ŚLĄSKI UNIWERSYTET MEDYCZNY AUTOREFERAT

Załącznik nr 2 do wniosku o przeprowadzenie postępowania habilitacyjnego ŚLĄSKI UNIWERSYTET MEDYCZNY Zakład Biochemii i Genetyki Medycznej AUTOREFERAT do wniosku o przeprowadzenie postępowania habilitacyjnego Oddziaływania typu gen-tradycyjne czynniki ryzyka w kształtowaniu ryzyka choroby niedokrwiennej serca Paweł Niemiec

AUTOREFERAT 1. Imię i Nazwisko: Paweł Niemiec 2. Posiadane dyplomy, stopnie naukowe/ artystyczne z podaniem nazwy, miejsca i roku ich uzyskania oraz tytułu rozprawy doktorskiej. - tytuł magistra biologii, uzyskany na podstawie pracy magisterskiej pt.: Ocena wrażliwości komórek nowotworowych na indukcję apoptozy przez wybrane leki przeciwnowotworowe, wykonanej w Instytucie Onkologii im Marii Skłodowskiej-Curie w Gliwicach. Wydział Biologii i Ochrony Środowiska w Katowicach. Uniwersytet Śląski, Katowice 2000 - stopień naukowy doktora w dziedzinie nauk medycznych, w dyscyplinie biologia medyczna, uzyskany na podstawie rozprawy doktorskiej pt.: Warianty polimorficzne genu CYBA i genów dla białek układu RAS wśród pacjentów z chorobą niedokrwienną serca. Wydział Farmaceutyczny z Oddziałem Medycyny Laboratoryjnej w Sosnowcu. Śląska Akademia Medyczna, Sosnowiec 2006 3. Informacje o dotychczasowym zatrudnieniu w jednostkach naukowych/ artystycznych. Jestem biologiem. Studiowałem na Wydziale Biologii i Ochrony Środowiska w Katowicach (Uniwersytet Śląski). Ukończyłem studia w roku 2000. W trakcie studiów, w latach 1997-2000, podjąłem wolontariat w Zakładzie Radiobiologii Doświadczalnej i Klinicznej, Instytutu Onkologii im Marii Skłodowskiej-Curie w Gliwicach. W tym czasie wykonywałem część eksperymentalną mojej pracy magisterskiej, poświęconej indukcji apoptozy w komórkach nowotworowych, jak też uczestniczyłem czynnie w innych pracach badawczych, prowadzonych w Zakładzie. Po ukończeniu studiów, w roku 2000, zostałem zatrudniony na stanowisku asystenta w Zakładzie Chemii i Biochemii Ogólnej, Wydziału Lekarskiego, Śląskiej Akademii Medycznej w Katowicach. W 2003 roku Zakład Chemii i Biochemii Ogólnej został włączony do jednostek Wydziału Opieki Zdrowotnej i zmienił nazwę na Katedrę i Zakład Biochemii i Genetyki Medycznej. W latach 2000-2006, oprócz pracy dydaktycznej ze studentami Wydziałów Lekarskiego (przedmiot chemia medyczna) i Opieki Zdrowotnej (przedmioty biologia medyczna, podstawy genetyki dla studentów fizjoterapii, przedmioty genetyka, biochemia dla studentów fizjoterapii, pielęgniarstwa i połoźnictwa), uczestniczyłem czynnie w pracach badawczych jednostki, poświęconych genetycznemu podłożu miażdżycy. Część wyników badań, przeprowadzonych w tamtym okresie, wykorzystałem w eksperymentalnej części swojej pracy doktoranckiej, obronionej w roku 2006. W pierwszym okresie mojej 1

pracy w Śląskim Uniwersytecie Medycznym (do roku 2007 Śląskiej Akademii Medycznej), przed uzyskaniem stopnia doktora, uczestniczyłem także w pracach nad dwoma podręcznikami dla studentów kierunków medycznych i pokrewnych. Od roku 2008-nadal, pracuję na stanowisku adiunkta w Zakładzie Biochemii i Genetyki Medycznej, Wydziału Opieki Zdrowotnej, obecnie Nauk o Zdrowiu, Śląskiego Uniwersytetu Medycznego w Katowicach. Jestem promotorem 12-tu prac magisterskich i recenzentem 17-tu prac, obronionych w latach 2009-2015, o tematyce pokrywającej się w dużej mierze z moimi zainteresowaniami badawczymi. W latach 2010-2014 sprawowałem również opiekę naukową nad doktorantem w przygotowaniu rozprawy doktorskiej, wykonywanej w Zakładzie Biochemii i Genetyki Medycznej, SUM. Wynikiem mojej dotychczasowej pracy zawodowej jest współautorstwo 27 eksperymentalnych prac oryginalnych, w tym 20 z listy filadelfijskiej, 2 prac przeglądowych i 33 komunikatów zjazdowych. Sumaryczna wartość wskaźnika impact factor za całokształt dorobku naukowego, nie licząc komunikatów zjazdowych, wynosi IF=32.020, MNiSW=499 (w tym IF=28.787, MNiSW=396 po uzyskaniu stopnia doktora). Brałem czynny udział w 21 konferencjach naukowych o zasięgu międzynarodowym i krajowym, na których prezentowałem 33 doniesienia. Pełniłem także funkcję recenzenta prac badawczych w czasopismach takich jak Atherosclerosis, BMC Cardiovascular Disorders (dwukrotnie) oraz Postępy Higieny i Medycyny Doswiadczalnej. Jestem laureatem dziewięciu zespołowych nagród Rektora Śląskiego Uniwersytetu Medycznego w Katowicach, w tym siedmiu w zakresie działalności naukowej i dwóch w zakresie działalności dydaktycznej. 4. Wskazanie osiągnięcia* wynikającego z art. 16 ust. 2 ustawy z dnia 14 marca 2003 r. o stopniach naukowych i tytule naukowym oraz o stopniach i tytule w zakresie sztuki (Dz. U. nr 65, poz. 595 ze zm.): a) tytuł osiągnięcia naukowego/artystycznego Jednotematyczny cykl publikacji pod wspólnym tytułem: Oddziaływania typu gen-tradycyjne czynniki ryzyka w kształtowaniu ryzyka choroby niedokrwiennej serca. [IF=9.126, MNiSW=103] b) Autor/autorzy, tytuł/tytuły publikacji, rok wydania, nazwa wydawnictwa. 1. Niemiec P, Nowak T, Iwanicki T, Gorczynska-Kosiorz S, Balcerzyk A, Krauze J, Grzeszczak W, Wiecha M and Zak I. The rs2516839 polymorphism of the USF1 gene may modulate serum triglyceride levels in response to cigarette smoking. Int. J. Mol. Sci. 2015;16:13203-13216. [IF=2.862, MNiSW=30] 2. Niemiec P, Nowak T, Iwanicki T, Krauze J, Gorczynska-Kosiorz S, Grzeszczak W, Ochalska-Tyka A, Zak I. The -930A>G polymorphism of the CYBA gene is 2

associated with premature coronary artery disease. A case-control study and gene-risk factors interactions. Mol Biol Rep 2014;41:3287-3294. [IF=2.024, MNiSW=20] 3. Niemiec P, Gorczynska-Kosiorz S, Iwanicki T, Krauze J, Trautsolt W, Grzeszczak W, Bochenek A, Zak I. The rs10757278 Polymorphism of the 9p21.3 Locus Is Associated with Premature Coronary Artery Disease in Polish Patients. Genet Test Mol Biomarkers 2012;16:1080-1085. [IF=1,444, MNiSW=15] 4. Niemiec P, Nowak T, Balcerzyk A, Krauze J, Zak I. The CYBA gene A640G polymorphism influences predispositions to coronary artery disease through interactions with cigarette smoking and hypercholesterolemia. Biomarkers 2011;16:405-412. [IF=2,215, MNiSW=25] 5. Zak I, Niemiec P, Balcerzyk A, Krauze J. Combined proatherosclerotic variants of the ACE and APOE genes increase the risk of coronary artery disease associated with the presence of cigarette smoking. Acta Cardiologica 2008;63:741-747. [IF=0,581, MNiSW=13] c) Omówienie celu naukowego/artystycznego ww. pracy/prac i osiągniętych wyników wraz z omówieniem ich ewentualnego wykorzystania. Choroba niedokrwienna serca (ChNS) jest najczęściej schorzeniem wieloczynnikowym, którego złożony fenotyp wynika z oddziaływań pomiędzy licznymi czynnikami genetycznymi i niegenetycznymi. Wielogenowy model dziedziczenia choroby niedokrwiennej serca zakłada silną heterogenność genetyczną fenotypu miażdżycowego, którą potwierdzają wyniki współczesnych badań [1]. Badania stanowiące bieżące osiągnięcie naukowe skupiają się na poznaniu genetycznego tła choroby niedokrwiennej serca w populacji polskiej, w kontekście oddziaływania czynników genetycznych z tradycyjnymi czynnikami ryzyka ChNS, takimi jak nikotynizm, zaburzenia gospodarki lipidowej, nadciśnienie tętnicze, nadwaga/otyłość i inne. Opisano wiele wariantów genetycznych, zarówno w obrębie genów kandydatów jak i sekwencji niekodujących, wykazujących związek z ChNS w badaniach funkcjonalnych i kliniczno-kontrolnych [2]. Do genów kandydatów należą między innymi geny kodujące informację o białkach zaangażoanych w regulację gospodarki lipidowej i wolnorodnikowej, geny dla białek regulujących ciśnienie tętnicze krwi, procesy krzepnięcia i fibrynolizy jak też zaagnażowanych w przemiany metaboliczne podstawowych substratów energetycznych. Liczną grupę genów kandydatów stanowią również geny dla białek regulatorowych, elementów przekaźnictwa komórkowego oraz czynników transkrypcyjnych, zaangażowanych w utrzymywanie homeostazy na terenie ściany tętniczej, których związki z ChNS wykazano stosunkowo niedawno, w prowadzonych na wielką skalę wieloośrodkowych badaniach asocjacyjnych całego genomu (ang. Genome-Wide Association Studies, GWAS). Badania GWAS przyczyniły się także do wykrycia wariantów genetycznych, zlokalizowanych w sekwencjach niekodujących, w tym polimorfizmów w obrębie locus 9p21.3 [3-5]. 3

Polimorficzne geny kształtują osobniczą podatność na ChNS głównie poprzez wpływ na tempo i wydajność ekspresji kodowanych przez nie białek. Substytucje w sekwencjach egzonowych typu zmiany sensu mogą również finalnie wpływać na konformację białek, przyczyniając się do ich zróżnicowanej aktywności biologicznej. Polimorfizmy w sekwencjach niekodujących mogą natomiast wpływać na flankujące sekwencje DNA, regulując przykładowo ekspresję genów w układzie cis. W wielu przypadkach nie zostały poznane dokładne mechanizmy ich wpływu na ustrój, co może wynikać ze złożoności oddziaływań poszczególnych wariantów genetycznych z innymi polimorfizmami, jak też tradycyjnymi czynnikami ryzyka miażdżycy. Analiza oddziaływań polimorfizmów genetycznych i tradycyjnych czynników ryzyka oraz wpływ ich współwystępowania na ryzyko wczesnej choroby niedokrwiennej serca znalazły się w centrum moich zainteresowań badawczych. Są też przewodnim tematem bieżącego osiągnięcia naukowego. W pracach stanowiących bieżące osiągnięcie naukowe analizowałem polimorfizmy genów dla białek regulujących gospodarkę wolnorodnikową (CYBA) oraz lipidową (APOE i USF1), a także polimorfizm sekwencji niekodujacych w obrębie locus 9p21.3. Prace te stanowią kontynuację badań kliniczno-kontrolnych, prowadzonych we współpracy z I Kliniką Kardiologii Śląskiego Uniwersytetu Medycznego oraz z I Kliniką Kardiochirurgii SUM, nieprzerwanie od roku 2000. Wszystkie badania przeprowadzono w tych samych grupach badanych a ich nadrzędnym celem było poszerzenie wiedzy na temat genetycznego tła choroby niedokrwiennej serca w populacji polskiej. Prace stanowiące bieżące osiągnięcie naukowe, jako pierwsze prezentują częstości genotypów i alleli badanych polimorfizmów w populacji polskiej (wyjątek stanowi polimorfizm genu APOE, analizowany również przez inne polskie zespoły badawcze), wzbogacając wiedzę na temat jej genetycznej różnorodności. Jednym z aspektów bieżącego osiągnięcia naukowego była analiza polimorfizmów genu CYBA, zaangażowanego w regulację syntezy anionorodnika ponadtlenkowego (O - 2 ) w układzie sercowo-naczyniowym. Zaburzenia stanu oksydacyjno-redukcyjnego, wynikające ze - zwiekszonej dostępności O 2 na terenie ściany tętniczej, są uznawane za jedną z - podstawowych przyczyn inicjacji i progresji procesu miażdżycowego. Głównym źródłem O 2 w układzie sercowo-naczyniowym są naczyniowe i fagocytarne oksydazy NADPH. Są to wielopodjednostkowe kompleksy enzymatyczne, w których skład wchodzi błonowy cytochrom b 558 (dimer złożony z katalitycznego białka NOX i pomocniczego białka p22phox) oraz liczne podjednostki cytoplazmatyczne (inne białka phox i GTPazy Rac). Białko p22phox jest wspólnym i niezmiennym elementem kompleksów oksydaz zawierających białka NOX1- NOX4 i pełni kluczową rolę w stabilizacji tych kompleksów. Jest też niezbędne do inicjacji syntezy O - 2. Białko p22phox kodowane jest przez gen CYBA (ang. cytochrome b 245 -alpha), zlokalizowany na chromosomie 16 (16q24). W ostatnich latach, w genie tym wykazano obecność licznych wariantów polimorficznych, spośród których na uwagę zasługują dwa funkcjonalne polimorfizmy, mianowicie -930A>G, oraz 640A>G. Ponieważ zagadnienia charakteryzujące specyfikę naczyniowych oksydaz NADPH i białka p22phox były przedmiotem wcześniejszego opracowania polskojęzycznego, którego jestem współautorem [6], teoretyczne wprowadzenie do powyższych zagadnień ograniczyłem do niezbędnego minimum. 4

- Synteza O 2 zależy zarówno od wariantów polimorficznych genów kodujących składniki oksydaz NADPH, jak też wzmaga się podczas ekspozycji na tradycyjne czynniki ryzyka miażdżycy, takie jak np. nikotynizm i hipercholesterolemia [7]. Z tego powodu podjęto badania własne nad polimorfizmem 640A>G genu CYBA w kontekście przedwczesnej ChNS i jej korelatów, których wyniki opublikowano w pracy o tytule The CYBA gene A640G polymorphism influences predispositions to coronary artery disease through interactions with cigarette smoking and hypercholesterolemia (Niemiec i wsp. Biomarkers 2011;16:405-412). Polimorfizm 640A>G (rs1049255) zlokalizowany jest w pozycji 24 nukleotydu, regionu 3 UTR genu CYBA. Należy do polimorfizmów funkcjonalnych. U heterozygot AG obserwuje się znamiennie wyższą ilość kopii transkryptu zawierającego allel 640G. Allel ten jest również związany ze zwiększoną syntezą anionorodnika ponadtlenkowego i jego pochodnych. Rolę polimorfizmu 640A>G szczegółowo omówiono w kolejnej polskojęzycznej pracy przeglądowej mojego współautorstwa [8]. Wyniki badań własnych (Niemiec i wsp. Biomarkers 2011;16:405-412) sugerują, że warianty genotypowe polimorfizmu 640A>G nie są niezależnym czynnikiem ryzyka ChNS w populacji polskiej (brak róznic w częstości alleli i genotypów pomiędzy pacjentami i grupą kontrolną). Wykazano jednak, że allel 640G genu CYBA oddziałuje synergicznie z nikotynizmem i hipercholesterolemią, zwiększając ryzyko ChNS. Nosiciele allelu 640G, palący papierosy, charakteryzowali się najwyższym ryzykiem ChNS względem osób z pozostałymi kombinacjami obu czynników (P < 10-6 ). Ryzyko ChNS u nikotynistów, będących nosicielami allelu 640G, było około 100% wyższe od wartości wynikającej z addycji efektów obu czynników (SI = 2.02) i około 130% wyższe od wartości oszacowanej na podstawie ich mnożenia (SIM = 2.32). Nosicielstwo allelu 640G zwiększało znacząco ryzyko ChNS również u osób jednocześnie eksponowanych na nikotynizm i hipercholesterolemię (TC 5mmol/L), a obserwowany efekt był silniejszy niż w przypadku nikotynizmu (SI = 2.70, SIM = 3.60). Ponadto, obecność allelu 640G korelowała dodatnio ze stężeniami triacylogliceroli (r = 0.27, P = 0.001) i nadwagą/otyłością (r = 0.21, P = 0.011). Reasumując, chociaż polimorfizm 640A>G nie wykazuje związku z ChNS w analizie jednoczynnikowej, nosiciele allelu 640G są szczególnie narażeni na negatywne skutki palenia papierosów i hipercholesterolemii. Istnieje przypuszczenie, że działanie obu tradycyjnych czynników ryzyka może potęgować efekty wynikające z chronicznej nadekspresji genu CYBA, towarzyszącej nosicielstwu allelu 640G. W kolejnej pracy, dotyczącej genu CYBA pt. The -930A>G polymorphism of the CYBA gene is associated with premature coronary artery disease. A case-control study and generisk factors interactions (Niemiec i wsp., Mol Biol Rep 2014; 41:3287-3294), analizowałem wpływ polimorfizmu -930A>G na ryzyko przedwczesnej ChNS, jak również oddziaływania jego wariantów genotypowych z powszechnymi, tradycyjnymi czynnikami ryzyka miażdżycy. Polimorfizm -930A>G (rs9932581: A>G) jest jednym z polimorfizmów obecnych w promotorze genu CYBA, w nukleotydowej pozycji -930, licząc od kodonu ATG. Znajduje się on w miejscu potencjalnego wiązania czynników transkrypcyjnych z rodziny C/EBP (ang. CCAAT/enhancer-binding proteins). Należy do polimorfizmów funkcjonalnych i jest związany ze zróżnicowanym, zależnym od allelu wiązaniem białek C/EBP i w konsekwencji zróżnicowaną aktywnością transkrypcyjną genu CYBA. Promotor -930G posiada silniejsze 5

powinowactwo do C/EBP i charakteryzuje się wyższą o 30% ekspresją względem promotora -930A. Szczegółowe omówienie roli tego polimorfizmu przedstawiono w polskojęzycznym opracowaniu, mojego współautorstwa [8]. Wyniki uzyskane w badaniach własnych (Niemiec i wsp., Mol Biol Rep 2014; 41:3287-3294) wskazują, że nosicielstwo allelu -930G genu CYBA jest niezależnym czynnikiem ryzyka choroby niedokrwiennej serca w populacji polskiej (OR = 2.22, 95%CI; 1.17-4.20, P = 0.015). Wykazano również, że grupę wysokiego ryzyka przedwczesnej ChNS stanowią nosiciele allelu -930G z nadwagą i/lub otyłością, z indeksem masy ciała (BMI) 25. Zależność ta ma charakter synergiczny a ryzyko ChNS, wynikające z współwystępowania allelu -930G z nadwagą/otyłością, wzrasta o 160% względem wartości oszacowanej przy założeniu addytywnego oddziaływania obu czynników (SI = 2.59). Wykazano również, że obecność allelu -930G koreluje z wartościami BMI (r = 0.36, P = 0.04). Najwyższą wartością BMI charakteryzowali się pacjenci z ChNS, będący nosicielami allelu -930G. W omawianej pracy wykazano także obecność efektu synergicznego pomiędzy nosicielstwem allelu -930G i nikotynizmem. Współwystępowanie obu czynników zwiększa ryzyko ChNS o 40%, względem oszacowanego przy założeniu addytywności efektów (SI = 1.39). Podsumowując, wyniki bieżącej pracy wskazują na związek polimorfizmu -930A>G genu CYBA z chorobą niedokrwienną serca w populacji polskiej. Synergiczne oddziaływania allelu -930G z nadwagą/otyłością i nikotynizmem zwiększają ryzyko ChNS. Nosiciele allelu - 930G są szczególnie narażeni na konsekwencje otyłości i nikotynizmu, które uwydatniają właściwość allelu -930G, będącego determinantem wzmożonej ekspresji genu CYBA. Zaburzenia lipidowe należą do najważniejszych czynników predykcyjnych miażdżycopochodnej choroby niedokrwiennej serca i jej komplikacji, takich jak zawał mięśnia sercowego [9]. Wynikają one częściowo z obecności polimorficznych wariantów ryzyka w obrębie genów zaangażowanych w metabolizm lipidów, do których należą APOE i USF1. Pierwszy z nich koduje apolipoproteinę E (apoe), białko odpowiedzialne za transport i metabolizm lipidów [10]. Gen USF1 niesie informację o podjednostce czynnika transkrypcyjnego USF (ang. upstream stimulatory factor), regulującego liczne przemiany lipidowe w organizmie człowieka [11]. Badania własne skupiły się na określeniu roli powszechnych polimorfizmów obu genów w kształtowaniu ryzyka przedwczesnej ChNS w populacji polskiej. Obok klasycznej analizy kliniczno-kontrolnej, analizowano wpływ wariantów genetycznych na stężenia osoczowe lipidów i fenotyp kliniczny ChNS. Podjęto także próbę określenia charakteru oddziaływań pomiędzy genotypami i allelami badanych polimorfizmów a tradycyjnymi czynnikami ryzyka miażdżycy, modyfikującymi zarówno profil lipidowy jak też ryzyko ChNS. W pracy o tytule Combined proatherosclerotic variants of the ACE and APOE genes increase the risk of coronary artery disease associated with the presence of cigarette smoking (Zak, Niemiec i wsp. Acta Cardiologica 2008;63:741-747), analizowano oddziaływania typu gen-gen oraz gen-tradycyjne czynniki ryzyka ChNS w obrębie wariantów genotypowych polimorfizmów genów APOE (polimorfizm epsilon, E) i ACE (polimorfizm insercyjno/delecyjny, I/D). Białko apoe jest składnikiem zarówno chylomikronów, jak też lipoprotein klasy VLDL. Ponieważ jest ligandem receptora dla LDL oraz białka podobnego do receptora LDL (ang. LDL receptor-related protein, LRP), reguluje transport i metabolizm 6

lipidów oraz współuczestniczy w usuwaniu nadmiaru cholesterolu z makrofagów. Bierze też udział w regulacji odpowiedzi zapalnej, apoptozy i stresu oksydacyjnego. Polimorfizm epsilon badano intensywnie w kontekście licznych chorób, również tych o podłożu miażdżycowym. Powszechnie przyjmuje się, że allel E4 odpowiedzialny jest za zwiększone stężenie cholesterolu całkowitego (TC), LDL i triacylogliceroli (TG) w krwioobiegu, stanowiąc allel ryzyka chorób układu sercowo-naczyniowego [12]. Drugi z genów, ACE (ang. angiotensin I converting enzyme), koduje informację o konwertazie angiotensyny I (ACE), głównym enzymie tworzącym w układzie sercowo-naczyniowym angiotensynę II, oktapeptyd o silnych właściwościach naczyniokurczących. Nosiciele allelu D, polimorfizmu I/D genu ACE, charakteryzują się wzmożoną ekspresją ACE a efekt ten zależy od dawki allelu D. Nosiciele allelu D charakteryzują się wyższymi wartościami ciśnienia tętniczego, większym ryzykiem miażdżycy, przerostu lewej komory serca i ostrego incydentu sercowonaczyniowego, względem homozygot II [13]. Wyniki badań własnych (Zak I, Niemiec P i wsp. Acta Cardiologica 2008;63:741-747) sugerują, że jednoczesne nosicielstwo alleli ryzyka w genach APOE (allel E4) i ACE (allel D) może predysponować do choroby niedokrwiennej serca silniej, niż nosicielstwo w obrębie każdego z genów, analizowanego indywidualnie. Chociaż allele E4 i D współwystępowały częściej w grupie pacjentów niż w grupie odniesienia, różnice te leżały na granicy znamienności statystycznej (OR = 2.18, 95%CI; 0.84-5.77, P = 0.08). Wykazano jednak, że jednoczesne nosicielstwo alleli ryzyka w genach APOE i ACE oddziałuje synergicznie z nikotynizmem, zwiększając znacząco ryzyko ChNS. Współwystępowanie nikotynizmu z allelem E4 i genotypem DD zwiększało ryzyko ChNS ponad 13-krotnie względem wartości addytywnej efektów dla obu czynników genetycznych i nikotynizmu (SI = 13.4, 95%CI; 1.15-156.3). Nieco słabszy efekt zaobserwowano w przypadku współwystępowania nikotynizmu z allelem E4 i nosicielstwem allelu D (SI = 9.7, 95%CI; 1.27-73.9). W podsumowaniu bieżącego badania, kumulacja promiażdżycowych wariantów polimorficznych genów APOE i ACE może przyczyniać się do ujawnienia ChNS w populacji polskiej. Allele E4 (APOE) i D (ACE) mogą intensyfikować efekty wynikające z ekspozycji na nikotynizm, zwiekszając kilkunastokrotnie ryzyko ChNS związane z ekspozycją na ten czynnik środowiskowy. Drugim z badanych genów odpowiedzialnych za regulację gospodarki lipidowej był gen USF1. W pracy The rs2516839 polymorphism of the USF1 gene modulates serum triglyceride levels in response to cigarette smoking (Niemiec i wsp., Int. J. Mol. Sci. 2015;16:13203-13216) analizowałem jego dwa powszechne polimorfizmy, mianowicie rs2516839 (c.161043331c>t) i rs3737787 (c.161039733g>a), w kontekście ChNS. Gen USF1 (1q23.3) koduje polipeptyd USF1, będący podjednostką heterodimerycznego czynnika transkrypcyjnego USF (ang. upstream stimulatory factor). USF moduluje aktywność licznych genów zaangażowanych w regulację cyklu komórkowego, odpowiedź immunologiczną oraz odpowiedź na stres. USF reguluje również metabolizm węglowodanów i lipidów poprzez wpływ na docelowe geny, do których należy między innymi analizowany w poprzedniej pracy gen APOE [11]. W kilku populacjach kaukaskich polimorfizmy genu USF1 wykazywały związek z rodzinną hiperlipidemią mieszaną lub jednym z jej korelatów, takich jak stężenie triacylogliceroli i/lub poszczególnych frakcji lipoprotein w surowicy [14]. Z badań własnych (Niemiec i wsp., Int. J. Mol. Sci. 2015;16:13203-13216) wynika, że żaden z 7

wariantów genotypowych w obrębie badanych polimorfizmów nie stanowi niezależnego czynnika ryzyka ChNS w populacji polskiej. Wykazano jednak, że stężenie triacylogliceroli (TG) w surowicy wzrasta wraz z dawką allelu C polimorfizmu rs2516839. W grupie pacjentów homozygoty CC charakteryzowały się najwyższymi stężeniami TG (2.17 mmol/l), heterozygoty CT pośrednimi (1.86 mmol/l) a homozygoty TT najniższymi (1.73 mmol/l). Z kolejnych analiz wynika, że allel C polimorfizmu rs2516839 oddziałuje synergicznie z nikotynizmem, zwiększając ryzyko ChNS. Palacze papierosów, będący nosicielami allelu C posiadali wyższe ryzyko ChNS (OR = 3.85, P<10-6 ) w odniesieniu do palących homozygot TT (OR = 1.90, P = 0.045) i niepalących nosicieli allelu C (OR = 0.75, P = 0.27). Ryzyko ChNS u nikotynistów będących nosicielami allelu C było około 170% wyższe od wartości oszacowanej na podstawie mnożenia efektów dla obu czynników (SIM = 2.69, 95%CI; 1.21-6.01, P = 0.015). Dalsze badania ujawniły, że polimorfizm rs2516839 genu USF1 moduluje stężenie triacylogliceroli w surowicy, w odpowiedzi na nikotynizm. Wzrost stężenia TG w surowicy, w odpowiedzi na dawkę allelu C, obserwowano tylko u osobników palących papierosy (stężenia TG: 1.53 mmol/l dla genotypu TT, 1.80 mmol/l dla CT i 2.27 mmol/l dla CC) a różnice pomiędzy poszczególnymi genotypami były znamienne statystycznie. Nie wykazano tej tendencji u niepalących (stężenia TG: 1.57 mmol/l dla genotypu TT, 1.46 mmol/l dla CT i 1.49 mmol/l dla CC). Uzyskane wyniki potwierdzono w modelu wieloczynnikowej regresji logistycznej, po uwzględnieniu tradycyjnych czynników ryzyka miażdżycy. Podsumowując, wyniki bieżącej pracy wskazują, że wpływ genotypów polimorfizmu rs2516839 genu USF1 na stężenia triacylogliceroli w surowicy jest zależny od nikotynizmu. Nosiciele allelu C są szczególnie silnie eksponowani na efekty wywoływane przez nikotynizm, do których zaliczyć można podwyższone stężenie triacylogliceroli. Liczne interakcje pomiędzy genem USF1, genami od niego zależnymi oraz paleniem papierosów i zaburzeniami lipidowymi mogą intensyfikować efekty związane z ekspozycją na każdy z poszczególnych czynników z osobna. Na przestrzeni ostatnich dziesięciu lat badania GWAS zidentyfikowały liczne, nowe warianty genetyczne, zwiększające predyspozycje do ChNS, z których tylko około 30% wpływa na chorobę poprzez znane czynniki ryzyka [15]. Do polimorfizmów, których mechanizm działania nie został w pełni poznany, należą polimorfizmy locus 9p21.3. Locus to jest pustynią genową, obfitującą w polimorfizmy pojedynczych nukleotydów oraz w regulatorowe sekwencje wzmacniające. Polimorfizm rs10757278 (c.22114477a>g) pełni krytyczną rolę w regulacji locus 9p21.3 [16]. Jest on zlokalizowany w obrębie jednego ze wzmacniaczy, zaś allel G tego polimorfizmu niszczy miejsce wiązania STAT1, czynnika transkrypcyjnego aktywowanego przez γ-interforon. W konsekwencji dochodzi do zaburzeń w ekspresji sąsiadujących genów (CDKN2A, CDKN2B, ANRIL), prowadzących między innymi do nadmiernej proliferacji komórek mięśni gładkich w aorcie i ograniczenia procesu ich starzenia [17]. Wysoka częstość homozygotycznego genotypu GG (pomiędzy 20-30% w populacjach kaukaskich) sprawia, że stanowi on istotny czynnik ryzyka, tym bardziej, że zwiększa ryzyko ChNS i zawału mięśnia sercowego około dwukrotnie. Jest to najsilniejszy czynnik genetyczny związany z heterogenną postacią ChNS, spośród opisanych do dzisiaj polimorfizmów pojedynczych nukleotydów. Wyniki badań własnych nad polimorfizmem rs10757278 opublikowałem w pracy pod tytułem The rs10757278 Polymorphism of the 8

9p21.3 Locus Is Associated with Premature Coronary Artery Disease in Polish Patients (Niemiec i wsp. Genet Test Mol Biomarkers 2012;16:1080-1085). Częstość alleli i genotypów polimorfizmu rs10757278 w populacji polskiej nie różni się od wartości obserwowanych w innych populacjach pochodzenia kaukaskiego. Częstość genotypu GG wynosiła 30.6% w grupie pacjentów i 17.5% w grupie kontrolnej (P = 0.003). Uzyskane wyniki sugerują, że genotyp GG oraz częstość allelu G są czynnikami ryzyka ChNS w populacji polskiej (OR = 2.46, 95% CI: 1.35-4.49, P = 0.003 oraz OR = 1.49, 95%CI; 1.08-2.07, P = 0.011, odpowiednio). W badanej polskiej populacji polimorfizm ten nie oddziałuje z żadnym z tradycyjnych czynników ryzyka ChNS. Co więcej, ryzyko ChNS związane z obecnością genotypu GG i allelu G wzrasta w podgrupach pacjentów tzw. niskiego ryzyka, z niewielkim udziałem czynników tradycyjnych (OR = 2.91, 95% CI:1.37-6.20, P = 0.0022 oraz OR = 1.70, 95% CI:1.08-2.67, P = 0.016, odpowiednio). Reasumując, wyniki bieżącego badania wskazują, że polimorfizm locus 9p21.3 jest silnym, niezależnym czynnikiem ryzyka ChNS również w populacji polskiej. Wyniki te również stanowią możliwą odpowiedź na pytanie dotyczące przyczyny choroby niedokrwiennej serca u pacjentów z grup niskiego ryzyka. W chwili obecnej trwają badania mające określić czy polimorfizm locus 9p21.3 powinien zostać włączony do skali oceny ryzyka Framingham (ang. Framingham Risc Score, FRS). Istnieją dowody, że jego uwzglednienie może poprawić ocenę ryzyka ChNS, szczególnie u ludzi starszych, z niską ekspozycją na tradycyjne czynniki ryzyka [18]. Włączenie polimorfizmu locus 9p21.3 do skali oceny ryzyka ARIC (ang. Atherosclerosis Risk in Communities) także może ulepszyć klasyfikację ryzyka ChNS, zwłaszcza wśród osób z średnio-niskim (ang. intermediate-low) ryzykiem ChNS (>5% i 10% 10-letniego ryzyka ChNS) [19]. Niedoszacowanie ryzyka, wynikające z braku polimorfizmu locus 9p21.3 w obowiązujących kalkulatorach ryzyka może wpływać w znacznym stopniu na skuteczność prewencji ChNS i efekty jej leczenia. Niewykluczone, że wyniki bieżącej pracy pomogą w przyszłości ulepszyć metody oceny ryzyka ChNS także w populacji polskiej. W podsumowaniu należy podkreślić, że udział pojedynczych polimorfizmów w kształtowaniu osobniczych predyspozycji do ChNS jest stosunkowo niewielki. Wyniki GWAS wskazują, że obecność pojedynczego allelu podatności zwiększa ryzyko ChNS zwykle o kilka procent, a bardzo rzadko (np. w przypadku analizowanego polimorfizmu locus 9p21.3) o kilkadziesiąt [15]. W żadnym razie nie tłumaczą one fenomenu odziedziczalności ChNS i wysokiego ryzyka choroby, wynikającego z dodatniej historii rodzinnej [20]. Badania będące podstawą niniejszego osiągnięcia naukowego dowodzą jednak, że udział pojedynczego polimorfizmu w kształtowaniu ryzyka ChNS może znacząco wzrastać w obecności specyficznego tła genetycznego (Żak, Niemiec i wsp. Acta Cardiologica 2008;63:741-747) lub w przypadku ekspozycji na tradycyjne czynniki ryzyka miażdżycy, modulujące zależną od allelu odpowiedź organizmu (Niemiec i wsp. Mol Biol Rep 2014; 41:3287-3294, Niemiec i wsp. Biomarkers 2011;16:405-412, Żak, Niemiec i wsp. Acta Cardiologica 2008;63:741-747, Niemiec i wsp. 2014 USF1). Dotyczy to także wariantów genetycznych, których związki z chorobą nie zostały wychwycone w klasycznym, jednoczynnikowym modelu kliniczno-kontrolnym (Niemiec i wsp. Biomarkers 2011;16:405-412, Niemiec i wsp. Int. J. Mol. Sci. 2015;16:13203-13216). Z uwagi na wieloczynnikowe podłoże miażdżycy i ChNS, analiza oddziaływań typu gen-tradycyjne czynniki ryzyka pełniej 9

wyjaśnia charakter choroby i dostarcza większej ilości informacji w odniesieniu do analizy indywidualnych czynników. Oprócz lepszego zrozumienia przyczyn i przebiegu procesu miażdżycowego, poznanie oddziaływań typu gen-tradycyjne czynniki ryzyka może umożliwić identyfikację podgrup pacjentów predysponowanych genetycznie do silniejszej odpowiedzi organizmu na ekspozycję. Zdolność do minimalizowania lub modyfikowania ekspozycji na tradycyjne czynniki ryzyka, szczególnie w grupach wysokiego ryzyka genetycznego, może być w przyszłości najprostszą i jednocześnie najskuteczniejszą strategią prewencji miażdżycy i jej komplikacji. Ustalenie wpływu i charakteru oddziaływań pomiędzy czynnikami genetycznymi i tradycyjnymi czynnikami ryzyka miażdżycy ma niezwykle istotne znaczenie zarówno w aspekcie poznawczym, klinicznym jak i ekonomicznym, ponieważ konsekwencje i komplikacje miażdżycy pozostają w Polsce najważniejszą przyczyną absencji chorobowej, hospitalizacji, inwalidztwa i przedwczesnej umieralności. Bibliografia: 1. Roberts R, Stewart AF. Genetics of coronary artery disease in the 21st century. Clin Cardiol 2012;35:536-540. 2. Sayols-Baixeras S, Lluís-Ganella C, Lucas G et al. Pathogenesis of coronary artery disease: focus on genetic risk factors and identification of genetic variants. Appl Clin Genet 2014;7:15-32. 3. Helgadottir A, Thorleifsson G, Manolescu A et al. A common variant on chromosome 9p21 affects the risk of myocardial infarction. Science 2007;316:1491-1493. 4. McPherson R, Pertsemlidis A, Kavaslar N et al. A common allele on chromosome 9 associated with coronary heart disease. Science 2007;316:1488-1491. 5. Samani NJ, Erdmann J, Hall AS et al. Genomewide association analysis of coronary artery disease. N Engl J Med 2007;357:443-453. 6. Niemiec P., Żak I. Naczyniowe oksydazy NAD(P)H - znaczenie w patogenezie miażdżycy. Post Bioch 2005;51:1-11. 7. Guzik TJ, West NE, Black E et al. Vascular superoxide production by NAD(P)H oxidase: association with endothelial dysfunction and clinical risk factors. Circ Res 2000;86:E85-90. 8. Nowak T, Niemiec P, Zak I. Białko p22phox oraz gen CYBA. Ich funkcja i związki z chorobami o podłożu miażdżycowym.wiad Lek 2013;66:10-17. 9. Yusuf S, Hawken S, Ounpuu S et al. Effect of potentially modifiable risk factors associated with myocardial infarction in 52 countries (the INTERHEART study): case-control study. Lancet 2004;364:937-952. 10. Mahley RW, Rall SC Jr. Apolipoprotein E: far more than a lipid transport protein. Annu Rev Genomics Hum Genet 2000;1:507-37. 11. Naukkarinen J, Gentile M, Soro-Paavonen A et al. USF1 and dyslipidemias: converging evidence for a functional intronic variant. Hum Mol Genet 2005;14:2595-2605. 10

12. IBC 50K CAD Consortium. Large-scale gene-centric analysis identifies novel variants for coronary artery disease. PLoS Genet 2011;7:e1002260. doi: 10.1371/journal.pgen.1002260. 13. Agerholm-Larsen B, Nordestgaard BG, Tybjaerg-Hansen A. ACE gene polymorphism in cardiovascular disease: meta-analyses of small and large studies in whites. Arterioscler Thromb Vasc Biol 2000;20:484-492. 14. Fan YM, Hernesniemi J, Oksala N et al. Upstream Transcription Factor 1 (USF1) allelic variants regulate lipoprotein metabolism in women and USF1 expression in atherosclerotic plaque. Sci Rep 2014;4:4650. DOI:10.1038/srep04650. 15. Roberts R. Genetics of coronary artery disease. Circ Res 2014 114:1890-1903. 16. Harismendy O, Notani D, Song X et al. 9p21 DNA variants associated with coronary artery disease impair interferon-γ signalling response. Nature 2011;470:264-268. 17. Roberts R, Stewart AF. 9p21 and the genetic revolution for coronary artery disease. Clin Chem 2012;58:104-112. 18. Dutta A, Henley W, Lang IA et al.the coronary artery disease-associated 9p21 variant and later life 20-year survival to cohort extinction. Circ Cardiovasc Genet 2011;4:542-548. 19. Brautbar A, Ballantyne CM, Lawson K et al. Impact of adding a single allele in the 9p21 locus to traditional risk factors on reclassification of coronary heart disease risk and implications for lipid-modifying therapy in the Atherosclerosis Risk in Communities study. Circ Cardiovasc Genet 2009;2:279-285. 20. Andresdottir MB, Sigurdsson G, Sigvaldason Het al. Fifteen percent of myocardial infarctions and coronary revascularizations explained by family history unrelated to conventional risk factors. The Reykjavik Cohort Study. Eur Heart J 2002;23:1655-1663. 5. Omówienie pozostałych osiągnięć naukowo - badawczych. Inne publikacje naukowe, nie wchodzące w skład osiągnięcia naukowego, będącego podstawą do ubiegania się o stopień doktora habilitowanego. Poza pracami omówionymi powyżej, i należącymi do jednotematycznego cyklu wchodzącego w skład bieżącego osiągnięcia naukowego, jestem współautorem 24 publikacji naukowych, w tym 22 oryginalnych publikacji eksperymentalnych i dwóch prac przeglądowych. Jestem również współautorem 33 doniesień zjazdowych z konferencji krajowych i międzynarodowych. W doniesieniach zjazdowych prezentowałem wstępne wyniki badań pilotowych, publikowanych następnie w formie pełnotekstowych prac eksperymentalnych. Z tego powodu doniesienia zjazdowe zostaną tutaj tylko wymienione, i nie będą szczegółowo omawiane. Tematyka publikacji, których jestem współautorem, dotyczy czterech aspektów badawczych, mianowicie: - genetycznego podłoża miażdżycy [pozycje II.A:1,8-14; II.D:2,5,8,9; III.B:2,8-28,30-32 w wykazie opublikowanych prac naukowych, załącznik nr 4 do wniosku], 11

- genetycznego podłoża dziecięcego udaru niedokrwiennego mózgu [pozycje II.A:2,3,5-7; II.D:1,3,4,6,7; III.B.3-7,26,29,31,32 w wykazie opublikowanych prac naukowych, załącznik nr 4 do wniosku], - genetycznego podłoża padaczki lekoopornej [pozycje II.A:4; III.B:1 w wykazie opublikowanych prac naukowych, załącznik nr 4 do wniosku], oraz - procesu apoptozy [pozycje II.A:15; III.B:33 w wykazie opublikowanych prac naukowych, załącznik nr 4 do wniosku]. We wszystkich wymienionych powyżej pracach, mój udział dotyczył współtworzenia koncepcji badań, współuczestnictwa w wykonywaniu analiz molekularnych i redagowania pierwotnej oraz ostatecznej wersji manuskryptu. Genetyczne podłoże miażdżycy Genetyczne podłoże miażdżycy stanowi wiodący temat moich zainteresowań badawczych. Najnowsza z prac mojego współautorstwa [II.A:1], dotyczących patogenezy miażdżycy, przedstawia wyniki analizy polimorfizmu regionu 5 genu CYP7A1 (rs7833904), kodującego hydroksylazę 7-alfa cholesterolu, enzym rozpoczynający konwersję cholesterolu do kwasów żółciowych. W bieżącej pracy wykazaliśmy, że nosicielstwo allelu A zwiększa ryzyko choroby niedokrwiennej serca (OR=1.76, P=0.014), szczególnie silnie u mężczyzn (OR=2.16, P=0.003). Analizowany polimorfizm nie wpływa jednak na parametry gospodarki lipidowej [II.A:1]. Spośród prac nad genetycznym podłożem miażdżycy, nie wchodzących w skład osiągnięcia naukowego, kolejnych pięć powstało po uzyskaniu stopnia doktora [II.A:8-12] i upublicznia wyniki będące podstawą mojej rozprawy doktorskiej. W swoim doktoracie analizowałem udział polimorfizmu 242C>T genu CYBA i powszechnych polimorfizmów genów układu renina-angiotensyna (polimorfizm M235T genu AGT, 1166A>C genu AT 1 R oraz I/D genu ACE), w kształtowaniu predyspozycji do ChNS w populacji polskiej. Wyniki badań nad polimorfizmem 242C>T genu CYBA sugerują, że jego warianty genotypowe nie wykazują związku z ChNS w analizie jednoczynnikowej [II.A:12]. Badania te dowodzą jednak, że nosicielstwo allelu 242T może znacząco zwiększać ryzyko ChNS w obecności nikotynizmu i hipercholesterolemii (P < 0.00000). Wyniki prac własnych, poświęconych polimorfizmowi I/D genu ACE, wskazują na potencjalny udział allelu delecyjnego (D) w warunkowaniu miażdżycopochodnej ChNS w populacji polskiej [II.A:10,11]. Allel D wykazywał związek z chorobą wielonaczyniową (P = 0.0017), jak też dominował wśród pacjentów z krytyczną niedrożnością, > 90%, tętnic wieńcowych (P = 0.023) w modelu klinicznym [II.A:10]. Wyniki analizy kliniczno-kontrolnej wskazują natomiast, że genotyp DD jest niezależnym czynnikiem ryzyka ChNS w populacji polskiej (OR = 1.88, 95% CI; 1.13-3.15, P = 0.010), szczególnie silnym u mężczyzn (OR = 2.15, 95% CI; 1.14-4.04, P = 0.010) [II.A:11]. W kolejnej pracy, nad polimorfizmem M235T genu AGT [II.A:9], wykazałem że nosicielstwo allelu 235T stanowi niezależny czynnik ryzyka choroby niedokrwiennej serca w populacji polskiej (OR = 2.20, 95% CI; 1.10-4.40, P = 0.026). Wyniki tych badań sugerują również, że allel 235T oddziałuje z hipercholesterolemią, 12

potęgując ryzyko ChNS związane z ekspozycją na ten znany czynnik proaterogenny [II.A:9]. Ostatnia spośród prac upubliczniających wyniki mojej rozprawy doktorskiej, poświęcona była polimorfizmowi 1166A>C genu AT 1 R [II.A:8]. Uzyskane wyniki wskazują, że polimorfizm 1166A>C nie wpływa na ryzyko ChNS w populacji polskiej. Może je jednak nieznacznie modulować poprzez oddziaływania z tradycyjnymi czynnikami ryzyka miażdżycy, takimi jak nikotynizm i hipercholesterolemia [II.A:8]. Niepublikowane wyniki mojej rozprawy doktorskiej wskazują również, że współwystępowanie promiażdżycowych wariantów genotypowych w obrębie genów CYBA, ACE, AGT i AT 1 R zwiększa znacząco ryzyko ChNS, w odniesieniu do efektów obserwowanych dla każdego z polimorfizmów z osobna, co wspiera tezę o wielogenowej naturze ChNS. Analogiczne wnioski wynikają z pracy, w której analizowaliśmy efekt współwystępowania polimorficznych wariantów w genach APOE (polimorfizm epsilon), ICAM1 (1405A>G), PPARA (G>C w intronie 7) i PAI-1 (4G/5G) [II.A:13]. Tylko allel 5G w genie PAI-1 wykazywał słaby związek z ChNS w analizie jednoczynnikowej. Jendoczesne nosicielstwo dwóch wariantów promiażdżycowych w obrębie genów PPARA i PAI-1 oraz APOE i ICAM1, jak też trzech wariantów w obrębie genów PPARA, ICAM1 i PAI-1, było związane ze znacznym wzrostem ryzyka ChNS, względem efektów obserwowanych dla alleli w pojedynczych genach [II.A:13]. Druga z prac opublikowanych przed uzyskaniem stopnia doktora, z cyklu poświęconego genetycznemu podłożu miażdżycy, przedstawia wstępne wyniki analizy polimorfizmów I/D genu ACE oraz 677C>T genu MTHFR [II.A:14]. Jej wyniki dowodzą związku allelu D z ChNS w populacji polskiej, potwierdzonego w późniejszych badaniach na większej grupie badanej [II.A:11]. W omawianej pracy częstości genotypów i alleli polimorfizmu 677C>T genu MTHFR nie różnicowały grupy pacjentów z ChNS od grupy odniesienia [II.A:14]. Wyniki badań pilotowych, nad polimorfizmem Thr312Ala genu kodującego podjednostkę α fibrynogenu, wskazują na związek nosicielstwa allelu A z chorobą niedokrwienną serca w populacji polskiej (P = 0.031) [II.D:5]. Ostatnia z prac doświadczalnych omawianego cyklu stanowi uzupełnienie badań nad genetycznymi predyspozycjami do ChNS. W pracy tej analizowaliśmy wybrane tradycyjne czynniki ryzyka miażdżycy w grupie krwiodawców z Górnego Śląska [II.D:2]. Zainteresowanie tematyką patogenezy miażdżycy oraz jej wolnorodnikowego tła zaowocowało także powstaniem dwóch polskojęzycznych artykułów przeglądowych, których jestem współautorem. Obie publikacje przeglądowe poświęcone są oksydazom NADPH, głównym enzymom odpowiedzialnym za syntezę anionorodnika ponadtlenkowego na terenie naczyń tętniczych. W pierwszej pracy przedstawiliśmy charakterystykę naczyniowych enzymów i ich rolę w stanie fizjologii i patologii ustroju [II.D:8]. Omówiliśmy szczegółowo budowę i rolę składników oksydaz NADPH, budowę i mechanizm tworzenia kompleksu aktywnego, jak też mechanizm działania katalitycznych białek NOX. Opisaliśmy również funkcję aktywatorów oksydaz NADPH, ze szczególnym uwzględnieniem angiotensyny II i wewnątrzkomórkowych szlaków sygnalizacyjnych, zależnych od wolnych rodników. Przedstawiliśmy także rolę oksydaz NADPH w patogenezie miażdżycy, na jej poszczególnych etapach. Praca ta została opublikowana przed uzyskaniem tytułu doktora. Druga praca, opublikowana po uzyskaniu stopnia doktora, skupiła się na charakterystyce białka p22phox oraz genu CYBA, odpowiedzialnego za kodowanie p22phox [II.D:9]. Praca ta 13

omawia budowę p22phox i jego rolę w działaniu kompleksów oksydaz NADPH. Istotna jej część poświęcona jest polimorfizmom genu CYBA, które omówiliśmy kompleksowo, zarówno w aspekcie funkcjonalnym jak i klinicznym. W pracy podsumowaliśmy również obecny stan wiedzy na temat związków polimorfizmów genu CYBA z chorobami o podłożu miażdżycowym. Obie prace stanowią wkład w popularyzację wiedzy na temat molekularnego podłoża procesu miażdżycowego. Genetyczne podłoże dziecięcego udaru niedokrwiennego mózgu Drugi ważny obszar prowadzonych przeze mnie badań stanowią genetyczne uwarunkowania patogenezy dziecięcego udaru niedokrwiennego mózgu. Niedokrwienny udar dziecięcy ma wieloczynnikowe i wielogenowe podłoże [II.A:6]. Głównymi przyczynami dziecięcego udaru niedokrwiennego mózgu są arteriopatie mózgowe, choroby serca, urazy, infekcje, choroby metaboliczne i mitochondrialne, jak również różne inne przypadłości. Powszechnie przyjmuje się, że udar niedokrwienny mózgu u dzieci może również wynikać z nadkrzepliwości, mającej u podłoża dysfunkcję śródbłonka oraz rozmaite zaburzenia składowych kaskady krzepnięcia krwi. Mimo, że miażdżyca jest główną przyczyną niewydolności naczyń mózgowych w udarze niedokrwiennym dorosłych, jej udział w warunkowaniu udaru dziecięcego jest raczej marginalny i ogranicza się jedynie do rzadkich chorób jednogenowych, takich jak np. hipercholesterolemia rodzinna. Niektóre klasyczne czynniki ryzyka udaru niedokrwiennego dorosłych, takie jak hipercholesterolemia czy nadciśnienie, są jednak stosunkowo powszechne u dzieci. Chociaż wiele chorych dzieci posiada kilka potencjalnych czynników ryzyka, a nie jeden czynnik sprawczy, aż 50% wszystkich przypadków dziecięcego udaru mózgu to postacie kryptogenne. Słaby stan poznania genetycznego podłoża dziecięcego udaru niedokrwiennego mózgu skłonił nas do podjęcia badań własnych, których celem było poszukiwanie predysponujących wariantów genetycznych. Pierwsze publikacje powstały w oparciu o wyniki badań pilotowych, przeprowadzonych w grupie pacjentów leczonych w Klinice Neurologii Wieku Rozwojowego Śląskiej Akademii Medycznej w Katowicach [II.D:3,4,6,7]. Ze względu na niską częstość choroby (2-4/100 000 urodzeń), projekt, którego wynikiem są kolejne prace [II.A:2,3,5-7; II.D:1], miał charakter wieloośrodkowy. Grupy badane rekrutowano spośród pacjentów kilku krajowych ośrodków neurologii dziecięcej (Gdańsk, Łódź, Kraków, Katowice). W centrum naszego zainteresowania znalazły się polimorfizmy genów, których produkty białkowe wiązano z dysfunkcją śródbłonka (gen CYBA dla białka p22phox, gen MTHFR kodujący reduktazę metylenotetrahydrofolianową), metabolizmem i transportem lipidów (geny APOE, ABCA1 i PON1) i procesami krzepnięcia (geny dla podjednostek fibrynogenu oraz czynników krzepnięcia II, V, VII i XIII). Rolę polimorfizmów genetycznych w warunkowaniu dziecięcego udaru niedokrwiennego mózgu badaliśmy z użyciem dwóch niezależnych modeli doświadczalnych: wewnątrzrodzinnego, analizującego przekazywanie dzieciom alleli ryzyka przez heterozygotycznych rodziców (ang. transmission disequilibrium test, TDT) i klasycznego modelu kliniczno-kontrolnego. W pracy dotyczącej polimorfizmów genu MTHFR (1298A>C i 677C>T) nie obserwowaliśmy żadnych statystycznie znamiennych różnic, zarówno w przekazywaniu poszczególnych alleli w teście wewnątrzrodzinnym, jak też 14

w częstościach alleli pomiędzy grupą dzieci chorych a grupą kontrolną [II.A:3]. Nie wykazaliśmy także żadnych efektów addytywnych bądź synergicznych, zwiększających ryzyko dziecięcego udaru mózgu, pomiędzy polimorfizmami 1298A>C i 677C>T. Analizując polimorfizm 242C>T w genie CYBA, wykazaliśmy, że allel C242 był blisko dwukrotnie częściej przekazywany chorym dzieciom przez heterozygotycznych rodziców (62.2%) niż allel 242T (37.8%). Obserwowane różnice nie wykazywały jednak znamienności statystycznej (P = 0.1) [II.A:6]. Również analiza kliniczno-kontrolna nie wykazała znaczących różnic w częstości alleli i genotypów polimorfizmu 242C>T pomiędzy grupą dzieci z udarem niedokrwiennym mózgu a grupą odniesienia [II.A:6]. W przypadku polimorfizmu epsilon genu APOE także nie zaobserwowaliśmy żadnej preferencyjnej dystrybucji alleli [II.A:7], podobnie jak w przypadku pozostałych genów związanych z metabolizmem i transportem lipidów [II.D:1]. Wyniki badań nad polimorfizmami genów dla czynników krzepnięcia (20210G>A dla genu FII; 1691G>A, czyli mutacja Leiden, dla FV; R353Q dla genu FVII; V35L dla genu FXIII) również wskazują na brak preferencyjnego przekazywania chorym dzieciom któregokolwiek z alleli w obrębie badanych genów [II.A:5]. Jedynie w przypadku polimorfizmu R353Q, w genie dla czynnika VII, istnieje tendencja do częstszego występowania allelu R w grupie badanej. Różnice pomiędzy pacjentami i dziećmi z grupy kontrolnej w częstości homozygot RR, allelu Q oraz nosicielstwa allelu Q leżały jednak na granicy istotności statystycznej (P = 0.08) [II.A:5]. W przypadku pozostałych polimorfizmów nie zaobserwowaliśmy istotnych różnic w rozkładzie genotypów i alleli pomiędzy pacjentami i grupą kontrolną [II.A:5]. W naszej ostatniej pracy z cyklu poświęconego genetycznemu podłożu udaru dziecięcego [II.A:2] analizowaliśmy możliwe zależności pomiędzy polimorfizmem -455G>A genu kodującego podjednostkę β fibrynogenu (FGB) oraz polimorfizmem Thr312Ala w obrębie genu dla podjednostki α fibrynogenu (FGA) a dziecięcym udarem niedokrwiennym mózgu. W wynikach testu TDT istniała tendencja do częstszej transmisji alleli 312Ala genu FGA oraz -455A genu FGB, jakkolwiek nieznamienna statystycznie. Częstości alleli i genotypów genów FGA i FGB nie różnicowały dzieci obu grup również w modelu kliniczno-kontrolnym. Analiza wyników prac stanowiących cykl publikacji dotyczących genetycznego podłoża dziecięcego udaru niedokrwiennego mózgu wskazuje, że badane polimorfizmy nie stanowią istotnych determinantów dziecięcego udaru niedokrwiennego mózgu w ujęciu epidemiologicznym. Jednak, ze względu na dużą heterogenność dziecięcego udaru niedokrwiennego mózgu i relatywnie nieliczną grupę badaną, nie można wykluczyć roli analizowanych polimorfizmów w warunkowaniu choroby u poszczególnych pacjentów, szczególnie u homozygot/ nosicieli kilku wariantów ryzyka jednocześnie Genetyczne podłoże padaczki lekoopornej Brałem również udział w badaniach poświęconych genetycznemu podłożu padaczki lekoopornej [II.A:4]. Badania te powstały we współpracy z katowickim ośrodkiem neurologii dziecięcej (Katedra i Klinika Pediatrii i Neurologii Wieku Rozwojowego, Śląskiego Uniwersytetu Medycznego w Katowicach). Padaczki należą do najczęstszych chorób 15

neurologicznych wieku dziecięcego, a ich lekooporność pozostaje nadal jednym z największych problemów współczesnej epileptologii. Zakładane są różne mechanizmy oporności z postulowanym udziałem czynników genetycznych. Dużą wagę przywiązuje się do genów, które kodują enzymy metabolizujące leki przeciwpadaczkowe. Należy do nich CYP3A5, kodujący białko z rodziny cytochromu P450 oraz gen oporności wielolekowej typu 1 (MDR1), który koduje glikoproteinę P (P-gp), białko uczestniczące w transporcie leków. Celem badań własnych było zbadanie związku między polimorfizmami *1/*3 genu CYP3A5 oraz 3435C>T genu MDR1 a lekoopornością u dzieci i młodzieży z częściową, ogniskową padaczką. Nie wykazaliśmy róznic w częstości genotypów *1/*3 i *3/*3 genu CYP3A5 pomiędzy grupami dzieci z padaczką lekooporną, padaczką lekowrażliwą i grupą kontrolną. Chociaż częstość genotypu CC polimorfizmu 3435C>T genu MDR1 różnicowała badane grupy (15% w grupie pacjentów z padaczką lekooporną, 4% w grupie z padaczką lekowrażliwą i 21% w grupie kontrolnej), obserwowane różnice nie wykazywały znamienności statystycznej, co najprawdopodobniej wynika z niskiej liczebności badanych grup. Badania bieżącej pracy nie potwierdzają wartości badanych polimorfizmów w prognozowaniu lekooporności w przypadku padaczek [II.A:4]. Apoptoza Ostatnia z publikacji [II.A:15] prezentuje wyniki mojej pracy magisterskiej (Ocena wrażliwości komórek nowotworowych na indukcję apoptozy przez wybrane leki przeciwnowotworowe), wykonanej w Instytucie Onkologii im Marii Skłodowskiej-Curie w Gliwicach. W pracy tej oceniałem proces apoptozy i klonogenności trzech linii komórkowych, mianowicie szczurzego mięsakomięśniaka (R1), ludzkiego czerniaka (Me45) i ludzkiej białaczki promielocytarnej (HL-60), poddanych działaniu cytostatyków (etopozyt lub cis-ddp) lub UV, metodami molekularnymi oraz cyto- i histochemicznymi. Odpowiedź na czynniki genotoksyczne różnicowała badane linie komórkowe a proces apoptozy niekoniecznie korelował z utratą klonogenności; dla przykładu, komórki Me45 wykazywały najwyższą czułość względem wszystkich trzech czynników genotoksycznych w teście klonogenności, lecz charakteryzowały się znacznie niższym poziomem apoptozy w odniesieniu do komórek linii R1 i HL-60. Wyniki te wskazują, że skuteczność eliminacji komórek tworzących kolonie przez czynniki genotoksyczne zależy nie tylko od indukowania procesu apoptozy. Z przeprowadzonych badań wynika raczej, że indukowanie apoptozy i tłumienie klonogenności mogą być procesami niezależnymi [II.A:15]. ANALIZA BIBLIOMETRYCZNA DOROBKU NAUKOWEGO Mój dotychczasowy dorobek naukowy obejmuje: 20 publikacji oryginalnych z listy filadelfijskiej (IF=32.020, MNiSW=428), w tym: - 17 opublikowanych po uzyskaniu stopnia doktora (IF=28.787, MNiSW=376) - 3 opublikowane przed uzyskaniem stopnia doktora (IF=3.233, MNiSW=52) 16