MAX Enteric Parasite Panel

Transkrypt

1 MAX Enteric Parasite Panel Do stosowania w diagnostyce in vitro P0219(02) Do stosowania z systemem BD MAX Polski PRZEZNACZENIE BD MAX Enteric Parasite Panel (panel pasożytów przewodu pokarmowego) służący do przeprowadzania testów z użyciem systemu BD MAX to zautomatyzowany test diagnostyczny in vitro do bezpośredniego jakościowego wykrywania patogenów pasożytów przewodu pokarmowego. Przy pomocy panelu pasożytów przewodu pokarmowego BD MAX można wykryć kwasy nukleinowe pochodzące od: Giardia lamblia Cryptosporidium (wyłącznie C. hominis i C. parvum); Entamoeba histolytica. Test przeprowadza się na niekonserwowanych lub utrwalonych w 10% formalinie próbkach kału pobranych od pacjentów z objawami i podejrzeniem zapalenia żołądka i jelit, zapalenia jelit lub zapalenia okrężnicy. To oznaczenie służy do wspomagania diagnostyki zakażeń układu pokarmowego i należy je stosować w połączeniu z oceną kliniczną oraz innymi badaniami laboratoryjnymi. Test przeprowadza się bezpośrednio na próbce z wykorzystaniem reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR) w czasie rzeczywistym w celu amplifikacji określonych substancji docelowych. W teście wykorzystuje się fluorogenne swoiste dla danych genów sondy hybrydyzacyjne do wykrywania amplifikowanego DNA. Test ten ma za zadanie ułatwić, w połączeniu z objawami klinicznymi, badaniami laboratoryjnymi oraz danymi epidemiologicznymi, rozpoznanie różnicowe zakażeń wywoływanych przez Giardia lamblia, Cryptosporidium hominis i C. parvum, jak również Entamoeba histolytica. Wyniki testu nie powinny stanowić wyłącznej podstawy do rozpoznania, leczenia ani innych decyzji dotyczących postępowania. Dodatni wynik nie wyklucza współistniejącego zakażenia innymi organizmami, które nie są wykrywane w tym teście, i może nie być jedyną ani ostateczną przyczyną choroby pacjenta. Wynik ujemny przy występujących objawach klinicznych spójnych z obrazem zapalenia żołądka i jelit lub zapalenia okrężnicy może być związany z tym, że mamy do czynienia z zakażeniem patogenami niewykrywanymi w tym teście lub z przyczynami innymi niż zakażenie, takimi jak wrzodziejące zapalenie jelita grubego, zespół jelita drażliwego lub choroba Leśniowskiego-Crohna. STRESZCZENIE I OBJAŚNIENIE PROCEDURY Organizmy powodujące choroby jelit odpowiadają za znaczną część przypadków zachorowań i zgonów na świecie. Jelitowe czynniki zakaźne wnikają do organizmu przez przewód pokarmowy i zazwyczaj przenoszą się przez skażoną żywność i wodę lub przez kontakt z wymiocinami lub odchodami. CDC szacuje, że każdego roku w USA dochodzi do 48 milionów przypadków zakażeń, których źródłem jest żywność i które prowadzą do hospitalizacji i 3000 zgonów. 1 W krajach rozwijających się choroby te powodują około 2,5 miliona zgonów rocznie wśród małych dzieci. 2 Każdy z patogenów chorobotwórczych może wywoływać nieco inne objawy, takie jak skurcze lub ból brzucha, utrata apetytu, mdłości lub wymioty; jednak wszystkim tym zakażeniom towarzyszy biegunka. 3 Powtarzające się napady biegunki i utrzymujące się stany biegunkowe powodują zaburzenie czynności jelit i wchłaniania, co u dzieci może prowadzić do niedożywienia i zahamowania wzrostu. 4 Podłoże etiologiczne biegunki stanowią wirusy, bakterie i pasożyty. Giardia lamblia, Cryptosporidium hominis and C. parvum, as well as Entamoeba histolytica to główne pasożyty uznawane za odpowiedzialne za wywoływanie biegunki. Wszystkie te organizmy są przenoszone drogą fekalno-oralną poprzez spożywanie skażonej żywności lub wody i często wiążą się z wybuchami epidemii. Na całym świecie Giardia jest jednym z najczęściej identyfikowanych pasożytów związanych z epidemiami chorób przenoszonych przez wodę. 5 Giardioza charakteryzuje się biegunką, skurczami brzucha, wzdęciem, utratą masy ciała i pogorszeniem wchłaniania substancji odżywczych. Z giardiozą wiążą się również zaburzenia układu pokarmowego, alergie i reaktywne zapalenie stawów. Choroba jest na ogół samoograniczająca się; mogą również występować infekcje bezobjawowe. 1

2 Cryptosporidium hominis i C. parvum powodują kryptosporydiozę, charakteryzującą się wodnistą biegunką, której towarzyszą skurcze żołądka, gorączka, nudności, wymioty i utrata masy ciała. U pacjentów z obniżoną odpornością w wyniku zakażenia może rozwinąć się zapalenie dróg żółciowych lub zapalenie trzustki. 5,6 Mogą również wystąpić infekcje bezobjawowe. Zakażenia Entamoeba histolytica zazwyczaj przebiegają bezobjawowo. W przypadku wystąpienia objawów często występuje łagodna do ciężkiej biegunka oraz wzdęcia. Utrzymująca się choroba może prowadzić do utraty masy ciała i przewlekłego zmęczenia. 6 Zakażenie Entamoeba histolytica może mieć również charakter inwazyjny i powodować uszkodzenie tkanek i ropnie wątroby. 7 Badania mikroskopowe w kierunku obecności tych pasożytów nie są wystarczająco czułe i wymagają czasu, odpowiedniego sprzętu i przeszkolenia. Ponadto w badaniach mikroskopowych nie można odróżnić gatunku Entamoeba histolytica od niepatogennego gatunku Entamoeba dispar. 8 PCR to metoda bardziej czuła niż metody tradycyjne i może przyczynić się do wcześniejszego wykrywania pasożytów, co może zmniejszyć potrzebę testowania wielu próbek kału i usprawnić leczenie pacjentów i kontrolę zakażeń. 9 Panel pasożytów przewodu pokarmowego BD MAX to oznaczenie złożone, wykrywające jednocześnie Giardia lamblia, Cryptosporidium hominis i C. parvum, a także Entamoeba histolytica i umożliwiające różnicowanie tych pasożytów. Panel pasożytów przewodu pokarmowego BD MAX służący do przeprowadzania testów z użyciem systemu BD MAX pozwala na uzyskanie wyników badania dla 24 próbek w ciągu około 4,5 godziny. Panel pasożytów przewodu pokarmowego BD MAX ułatwia i upraszcza proces badania, eliminując potrzebę interwencji ze strony operatora w okresie od umieszczenia próbki w systemie BD MAX do momentu uzyskania wyników. Pobraną próbkę kału transportuje się do laboratorium, gdzie jest ona homogenizowana i przenoszona ezą do BD MAX Enteric Parasite Panel Sample Buffer Tube (probówki na bufor próbki panelu pasożytów przewodu pokarmowego). Probówkę na bufor próbki zamyka się korkiem z przegrodą, a następnie podgrzewa w cieplarce do wstępnego ogrzewania BD Pre-warm Heater, aby przyspieszyć lizę komórek pasożytów. Probówkę na bufor próbki worteksuje się i umieszcza w systemie BD MAX, gdzie zachodzą następujące zautomatyzowane czynności: komórki są poddawane lizie, kwasy nukleinowe są ekstrahowane na koralikach magnetycznych i zatężane, a następnie podpróbkę wymytych kwasów nukleinowych dodaje się do odczynników do PCR zawierających swoiste dla danych genów primery służące do amplifikacji genów docelowych w BD MAX PCR Cartridge (kasecie do PCR), o ile są obecne. Test zawiera również próbkę kontrolną. Próbka kontrolna znajduje się w probówce ekstrakcyjnej; przeprowadzane są na niej etapy ekstrakcji, zatężania i amplifikacji w celu wykrycia inhibitorów lub nieprawidłowości w działaniu aparatów lub odczynników. Po umieszczeniu w systemie BD MAX próbki oraz BD MAX Unitized Reagent Strip (scalonego paska z odczynnikami) i kasety do PCR interwencja operatora nie jest już potrzebna. System BD MAX umożliwia automatyzację lizy próbki, ekstrakcji i zatężania kwasu nukleinowego, ponownego nawodnienia odczynników, amplifikacji kwasów nukleinowych oraz wykrywania docelowych sekwencji kwasów nukleinowych przy wykorzystaniu reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR) w czasie rzeczywistym. Docelowe związki po amplifikacji wykrywane są sondami hydrolizy znakowanymi wygaszonymi fluoroforami. Amplifikacja, wykrywanie i interpretacja sygnałów zachodzą w systemie BD MAX automatycznie. ZASADY PROCEDURY Próbki kału pobiera się od pacjentów i transportuje do laboratorium w czystym pojemniku, niekonserwowane lub utrwalone w 10% formalinie. Próbkę worteksuje się, a następnie 10-µL ezę wprowadza się na całą długość pętli do próbki i ruchem okrężnym przenosi się do probówki na bufor próbki BD MAX. Probówkę na bufor próbki zamyka się korkiem z przegrodą, a następnie podgrzewa w cieplarce do wstępnego ogrzewania BD Pre-warm Heater, aby przyspieszyć lizę komórek pasożytów. Probówkę na bufor próbki worteksuje się i przenosi do systemu BD MAX. Po wygenerowaniu listy roboczej i umieszczeniu próbki w aparacie BD MAX wraz ze scalonym paskiem z odczynnikami oraz kasetą do PCR panelu pasożytów przewodu pokarmowego BD MAX rozpoczyna się analiza i nie jest już wymagana interwencja operatora. System BD MAX automatyzuje przygotowanie próbki, w tym lizę organizmów docelowych, ekstrakcję i zatężanie DNA, ponowne nawadnianie odczynników oraz amplifikację i wykrywanie docelowych sekwencji kwasów nukleinowych przy wykorzystaniu reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR) w czasie rzeczywistym. System BD MAX przeprowadza też automatyczną interpretację sygnałów. Test zawiera również próbkę kontrolną, znajdującą się w probówce ekstrakcyjnej i poddawaną ekstrakcji, zatężaniu i amplifikacji. Podczas etapu lizy, ekstrakcji, zatężania i amplifikacji jest stosowana próbka kontrolna w celu monitorowania obecności potencjalnych inhibitorów, jak również wykrywania nieprawidłowego działania systemu lub odczynników. Po enzymatycznej lizie komórek w podwyższonej temperaturze uwolnione kwasy nukleinowe są wychwytywane na koralikach magnetycznych. Koraliki wraz z przyczepionymi do nich kwasami nukleinowymi są płukane, a kwasy nukleinowe ulegają wymywaniu w buforze do wymywania pod wpływem wysokiej temperatury i wysokiego ph. Wymyte cząsteczki DNA neutralizuje się i przenosi do probówki z mieszaniną wzorcową w celu nawodnienia odczynników do PCR. Po nawodnieniu system BD MAX przenosi stałą objętość roztworu gotowego do analizy PCR do kasety do PCR BD MAX. Mikrozastawki w kasecie do PCR BD MAX są zamykane przed rozpoczęciem PCR, aby zabezpieczyć mieszaninę amplifikacyjną przed parowaniem i skażeniem. Docelowe sekwencje DNA po amplifikacji wykrywane są przy pomocy sond hydrolitycznych (TaqMan) znakowanych z jednej strony fluorescencyjnym barwnikiem sygnałowym (fluoroforem), a z drugiej grupą wygaszającą. Do wykrywania amplikonów pasożytów docelowych oraz próbki kontrolnej w czterech różnych kanałach optycznych systemu BD MAX wykorzystywane są sondy znakowane różnymi fluoroforami. Amplikony Giardia lamblia są wykrywane w kanale FAM, amplikony Cryptosporidium hominis/ parvum są wykrywane w kanale ROX, amplikony Entamoeba histolytica są wykrywane w kanale VIC, a amplikony próbki kontrolnej są wykrywane w kanale Cy5.5. Gdy sondy są w stanie natywnym, fluorofor jest wygaszony wskutek bliskości grupy wygaszającej. Jednak w obecności docelowego DNA sondy hybrydyzują do swoich sekwencji komplementarnych i ulegają hydrolizie w wyniku aktywności egzonukleazy 5 3, jaką wykazuje polimeraza DNA, gdy syntetyzuje powstającą nić wzdłuż istniejącej nici DNA. W efekcie fluorofory pozostają odseparowane od cząsteczek wygaszających i emitowana jest fluorescencja. System BD MAX monitoruje te sygnały w każdym cyklu i na zakończenie programu interpretuje dane do raportu końcowego. 2

3 ODCZYNNIKI I MATERIAŁY NR KAT. Zawartość Ilość BD MAX Enteric Parasite Master Mix (mieszanina wzorcowa) (A7) Suszona w piecu mieszanina wzorcowa do PCR zawierająca swoiste sondy molekularne TaqMan i primery wraz 24 testy ze swoistą dla próbki kontrolnej sondą TaqMan i primerami. BD MAX Enteric Parasite Unitized Reagent Strips (scalone paski z odczynnikami) Scalony pasek z odczynnikami zawierający wszystkie płynne odczynniki i jednorazowe końcówki pipet niezbędne 24 testy do ekstrakcji DNA. BD MAX Enteric Parasite Extraction Tube (probówka ekstrakcyjna) (B2) Wysuszony w piecu osad zawierający koraliki magnetyczne z powinowactwem do DNA, odczynniki proteazowe 24 testy oraz próbkę kontrolną. BD MAX Enteric Parasite Sample Buffer Tube (probówka na bufor próbki) 24 testy Korki z przegrodą 25 SPRZĘT I MATERIAŁY WYMAGANE, ALE NIEZNAJDUJĄCE SIĘ W ZESTAWIE BD Pre-warm Heater (Cieplarka do wstępnego ogrzewania) (nr kat. BD Diagnostic Systems ) BD MAX PCR Cartridges (kasety do PCR) (nr kat. BD Diagnostic Systems ) VWR Multi-Tube Vortex Mixer (mieszadło wieloprobówkowe) lub równoważne Vortex Genie 2 (mieszadło) lub równoważne Nalgene Cryogenic Vial Holder (stojak do probówek kriogenicznych) lub równoważny Rękawiczki jednorazowe, bez talku 10 µl ezy (nr kat. BD Diagnostic Systems ) Dla niekonserwowanych próbek kału: Suche, czyste pojemniki do zbierania próbek kału Dla utrwalonych w 10% formalinie próbek kału: Podłoże transportowe z 10% formaliny (15 ml) OSTRZEŻENIA I ŚRODKI OSTROŻNOŚCI Niebezpieczeństwo H319 Działa drażniąco na oczy. H360 Może działać szkodliwie na płodność lub na dziecko w łonie matki. P280 Stosować rękawice ochronne/odzież ochronną/ochronę oczu/ochronę twarzy. P264 Dokładnie umyć po użyciu. P201 Przed użyciem zapoznać się ze specjalnymi środkami ostrożności. P202 Nie używać przed zapoznaniem się i zrozumieniem wszystkich środków bezpieczeństwa. P305+P351+P338 W PRZYPADKU DOSTANIA SIĘ DO OCZU: Ostrożnie płukać wodą przez kilka minut. Wyjąć soczewki kontaktowe, jeżeli są używane i można je łatwo usunąć. Kontynuować płukanie. P308+P313 W PRZYPADKU narażenia lub styczności: Zasięgnąć porady/zgłosić się pod opiekę lekarza. P337+P313 W przypadku utrzymywania się działania drażniącego na oczy: Zasięgnąć porady/zgłosić się pod opiekę lekarza. P405 Przechowywać pod zamknięciem. P501 Zawartość/pojemnik usuwać zgodnie z lokalnymi/regionalnymi/krajowymi/międzynarodowymi przepisami. Panel pasożytów przewodu pokarmowego BD MAX przeznaczony jest wyłącznie do stosowania w diagnostyce in vitro. Krajowe i lokalne organy opieki zdrowotnej opublikowały wytyczne dotyczące informowania o podlegających zgłaszaniu chorobach na obszarach objętych ich jurysdykcją, w tym między innymi o chorobach wywołanych przez Giardia, Cryptosporidium i Entamoeba w celu określenia niezbędnych środków weryfikacji wyników, które umożliwią identyfikację i śledzenie wybuchów epidemii. Laboratoria odpowiadają za przestrzeganie stanowych i lokalnych regulacji dotyczących przekazywania materiałów klinicznych lub izolatów próbek dodatnich do krajowych laboratoriów organów opieki zdrowotnej. Środki ostrożności związane ze powiadamianiem instytucji zdrowia publicznego: Lokalne, stanowe i federalne przepisy w zakresie powiadamiania o chorobach podlegających zgłaszaniu są aktualizowane na bieżąco i obejmują szereg organizmów, które są istotne dla nadzoru i badania epidemii. 18,19 Ponadto Centers for Disease Control (Ośrodki Zwalczania Chorób, CDC) zalecają, aby w przypadku wykrycia patogenów chorób podlegających zgłaszaniu w ramach testu diagnostycznego niezależnego od hodowli (CIDT), laboratorium powinno umożliwić pozyskanie izolatu lub materiałów klinicznych do przedłożenia do odpowiedniego laboratorium zdrowia publicznego, aby wspierać je w wykrywaniu epidemii i w badaniach epidemiologicznych. Laboratoria mają obowiązek przestrzegania stanowych lub lokalnych regulacji i powinny konsultować się z lokalnymi lub stanowymi stacjami sanitarno-epidemiologicznymi w sprawie wytycznych dotyczących izolowania i przesyłania próbek klinicznych. Nie stosować przeterminowanych odczynników ani materiałów. 3

4 Nie używać zestawu, jeśli w chwili dostarczenia etykieta stanowiąca zamknięcie zewnętrznego pudełka jest uszkodzona. Nie używać odczynników, jeśli w chwili dostarczenia woreczki ochronne są otwarte lub uszkodzone. Nie używać odczynników, jeśli brak środka osuszającego lub jeśli jest on otwarty wewnątrz woreczka z odczynnikiem. Nie wyjmować środka osuszającego z woreczka z odczynnikiem. Po każdym użyciu odczynnika niezwłocznie szczelnie zamykać woreczki ochronne. Przed zamknięciem woreczka usunąć nadmiar powietrza. Chronić odczynniki przed wysoką temperaturą i wilgotnością. Przedłużone narażenie na działanie wilgotnego środowiska może wpłynąć na działanie produktu. Nie używać odczynników, jeśli folia jest przerwana lub uszkodzona. Nie mieszać odczynników z różnych woreczków, zestawów lub serii. Nie należy zamieniać ani ponownie używać korków, gdyż może to spowodować ich zanieczyszczenie i negatywnie wpłynąć na wyniki testu. Odpowiednie napełnienie płynami można sprawdzić na scalonych paskach z odczynnikami (należy dopilnować, by płyny znajdowały się na dnie probówek [patrz Rysunek 1]). Sprawdzić na scalonych paskach z odczynnikami, czy wszystkie końcówki pipet są obecne (patrz Rysunek 1). Zachować ostrożność przy używaniu roztworów chemicznych, ponieważ kody kreskowe dla mieszaniny wzorcowej i probówki ekstrakcyjnej mogą stać się nieczytelne. Dla odpowiedniego działania tego testu zasadnicze znaczenie ma zachowanie dobrych praktyk laboratoryjnych. Z uwagi na wysoką czułość analityczną tego testu należy dołożyć szczególnych starań w kierunku zachowania czystości wszystkich materiałów i odczynników. Jeśli w tym samym obszarze laboratorium wykonywane są inne testy PCR, należy dopilnować, aby panel pasożytów przewodu pokarmowego BD MAX, wszelkie dodatkowe odczynniki potrzebne do badania oraz system BD MAX nie uległy skażeniu. Należy bezwzględnie unikać skażenia odczynników mikroorganizmami i deoksyrybonukleazą (DNazą). Przed manipulacjami odczynnikami i kasetami konieczna jest zmiana rękawiczek. Aby uniknąć skażenia otoczenia amplikonami, nie otwierać kaset do PCR BD MAX po ich użyciu. Uszczelnienia kaset do PCR BD MAX zaprojektowane są tak, by zapobiegać skażeniu. Wykonanie badania przy użyciu panelu pasożytów przewodu pokarmowego BD MAX poza zalecanymi ramami czasowymi może dać nieprawidłowe wyniki. Oznaczenia niewykonane w określonych ramach czasowych należy powtórzyć. W zależności od wytycznych lub wymogów wynikających z przepisów lokalnych, stanowych, wojewódzkich lub federalnych lub zaleceń organizacji akredytujących można zbadać dodatkowe próbki kontrolne. Należy zawsze postępować z próbkami jak z materiałem zakaźnym, zgodnie z wytycznymi dotyczącymi bezpiecznych procedur laboratoryjnych, takimi jak opisane w dokumentach CLSI M29 10 oraz Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories. 11 Pracując z odczynnikami, zawsze nosić odzież ochronną i rękawiczki jednorazowe. Po wykonaniu oznaczenia dokładnie umyć ręce. Nie pipetować ustami. Nie palić papierosów, nie spożywać płynów, nie jeść ani nie żuć w strefach pracy z próbkami lub odczynnikami zestawu. Niewykorzystane odczynniki i odpady zutylizować zgodnie z przepisami miejscowymi, stanowymi, wojewódzkimi lub ogólnokrajowymi. Dodatkowe ostrzeżenia, środki ostrożności i procedury można znaleźć w podręczniku użytkownika systemu BD MAX. 12 PRZECHOWYWANIE I STABILNOŚĆ Pobrane próbki kału niekonserwowanego lub utrwalonego w 10% formalinie należy transportować w temperaturze 2 5 C. Chronić przed ich zamrożeniem i zbyt wysoką temperaturą. Próbki kału niekonserwowanego lub utrwalonego w 10% formalinie można przechowywać przed badaniem przez maksymalnie 120 godzin (5 dni) w temperaturze 2 8 C lub przez maksymalnie 48 godzin w temperaturze 2 25 C. Przed wstępnym ogrzewaniem lub po nim inokulowane probówki na bufor próbki można przechowywać przed badaniem lub ponownym badaniem przez maksymalnie łącznie: Czas Temperatura 120 godzin (5 dni) 2 8 C 48 godziny 2 25 C Składniki panelu pasożytów przewodu pokarmowego BD MAX pozostają stabilne w temperaturze 2 25 C do upływu podanego terminu ważności. Nie należy używać odczynników i elementów, których termin ważności upłynął. Mieszanina wzorcowa i probówki ekstrakcyjne panelu pasożytów przewodu pokarmowego BD MAX dostarczane są w zamkniętych woreczkach. Aby chronić produkt przed działaniem wilgoci, należy niezwłocznie zamknąć woreczek ponownie po jego otwarciu. Probówki z odczynnikami są stabilne przez okres do 14 dni w temperaturze 2 25 C po otwarciu i ponownym zamknięciu lub do upływu daty ważności, w zależności od tego, co nastąpi pierwsze. 4

5 INSTRUKCJE STOSOWANIA Pobieranie/transport próbek W celu uzyskania próbki materiału odpowiedniej jakości należy ściśle przestrzegać zasad dotyczących pobierania próbek. Próbki kału pobiera się zgodnie z następującą procedurą: Próbki niekonserwowane: Przenieść próbkę kału do suchego, czystego pojemnika. Unikać zanieczyszczenia wodą lub moczem. Oznaczyć pojemnik etykietą i przetransportować do laboratorium zgodnie ze standardową procedurą postępowania w instytucji (patrz część Przechowywanie i stabilność). Unikać mieszania próbki z papierem toaletowym, wodą lub mydłem. Próbki utrwalone w 10% formalinie: Przenieść próbkę kału do urządzenia do utrwalania zgodnie z instrukcją producenta. Unikać zanieczyszczenia wodą lub moczem. Oznaczyć pojemnik etykietą i przetransportować do laboratorium zgodnie ze standardową procedurą postępowania w instytucji (patrz część Przechowywanie i stabilność). Unikać mieszania próbki z papierem toaletowym, wodą lub mydłem. Przygotowanie próbek 1. Oznakować określającą próbkę etykietą probówkę na bufor próbki BD MAX (z bezbarwnym korkiem) z kodem kreskowym. Nie zasłaniać kodu kreskowego. 2. Próbki niekonserwowane lub konserwowane worteksować z dużą prędkością przez 15 sekund. Zachować ostrożność podczas otwierania zworteksowanych próbek, ponieważ materiał może przylgnąć do pokrywki pojemnika. 3. Zdjąć bezbarwny korek z probówki na bufor próbki. 4. Inokulacja probówki na bufor próbki BD MAX: a. Dla niekonserwowanych próbek kału: i. Wprowadzić jednorazową ezę do inokulacji o pojemności 10 μl, aż cała część z pętlą będzie zanurzona w próbce. Nie wprowadzać poza pętlę, ponieważ obecność dodatkowego kału na trzonie może spowodować przeciążenie reakcji PCR. ii. Wprowadzić napełnioną pętlę do probówki na bufor próbki i wprowadzić próbkę ruchem okrężnym. iii. Wyjąć i wyrzucić ezę. UWAGA: nie ma konieczności usuwania całej próbki z ezy. Wynikowy roztwór znajdujący się w probówce na bufor próbki powinien mieć kolor nie ciemniejszy niż herbaciany. b. Dla utrwalonych w 10% formalinie próbek kału: i. Wprowadzić jednorazową ezę do inokulacji o pojemności 10 μl, aż cała część z pętlą będzie zanurzona w próbce. Utworzenie trwałego pęcherzyka w ezie może być trudne w przypadku niektórych próbek. ii. Wprowadzić napełnioną pętlę do probówki na bufor próbki i wprowadzić próbkę ruchem okrężnym. iii. Wyjąć i wyrzucić ezę. 5. Zamknąć inokulowaną probówkę na bufor próbki niebieskim korkiem z przegrodą. 6. Przygotować ewentualne dodatkowe próbki do badania, powtarzając kroki od 1 do 5, a następnie przejść do ogrzewania w cieplarce do wstępnego ogrzewania BD. Ogrzewanie w cieplarce do wstępnego ogrzewania BD (Instrukcję obsługi można znaleźć w podręczniku użytkownika cieplarki do wstępnego ogrzewania BD Pre-warm Heater 13 ). 1. W panelu Run (Cykl)>Worklist (Lista robocza) wybrać opcję <BD MAX ENT PARA 53>. 2. Zaznaczyć numer serii dla zestawu BD MAX Enteric Parasite (do celów śledzenia serii); należy pamiętać, że informacje dotyczące LOT (serii) zestawu należy zeskanować oddzielnie przed wyszukaniem ich na liście roboczej oczekujących testów. UWAGA: upewnić się, że w menu Configuration (Konfiguracja) > System włączono śledzenie numeru serii. 3. Wprowadzić kod kreskowy z każdej probówki na bufor próbki panelu pasożytów przewodu pokarmowego BD MAX w polu probówki na próbkę, korzystając z czytnika kodów kreskowych lub ręcznie, wraz z numerem dostępu pacjenta. 4. Oczekująca lista robocza zostanie teraz zaktualizowana i wyświetlone zostanie pole wyboru dla zaprogramowania etapu wstępnego ogrzewania. 5. Zaprogramować próbkę, zaznaczając pole na liście roboczej. 6. Umieścić probówkę na bufor próbki panelu pasożytów przewodu pokarmowego BD MAX (zawierającą próbkę) w cieplarce do wstępnego ogrzewania BD. Stacja mieści maksymalnie do 24 probówek na bufor próbki. 7. Zamknąć pokrywę cieplarki do wstępnego ogrzewania BD i wybrać Start Pre-warm (Rozpocznij wstępne ogrzewanie) na panelu Run (Cykl) > Worklist (Lista robocza). Rozpocznie się właściwy dla panelu pasożytów przewodu pokarmowego BD MAX cykl ogrzewania i schładzania. UWAGA: potwierdzić, że probówki fizycznie umieszczono w statywie cieplarki BD oraz że statyw załadowano do cieplarki do wstępnego ogrzewania BD, następnie wybrać OK w odpowiedzi na komunikat Start Pre-warm (Uruchom wstępne ogrzewanie). 8. Czas ukończenia cyklu wstępnego ogrzewania zostanie wyświetlony na ekranie Status, a na ekranie Listy roboczej zostanie wyświetlony komunikat wstępnego ogrzewania In Progress (W toku). 9. Po zakończeniu wstępnego ogrzewania na ekranie listy roboczej wybrana próbka/test będą oznaczone jako Pre-warm complete (Wstępne ogrzewanie zakończone). 10. Po ukończeniu z powodzeniem etapu wstępnego ogrzewania wyjąć z cieplarki do wstępnego ogrzewania BD probówkę na bufor próbki i krótko worteksować każdą probówkę na bufor próbki przez 5 sekund lub, alternatywnie, umieścić wszystkie probówki na bufor próbki w wytrząsarce na wiele probówek i worteksować przez minutę. 11. Przejść do części Obsługa systemu BD MAX, aby ustawić statyw systemu BD MAX. 5

6 UWAGA: w przypadku niepowodzenia etapu wstępnego ogrzewania wyświetlony zostanie status licznika systemu BD MAX Failed / Cooling (Niepowodzenie / Chłodzenie). Przed rozpoczęciem testu w systemie BD MAX może być konieczne powtórzenie wstępnego ogrzewania. Jeśli wstępne ogrzewanie zakończy się niepowodzeniem, należy sprawdzić komunikaty na ekranie listy roboczej. Jeśli status wstępnego ogrzewania próbek to Failed (Niepowodzenie), należy powtórzyć etap wstępnego ogrzewania. Jeśli status wstępnego ogrzewania próbek to Complete (Zakończony), można kontynuować badanie probówek za pomocą panelu pasożytów przewodu pokarmowego BD MAX. UWAGA: panel pasożytów przewodu pokarmowego BD MAX można wykonać dopiero po ukończeniu z powodzeniem etapu wstępnego ogrzewania opisanego powyżej. Próbki, dla których cykl wstępnego ogrzewania zakończył się powodzeniem, nie wymagają ponownego ogrzania w sytuacji, gdy trzeba powtórzyć test (patrz część Przechowywanie i Stabilność). UWAGA: w przypadku laboratoriów wykorzystujących więcej niż jeden System BD MAX oraz cieplarkę do wstępnego ogrzewania BD próbki trzeba testować lub testować ponownie w tym samym systemie BD MAX, na którym przeprowadzono etap wstępnego ogrzewania. UWAGA: po zakończeniu etapu wstępnego ogrzewania należy przeprowadzić badanie z użyciem panelu pasożytów przewodu pokarmowego BD MAX w czasie podanym w części Przechowywanie i stabilność. W razie konieczności ponownego wykonania testu należy ponownie wykonać worteksowanie próbek. Obsługa systemu BD MAX UWAGA: szczegółowe instrukcje znajdują się w podręczniku użytkownika systemu BD MAX 12, w części Obsługa. UWAGA: jedna (1) probówka na bufor próbki, jeden (1) korek z przegrodą, jedna (1) probówka z mieszaniną wzorcową (A7), jedna (1) probówka ekstrakcyjna (B2) oraz jeden (1) scalony pasek z odczynnikami to materiały wymagane do przetestowania każdej próbki i każdej zewnętrznej próbki kontrolnej. Wyjąć wymagane materiały BD MAX w odpowiedniej liczbie z woreczków ochronnych lub pudełek. Z otwartych woreczków z mieszaniną wzorcową lub probówkami ekstrakcyjnymi w celu ich przechowywania usunąć nadmiar powietrza i zamknąć szczelnie woreczek, upewniając się, że w woreczku znajduje się opakowanie ze środkiem osuszającym. 1. Włączyć system BD MAX (jeśli nie jest już włączony) i zalogować się, wprowadzając <user name> (nazwę użytkownika) i <password> (hasło). 2. Przed manipulacjami odczynnikami i kasetami konieczna jest zmiana rękawiczek. 3. Wyjąć pożądaną liczbę scalonych pasków z odczynnikami z zestawu panelu pasożytów przewodu pokarmowego BD MAX. Delikatnie postukać każdym scalonym paskiem z odczynnikami o twardą powierzchnię, tak aby wszystkie porcje płynu znalazły się na dnie probówek. 4. Wyjąć pożądaną liczbę probówek ekstrakcyjnych i probówek z mieszaniną wzorcową z woreczków zabezpieczających. Usunąć nadmiar powietrza i zamknąć szczelnie woreczki. 5. Dla każdej badanej próbki umieścić 1 (jeden) scalony pasek z odczynnikami w statywie systemu BD MAX, zaczynając od pozycji 1 na statywie A. 6. Wcisnąć 1 (jedną) probówkę ekstrakcyjną (biała folia) do każdego scalonego paska z odczynnikami w pozycję 1, jak pokazano na Rysunku Wcisnąć 1 (jedną) probówkę z mieszaniną wzorcową (zielona folia) do każdego scalonego paska z odczynnikami w pozycję 2, jak pokazano na Rysunku 1. Rysunek 1: Wcisnąć probówki ekstrakcyjne panelu pasożytów przewodu pokarmowego BD MAX i probówki z mieszaniną wzorcową do scalonego paska z odczynnikami. 8. Umieścić probówki na bufor próbki w statywach systemu BD MAX odpowiadających scalonym paskom z odczynnikami zebranym w krokach 5 do 7. UWAGA: umieścić probówki na bufor próbki w statywie na próbki etykietą z kodem kreskowym 1D na zewnątrz (ułatwia to skanowanie probówek na bufor próbki podczas rejestracji próbki). 6

7 9. Umieścić wymaganą liczbę kaset do PCR BD MAX w systemie BD MAX (patrz Rysunek 2): Każda kaseta do mieści maksymalnie 24 próbki. System BD MAX automatycznie wybierze pozycję i rząd na kasecie do PCR BD MAX dla każdego cyklu. Kaset do PCR BD MAX można używać wielokrotnie, do wykorzystania wszystkich ścieżek. Aby zmaksymalizować wykorzystanie kaset do PCR BD MAX przy użyciu trybu 2000 Sample Mode, wybrać Run Wizard (Uruchom kreator) z karty Worklist (Lista robocza) do zadań dla ścieżki. Więcej informacji można znaleźć w podręczniku użytkownika systemu BD MAX. 12 Rysunek 2: Wkładanie kaset do PCR BD MAX 10. Umieścić statywy w systemie BD MAX (patrz Rysunek 3). Strona A Strona B Rysunek 3: Wkładanie statywów do systemu BD MAX. 11. Zamknąć pokrywę systemu BD MAX i kliknąć <Start>, aby rozpocząć przetwarzanie. 12. Pod koniec cyklu można sprawdzić wyniki od razu lub przechowywać probówki na bufor próbki w temperaturze 2 8 C do 120 dni (5 dni) LUB w temperaturze 2 25 C przez maksymalnie 48 godzin do sprawdzenia wyników. UWAGA: w razie uszkodzenia korka z przegrodą podczas cyklu należy wymienić go na nowy przed odłożeniem próbki do przechowywania. UWAGA: przygotowane probówki na bufor próbki panelu pasożytów przewodu pokarmowego BD MAX można przechowywać w temperaturze 2 8 C przez maksymalnie 120 godzin (5 dni) LUB w temperaturze 2 25 C przez maksymalnie 48 godzin po umieszczeniu próbki w probówce na bufor próbki. W razie uzyskania wyniku nieokreślonego (IND), nierozstrzygającego (UNR) lub niepełnego (INC) lub w razie niepowodzenia testu zewnętrznej próbki kontrolnej test materiału z probówki na bufor próbki musi być powtórzony w tych ramach czasowych (patrz część Procedura powtarzania testu). 7

8 KONTROLA JAKOŚCI Procedury kontroli jakości służą do monitorowania działania oznaczenia. Laboratoria ustalają liczbę, rodzaj i częstotliwość wykonywania testów materiałów kontrolnych zgodnie z wytycznymi lub wymogami przepisów lokalnych, wojewódzkich, stanowych, federalnych lub krajowych lub organizacji akredytujących, w celu monitorowania skuteczności całej procedury analitycznej. W zakresie ogólnych wytycznych dotyczących kontroli jakości użytkownik może odnieść się do dokumentów CLSI MM3 14 i EP Materiały do zewnętrznych próbek kontrolnych nie są dostarczane przez BD. Zewnętrzne kontrole dodatnie i ujemne nie są wykorzystywane przez oprogramowanie systemu BD MAX do celów interpretacji wyniku badania próbki. Zewnętrzne próbki kontrolne traktowane są tak, jak próbki pochodzące od pacjentów. W kwestii interpretacji wyników badania zewnętrznych próbek kontrolnych należy odnieść się do tabeli w części Interpretacja wyników. 2. W każdym laboratorium należy co najmniej raz dziennie wykonywać badanie 1 (jednej) zewnętrznej próbki kontrolnej dodatniej i 1 (jednej) zewnętrznej próbki kontrolnej ujemnej, do momentu uzyskania odpowiedniej walidacji procesu wykonywanego przy użyciu systemu BD MAX. Częstotliwość testów kontrolnych można zmniejszyć zgodnie z mającymi zastosowanie przepisami. 3. Celem badania zewnętrznych próbek kontrolnych dodatnich jest monitorowanie pod kątem znacząco nieprawidłowego działania odczynników. Celem badania zewnętrznych próbek kontrolnych ujemnych jest wykrywanie skażenia odczynników lub otoczenia docelowymi kwasami nukleinowymi (lub ich przeniesienia na próbkę). 4. Zaleca się stosowanie różnych rodzajów zewnętrznych próbek kontrolnych, aby umożliwić użytkownikowi wybranie najbardziej odpowiednich dla programu kontroli jakości w danym laboratorium. a. Zewnętrzna kontrola ujemna: Nieinokulowana probówka na bufor próbki panelu pasożytów przewodu pokarmowego BD MAX. Firma BD zaleca przygotowanie zewnętrznej próbki kontrolnej ujemnej przed zewnętrzną próbką kontrolną dodatnią, aby zmniejszyć ryzyko skażenia podczas przygotowywania próbki kontrolnej. b. Zewnętrzna kontrola dodatnia: Ze względu na brak dostępności w sprzedaży oocyst/cyst organizmów docelowych oraz uciążliwe metody hodowli dla postaci trofozoitów organizmów docelowych, firma BD zaleca preparaty genomowego DNA podane w Tabeli 1 poniżej. Tabela 1: Dostępne w sprzedaży szczepy do zewnętrznej kontroli dodatniej Szczep do zewnętrznej kontroli dodatniej Giardia intestinalis (Lambl) (ATCC 30888D) Cryptosporidium parvum (ATCC PRA-67D) Entamoeba histolytica (ATCC 30459D) Stężenie genomowego DNA 2475 pg/ml pg/ml 150 pg/ml UWAGA: jeśli oznaczone ilościowo roztwory genomowego DNA z kolekcji są przechowywane zgodnie z zaleceniami producenta, można je wykorzystać do przygotowania wielu mieszanin, zgodnie z opisem poniżej. (1) Jeśli produkt jest dostarczany w postaci liofilizowanej, należy nawodnić zawartość fiolki zgodnie z instrukcją producenta, stosując 50 µl buforu 1X TE Buffer (10 mm Tris-HCl, 1 mm EDTA, ph=8,0, woda do biologii molekularnej). (2) Oznaczyć ilościowo każdy preparat DNA metodą spektrofotometryczną, uzywając absorbancji przy 260 nm. (3) Przygotować mieszaninę trzech preparatów DNA przez seryjne rozcieńczenie w buforze 1X TE, zgodnie z końcowymi stężeniami genomowego DNA wymienionymi w powyższej tabeli. (4) Wymieszać dobrze roztwór przez worteksowanie i przenieść skalibrowaną pipetą 10 µl roztworu do odpowiedniej probówki na bufor próbki panelu pasożytów przewodu pokarmowego BD MAX. Genomowe DNA każdego docelowego organizmu będzie obecne w swoistym stężeniu 5X LoD w probówce na bufor próbki. (5) Zamknąć probówkę na bufor próbki niebieskim korkiem z przegrodą i worteksować przez 5 sekund. 5. Wszystkie zewnętrzne próbki kontrolne powinny dawać oczekiwane wyniki (dodatnie dla zewnętrznej kontroli dodatniej, ujemne dla zewnętrznej kontroli ujemnej) i nie powinny wystąpić niepowodzenia testu próbki zewnętrznej (wyniki nierozstrzygające, nieokreślone lub niepełne). 6. Jeśli dla zewnętrznej kontroli ujemnej wynik testu okaże się dodatni, oznacza to nieprawidłowości lub skażenie przy przygotowywaniu próbki. Należy sprawdzić technikę manipulacji próbką tak, by uniknąć pomyłek i skażenia. Jeśli dla zewnętrznej dodatniej próbki kontrolnej wynik testu okaże się ujemny, oznacza to nieprawidłowości przy manipulacji lub przygotowaniu próbki, lub błąd odczynnika. Należy sprawdzić technikę manipulacji próbką i jej przygotowania. 7. Nierozstrzygający, nieokreślony lub niepełny wynik testu dla zewnętrznej próbki kontrolnej wskazuje na nieprawidłowości w odczynnikach lub w działaniu systemu BD MAX. Sprawdzić, czy na monitorze systemu BD MAX nie ma komunikatów o błędach. Informacje dotyczące interpretacji kodów ostrzeżeń i błędów można znaleźć w części Podsumowanie błędów systemowych podręcznika użytkownika systemu BD MAX 12. Jeśli problem powtarza się, należy użyć odczynników z nieotwartego woreczka lub nowego zestawu testowego. 8

9 8. Każda probówka ekstrakcyjna zawiera próbkę kontrolną będącą plazmidem zawierającym syntetyczną sekwencję DNA docelowego. Próbkę kontrolną poddaje się ekstrakcji, wymywaniu i amplifikacji wraz z DNA obecnym w przetwarzanej próbce, co ma zapewnić przewidywalność wyników oznaczenia. Próbka kontrolna służy do monitorowania skuteczności wychwytywania DNA, jego płukania i wymywania podczas przetwarzania próbki, jak również skuteczności amplifikacji i wykrywania DNA podczas analizy PCR. Jeśli wynik badania dla próbki kontrolnej nie spełni kryteriów dopuszczalności, wynik badania dla próbki zostanie podany jako nierozstrzygający; jednak wyniki dodatnie (POS) oznaczenia zostaną również podane, a ponadto żadna z próbek nie dostanie kwalifikacji ujemnej (NEG). Wynik nierozstrzygający wskazuje na obecność inhibitorów w próbce lub nieprawidłowe działanie odczynnika. Testy dla wszelkich próbek, dla których podano wyniki nierozstrzygające, należy powtórzyć zgodnie z Procedurą powtarzania testu podaną poniżej. INTERPRETACJA WYNIKÓW Wyniki są dostępne na karcie <Results> (Wyniki) w okienku <Results> na monitorze systemu BD MAX. Oprogramowanie BD MAX automatycznie interpretuje wyniki testu. Wyniki podawane są dla każdego analitu oraz dla próbki kontrolnej. Wynik testu może być NEG (negative ujemny), POS (positive dodatni) lub UNR (unresolved nierozstrzygający) w zależności od statusu substancji docelowej po amplifikacji i próbki kontrolnej. Wyniki IND (indeterminate nieokreślony) lub INC (incomplete niepełny) związane są z nieprawidłowym działaniem systemu BD MAX. W przypadku częściowego wyniku UNR, gdzie dla jednej lub większej liczby próbek uzyskano wynik POS, a dla pozostałych wynik UNR, nie będą przypisywane wyniki NEG. Tabela 2: Interpretacja wyników panelu pasożytów przewodu pokarmowego BD MAX Podany wynik oznaczenia Glamb POS Glamb NEG Glamb UNR Crypto POS Crypto NEG Crypto UNR Ehist POS Ehist NEG Ehist UNR IND INC Interpretacja wyniku a Wykryto DNA Giardia lamblia Nie wykryto DNA Giardia lamblia Wynik nierozstrzygający obecność inhibitorów w próbce lub nieprawidłowe działanie odczynnika, brak amplifikacji organizmów docelowych lub próbki kontrolnej Wykryto DNA Cryptosporidium parvum lub hominis Nie wykryto DNA Cryptosporidium parvum ani hominis Wynik nierozstrzygający obecność inhibitorów w próbce lub nieprawidłowe działanie odczynnika, brak amplifikacji organizmów docelowych lub próbki kontrolnej Wykryto DNA Entamoeba histolytica Nie wykryto DNA Entamoeba histolytica Wynik nierozstrzygający obecność inhibitorów w próbce lub nieprawidłowe działanie odczynnika, brak amplifikacji organizmów docelowych lub próbki kontrolnej Wynik nieokreślony w związku z nieprawidłowym działaniem systemu BD MAX (z kodami ostrzeżeń lub błędów b ) Niepełny cykl (z kodami ostrzeżeń lub błędów b ) a Wyników panelu pasożytów przewodu pokarmowego BD MAX można użyć do określenia poziomu zachowywanych środków ostrożności zgodnie z programami i praktyką w danej instytucji. b Informacje dotyczące interpretacji kodów ostrzeżeń i błędów można znaleźć w części Rozwiązywanie problemów podręcznika użytkownika systemu BD MAX. 12 PROCEDURA POWTARZANIA TESTU UWAGA: w probówce na bufor próbki znajduje się objętość wystarczająca na wykonanie jednego powtórzenia testu. Jeśli probówki na bufor próbki były przechowywane w temperaturze 2 25 C, ponowne badanie należy wykonać w ciągu 48 godzin po pierwotnej inokulacji probówki na bufor próbki i jej wstępnym ogrzaniu. Jeśli jednak probówki na bufor próbki były przechowywane w temperaturze 2 8 C, ponowne badanie należy wykonać w ciągu 120 godzin (5 dni). Pozostałą próbkę kału można również wykorzystać do powtórzenia badania w ciągu 5 dni od pobrania, jeśli była przechowywana w temperaturze 2 8 C, lub 48 godzin, jeśli była przechowywana w temperaturze 2 25 C. UWAGA: nowe próbki można przetestować w tym samym cyklu, co próbki badane ponownie. Wynik nierozstrzygający Wynik nierozstrzygający uzyskuje się w przypadku, gdy obecność inhibitora w próbce lub nieprawidłowe działanie odczynnika uniemożliwia odpowiednią amplifikację substancji docelowej lub próbki kontrolnej. Jeśli substancja w próbce kontrolnej nie ulegnie amplifikacji, dla próbki podany zostanie wynik UNR; jednak wyniki dodatnie (POS) oznaczenia zostaną również podane, a dla żadnych organizmów docelowych nie zostanie uzyskany wynik NEG. System BD MAX podaje wynik testu oddzielnie dla każdej substancji docelowej; wynik UNR może pojawić się dla jednej lub więcej substancji docelowych panelu pasożytów przewodu pokarmowego BD MAX. W przypadku pełnego UNR, gdy dla wszystkich próbek odnotowano wynik nierozstrzygający, konieczne jest powtórzenie testu. W przypadku częściowego wyniku UNR, gdzie dla jednej lub większej liczby organizmów docelowych uzyskano wynik POS, a dla pozostałych wynik UNR, zaleca się powtórzenie testu zgodnie z opisem powyżej. W rzadkich przypadkach można uzyskać rozbieżne wyniki po wykonaniu ponownego testu dla próbek, dla których odnotowano początkowy wynik POS. Należy przestrzegać odpowiednich procedur zgodnie z obowiązującymi procedurami laboratoryjnymi. 9

10 Testy dla próbek można powtórzyć przy użyciu materiału pozostałego w odpowiednich probówkach na bufor próbki w czasie określonym powyżej. Próbki należy worteksować przez 1 (jedną) minutę i wykonać test ponownie, postępując zgodnie z częścią Obsługa systemu BD MAX. Pozostałą próbkę kału można również wykorzystać do powtórzenia testu przy użyciu nowej probówki na bufor próbki w czasie określonym powyżej. Należy wykonać test ponownie, zaczynając od części Przygotowanie próbek. Wynik nieokreślony Wynik nieokreślony można uzyskać w przypadku nieprawidłowego działania systemu. Testy dla próbek można powtórzyć przy użyciu materiału pozostałego w odpowiednich probówkach na bufor próbki w czasie określonym powyżej. Próbki należy worteksować przez 1 (jedną) minutę i wykonać test ponownie, postępując zgodnie z częścią Obsługa systemu BD MAX. Pozostałą próbkę kału, przy użyciu nowej probówki na bufor próbki, można również wykorzystać do powtórzenia testu w czasie określonym powyżej. Należy wykonać test ponownie, zaczynając od części Przygotowanie próbek. Informacje dotyczące interpretacji kodów ostrzeżeń i błędów można znaleźć w podręczniku użytkownika systemu BD MAX, 12 w części Rozwiązywanie problemów. Wynik niepełny Wynik niepełny można uzyskać w przypadku, gdy procedura przygotowania próbki lub PCR nie zakończą się. Testy dla próbek można powtórzyć przy użyciu materiału pozostałego w odpowiednich probówkach na bufor próbki w dozwolonych ramach czasowych określonych powyżej. Próbki należy worteksować przez 1 (jedną) minutę i wykonać test ponownie, zaczynając od części Obsługa systemu BD MAX. Pozostałą próbkę kału można również wykorzystać do powtórzenia testu przy użyciu nowej probówki na bufor próbki w czasie określonym powyżej. Należy wykonać test ponownie, zaczynając od części Przygotowanie próbek. Informacje dotyczące interpretacji kodów ostrzeżeń i błędów można znaleźć w podręczniku użytkownika systemu BD MAX, 12 w części Rozwiązywanie problemów. Niepowodzenie testu zewnętrznej próbki kontrolnej Wyniki testu dla zewnętrznej próbki kontrolnej powinny być zgodne z oczekiwanymi. Jeśli badanie dla próbek należy powtórzyć z powodu nieprawidłowego wyniku testu próbki zewnętrznej, należy wykonać ponowne testy próbek, korzystając z materiału w probówce na bufor próbki oraz świeżo przygotowanych zewnętrznych próbek kontrolnych w wyżej zdefiniowanych dozwolonych ramach czasowych. Próbki należy worteksować przez 1 (jedną) minutę i wykonać test ponownie, zaczynając od części Obsługa systemu BD MAX. Błąd wstępnego ogrzewania W przypadku błędu wstępnego ogrzewania probówki na bufor próbki należy pozostawić w stacji wstępnego ogrzewania przez cały 30-minutowy cykl schładzania. Po zakończeniu cyklu schładzania ponownie uruchomić procedurę wstępnego ogrzewania, używając tych samych probówek na bufor próbki, jak opisano w części Operation (Działanie) w instrukcji BD Pre-warm Heater (cieplarki do wstępnego ogrzewania), pod warunkiem, że probówki te spełniają ograniczenia czasowe zdefiniowane w sekcji Przechowywanie i stabilność. Jeśli probówki przekraczają limit przechowywania i stabilności zdefiniowany dla probówek na bufor próbki, przygotować nowe probówki na bufor próbki z próbką, zaczynając od etapów przygotowania próbki. OGRANICZENIA PROCEDURY Produkt jest przeznaczony do używania tylko z niekonserwowanymi lub utrwalonymi w 10% formalinie próbkami kału ludzkiego. Panel panel pasożytów przewodu pokarmowego BD MAX nie jest zwalidowany do badania próbek pochodzących z wymazu z odbytu lub próbek kału zanieczyszczonych barem. Przyczyną uzyskania błędnych wyników może być nieodpowiednia technika pobrania próbki lub manipulacji nią, nieprawidłowe przechowywanie, błąd techniczny, pomylenie próbek lub liczba organizmów w próbce poniżej czułości analitycznej testu. Jeśli w panelu pasożytów przewodu pokarmowego BD MAX uzyskany zostanie wynik IND, INC lub UNR, test należy powtórzyć. Dodatni wynik w panelu pasożytów przewodu pokarmowego BD MAX nie oznacza obecności organizmów żywych. Wskazuje on jednak na obecność DNA Giardia lamblia, Cryptosporidium parvum, Cryptosporidium hominis lub Entamoeba histolytica, umożliwiając identyfikację organizmów wchodzących w skład panelu panelu pasożytów przewodu pokarmowego BD MAX. Mutacje lub polimorfizm w regionie wiążącym primer lub sondę mogą wpłynąć na wykrywanie organizmów docelowych, co może spowodować fałszywie ujemny wynik badania w panelu panelu pasożytów przewodu pokarmowego BD MAX. Podobnie jak w przypadku wszystkich testów diagnostycznych in vitro opartych na PCR, przy bardzo niskim stężeniu substancji docelowej poniżej czułości analitycznej oznaczenia substancja może być wykryta, ale wyniki mogą nie być powtarzalne. Fałszywie ujemne wyniki mogą wystąpić z powodu utraty kwasów nukleinowych wskutek nieodpowiedniego sposobu pobrania, transportu lub przechowywania próbek lub niewystarczającej lizy organizmów. Test zawiera próbkę kontrolną mającą na celu wspomaganie identyfikacji próbek zawierających inhibitory amplifikacji PCR. Badanie próbki kontrolnej nie pozwala na ustalenie, czy doszło do utraty kwasów nukleinowych wskutek nieodpowiedniej techniki pobrania, transportu lub przechowywania próbek, czy też komórki nie uległy lizie w odpowiednim stopniu. Wyniki panelu pasożytów przewodu pokarmowego BD MAX powinny pełnić rolę pomocniczą względem obserwacji klinicznych i innych danych dostępnych lekarzowi. Podobnie jak w przypadku wszystkich testów diagnostycznych in vitro, przewidywalne wartości dodatnie i ujemne zależą w dużym stopniu od częstości występowania. Skuteczność stosowania panelu pasożytów przewodu pokarmowego BD MAX może być różna w zależności od częstości występowania i badanej populacji. Probówki na bufor próbki BD MAX nie są przeznaczone do stosowania podczas badań morfologicznych organizmów. Badanie morfologiczne lub barwienie należy wykonać z użyciem oryginalnej próbki. Działania tego testu nie oceniano w monitorowaniu leczenia zakażenia Giardia lamblia, Cryptosporidium parvum, Cryptosporidium hominis ani Entamoeba histolytica. 10

11 Panel pasożytów przewodu pokarmowego BD MAX przeznaczony jest do wykrywania DNA C. hominis i C. parvum bez rozróżniania tych dwóch gatunków. Ten test nie jest przeznaczony do wykrywania DNA innych gatunków Cryptosporidium. Test ma charakter jakościowy i nie daje informacji ilościowych ani nie wskazuje na ilość obecnych organizmów. Nie oceniono skuteczności testu w przypadku osób z obniżoną odpornością ani osób, u których nie występują objawy zakażenia układu pokarmowego. Efekt substancji zakłócających oceniono tylko dla substancji wymienionych w części Substancje zakłócające. Nie oceniono potencjalnie zakłócającego wpływu substancji innych niż wymienione w części Substancje zakłócające. Nie oceniono reaktywności krzyżowej z organizmami innymi niż wymienione poniżej w części Swoistość analityczna. CHARAKTERYSTYKA WYDAJNOŚCIOWA Charakterystykę kliniczną działania panelu pasożytów przewodu pokarmowego BD MAX określono w drodze wieloośrodkowego badania klinicznego. W badaniu wzięło udział łącznie 5 (pięć) ośrodków klinicznych, w których próbki pobierano w ramach standardowej opieki medycznej, włączano do badania i testowano przy użyciu panelu pasożytów przewodu pokarmowego BD MAX. W 7 (siedmiu) dodatkowych ośrodkach pobierania próbek pozyskano próbki do oceny w laboratorium centralnym. Próbki pobrano od dzieci lub dorosłych pacjentów z podejrzeniem ostrego zapalenia żołądka i jelit lub zapalenia okrężnicy, u których lekarz zlecił badanie w kierunku obecności pasożytów docelowych. W przypadku próbek prospektywnych wykorzystano standaryzowaną metodę referencyjną (badanie mikroskopowe DFA i barwienie trichromem) w celu identyfikacji pasożytów jelitowych, a następnie naprzemiennie reakcję PCR i sekwencjonowanie dwukierunkowe, aby uzyskać złożoną metodę referencyjną. Ponieważ na podstawie badania DNA można zidentyfikować Cryptosporidium na poziomie rodzaju, próbki o dodatnim wyniku DFA zidentyfikowane podczas sekwencjowania dwukierunkowego jako inne niż C. hominis lub C. parvum uznano za ujemne względem metody referencyjnej. Referencyjną metodę testu zastosowano zgodnie z odpowiednią ulotką dołączoną do opakowania poszczególnych produktów. W przypadku próbek uzyskanych retrospektywnie wyniki wcześniej przeprowadzonych badań zarejestrowano w miejscu pobrania i nie wykonywano badania próbek ponownie. Wyniki wcześniej przeprowadzonych badań potwierdzono z wykorzystaniem alternatywnego badania PCR oraz dwukierunkowego sekwencjonowania w ramach złożonej metody referencyjnej w celu potwierdzenia obecności docelowego DNA. Do oceny klinicznej włączono ogółem 2204 próbek prospektywnych (1058 utrwalonych w 10% formalinie, 251 niekonserwowanych i 18 niespełniających wymogów) oraz 411 próbek retrospektywnych (148 utrwalonych w 10% formalinie, 251 niekonserwowanych i 12 niespełniających wymogów). W Tabeli 3 opisano liczbę zgodnych próbek włączonych według wieku pacjenta i rodzaju próbki. Łącznie 128 próbek uzyskanych retrospektywnie nie uwzględniono w poniższych wyliczeniach skuteczności, ponieważ wcześniej uzyskanych wyników nie potwierdzono z wykorzystaniem alternatywnej metody PCR oraz sekwencjonowania dwukierunkowego. W Tabelach od 4 do 7 opisano charakterystykę działania panelu pasożytów przewodu pokarmowego BD MAX, którą obserwowano w trakcie badania klinicznego. Tabela 3: Zestawienie włączonych do badania, spełniających kryteria próbek według grupy wiekowej i rodzaju próbki Grupa wiekowa Typ próbki Formalina 10% Próbki niekonserwowane Połączone 0 1 miesiąc Od 1 miesiąca do 2 lat lat lat lat Ponad 21 lat Nieznana Łącznie