 CFU, równoważników komórek lub materiału genetycznego/ml kału, lub 10 5 PFU/mL kału lub TCID50/mL kału. Łącznie przebadano 112 organizmów. Dla większości zbadanych szczepów bakterii, drożdży, pasożytów i wirusów uzyskano w panelu enterowirusów BD MAX wynik ujemny. Dla adenowirusa typu 1 związanego z zachorowaniami u ludzi uzyskano w panelu enterowirusów BD MAX wynik dodatni. Jednak dla tego szczepu przy stężeniu 1,0 x TCID50 jednostek/ml kału nie uzyskano wyniku dodatniego. 14

15 Substancje zakłócające 32 (trzydzieści dwie) substancje biologiczne i chemiczne, jakie mogą występować w próbkach kału, oceniono pod kątem potencjalnego zakłócania panelu enterowirusów BD MAX. Badaniem objęto mieszaninę antybiotyków składającą się z 7 różnych antybiotyków lub środków przeciwbólowych testowanych jednocześnie. Te antybiotyki lub środki przeciwbólowe obejmowały sól sodową naproksenu, sól disodową ceftriaksonu, erytromycynę, metronidazol, sulfametoksazol, chlorowodorek tetracykliny i trimetoprim. Krem z hydrokortyzonem miał działanie zakłócające przy stężeniu powyżej 25% v/v. Dla szczepionki RotaTeq również wykazano wynik dodatni, zgodnie z oczekiwaniami, ponieważ może ona być obecna w kale do 9 dni po szczepieniu. 12 Nie wykazano obserwowalnych zakłóceń dla innych badanych substancji (patrz Tabela 10). Ponadto zbadano pod kątem potencjalnego zakłócania działania panelu enterowirusów BD MAX takie mikroorganizmy, które mogą być obecne endogennie w próbkach kału. Przetestowano 5 (pięć) organizmów w dużych stężeniach (1 x10 6 komórek/ml kału). Nie wykazano obserwowalnego zakłócania działania panelu dla żadnego z testowanych mikroorganizmów (patrz Tabela 11). Tabela 10: Substancje endogenne i dostępne w sprzedaży substancje egzogenne badane w panelu enterowirusów BD MAX Nazwa występująca w opisie Wynik Nazwa występująca w opisie Wynik Tłuszcz występujący w kale NI Lubrykant plemnikobójczy NI Ludzkie DNA NI Czopek (glicerynowy) NI Śluz NI Vagisil NI Krew pełna ludzka NI Środki przeczyszczające NI Krem z hydrokortyzonem I Środki przeciwbiegunkowe (płynne) NI Chusteczki przeciwbakteryjne NI Środki przeciwbiegunkowe (pigułki) NI Wlew doodbytniczy; olej mineralny NI Mieszanina antybiotyków NI Żel na hemoroidy NI Środki przeciw nadkwasocie NI Krem z nystatyną NI Niesterydowe leki przeciwzapalne (NLPZ) NI Miejscowo stosowany antybiotyk NI Szczepionka RoV (reasortowany rotawirus ATCC VR-2195 i VR-2415) NI I: Odnotowano zakłócenie działania panelu enterowirusów BD MAX przy dużym stężeniu. NI: Nie odnotowano zakłócania działania panelu enterowirusów BD MAX. Tabela 11: Mikroorganizmy przebadane pod kątem zakłócania działania panelu enterowirusów BD MAX Mikroorganizmy Salmonella typhimurium Escherichia coli Proteus vulgaris Enterococcus faecalis Peptostreptococcus anaerobius Wynik NI NI NI NI NI NI: Nie odnotowano zakłócania działania panelu enterowirusów BD MAX. Zakażenie mieszane / zakłócanie kompetycyjne Opracowano badanie zakażeń mieszanych / zakłócania kompetycyjnego, aby ocenić możliwość wystąpienia w panelu enterowirusów BD MAX słabego odczynu dodatniego w obecności innych organizmów docelowych w dużych stężeniach. Przygotowano mieszaninę dwóch z trzech organizmów (norowirusa, adenowirusa i rotawirusa) dla mieszaniny wzorcowej D6 lub mieszaninę jednego z dwóch organizmów (sapowirusa, hastro) dla mieszaniny wzorcowej D5 w stężeniach odpowiadających 95. percentylowi odnotowanych w badaniu klinicznym, aby zasymulować wysoką wiremię w celu zapewnienia dużego stężenia organizmu docelowego w badaniu przy użyciu probówki na bufor próbki panelu enterowirusów BD MAX. Analit panelu enterowirusów BD MAX, którego brakowało w mieszaninie o wysokim stężeniu organizmów docelowych, dodano do probówki na bufor próbki w stężeniu 2x LoD reprezentującym niskie stężenie organizmów docelowych wraz z 5 μl niekonserwowanego kału i przebadano w celu zasymulowania zakażenia mieszanego. Nawet przy wysokiej wiremii wszystkie organizmy odpowiadające odpowiednim symulowanym zakażeniom mieszanym zostały z powodzeniem wykryte w panelu enterowirusów BD MAX. Precyzja Precyzję wewnątrzlaboratoryjną panelu enterowirusów BD MAX badano w jednej placówce. Testy przeprowadzano przez 12 dni, dwa cykle dziennie (przeprowadzane po jednym przez dwóch operatorów), łącznie 24 cykle. Do stworzenia elementów panelu użyto pięciu swoistych organizmów docelowych w różnych stężeniach. Elementy panelu obejmowały norowirusa, rotawirusa, adenowirusa, sapowirusa i wirusa hastro. Dodano ilości organizmów docelowych odpowiadające następującym stężeniom dla każdego elementu panelu: Odczyn umiarkowanie dodatni (moderate positive, MP): 2,99x LoD Odczyn słabo dodatni (low positive, LP): 1,99x LoD Odczyn prawdziwie ujemny (true negative, TN): brak organizmów docelowych 15