Spektrometria mas związków organicznych z chromatograficznym wprowadzeniem próbki Sprzężenie chromatografu gazowego ze spektrometrem mas jest potężnym narzędziem w oznaczaniu lotnych i półlotnych związków organicznych w wielu matrycach środowiskowych takich jak powietrze, woda, gleba, w materiałach zawierających polimery naturalne lub syntetyczne, a także w tkankach organizmów żywych. W układzie GC/MS kolumna chromatograficzna pełni rolę separatora składników analizowanej mieszaniny, zaś detektor mas rejestruje ich widma masowe, na podstawie których składniki rozdzielonej mieszaniny można zidentyfikować. Zachodząca w detektorze mas fragmentacja związku organicznego dostarcza charakterystycznego dla niego widma, które porównuje się z tzw. biblioteką widm (widma uzyskane przez różnych badaczy na całym świecie). Spektrometr mas Kolumna chromatograficzna dostarcza rozdzielone związki do źródła jonów spektrometru zgodnie z ich czasami retencji. Do identyfikacji i oznaczania węglowodorów aromatycznych wykorzystano spektrometr mas HP 5973. Podstawowe zespoły urządzenia to: układ pomp próżniowych (vacuum pumps) źródło jonów (ion source) soczewki skupiające wiązkę jonów (focusing lens) analizator kwadrupolowy (analyzer) detektor właściwy (detector) Rysunek 1. przedstawia schemat spektrometru mas. Rys. 1.a. Schemat blokowy spektrometru mas 1
Rys. 1.b. Schemat działania spektrometru mas HP 5973. Układ wytwarzania wysokiej próżni Zadaniem spektrometru jest zarejestrowanie sygnału pochodzącego od bardzo małej ilości jonów, gdyż tylko mała część próbki ulega jonizacji (jedna cząsteczka na tysiąc). Najczęściej stosowana jonizacja elektronami wymaga wysokiej próżni tak, aby powstały jon molekularny nie miał możliwości przekazywania energii innym cząsteczkom i jonom podczas zderzeń. Aby średnia droga swobodna jonu była porównywalna z długością analizatora, konieczne jest wytworzenie próżni w skrzyni analizatora rzędu 10-5 Torr (1 Torr = 1 mm Hg). Jest to realizowane w układzie dwóch pomp: pompy wstępnej (rough pump) połączonej z pompą turbomolekularną (turbo pump). Pompa wstępna posiada tradycyjny układ rotorowy, w którym tłok umocowany niecentrycznie na wale napędowym na przemian zasysa gaz z układu próżni i tłoczy go na zewnątrz dzięki ciśnieniowym zaworom sprężynowym. Wirnik pompy turbo (rys. 2) zaopatrzony jest w zagięte ostrza, ułożone promieniście względem rdzenia wirnika. Obracające się z szybkością 60000-80000 obrotów na minutę ostrza zagarniają cząsteczki powodując ich ruch ku dołowi, gdzie zostają zassane przez pompę wstępną. Ciśnienie wytwarzane przez pompę turbo wynosi, przy maksymalnym dopuszczalnym przepływie gazu nośnego 4 cm 3 /min, około 710-5 Torr, a osiągnięcie takiej próżni zajmuje do kilkunastu minut. Pompa turbomolekularna jest w stanie przetoczyć w ciągu sekundy 250 litrów gazu. Jest to konieczne, gdyż przy przepływie 1 cm 3 /min po rozprężeniu do ciśnienia rzędu 10-5 Torr otrzymałoby się kilkaset tysięcy cm 3 gazu pod tym ciśnieniem. 2
Rys 2. Pompa turbomolekularna. Źródło jonów Pary rozdzielonych chromatograficznie związków (sample molecules in vapor state) dostają się, przez termostatowane połączenie chromatografu ze spektrometrem do źródła jonów (rys. 3). Wiązka elektronów (electron beam) emitowanych z włókien wolframowych (filament) jonizuje mały ułamek cząsteczek wpływających do komory jonizacyjnej. Najczęściej stosuje się wiązkę elektronów o energii 70 ev, co odpowiada przeciętnej energii wiązań w cząsteczkach organicznych (długość fali 0,14 nm), pozwalając uzyskać maksymalną ilość jonów. Przyspieszacz jonów (repeller rys 1), spolaryzowany dodatnio, kieruje jony przez otwór w płytce przejściowej (drawout plate, acceleration plate) do układu soczewek (płytek) skupiających (focusing lens, plates). Cząsteczki obojętne są zasysane przez pompy próżniowe na zewnątrz spektrometru. Rys 3. Komora jonizacyjna. 3
Przy bombardowaniu elektronami o małej energii fragmentacja cząsteczek organicznych zachodzi w niewielkim stopniu i w widmie masowym występuje intensywny pik jonu molekularnego, natomiast w przypadku bombardowania elektronami o dużej energii następuje intensywna fragmentacja. Na rysunku poniżej przedstawiono widmo masowe kwasu benzoesowego C6H5COOH uzyskane przy jonizacji techniką EI i bombardowaniu elektronami o energii 9 ev, 15 ev i 30 ev (rys. 5) i 70 ev (Rys. 4). Rys. 4. Widmo masowe C6H5COOH uzyskane techniką EI o energii elektronów: a) 9 ev; b) 15 ev; c) 30 ev Układ soczewek skupiających Soczewki skupiające (rys. 5.) mają za zadanie uformować skupioną wiązkę wchodzącą do analizatora kwadrupolowego. Zarówno do soczewek skupiających jak i 4
wprowadzających jony do filtra mas (entrance lens) stosuje się napięcie stałe. Im większa wartość napięcia, tym większa czułość analizy związków niskocząsteczkowych. Rys. 5. Formowanie wiązki jonów wchodzących do kwadrupola. Analizator Jony wychodzące z układu soczewek osiągają kwadrupolowy filtr mas. Filtr pokazany na rys. 5, jest kształtką kwarcową pokrytą warstwą złota w celu zmniejszenia niejednorodności powierzchni, a co za z tym idzie, niejednorodności pola elektrycznego między prętami. Elementy kształtki są połączone ze sobą w taki sposób, że podłużne segmenty położone obok siebie nie mają kontaktu elektrycznego, zaś położone naprzeciwlegle są ze sobą połączone. Działanie kwadrupola najlepiej wyjaśnić przedstawiając filtr jako układ czterech prętów przewodzących prąd elektryczny. Do układu prętów przyłożone jest napięcie stałe U oraz napięcie sinusoidalnie zmienne Vcost (jak na rys. 6) gdzie oznacza częstość kątową (2f) zmian napięcia mieszczącą się w zakresie fal radiowych. Pręty spolaryzowane ujemnie (U-Vcost) są ustawione naprzeciw, podobnie jest z prętami spolaryzowanymi dodatnio (U-Vcost). Przyłożenie napięcia U powoduje że jon wprowadzony do wnętrza kwadrupola jest równomiernie przyciągany i odpychany (równomierny rozkład natężenia pola). W takim przypadku przez kwadrupol przelecieć mogą jony o dowolnej masie i ładunku. Przyłożenie napięcia zerowego lub bardzo niskiego nie zrównoważyłoby siły grawitacji jony w kwadrupolu poruszałyby się torem parabolicznym. Przyłożenie tylko napięcia przemiennego sinusoidalnie wprowadza jony w ruch drgający w płaszczyznach prostopadłych do siebie, wzdłuż osi kwadrupola. Jednak tory jonów o niższej masie, niż odpowiadająca amplitudzie V wykraczają poza kwadrupol. Złożenie napięcia stałego i przemiennego pozwala na uzyskiwanie stabilnych trajektorii lotu jonów o danej 5
masie, tylko dla danej kombinacji U i V. odgrywa drugorzędną rolę; jej wartość jest stała i zależna od konstrukcji kwadrupola. Nazwa filtr mas pochodzi od funkcji urządzenia, gdyż dla zadanych wartości U i Vcost filtr przepuszcza tylko jony o odpowiedniej wartości masy do ładunku m/z. Tor jonów przelatujących przez analizator może być opisany złożeniem sinusoid. Przy zadanej częstości zmian napięcia jony o określonym stosunku m/e uzyskują warunki rezonansu to znaczy drgają w rytm zmian napięcia przykładanego na pręty analizatora. Pozostałe jony są zbyt silnie przyciągane lub odpychane przez elektrody, a przyspieszenia spowodowane polem elektrycznym są zbyt duże lub zbyt małe wobec bezwładności masy jonu. Końcem ich wędrówki przez kwadrupol jest rozładowanie na ujemnie spolaryzowanych elementach spektrometru. Rys. 6. Kwadrupol. Detektor właściwy - powielacz Po przejściu przez filtr mas jony uderzają w wewnętrzną powierzchnię powielacza elektronów w kształcie rożka (rys. 7). Na rożku panuje wysokie napięcie (rzędu kilku tysięcy V) i jony zderzające się z powierzchnią powodują emisję elektronów. Wiązka wyemitowanych elektronów uderza w inną część powielacza, a energia kinetyczna każdego z elektronów powoduje wybicie kilkunastu elektronów z płytki powielacza. Napięcie powielacza ustala się w zależności od stężenia analitów, w granicach 0-3000 V. Im niższe stężenie substancji oznaczanych tym niższe (zmierzające do -3000 V) powinno być napięcie na powielaczu. 6
Rys. 7. Dynoda wzmacniająca prąd jonowy. Tryby pracy kwadrupolowego detektora mas Możliwe są dwa tryby pracy detektora mas: SCAN (Scanning) Rejestracja pojedynczego punktu chromatogramu to zapis całkowitego prądu jonów którym udało się przejść przez kwadrupol i dotrzeć do powielacza. Zbieranie punktu na chromatografie wiąże się z dyskretną, równoczesną zmianą napięcia U i amplitudy V w bardzo krótkim przedziale czasu od kilku do kilkudziesięciu milisekund. Kolejnym kombinacjom U i V (UV) 1, (UV) 2,.. (UV) n odpowiadają masy jonów stabilnych m 1, m 2,... m n. Każdemu punktowi chromatogramu przyporządkowane jest widmo złożone z jonów o masie m 1, m 2,... m n. Im mniejszy zakres monitorowanych mas, tym więcej jonów o danej masie zostanie zarejestrowanych. SIM (Selected Ions Measurement) Aby zwiększyć czułość aparatu należy jak najbardziej zmniejszyć zakres mas jonów. Ostatecznie zamiast stosować przemiatanie w zakresie kilkudziesięciu jednostek masy atomowej np. od 40 do 100 (40, 41, 42,.. 98, 99, 100) można wybrać kilka mas o największych intensywnościach charakterystycznych dla oznaczanego związku chemicznego. Przykładowo dla toluenu największą intensywność rejestruje się dla jonów: 91, 92, 65. Aby wiedzieć, które jony wybrać należy wpierw zarejestrować widma mas dla bardziej stężonej próbki substancji w trybie SCAN. Widmo, a struktura cząsteczki Chromatogram uzyskany w pomiarze SCAN oprócz charakterystyki całkowitego prądu jonowego w czasie (rys. 8A), zawiera również, dla każdego punktu chromatogramu, 7
informacje o składowych prądach pochodzących od różnych jonów czyli widmo mas (rys. 8B). Widmo mas zawiera informację o ilości wybranych jonów (np. 106 m/z) względem jonów pozostałych. Dzięki temu uzyskuje się dodatkową informację jakościową (oprócz czasu retencji), gdyż dany związek organiczny rozpada się w źródle jonów na charakterystyczną liczbę charakterystycznych jonów. Na podstawie jednego widma czasami można zaproponować kilka różnych struktur związku, oraz niektóre izomery mają praktycznie nierozróżnialne widma mas. W takich przypadkach należy wspomagać się inną techniką analityczną, która rozwieje wątpliwości spektroskopia NMR, IR, czy użyć wzorca lub skorzystać z indeksów retencji. Jednak w przypadku próbek środowiskowych o znanym pochodzeniu i spodziewanym składzie spektrometria mas oddaje nieocenione usługi w analizie jakościowej i ilościowej. A b u n d a n c e T I C : H S G R 7 _ 2 2. D 7 5 0 0 0 0 0 7 0 0 0 0 0 0 4. 1 7 6 5 0 0 0 0 0 6 0 0 0 0 0 0 5 5 0 0 0 0 0 6. 4 8 5 0 0 0 0 0 0 4 5 0 0 0 0 0 9. 5 6 4 0 0 0 0 0 0 3 5 0 0 0 0 0 3 0 0 0 0 0 0 2 5 0 0 0 0 0 2 0 0 0 0 0 0 1 5 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 2. 6 4 6. 2 8 7. 0 5 8. 7 8 8. 8 1 9. 2 2 8. 5 78. 9 5 T i m e - - > 5 0 0 0 0 0 3. 0 0 4. 0 0 5. 0 0 6. 0 0 7. 0 0 8. 0 0 9. 0 0 A A b u n d a n c e 1 6 0 0 0 0 0 S c a n 5 0 5 4 ( 6. 4 8 2 m i n ) : H S G R 7 _ 2 2. D ( - ) 9 1 1 5 0 0 0 0 0 1 4 0 0 0 0 0 1 3 0 0 0 0 0 1 2 0 0 0 0 0 1 1 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 9 0 0 0 0 0 8 0 0 0 0 0 1 0 6 7 0 0 0 0 0 6 0 0 0 0 0 5 0 0 0 0 0 4 0 0 0 0 0 3 0 0 0 0 0 2 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 m / z - - > 2 7 3 9 5 1 6 5 1 5 9 8 8 5 1 1 9 1 3 3 7 7 1 0 2 0 3 0 4 0 5 0 6 0 7 0 8 0 9 0 1 0 0 1 1 0 1 2 0 1 3 0 1 4 0 B Rys. 8. Chromatogram z oznaczenia związków organicznych w wodzie A i widmo mas dla punktu chromatogramu o czasie retencji 6,48 min (szczyt piku) - B. Powstawanie widma Po separacji na kolumnie chromatograficznej cząsteczki danego związku zostają wprowadzone do źródła jonów gdzie panuje temperatura 200 300 C. W tej części spektrometru cząsteczki bombardowane są elektronami emitowanymi z włókien 8
wolframowych. Elektrony przelatujące w pobliżu wspomnianej cząsteczki powodują zakłócenie elektromagnetyczne i prowadzą do wybicia elektronu, przez co cząsteczka staje się kationorodnikiem zachowując masę cząsteczki. Jon powstały poprzez utratę jednego elektronu nazywany jest jonem molekularnym. Jeśli elektron został usunięty z zewnętrznej (walencyjnej) powłoki powstaje jon w podstawowym stanie elektronowym (o niższej energii) M.. Jony w podstawowym stanie elektronowym mogą występować we wzbudzonym stanie oscylacyjnym. Gdy cząsteczka traci elektron z głębszej powłoki jon w stanie elektronowym wzbudzonym (o wyższej energii) n M energia a M a M p M... M b M b M q A jak na poniższym schemacie: 1. 1 c M c M r B 2 widmo mas n e. 2 I tak w pierwszej kolejności z n cząsteczek o masie M, które uległy jonizacji, powstają jony molekularne w stanach nie wzbudzonych elektronowych, wzbudzonych oscylacyjnych i wzbudzonych elektronowych. Następnie jony molekularne w stanach wzbudzonych elektronowo, dokonują przegrupowania elektronu na zewnętrzne powłoki, a nadmiar energii pozwala na przejście w stany wzbudzone oscylacyjne np. M i.. 1 M2. Energia elektronowa zamieniona na energię drgań prowadzi do fragmentacji jonów molekularnych (nieparzystoelektronowych) na jony z parzystą liczbą elektronów walencyjnych np. Α lub Β. Na tym etapie kończy się fragmentacja. Może się jednak zdarzyć, że jon molekularny odszczepi cząsteczkę obojętną niebędącą rodnikiem (np. H 2O), tworząc jon nieparzystoelektronowy mogący fragmentować dalej. Także jony parzystolektronowe mogą odszczepiać takie cząsteczki. To czy dany jon jest widoczny w widmie zależy od jego czasu życia. Jony trwałe nie fragmentują dalej, docierają do powielacza i zaznaczają swoją obecność w widmie. Jony nietrwałe ulegają dość szybko fragmentacji i nie są widoczne w widmie. Jony o pośrednim czasie życia, tzw. jony o pośredniej trwałości (metastabilne), dają widoczny sygnał przy filtracji kwadrupolowej, ale nie są obecne w widmie po filtracji sektorowej (magneto-elektrycznej). Podczas fragmentacji poniższym schemacie obowiązuje reguła parzystego elektronu, przedstawiona na 9
Reakcje fragmentacji Fragmentacja węglowodorów Najłatwiejsze w ocenie jakościowej są widma węglowodorów alifatycznych i aromatycznych. Cechą widm węglowodorów alifatycznych jest podobieństwo wizualne, bogata fragmentacja i niska intensywność jonu molekularnego. Widmo n-dekanu zawiera jon molekularny o m/z = 142 związany z wybiciem jednego elektronu z cząsteczki. Jon ten dociera do powielacza i zostaje zarejestrowany sygnał. Jon molekularny węglowodorów alifatycznych jest nietrwały (parzysta masa i nieparzysta liczba elektronów) i ulega rozpadowi na jony o nieparzystej masie i nieparzystej liczbie elektronów, odszczepiając rodnik CH 3, CH3 -CH 2, CH 3-CH 2- CH 2, itp. Powstają wtedy odpowiednio kationy o m/z 127, 113, 99 itp. Największą intensywność (największą trwałość) osiągają jony powstające w wyniku odszczepienia rodnika CH 3-CH 2-CH 2-CH 2-CH 2-CH 2. Generalnie trwalszy jest rodnik mający dłuższy łańcuch. Reakcja fragmentacji polegająca na rozbiciu wiązania z wytworzeniem rodnika i kationu nazywa się rozszczepieniem. 10
Abundance 9000 #30005: Decane (CAS) $$ n-decane $$ Isodecane $$ n-c10h22 $ 57 43 8000 7000 6000 5000 4000 71 85 3000 29 2000 m/z--> 1000 0 113 15 37 51 65 77 91 126 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120 130 140 150 99 142 Rys 8. Widmo n-dekanu Wiązania C-H są w jonach molekularnych słabsze od wiązań C-C. Zdarza się zatem, głównie w węglowodorach rozgałęzionych, że w wyniku przegrupowania wodoru (oznaczenie rh), zostaje odszczepiona cząsteczka węglowodoru niebędąca rodnikiem, np. etan lub propan. Wtedy powstaje jon o parzystej masie np. 56 czy 70: Ponieważ jon o parzystej masie jest karbokationem, może fragmentować dalej ulegając tzw. rozszczepieniu czyli przeniesieniem elektronu z utworzeniem rodnika i kationu. W widmach obecne są też jony związane z obecnością izotopu C 13, mające m/z wyższe o 1 od jonów zawierających wyłącznie izotop C 12. Często jony fragmentacyjne odszczepiają H 2 tworząc jon stabilny o parzystej masie, zawierający wiązanie podwójne. Fragmentacja węglowodorów rozgałęzionych występuje najczęściej w pobliżu rozgałęzień: Jon węglowodorowy o m/z 57 łatwo odszczepia metan tworząc jon propenium (41), który przechodzi w trwalszy jon cyklopropenium (39) pozbywając się wodoru: 11
CH 3 H 3 C C + -CH 4 CH 3 H 3 C CH 2 -CH 4 + CH 2 CH 2 C H 2 41 CH CH 2 + -H 2 CH + HC CH 39 57 Jon molekularny utworzony z węglowodoru cyklicznego jest trwalszy w porównaniu z alkanami, a po rozpadzie fragmentuje jak alkan. Główne jony fragmentaryczne mają wartości m/e zgodne z formułą C nh 2n+1-2r gdzie r liczba pierścieni, tworząc jony o masach np. 27, 41, 55, 71, 85 itp. Po rozerwaniu pierścienia często odszczepia się etylen lub propylen, dając intensywny jon o parzystej m/z: Węglowodory pojedynczo nienasycone fragmentują z zachowaniem układu allilowego w łańcuchu jonu; ich widma zawierają jony o m/z: 41, 55, 69, 83, 97 itp.: równolegle, w mniejszym stopniu, występuje też fragmentacja typowa dla alkanów: 12
Abundance 9500 #5956: 2-Heptene, (E)- (CAS) $$ trans-2-heptene $$ (E)-2-H 55 9000 8500 8000 41 7500 7000 6500 6000 5500 27 5000 4500 4000 3500 3000 2500 2000 69 98 1500 1000 15 m/z--> 500 0 50 83 36 63 77 91 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 70 75 80 85 90 95 100105 Rys 9. Widmo 2-heptenu Przegrupowanie H i rozszczepienie indukowane miejscem rodnikowym prowadzi do odszczepienia alkenu i powstania jonu o parzystej masie (tu 56 m/z): Podwójne wiązanie w alkenach może migrować, przez co izomery mogą być nierozróżnialne. Widma węglowodorów aromatycznych składają się z niewielkiej ilości dość intensywnych pików. Najintensywniejsze sygnały pochodzą od jonów najtrwalszych. Trwałe są jony molekularne w przypadku propylobenzenu 120 m/z. W widmach arenów (związki aromatyczno - alifatyczne) monoaromatycznych najwięcej jest jonów związanych ze stabilizacją struktury kationu metylenobenzenowego o m/z = 91. Cechą charakterystyczną fragmentacji arenów i benzenu jest odszczepianie acetylenu i tworzenie jonów metastabilnych odpowiednio przy 65 i 52 m/z. Abundance 9500 #14927: Benzene, propyl- (CAS) $$ n-propylbenzene $$ Isocum 91 9000 8500 8000 7500 7000 6500 6000 5500 5000 4500 4000 3500 3000 2500 2000 120 m/z--> 1500 1000 500 0 27 39 51 65 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120 78 45 58 73 84 98 Rys 11. Widmo n-propylobenzenu 105 115 13
Często obecne są w widmach jony związane z migracją wodoru w monoalkilobenzenach, jak np. 77 (także 78 i 79) także odszczepiające acetylen: HC HC + CH CH CH CH 71 CH 2 H 2 C + + HC H 2 C CH 2 51 W widmie widoczne są piki jonów pochodzące z fragmentacji łańcucha alifatycznego np. 105 a także 91 m/z. Wprowadzenie do łańcucha węglowodorowego podstawników (grup funkcyjnych) nieco wzbogaca możliwości fragmentacji. Równocześnie z powyżej przedstawionymi reakcjami fragmentacji zachodzą reakcje związane z obecnymi w łańcuchu grupami. Podstawniki dzieli się na: nienasycone zawierające wiązanie wielokrotne np. O HO C O H C O H 2 N C C H 3 i nasycone posiadające wyłącznie wiązania pojedyncze np. H 2 C OH H 2 C NH 2 H 2 C Cl O O C 26 CH Literatura E. de Hoffmann, J. Charette, V. Stroobant. Spektrometria mas, WNT, Warszawa 1998. M. McMaster, Ch. McMaster, GC/MS, A Practical User s Guide, Wiley-VCH, New York, 1998 R.A.W. Johnstone, M. E. Rose, Spektrometria mas w chemii organicznej, PWN, Warszawa 2001, A. S. Płaziak, Spektrometria masowa związków organicznych, UAM, Poznań 1997, R. M. Silverstein, F. X. Webster, D. J. Kremle, Spektroskopowe metody identyfikacji związków organicznych, PWN, Warszawa 2007. 14