Laboratorium Laserowej Spektroskopii Molekularnej PŁ
Mikroskop (gr. μικρόσ mikros - "mały" i ςκοπέω skopeo - "patrzę, obserwuję") jest urządzeniem służącym do obserwacji małych obiektów, zwykle niewidocznych gołym okiem. Pierwsze mikroskopy były mikroskopami optycznymi, w których do oświetlania obserwowanych obiektów wykorzystywano światło dzienne. Za twórców tego rodzaju mikroskopów uważa się Holendrów: Zachariasza Janssena i jego ojca Hansa Janssena. Pierwsze konstrukcje wykonali oni około roku 1590. Ze względu na słabe powiększenie (10 razy) mikroskopy nie zdobyły wtedy uznania jako narzędzie badawcze. mikroskop Carl Zeiss 1879
Przełomu dokonał wynalazca i przedsiębiorca Antonie van Leeuwenhoek, który udoskonalił konstrukcję mikroskopu, a następnie rozwinął produkcję tych urządzeń w XVII wieku. Leeuwenhoek jako pierwszy obserwował żywe komórki pierwotniaki, erytrocyty itp. Wykorzystanie mikroskopu przyczyniło się do ogromnego postępu w biologii. Naukowcy mogli badać, co dzieje się we wnętrzu żywych organizmów. Powstały nowe dziedziny nauki, cytologia oraz mikrobiologia. Dzięki wykorzystaniu mikroskopu możliwy był ogromny postęp w leczeniu chorób zakaźnych. W roku 1882 Robert Koch odkrył z pomocą mikroskopu bakterie gruźlicy. Mikroskop wykorzystano do obserwacji podziału chromosomów w jądrze komórkowym. W roku 1910 Thomas Hunt Morgan udowodnił, że chromosomy są nośnikami genów dając początek genetyce. W technologii materiałowej mikroskopy wykorzystywano do obserwacji struktur metali albo innych materiałów. W ten sposób możliwe stało się opracowanie doskonalszych stopów metali wykorzystywanych w przemyśle. Kolejnym przełomem stało się wykorzystanie w mikroskopie elektronów. W roku 1931 pierwszy mikroskop elektronowy skonstruowali Ernst Ruska i Maksem Knollem w Berlinie. Możliwa stała się obserwacja najmniejszych struktur organelli komórkowych. W technologii wykorzystanie mikroskopów elektronowych stało się podstawą rewolucji krzemowej. Bez technik sprawdzania jakości wykonywanych w półprzewodnikach struktur nie udałoby się dokonać tak ogromnego postępu w tej dziedzinie.
W roku 1982 mikroskopia uczyniła pierwszy krok w kierunku świata atomów. Pracujący w Zurychu naukowcy Gerd Binnig oraz Heinrich Rohrer skonstruowali mikroskop STMskaningowy mikroskop tunelowy. Pozwolił on na obserwację struktur złożonych z pojedynczych atomów. Późniejsze prace doprowadziły do budowy szeregu odmian tego mikroskopu pozwalających na badanie różnych właściwości materii w skali nanometra. Niezwykłą cechą mikroskopu STM była jego zdolność nie tylko do obserwacji atomów, ale również manipulacji nimi. Obecnie badacze przewidują, że postęp w mikroskopii przyczyni się znacznie do rozwoju nanotechnologii, która może znaleźć zastosowanie w prawie każdej dziedzinie życia. Mikroskop jest zbudowany z: okularu, który służy do powiększenia obrazu tworzonego przez obiektyw mikroskopu, tubusa, który służy do formowania powiększonego obrazu pośredniego, śruby makrometrycznej, która służy do wstępnej regulacji odległości, śruby mikrometrycznej, która służy do ustalenia ostrości, rewolweru, który umożliwia prostą zmianę obiektywu, obiektywów, które zbierają światło wychodzące z przedmiotu i tworzą jego powiększony obraz pośredni, kondensora, który koncentruje światło formując z niego stożek, lusterka, które służy do naświetlania badanego obiektu;
Mikroskopia konfokalna jest odmianą mikroskopii świetlnej charakteryzująca się zwiększonym kontrastem, a zatem i rozdzielczością. W zwykłej mikroskopii (szerokiego pola, w tym mikroskopie fluorescencyjnym) próbka jest oświetlana przez źródło światła w całości. W odpowiedzi na to, albo odbija światło, albo fluoryzuje, przy czym sygnały te są zbierane przez obiektyw. Obiektyw zbiera sygnał nie tylko z miejsca ogniskowania, ale z całego przekroju próbki. Powoduje to, że tło wobec sygnału z miejsca ogniskowania jest dość wysokie, co zmniejsza kontrast. Zastosowanie przesłony z małym otworem przed detektorem (na przykład kamerą CCD), odcina sygnał dochodzący spoza płaszczyzny ogniskowania, co znacznie powiększa kontrast i jakość uzyskanego obrazu. Podstawy obrazowania konfokalnego zostały opatentowane przez Marvina Minsky'ego w 1961.
Zasada działania mikroskopu konfokalnego Promień lasera pada na lustro dichroiczne o selektywnym odbiciu fal świetlnych Wiązka przechodzi przez lustra skanujące, które dzięki minimalnym ruchom obrotowym mogą nią kierować Obiektyw skupia wiązkę w jednym punkcie, która wzbudza wyznakowany barwnikiem preparat co powoduje emisję dłuższej fali świetlnej Wiązka powraca tą samą drogą przez lustra skanujące i dichroiczne, po czym natrafia na przesłonę z niewielkim otworem Wreszcie wiązka dociera do detektora. Taki sygnał zostaje zamieniony przez przetworniki analogowo-cyfrowe na postać cyfrową i przeanalizowany przez komputer.
http://www.microscopyu.com/articles/confocal/confocalintr obasics.html Mikroskopia konfokalna ma wiele zalet w porównaniu z konwencjonalną mikroskopią optyczną. Cechują ją wysoki kontrast i rozdzielczość. Światło, które jest wzbudzane w punktach leżących poza ogniskiem jest eliminowane przez system pinholi i nie bierze udziału w tworzeniu obrazu. Wynikiem tego jest obraz niezawierający składowych pochodzących z płaszczyzn innych niż ogniskowa. Dzięki temu rozdzielczość i kontrast w tym mikroskopie są lepsze niż w zwykłym mikroskopie fluorescencyjnym.
Porównanie skanowania szerokopasmowego i punktowego w mikroskopii konwencjonalnej i konfokalnej porównanie obrazów nabłonka skrzydła motyla barwionego jodkiem propidyny http://www.microscopyu.com/articles/confocal/confocalintr obasics.html
Znaczniki Probe Ex (nm) Em (nm) MW Notes Hydroxycoumarin 325 386 331 Succinimidyl ester Aminocoumarin 350 445 330 Succinimidyl ester Methoxycoumarin 360 410 317 Succinimidyl ester Cascade Blue (375);401 423 596 Hydrazide Pacific Blue 403 455 406 Maleimide Pacific Orange 403 551 Lucifer yellow 425 528 NBD 466 539 294 NBD-X R-Phycoerythrin (PE) 480;565 578 240 k PE-Cy5 conjugates 480;565;650 670 aka Cychrome, R670, Tri-Color, Quantum Red
Rozpraszanie promieniowania Czy promieniowanie elektromagnetyczne, w którym nie ma fotonów pasujących do odstępów między poziomami energetycznymi, w ogóle nie oddziałuje z molekułami? Molekuła jest zbiorem ładunków elektrycznych dodatnich i ujemnych. Składowa elektryczna promieniowania elektromagnetycznego musi z nimi oddziaływać. Indukuje ona w molekule moment dipolowy proporcjonalny do natężenia E składowej elektrycznej pola, przy czym współczynnikiem proporcjonalności jest polaryzowalność molekuły. (1) (2)
(3) (4) Opisane zjawisko nazywamy rozpraszaniem promieniowania Ilustracja rozpraszania
Widmo RAMANA Teoria polaryzowalności Placzka (1) polaryzowalność: potencjalna zdolność przemieszczania się elektronów względem jąder w polu elektrycznym (2) (3) (4)
(5) polaryzowalność zmienia się z częstością drgania normalnego, ale tylko wtedy gdy pochodna polaryzowalności po współrzędnej drgania nie jest równa zero ostatecznie można pokazać, że: (6) rozpraszanie Rayleigha rozpraszanie Ramana skladowa stokesowska rozpraszanie Ramana skladowa antystokesowska
Zamiast wykrywać sumaryczną intensywność światła z danego punktu próbki, sygnał rozkłada się na widmo za pomocą spektrometru Można uzyskiwać różne widma: absorpcji, transmisji, odbiciowe, fluorescencji, Ramana, itp. Technika Ramana znakomicie współgra z mikroskopią konfokalną ze względu na wysoką specyficzność wykrycia struktur chemicznych, brak konieczności skomplikowanego przygotowana próbek, w odpowiednich warunkach dobrą jakość sygnału http://www.mitr.p.lodz.pl/raman http://www.witec.de
ZALETY MIKROSKOPII KONFOKALNEJ: Zastosowanie pinhola przed detektorem (na przykład kamerą CCD), odcina sygnał dochodzący spoza płaszczyzny ogniskowania, co znacznie powiększa kontrast i jakość uzyskanego obrazu ostrość i barwność. Możliwość rekonstrukcji obrazu 3D i 4D. Pozwala na rejestrowanie obrazów cienkich warstw preparatu, czyli przekrojów optycznych badanych obiektów. Z tego powodu jest on często stosowany do rejestracji serii przekrojów optycznych na różnych głębokościach preparatu. Eliminuje problem poświaty wynikającej z warstw preparatu leżących poza płaszczyzną ostrości. Oferuje lepszą rozdzielczość niż tradycyjna mikroskopia optyczna. Możliwość wizualizacji żywych preparatów.
WADY MIKROSKOPII KONFOKALNEJ : Wpływ czynników otoczenia. Blaknięcie. Fototoksyczność. Nadal gorsza rozdzielczość niż w mikroskopie elektronowym. Wysoka cena. http://www.microscopyu.com/articles/confocal/confocalintr obasics.html
Przykłady zastosowań: 1. Analiza tkanek gruczołu piersiowego ex-vivo http://www.mitr.p.lodz.pl/raman http://www.witec.de
1. Analiza tkanek gruczołu piersiowego ex-vivo Widma Ramana a) i b) tkanka zdrowa c) tkanka nowotworowa http://www.mitr.p.lodz.pl/raman http://www.witec.de
2. Analiza komórek skóry in-vivo skóra sucha skóra nawilżona http://www.horiba.com
3. Widma komórek bakterii widok kolonii bakterii widmo Ramana pojedynczej komórki bakterii http://www.horiba.com
4. Analizy farmaceutyczne kofeina kwas acetylosalicylowy paracetamol- N-(4- hydroksyfenylo)acetamid widma Ramana składników tabletki http://www.horiba.com
http://www.witec.de 5. Analiza polimerów
Laboratorium Laserowej Spektroskopii Molekularnej PŁ
Lasery impulsowe znalazły szerokie zastosowanie w spektroskopii rozdzielczej w czasie. Ze względu na rozdzielczość czasową metody, zależną od długości trwania impulsu, spektroskopię dzielimy na: nanosekundową (10-9 s) pikosekundową (10-12 s) femtosekundową (10-15 s)
Do najczęściej stosowanych metod spektroskopowych rozdzielczych w czasie należą: Techniki badające zanik fluorescencji Techniki typu wiązka pompująca-wiązka sondująca (pump-probe) Metody nieliniowej wymuszonej spektroskopii Ramana Echo fotonowe Dudnienia kwantowe (quantum beats)
Techniki spektroskopii laserowej rozdzielczej w czasie dostarczają informacji o dynamice różnych procesów takich jak: Relaksacja reorientacyjna Solwatacja nadmiarowego elektronu Dynamika różnych reakcji np. izomeryzacja cis- trans; przeniesienie protonu w stanie wzbudzonym, przeniesienie elektronu, zmiany konfirmacyjne Rozfazowanie wibracyjne T 2 w podstawowym stanie elektronowym Relaksacja wibracyjna T 1 w podstawowym i wzbudzonym stanie elektronowym Wibracyjna predysocjacja
Schemat ilustrujący metodę wiązki pompującej -sondującej laser wiązka sondująca próbka detektor wiązka pompująca t x c t- opóźnienie wiązki sondującej względem pompującej x- różnica dróg optycznych c-prędkość światła sygnał uzyskiwany w spektroskopii absorpcyjnej metodą wiązki pompującej-sondującej
Częstość wiązki pompującej lub sondującej można zmieniać w szerokich granicach za pomocą przestrajalnych źródeł światła, takich jak: Generatory parametryczne (OPG) Oscylatory parametryczne (OPO) Wzmacniacze parametryczne (OPA) Źródła białego kontinuum (WC- emitujące niemonochromatyczne promieniowanie w szerokim zakresie) laser próbka detektor wiązka sondująca OPO wiązka pompująca
Metody generowania krótkich impulsów: Q - switching synchronizacja modów aktywna: modulowanie długości rezonatora L przez wprowadzenie w drgania jednego ze zwierciadeł, zastosowanie przetwornika optoakustycznego pasywne: nasycające się absorbenty, autosynchronizacja, modulowanie współczynnika wzmocnienia ośrodka aktywnego
przetwornik optoakustyczny periodyczne zmiany współczynnika załamania ośrodka przez zmianę gęstości wywołane fala dźwiękową metoda nasycających się absorbentów
WZMOCNIENIE 527 nmylf pompowanie powodujące inwersję obsadzeń Tsunami 800 nm Kryształ Ti +3 :Al 2 O 3 Jeżeli impuls przechodzi przez ośrodek nieliniowy, w którym utrzymywana jest inwersja obsadzeń (przez pompowanie z innego źródła) to impuls przechodząc przez ośrodek wywołuje emisję wymuszoną. W rezultacie wychodzący impuls zostaje wzmocniony.
wzmacniacz regeneratywny (wielokrotne przejście światła po tej samej drodze w rezonatorze). Tsunami-stretcher Output /4 PC1 Input PC2 M1 Merlin (YLF) 250 ns, Q-switch ośrodek aktywny (Ti +3 :Al 2 O 3 ) P thin layer polarizer M2
Analiza fotouczulaczy ZnPcS4-H2O, c=1x10-5 M MgPcS4-H2O, c=1x10-5 M MITR
LOA MITR Analiza wodnych roztworów elektrolitów
Dynamika femtosekundowa DPPC porównania próbek DPPC wet i dry MBI - Berlin MITR
LABORATORIUM LASEROWEJ SPEKTROSKOPII MOLEKULARNEJ Politechnika Łódzka Międzyresortowy Instytut Techniki Radiacyjnej 93-590 Łódź Wróblewskiego 15 tel:(48-42) 6313175, 6313162, 6313188 fax:(48-42) 6840043 http://www.mitr.p.lodz.pl/raman
Lasery światłowodowe. Zasada działania światłowodu. Zasada działania mikroskopu konfokalnego. Sposoby pomiaru impulsu femtosekundowego.