OZNACZANIE STĘŻENIA GLUKOZY WE KRWI METODĄ ENZYMATYCZNĄ-OXY ZASADA OZNACZENIA Glukoza pod wpływem oksydazy glukozowej utlenia się do kwasu glukonowego z wytworzeniem nadtlenku wodoru. Nadtlenek wodoru w obecności peroksydazy ulega rozłożeniu do wody i tlenu, a ten utlenia chromogen (ABTS, sól sodowa kwasu 2,2 -azyno-di- (3-etylo-benzotiazolidyno-6-sulfonowego), czego efektem jest zmiana barwy. Natężenie powstałego zabarwienia jest proporcjonalne do stężenia glukozy w badanej próbce i mierzy się je spektrofotometrycznie. Metoda ta jest specyficzna dla D-glukozy i pozwala na oznaczanie jej stężenia w surowicy, krwi, moczu i płynie mózgowo-rdzeniowym. WYKONANIE ĆWICZENIA Materiał badany: - surowica Odczynniki: - bufor fosforanowy, ph 7 - roztwór roboczy enzymów (oksydazy glukozowej i peroksydazy) - roztwór wzorcowy glukozy I o stężeniu 5 mmol/l - roztwór wzorcowy glukozy II o stężeniu15 mmol/l - roztwór odbiałczający (kwas nadchlorowy 0,33 mmol/l) Przygotowanie próby badanej: Do próbówki wirówkowej odmierzyć roztwór odbiałczający i materiał badany (surowicę) w stosunku 10:1 (1ml roztworu odbiałczającego: 100µl surowicy). Zawartość próbówki wymieszać. Próbkę ustawić na wadze szalkowej i zrównoważyć umieszczając na drugiej szalce pustą probówkę wirnikową i dopełniając ją wodą destylowaną. Obie probówki umieścić naprzeciwlegle w wirówce. Wirować 15 minut przy 3000 obrotów. Przygotowanie rozcieńczeń do krzywej wzorcowej: W oznaczonych próbówkach przygotować roztwory wzorcowe według poniższej tabeli. Numer próbówki Stężenie roztworu wzorcowego [mmol/l] Wzorzec I [ml] Wzorzec II [ml] Woda destylowana [ml] odbiałczający W1 5 0,1-0,5 0,5 W2 10 0,2-0,4 0,5 W3 15-0,1 0,5 0,5 W4 20 0,4-0,2 0,5 1
Wykonanie oznaczenia: Do czystych i oznaczonych próbówek laboratoryjnych odmierzyć składniki wg tabeli przedstawionej poniżej. Objętości w tabeli zostały podane w ml: wzorcowy Supernatant z próby badanej odbiałczający roboczy Próba odczynnikowa - - 0,2 1 W1 0,2 - - 1 W2 0,2 - - 1 W3 0,2 - - 1 W4 0,2 - - 1 Próba badana - 0,2-1 Podane składniki wymieszać i inkubować w temperaturze pokojowej przez 20 minut. Po tym czasie zmierzyć absorbancję prób wzorcowych i próby badanej względem próby odczynnikowej przy długości fali = 500 nm. Pomiar powinien być przeprowadzony w czasie przed upływem 50 minut od dodania roztworu roboczego. Opracowanie wyników: Na podstawie absorbancję dla prób wzorcowych należy wykreślić na papierze milimetrowym krzywą wzorcową, odznaczając na osi odciętych (X) stężenia roztworów wzorcowych, a na osi rzędnych (Y) odpowiadającą im absorbancję. Stężenie glukozy należy odczytać ze sporządzonej krzywej kalibracyjnej. Zakres prostoliniowości mieści się w granicach od 0 20 mmol/l. Określić, czy stężenia w badanej próbce mieściło się w granicach wartości prawidłowych. 2
OZNACZANIE STĘŻENIA GLUKOZY WE KRWI METODĄ ENZYMATYCZNĄ-HEXO ZASADA OZNACZENIA Glukoza pod wpływem heksokinazy ulega fosforylacji przy udziale ATP do glukozo- 6-fosforanu i ADP. Glukozo-6fosforan jest utleniany do 6-fosfoglukonianu przy jednoczesnej redukcji NAD do NADH. Powstaniu NADH towarzyszy wzrost absorbancji przy długości fali 340nm, który jest proporcjonalny do stężenia glukozy w badanej próbce. Metoda pozwala na oznaczanie jej stężenia w surowicy krwi, osoczu i moczu. Glukoza +ATP G-6-P +ADP G-6-PDH (Dehydrogenaza G-6-P) G-6-P +NAD 6-PG +NADH + H + WYKONANIE ĆWICZENIA Materiał badany: - surowica, osocze, mocz Odczynniki: - trójetanoloamina 20 mmol/l - ATP 1 mmol/l - NAD 0,69 mmol/l - heksokinaza > 1,500 U/l - dehydrogenaza G-6-P > 1,500 U/l ph 7,3 temp. 20 o C Wykonanie oznaczenia: Przygotować i oznakować probówki laboratoryjne. Właściwą ilość odczynnika ogrzać do temperatury reakcji 37 o C co najmniej przez 5 minut. Dodać pozostałych składników mieszaniny reakcyjnej (wg tabeli poniżej) próba ślepa próba badana próba wzorcowa Odczynnik 1 ml 1 ml 1 ml Surowica lub standard - 10 l 10 l Woda destylowana 10 l - - Inkubować 3 minuty w temperaturze 37 o C. Zmierzyć absorbancję próby badanej oraz standardu względem próby ślepej przy długości fali 340 nm. Absorbancja jest stabilna przez 15 minut. 3
Opracowanie wyników: Obliczyć wyniki wg następującego wzoru: NORMY: Surowica/osocze- 70-105 mg/dl (3,89-5,83 mmol/l) Mocz- 5-15 mg/dl (0,28-0,83 mmol/l) Do diagnozowania cukrzycy i lub osłabionej tolerancji glukozy (GT) WHO zaleca następujące kryteria: Krew żylna - Cukrzyca na czczo =lub> 140 mg/dl 2 godz. po jedzeniu 200 mg/dl Krew kapilarna - Cukrzyca na czczo =lub> 140 mg/dl 2 godz. po jedzeniu 220 mg/dl Krew żylna - GT na czczo < 140 mg/dl 2 godz. po jedzeniu 140-200 mg/dl Krew kapilarna - GT na czczo < 140 mg/dl 2 godz. po jedzeniu 160-220 mg/dl 4
Oznaczanie stężenia glukozy w surowicy metodą o-toluidynową O-toluidyna (o-metyloanilina) w środowisku bezwodnym w temperaturze 100 o C reaguje z furfuralowymi pochodnymi aldoz. W tych warunkach powstaje barwny kompleks o zabarwieniu niebieskim. Natężenie barwy, proporcjonalne do stężenia glukozy, mierzy się kolorymetrycznie. Metodą tą oznacza się także galaktozę i mannozę. Fruktoza reaguje słabo w tych warunkach. Wpływ fruktozy i pentoz pozostaje wyeliminowany przez dokonanie pomiaru przy długości fali 630 nm. W metodzie tej przeszkadzają także leki zawierające grupę aldehydową. Znacznie zawyżone wyniki uzyskuje się u pacjentów otrzymujących dekstran. WYKONANIE ĆWICZENIA: Materiał badany: Surowica Odczynniki: 1. Odczynnik o-toluidynowy 2. Odczynnik odbiałczajacy 10% kwas trójchlorooctowy (TCA) 3. Wzorcowe roztwory glukozy o stężeniach: 50, 100, 250, 500 i 1000 mg/dl Uwaga Odczynnik o-toluidynowy jest szkodliwy dla zdrowia (kancerogenny i żrący). Należy odmierzyć go dozownikiem strzykawkowym, biuretą lub mikropipetą dozującą (wykonuje prowadzący ćwiczenie). Od momentu dodania odczynnika o-toluidynowego należy zachować szczególną ostrożność, w szczególności unikać wdychania par 1. Przygotowanie prób wzorcowych. W sześciu oznaczonych probówkach przygotować próby wzorcowe. Zawartość probówki W1 traktować jako próbę odczynnikową. Odmierzyć składniki według poniższej tabeli (objętości w ml): Roztwory wzorcowe glukozy Nr probówki Woda Odczynnik destylowana odbiałczający 50 mg/dl 100 mg/dl 250 mg/dl 500 mg/dl 1000 mg/dl W1 0,6 0,5 - - - - - W2 0,5 0,5 0,1 - - - - W3 0,5 0,5-0,1 - - - W4 0,5 0,5 - - 0,1 - - W5 0,5 0,5 - - - 0,1 - W6 0,5 0,5 - - - - 0,1 5
2. Przygotowanie próby badanej. Do probówki wirówkowej odmierzyć następujące odczynniki (w ml): woda destylowana 0,5 odczynnik odbiałczający 0,5 surowica 0,1 Zawartość probówki wymieszać. Próbkę ustawić na wadze szalkowej i zrównoważyć, umieszczając na drugiej szalce pustą probówkę wirówkową i dopełniając ją wodą destylowaną. Obie probówki umieścić naprzeciwlegle w wirówce. Wirować 10 min. przy 2000 obr/min. (wykonuje prowadzący ćwiczenie). 2. Przygotowanie reakcji z odczynnikiem o-toluidynowym. Do siedmiu czystych probówek odmierzyć składniki wg tabeli (objętości w ml): Numer probówki odczynnik o-toluidynowy supernatant z próby badanej Zawartość probówek z pkt. 1. W1 W2 W3 W4 W5 W6 1 1,0-0,2 - - - - - 2 1,0 - - 0,2 - - - - 3 1,0 - - - 0,2 - - - 4 1,0 - - - - 0,2 - - 5 1,0 - - - - - 0,2-6 1,0 - - - - - - 0,2 B 1,0 0,2 - - - - - - Wymieszać, probówki przykryć luźno folią aluminiową i wstawić do wrzącej łaźni wodnej dokładnie na 8 minut. Po tym czasie próby ochłodzić w zimnej wodzie. Do każdej próbówki dodać po 1 ml wody destylowanej, delikatnie wymieszać. Zmierzyć absorbancję prób wzorcowych (probówki nr 2-6) i próby badanej (probówka B) względem próby odczynnikowej (probówka nr 1) przy długości fali 630 nm. 3. Wykonanie krzywej standardowej. absorbancja 50 100 250 500 1000 stężenie glukozy [mg/dl] Na podstawie absorbancji dla prób wzorcowych (probówki nr 2-6) wykreślić krzywą standardową i na tej podstawie określić stężenie glukozy w próbie badanej (probówka B). 6
ZAGADNIENIA DO ĆWICZENIA: 1. Hipoglikemia - definicja, przyczyny. 2. Hiperglikemia - definicja, przyczyny. 3. Cukrzyca: definicja, rodzaje. Leczenie. 3. Hormony regulujące stężenie glukozy we krwi. 4. Metody oznaczania glukozy (metody enzymatyczne, metoda kondensacyjna o-toluidynowa, polarymetryczna, fermentacyjna, redukcyjna Nelsona). LITERATURA: 1. Ćwiczenia z biochemii Leokadia Kłyszejko-Stefanowicz, Wydawnictwo Naukowe PWN, Warszawa 2003 2. Biochemia Harpera Robert K. Murray, Daryl K. Granner, Peter A. Mayes, Victor W. Rodwell, [(red.)] Franciszek Kokot Wydawnictwo Lekarskie PZWL, Warszawa 2002, wyd. 5 3. Wybrane zagadnienia z biochemii ogólnej z ćwiczeniami Teresa Kędryna, Maria Gałka-Walczak, Barbara Ostrowska Wydawnictwo Uniwersytetu Jagiellońskiego, Kraków 2001, wyd. 1 7