Polimorfizm genu mitochondrialnej polimerazy gamma (pol γ) w populacjach ludzkich Europy Praca wykonana pod kierunkiem dr hab. Tomasza Grzybowskiego w Katedrze Medycyny Sądowej w Zakładzie Genetyki Molekularnej i Sądowej CM UMK w Bydgoszczy w ramach grantu promotorskiego MNiSW 2P04C 076 27
Struktura genetyczna ludzkiego mtdna Kompleks I Kompleks IV Kompleks III Kompleks V trna rrna www.mitomap.org
Schemat drzewa filogenetycznego głównych haplogrup mtdna w populacjach europejskich Torroni i wsp. (2006) Palanichamy i wsp. (2004) Achilli i wsp. (2004 i 2005)
Mitochondrialna polimeraza γ jedyny enzym replikacyjny mtdna heterotrimer (2 podjednostki towarzyszące p55 i 1 podjednostka katalityczna p140) naleŝy do rodziny polimeraz DNA typu A wprowadza substytucje na drodze dyslokacji nici (CAG)n wg Graziewicz i wsp. (2006)
Mutageneza dyslokacyjna Dyslokacja nici matrycowej Starter Matryca Starter 5 -TCCT-3 TTCT Matryca wg Malyarchuka i Rogozina (2004)
Cel pracy Scharakteryzowanie polimorfizmu genu mitochondrialnej polimerazy gamma (polγ) w wybranych populacjach europejskich pod kątem określenia moŝliwego wpływu liczby powtórzeń CAG w genie kodującym katalityczną podjednostkę enzymu na zmienność sekwencji regionu kontrolnego (HVS I i HVS II) oraz przynaleŝność haplogrupową mtdna.
Cele szczegółowe analiza zmienności liczby powtórzeń CAG w POLG w populacjach europejskich porównanie rozkładu częstości alleli i genotypów CAG POLG w populacjach europejskich i azjatyckich zestawienie rozkładu genotypów CAG POLG z rozkładem mutacji mtdna powstałych na drodze dyslokacji nici porównanie rozkładu częstości genotypów POLG z rozkładem częstości haplogrup mtdna w tych samych populacjach
Cele szczegółowe określenie ewentualnego związku między genotypami CAG POLG a przynaleŝnością haplogrupową mtdna określenie pełnych sekwencji genomów mitochondrialnych, które naleŝą do haplogrup wykazujących taki związek ocena spektrum mutacji w pełnych sekwencjach mtdna w świetle aktualnej wiedzy o filogenezie ludzkiego mtdna
Materiał badawczy DNA z krwi i/lub włosów pochodzący od niespokrewnionych osób z populacji polskiej, rosyjskiej, romskiej i bośniackiej (N = 969) próbki o znanej sekwencji regionów superzmiennych HVS I i/lub HVS II tych samych osób z populacji polskiej, rosyjskiej, romskiej i bośniackiej (N = 818) dla celów porównawczych wykorzystano dane o częstościach alleli i genotypów CAG POLG w populacjach azjatyckich (Malyarchuk i wsp. 2005)
Metody analiza molekularna amplifikacja fragmentu genu POLG za pomocą starterów znakowanych fluorescencyjnie określenie wielkości produktów amplifikacji w denaturującym Ŝelu poliakrylamidowym sekwencjonowanie alleli CAG POLG sekwencjonowanie pełnych genomów mitochondrialnych wyselekcjonowanych próbek
Metody analiza statystyczna częstości alleli i genotypów heterozygotyczność międzypopulacyjne dystanse genetyczne F ST i R ST, AMOVA skalowanie wielowymiarowe (MDS) test homozygotyczności Ewensa-Wattersona test dla dwóch frakcji jednostronny dokładny test Fishera konstrukcja drzewa filogenetycznego metodą największej oszczędności
Wyniki Rozkład częstości alleli CAG POLG w populacjach europejskich 100 częstość [%] 80 60 40 20 0 6- CAG 7- CAG 8- CAG 9- CAG 10- CAG 11- CAG 12- CAG 13- CAG Serie1 allel
Wyniki Rozkład częstości genotypów CAG POLG w populacjach europejskich częstość [%] 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0 10;10 10;11 10;12 6;10 7;10 8;10 9;10 9;9 9;12 8;11 11;11 11;12 11;13 średnia heterozygotyczność wynosi ok. 0,2 Serie1 genotyp
Wyniki Struktura sekwencji alleli CAG POLG 13-CAG (CGG) 3 (CAG) 13 CAA(CAG) 2 12-CAG (CGG) 3 (CAG) 12 CAA(CAG) 2 11-CAG (CGG) 3 (CAG) 11 CAA(CAG) 2 10-CAG (CGG) 3 (CAG) 10 CAA(CAG) 2 9-CAG (CGG) 3 (CAG) 9 CAA(CAG) 2 8-CAG (CGG) 3 (CAG) 8 CAA(CAG) 2 7-CAG (CGG) 3 (CAG) 7 CAA(CAG) 2 6-CAG (CGG) 3 (CAG) 6 CAA(CAG) 2
Neutralność selekcyjna sekwencji CAG POLG w populacjach euroazjatyckich F o 0,771 0,864 0,926 F e 0,486 0,561 0,597 p Europa 0,917 Azja płnwsch Azja płdzach 0,915 wyniki testu homozygotyczności Ewensa-Wattersona mogą wskazywać na istnienie selekcji F e homozygotyczność oczekiwana F o homozygotyczność obserwowana p poziom istotności 0,942 pozytywnej na allel 10-CAG
Analiza AMOVA dla populacji Eurazji z wykorzystaniem dystansów F ST i R ST wyznaczonych na podstawie częstości genotypów CAG POLG R ST Rozkład wariancji genetycznej (%) największą część zmienności CAG POLG stanowi zróŝnicowanie wewnątrz populacji Dystans genetyczny Pomiędzy regionami 1,08 (0,0001) Pomiędzy populacjami w obrębie regionów 6,61 (0,0105) Pomiędzy osobnikami wewnątrz populacji znamienne statystycznie zróŝnicowanie występuje 2,37 4,45 93,18 F ST między regionami oraz (0,0000) (0,0307) (0,0079) między populacjami wewnątrz regionów 92,31 (0,0037)
Substytucje powstałe na drodze mechanizmu dyslokacji nici w regionach HVS I i HVS II u osób o róŝnych genotypach CAG POLG w populacji Polaków, Bośniaków i Rosjan częstość [%] częstość [%] 300 18 14 300 16 250 12 14 250 10 200 200 12 10 1508 8 1006 150 100 4 504 2 0 50 0 0 10;11/10;12; p<0,05 10;10/10;12, 10;11/10;12, p<0,05 10;10/10;12, p<0,05 10;10/11;11, p<0,05 C>T T>C G>A A>G C>A A>C G>C C>T T>C G>A A>G HVS I HVS mutacje I G>A HVS II HVS I I C>A T>C 10;10 10;10 10;11 10;11 10;12 10;12 11;11 11;11 11;11 11;12 11;12 11;12
Częstość występowania haplogrup mtdna u osób o róŝnych genotypach CAG POLG w populacji Polaków, Bośniaków i Rosjan 80 70 częstość [%] 60 50 40 30 20 10 10;10 10;11 10;12 11;11 9;10 11;12 8;10 0 HV JT KU M N haplogrupy
Analiza MDS klasycznych dystansów F ST wyznaczonych na podstawie częstości haplogrup mtdna w grupach osób o róŝnych genotypach CAG POLG
Drzewo największej oszczędności odtworzone z wykorzystaniem sekwencji pełnych genomów mtdna VC#06 Carelli i wsp. (2006) SF#175 Finnilä i wsp. (2001) 16519 16294 15928 15607 14905 13368 10463 8697 4917 1888 709 T 16189 16163 12633A T1 16186 9899 195 152 T1a 14281 10143 16209 16163 15852 198 B145 SF#175 16126 15452A 11251 4216 JT 16069 13708 12612 10398 489 295 J 15257 7476 152 150 J2 16261 16231 16145 11377 10499 215 195 J2a 14133 7789 513 319 13722 10003 8440 1850 430 309-310insT B444 16284 15055 12501 11704 6635 4491 VC#06 3010 462 J1 14798 228 7184 482 J1c1 J1c 10192 5198 2387 742 522-523delAC 16519 3866 188 185 R 12372 12308 11467 U 16270 13617 9477 3197 U5 14182 7768 150 U5b 5656 U5b1 16189 12618 10927 7385 16311 16192 15191 U5b1b U5b1c 16288 16174 16140 9707 5899-5900insC 5120 516 B74 B378 B384 11719 73 R0 14766 HV 7028 2706 H 3010 4769 1438 H2 H1 15326 8860 750 263 16162 73 H1a 8271T H1a2 16519 3591 B105 rcrs - - - syn - Pętla D Pętla D 16S rrna ATP8 trna Gly 309-310 inst T430C T1850C A8440G T10003C J2a 11;11 B444 K Zmiana aa Lokalizacja Mutacje peryferyjne HG Genotyp CAG POLG Nr próbki
Wnioski silna konserwatywność sekwencji CAG w genie POLG występuje w obrębie powtórzeń oraz w obszarze flankującym sekwencja CAG w POLG moŝe się znajdować pod naciskiem selekcji naturalnej, która faworyzuje korzystny allel o 10 powtórzeniach CAG róŝny nacisk selekcyjny moŝe być wywierany na powtórzenia CAG w POLG w populacjach Europy i Azji
Wnioski brak allela 10-CAG lub jego obecność w dawce heterozygotycznej zwiększa częstość niektórych mutacji powstających w czasie replikacji w regionie kontrolnym mtdna na drodze dyslokacji nici brak allela 10-CAG jest związany z przynaleŝnością mtdna do kladu JT brak jest dowodów potwierdzających wpływ liczby powtórzeń CAG w POLG na częstość i charakter mutacji w regionie kodującym mtdna
Dziękuję za uwagę