ĆWICZENIA Z MIKROBIOLOGII DLA STUDENTÓW KOSMETOLOGII

ZAKŁAD MIKROBIOLOGII FARMACEUTYCZNEJ I DIAGNOSTYKI MIKROBIOLOGICZNEJ Katedra Biologii i Biotechnologii Farmaceutycznej Wydziału Farmaceutycznego ĆWICZENIA Z MIKROBIOLOGII DLA STUDENTÓW KOSMETOLOGII STUDIA LICENCJACKIE i MAGISTERSKIE POD REDAKCJĄ ELIGII M. SZEWCZYK Łódź 2014 1

AUTORZY: Bożena Dudkiewicz Wioletta Kmieciak Anna Kwaszewska Paweł Lisiecki Maria Sobiś-Glinkowska Jadwiga Szarapińska-Kwaszewska Magdalena Szemraj Eligia M. Szewczyk Piotr Wysocki ISBN: 978-83-64344-05-3 Wydanie drugie zmienione 2

Część I Przedmiot: MIKROBIOLOGIA Studia licencjackie Rozdział 1 Morfologia drobnoustrojów.. 7 Rozdział 2 Pożywki i hodowla drobnoustrojów. 23 Rozdział 3 Techniki posiewu bakterii na podłoża. Otrzymywanie czystych hodowli...33 Rozdział 4 Wymagania wzrostowe bakterii.. 41 Rozdział 5 Wykorzystanie cech biochemicznych bakterii do ich identyfikacji. 49 Rozdział 6 Dezynfekcja, antyseptyka, konserwacja 59 Rozdział 7 Sterylizacja. 75 Rozdział 8 Drobnoustroje bytujące na skórze. 83 Rozdział 9 Liczenie bakterii.. 91 Rozdział 10 Czystość mikrobiologiczna gotowego produktu kosmetycznego.. 101 3

Część II Przedmiot: MIKROBIOLOGIA KLINICZNA Studia magisterskie Rozdział 1 Bakterie bytujące na skórze i błonach śluzowych... 111 Rozdział 2 Bakterie w przewodzie pokarmowym.... 127 Rozdział 3 Inne bakterie bytujące w środowisku człowieka. 147 Rozdział 4 Bakterie wywołujące choroby o swoistym przebiegu, trudne do hodowli lub identyfikacji...155 Rozdział 5 Mikologia....165 Rozdział 6 Podstawy wiedzy o antybiotykach i antybiotykoterapii. 177 4

CZĘŚĆ I PRZEDMIOT: MIKROBIOLOGIA STUDIA LICENCJACKIE 5

6

Rozdział 1 Morfologia drobnoustrojów Cześć teoretyczna Organizmy prokariotyczne i eukariotyczne Do mikroorganizmów (drobnoustrojów), którymi zajmuje się mikrobiologia zaliczamy wirusy, bakterie, archeony, grzyby (bez kapeluszowych), niektóre glony i pierwotniaki. Organizmy te różnią się przynależnością taksonomiczną. Bakterie należą do domeny Bacteria, archeony do domeny Archaea, a grzyby, glony i pierwotniaki do domeny Eukarya. W zależności od budowy mikroorganizmy dzielimy na: prokariotyczne i eukariotyczne. Do organizmów prokariotycznych zaliczamy - bakterie i archeony, a do eukariotycznych - grzyby, glony i pierwotniaki. Te dwie grupy organizmów prezentują dwa odmienne typy budowy komórki. Wirusy nie mogą być zaliczone do żadnej z wymienionych grup, gdyż nie mają struktury ani organizacji komórkowej. Bakterie są mikroorganizmami. Jednak nie wszystkie mikroorganizmy są bakteriami. Choroby u ludzi wywołują zarówno drobnoustroje prokariotyczne (bakterie), jak i eukariotyczne (grzyby i pierwotniaki). Organizmy eukariotyczne mogą być zbudowane z jednej lub wielu komórek. Wszystkie drobnoustroje prokariotyczne są organizmami jednokomórkowymi. Cechą charakterystyczną ich komórek jest brak jądra otoczonego błoną jądrową i jąderka. Ich materiał genetyczny w formie nukleoidu, będącego podwójną nicią DNA styka się bezpośrednio z cytoplazmą. Nie mają one również dobrze wykształconych organelli komórkowych i systemu błon wewnętrznych, takich jak retikulum endoplazmatyczne, czy aparat Golgiego. W komórkach prokariotycznych brak mitochondriów i lizosomów. Prawie wszystkie komórki prokariotyczne (poza bakteriami z rodziny Mycoplasmataceae) mają ścianę komórkową, która zawiera peptydoglikan. Rybosomy prokariotów są mniejsze niż eukariotów. Wykazują mniejszą masę cząsteczkową 7

i niższą stałą sedymentacji. Podstawowe różnice w budowie komórki i replikacji materiału genetycznego pomiędzy komórkami prokariotycznymi i eukariotycznymi przedstawiono w tabeli. Tabela 1. Podstawowe różnice w strukturze komórek prokariotycznych i eukariotycznych. Cecha Komórka prokariotyczna Komórka eukariotyczna DNA wolny zawieszony w cytoplazmie; stanowiący jeden chromosom zawarty w jądrze; otoczonym błoną jądrową Rozmnażanie Wymiana materiału genetycznego tylko bezpłciowe przez podział komórki poprzez koniugację; transdukcję i transformację podział komórek przez mitozę; rozmnażanie płciowe z wytworzeniem gamet. w czasie rozmnażania płciowego Rybosomy 70 S 80 S (cytoplazmatyczne), 70 S (mitochondrialne) Mitochondria brak obecne Układ błon wewnętrznych brak Ściana zawiera peptydoglikan komórkowa Błona brak steroli (poza cytoplazmatyczna mikoplazmami) retikulum endoplazmatyczne; aparat Golgiego u grzybów zawiera chitynę mannany; glukany. obecne sterole Wielkość i kształt komórek Bakterie wykazują znaczną rozpiętość wymiarów. Wymiar większości komórek bakteryjnych wynosi od 1 do 10 µm. Rozmiar najmniejszych 8

wynosi od 0,15 do 0,2 µm, co jest na granicy zdolności rozdzielczej mikroskopu świetlnego. Wymiar największych wynosi od 250 do 600 µm. Przeciętna długość komórki bakteryjnej to 1-5µm, a średnica od 1-2 µm. Komórki bakterii mogą przybierać różne kształty. Bakterie kuliste, nazywane także ziarenkowcami, mogą być ułożone pojedynczo lub tworzyć charakterystyczne układy komórek. Powstanie układów związane jest z płaszczyzną i liczbą podziałów komórek w trakcie rozmnażania oraz brakiem ich rozdziałów po podziale. Wśród bakterii kulistych wyróżniamy następujące układy popodziałowe: dwoinki (Diplococcus) komórki po podziale pozostają po dwie, ziarniaki czworacze (Tetracocus) komórki dzielą się w dwóch płaszczyznach, pakietowce (Sarcina) komórki dzielą się w trzech płaszczyznach do siebie prostopadłych tworząc sześcianki, paciorkowce (Streptococcus) komórki układają się w krótsze lub dłuższe łańcuszki, gronkowce (Staphylococcus) komórki mogą się dzielić w dwóch lub trzech płaszczyznach, tworząc skupiska przypominające kiście winogron. Do bakterii cylindrycznych zaliczamy: pałeczki (Bacterium), laseczki (Bacillus), maczugowce (Corynebacterium), prątki (Mycobacterium), wrzecionowce (Fusobacterium). Niektóre formy bakterii cylindrycznych mogą także tworzyć charakterystyczne układy przestrzenne: dwoinki, łańcuszki, palisady, ugrupowania w kształcie liter V, X, Y. Do bakterii spiralnych zaliczamy: przecinkowce (Vibrio) z sierpowato zagiętą komórką, śrubowce (Spirillum), które tworzą pełną spiralę, krętki (Borrelia, Treponema, Leptospira), różniące się między sobą liczbą skrętów, grubością komórki i wyglądem jej biegunów. Niektóre gatunki bakterii wskazują tendencję do różnorodności morfologicznej i wielokształtności komórek. Ich komórki mogą różnić się wielkością i kształtem. Obok form kulistych mogą występować formy cylindryczne i odwrotnie. Zjawisko to nazywamy polimorfizmem. Komórki grzybów są większe od komórek bakteryjnych (2-40 μm). Wielkość komórek drożdży i grzybów drożdżopodobnych waha się zależnie od gatunku i warunków hodowli, od 2-8 µm średnicy i od 1-8µm długości. 9

Komórki drożdży mogą mieć kształt: kulisty, elipsoidalny, jajowaty, mniej lub bardziej wydłużony. Kształt ich komórek nie może być uważany za element diagnostyczny, ponieważ zależy od wieku komórki i warunków hodowli. Drożdże mogą tworzyć skupiska w postaci łańcuszków powstałych poprzez podział komórek (pączkowanie). Komórki grzybów pleśniowych (nitkowatych) tworzą strzępki. W mikroskopie widoczne są one jako nitkowate, cylindryczne twory, proste lub rozgałęzione. U niektórych gatunków pleśni strzępki są jednokomórkowe, u innych zaś powstają w ich wnętrzu poprzeczne porowate przegrody, dzielące je na szereg komórek. Średnica strzępki waha się od 1 do 1,5 μm. Strzępki mogą być różnej długość, zarówno krótkie jak i dochodzące do kilku metrów. Struktury anatomiczne komórki bakteryjnej Strukturami anatomicznymi występującymi w każdej komórce bakteryjnej są: nukleoid, rybosomy, cytoplazma i błona (membrana) cytoplazmatyczna. Większość bakterii ma ścianę komórkową. Strukturami anatomicznymi spotykanymi u niektórych tylko bakterii są: plazmidy, rzęski, fimbrie, otoczka, glikokaliks, mogą także tworzyć przetrwalniki (endospory), gromadzić w cytoplazmie materiały zapasowe. Liczne bakterie potrafią żyć w formie osiadłych zbiorowisk, które określamy jako biofilm. Nukleoid bakteryjny styka się bezpośrednio z cytoplazmą i zbudowany jest z kolistej i spiralnie skręconej podwójnej nici DNA. Nie jest otoczony błoną jądrową; tworzy pojedynczy chromosom. Nukleoid jest funkcjonalnym odpowiednikiem jądra komórek eukariotycznych. W cytoplazmie wielu komórek występują elementy informacji genetycznej poza chromosomalne zwane plazmidami. Najczęściej są to koliste cząsteczki dwuniciowego DNA, które mogą replikować samodzielnie. Wszystkie geny komórki tworzą jej genotyp. Wyznacza on pojawiające się cechy strukturalne i fizjologiczne komórki, czyli jej fenotyp. 10

Rybosomy bakterii są ośrodkami syntezy białek. W cytoplazmie komórki występują pojedynczo lub w skupiskach zwanych polirybosomami, w których powiązane są łańcuchem informacyjnego RNA (mrna). Rybosomy zbudowane są w 60% z RNA i w 40% z białka i wykazują stałą sedymentacji 70S. Każdy rybosom składa się z dwóch podjednostek 30S i 50S. Cytoplazma to wewnętrzna zawartość komórki bakteryjnej ograniczona błoną cytoplazmatyczną. Podstawowym jej składnikiem jest woda (80%), w której rozpuszczone są białka głównie enzymatyczne, węglowodany, lipidy, sole mineralne i inne niskocząsteczkowe związki organiczne i nieorganiczne. Całość ma charakter roztworu koloidalnego. Błona cytoplazmatyczna otacza cytoplazmę i odgradza ją od otaczającego środowiska. U bakterii, które mają ścianę komórkową, styka się z nią bezpośrednio. Wykazuje ona strukturę dwuwarstwową, zbudowaną z cząsteczek lipidów, w której zanurzone są cząsteczki białek. Pod względem chemicznym w 20-35% zbudowana jest z białek i w 50-70% z lipidów głównie fosfolipidów. Każda cząsteczka fosfolipidu zawiera część polarną zbudowaną z grupy fosforanowej i glicerolu, wykazującą hydrofilowy charakter oraz część niepolarną zbudowaną z kwasów tłuszczowych, wykazującą hydrofobowy charakter. Na zewnątrz w stronę białek ułożone są końce hydrofilowe. Fosfolipidy i białka są ruchliwe względem siebie. Taki sposób organizacji błony cytoplazmatycznej określany jest jako model płynnej mozaiki. Ściana komórkowa bakterii zawiera peptydoglikan (mureina), który styka się bezpośrednio z błoną cytoplazmatyczną. Składa się on z łańcuchów wielocukrowych, które mają charakter polimeru i zbudowane są z powtarzających się jednostek utworzonych z N-acetyloglukozaminy oraz kwasu N-acetylomuraminowego połączonych wiązaniem β-1,4-glikozydowym. Do reszt kwasu N-acetylomuraminowego dołączone są krótkie peptydy, które poprzecznie wiążą ze sobą sąsiednie łańcuchy. Tworzy się w ten sposób charakterystyczne usieciowanie peptydoglikanu. Peptydoglikanu występuje zarówno u bakterii gramdodatnich, jak i gramujemnych. 11

Ściana komórkowa bakterii gramdodatnich jest stosunkowo gruba i względnie jednorodna. Zawiera kilkadziesiąt warstw peptydoglikanu. W ich ścianie występują ponadto kwasy tejchojowe, lipotejchojowe i białka. Ściana bakterii gramujemnych jest cienka i ma budowę wielowarstwową. Jedną do trzech warstw peptydoglikanu pokrywa błona zewnętrzna - dominujący u nich element. Peptydoglikan oddzielony jest od błony zewnętrznej przestrzenią peryplazmatyczną. Błona zewnętrzna stanowi warstwę plastyczną ściany komórkowej; zbudowana jest z fosfolipidów, białek, lipoproteiny Brauna oraz lipopolisacharydu (LPS). Rzęski są elementami budowy niektórych bakterii, zwłaszcza cylindrycznych, które dzięki nim wykazują w środowisku płynnym lub półpłynnym, a nawet w cienkiej warstwie cieczy na podłożu stałym, zdolność poruszania się. Są to nitkowate wyrostki jednym końcem zaczepione w błonie cytoplazmatycznej i łączące się z cytoplazmą. Rzęski mają kształt lekko skręconej spirali i składają się z helikalnie zwiniętych cząsteczek białka zwanego flageliną. W komórkach bakterii występuje najczęściej jeden z trzech typów urzęsienia: monotrichalny jedna rzęska na biegunie, lofotrichalny pojedyncza rzęska lub ich pęczek na obu biegunach, perytrichalny wiele rzęsek dookoła komórki. Ruch krętków warunkuje włókno osiowe, które składa się z pęczka włókienek przypominających budową rzęski. Wyrastają one z bieguna komórki i tworząc włókno osiowe spiralnie ją oplatają. Rzęski można oglądać w mikroskopie elektronowym lub po odpowiednim wybarwieniu w zwykłym mikroskopie świetlnym. Barwienie rzęsek jest jednak trudne i kłopotliwe. Fimbrie są włókienkowatymi powierzchniowymi strukturami niektórych komórek bakteryjnej. Spotykamy je przede wszystkim u bakterii gramujemnych. Są liczne i występują na całej powierzchni komórki. Są cieńsze i krótsze niż rzęski. Widoczne są tylko w mikroskopie elektronowym. Odmianą fimbrii są sztywne wyrostki zawierające kanał dla transportu DNA w procesie koniugacji noszą one nazwę fimbrii płciowych (pili). Jedna komórka wytworzyć może tylko jeden pilus. 12

Przetrwalniki (endospory) tworzą tylko nieliczne bakterie. Do najważniejszych należą laseczki z rodzajów Bacillus i Clostridium. Powstają one w wyniku różnicowania się komórek wegetatywnych jeden przetrwalnik z jednej komórki. Powstawanie przetrwalników nazywamy sporulacją. Cechą charakterystyczną przetrwalników jest stan uśpienia metabolizmu i znacznie większa niż u form wegetatywnych oporność na działanie czynników fizyko-chemicznych. Przetrwalniki zawdzięczają oporność swojej unikatowej budowie: płaszczom zewnętrznemu i wewnętrznemu, z którymi wiąże się oporność na czynniki chemiczne oraz korze, która w dużym stopniu decyduje o oporności na wysoką temperaturę. Wytworzony przetrwalnik zachowuje żywotność, czyli zdolność do kiełkowania z wytworzeniem komórki wegetatywnej przez długi czas. Przetrwalnik może mieć kształt kulisty lub owalny i być umieszczony centralnie, podbiegunowo lub biegunowo. Przetrwalnik może mieć średnicę mniejszą lub większą od wymiaru porzecznego komórki. W przypadku, gdy jest większa, powoduje zniekształcenie komórki, nadając jej charakterystyczny kształt. Przetrwalniki nie barwią się zwykłymi metodami. Można je obserwować w komórkach nie zabarwionych, jako struktury silniej załamujące światło niż reszta komórki bakteryjnej (mikroskop fazowo-kontrastowy). Można je również obserwować w preparatach barwionych np. metodą Grama. W zabarwionej komórce widać wtedy bezbarwny przetrwalnik. Ziarnistości zapasowe gromadzone w cytoplazmie niektórych bakterii, nazywamy też wtrętami cytoplazmatycznymi lub ciałami zapasowymi. Mają one charakter polimerów, które gromadzone są w komórce w czasie jej wzrostu w warunkach nadmiaru substancji odżywczych, zużywane zaś w warunkach głodu - niedoboru związków pokarmowych. Do najczęściej występujących u bakterii ciał zapasowych należy kwas poli-βhydroksymasłowy. Częstym materiałem zapasowym są ziarnistości polimetafosforanowe, które zbudowane są z nieorganicznych fosforanów. Nazywamy je także wolutyną. Bakterie mogą także gromadzić polimery glukozy skrobię, glikogen. Bakterie siarkowe gromadzą w cytoplazmie koloidalną siarkę. Niektóre ziarnistości zapasowe można wykryć w komórce stosując specjalne metody barwienia. 13

Otoczka lub warstwa śluzowa otaczać może pojedyncze komórki lub grupy niektórych bakterii. Mogą one syntetyzować i wydzielać zewnątrzkomórkowe substancje o charakterze polimerów. Jeśli polimer tworzy zbitą warstwę, ściśle otaczającą komórkę i jest mocno z nią związaną nazywamy go otoczką. Polimer tworzący luźną warstwę, swobodnie przylegającą do powierzchni komórki, łatwo tracony i znajdowany w pożywce, w której wzrastają bakterie nazywamy śluzem. Otoczka może obejmować jedną lub dwie komórki. Warstwa śluzowa obejmuje zwykle wiele komórek bakteryjnych. Bakteryjne otoczki i śluzy najczęściej maja charakter polisacharydów. Otoczki niektórych bakterii mają strukturę polisacharydowo-peptydową lub peptydową. Polisacharydowe zewnątrzkomórkowe polimery bakteryjne niekiedy określane są jak glikokaliks. Otoczki trudno się wybarwiają. Można je obserwować w zwykłym mikroskopie świetlnym w preparatach zabarwionych metodą pozytywno-negatywną. Zewnątrzkomórkowy śluz umożliwia bakteriom wspólne bytowanie w naturze, tworzą dzięki niemu biofilm. Jest to zespół wzajemnie komunikujących się komórek osiadłych na określonym podłożu, przylegających do siebie i osłoniętych zewnątrzkomórkowymi polisacharydami. Bakterie mogą tworzyć biofilm w organizmie człowieka na powierzchni błon śluzowych układu oddechowego, pokarmowego, moczowo-płciowego, na powierzchni implantów z metalu i polimerów oraz w środowisku - w naturalnych systemach wodnych, na skałach opłukiwanych wodą czy rurach kanalizacyjnych. Przekształcenie formy bytowania bakterii ze swobodnie żyjących do związanych z biofilmem daje im wiele korzyści, ale stwarza wiele problemów człowiekowi. Jednym z najważniejszych jest większa oporność bakterii w biofilmie, w porównaniu z komórkami z nim nie związanymi, na antybiotyki, chemioterapeutyki i środki dezynfekcyjne. Stwarza to ogromne problemy w leczeniu zakażeń wywoływanych przez bakterie tworzące biofilm. Utrudnia to także eliminację biofilmów bakteryjnych ze środowiska szpitalnego czy linii produkcyjnych, na których wytwarzane są leki czy kosmetyki. 14

Tabela 2. Podstawowe funkcje pełnione przez struktury komórki bakteryjnej. Struktura Pełniona funkcja komórkowa Nukleoid zapis wszystkich potencjalnych możliwości komórki Rybosomy synteza białek Błona transport substancji pokarmowych do komórki, cytoplazmatyczna wydzielanie związków na zewnątrz, udział w procesach fosforylacji oksydatywnej Ściana komórkowa nadaje kształt komórce, chroni komórkę przed uszkodzeniami mechanicznymi i lizą osmotyczną, bariera przepuszczalności dla substancji wielkocząsteczkowych; składniki ściany mogą być induktorami odpowiedzi imunologicznej Otoczka ochrona przed wysychaniem, ochrona przed fagocytozą, czynnik zjadliwości; udział w adhezji bakterii do powierzchni Rzęski ruch Fimbrie udział w adhezji bakterii do powierzchni Fimbrie płciowe udział w procesie koniugacji przekazywania (pili) materiału genetycznego z komórki do komórki Przetrwalniki nadają gatunkom je wytwarzającym wyjątkową oporność na działanie czynników fizykochemicznych Metody Mikroskopowanie Do obserwacji bakterii wykorzystuje się przede wszystkim mikroskop z jasnym polem widzenia, którego zdolność rozdzielcza wynosi 0,2 µm. Zdolność rozdzielcza mikroskopu jest to najmniejsza odległość między 15

dwoma punktami oglądanego obiektu, przy której widziane są one jako dwa oddzielne punkty. Preparaty trwałe barwione należy oglądać przy użyciu obiektywu immersyjnego dającego powiększenie 100 razy i okularów powiększających 5-10 razy przy maksymalnie podniesionym kondensorze. Pozwala to na osiągnięcie największego powiększenia (1000 razy), jakie możemy uzyskać w mikroskopie świetlnym. Powiększenie mikroskopu jest iloczynem powiększenia okularu i powiększenia obiektywu. Obiektyw immersyjny wymaga zastosowania olejku immersyjnego, w którym należy zanurzyć soczewkę obiektywu przed przystąpieniem do oglądania preparatów. Promienie świetlne po przejściu przez szkiełko preparatu, wpadając do warstwy powietrza, ulegają załamaniu i większość z nich omijałaby soczewkę obiektywu immersyjnego. Wykorzystanie olejku immersyjnego niweluje to niekorzystne zjawisko. Po zakończeniu mikroskopowania z obiektywu należy usunąć pozostałości olejku bawełnianą szmatką. W przypadku zaschnięcia olejku na obiektywie, co grozi jego uszkodzeniem, usuwamy go specjalnym zmywaczem. Na jakość obrazu, jaki uzyskujemy w mikroskopie ma także wpływ oświetlenie oglądanego preparatu. Posługując się światłem dziennym, należy zastosować lusterko płaskie, a przy świetle sztucznym - lusterko wklęsłe. Preparaty przyżyciowe tzw. mokre oglądamy najczęściej przy pomocy obiektywów powiększających 40x lub 60x przy obniżonym kondensorze. Preparat w kropli spłaszczonej jest najłatwiejszy do wykonania. Badany materiał zawiesza się w kropli wody umieszczonej na szkiełku podstawowym i przykrywa się szkiełkiem nakrywkowym, które należy opuścić na szkiełko podstawowe ukośnie tak, aby do kropli nie dostały się pęcherzyki powietrza. Jeśli badany materiał jest płynny, przenosi się kroplę wprost na szkiełko. Niekiedy stosuje się barwienie przyżyciowe, co ułatwia obserwację kształtu drobnoustrojów. Przygotowanie rozmazów do preparatów trwałych Rozmazy wykonuje się na odtłuszczonych w płomieniu palnika szkiełkach podstawowych. Jeśli sporządza się rozmaz z bakterii zebranych z hodowli 16

stałej, na szkiełko należy najpierw nanieść 1 oczko ezy wody, a następnie zawiesić w niej bardzo niewielką ilość masy bakteryjnej. Powstała zawiesina powinna lekko opalizować. Nie może być ona zbyt gęsta, gdyż nie uzyskamy wtedy obrazu pojedynczych komórek, co jest warunkiem prawidłowej oceny ich morfologii. Z hodowli płynnej nanosi się ezą na szkiełko 2-3 krople materiału. Każdą kroplę, przed naniesieniem następnej należy wysuszyć. Trzeba też pamiętać o przepaleniu ezy przed powtórnym zanurzeniem jej w hodowli. Przygotowane rozmazy suszy się w powietrzu lub w strumieniu ciepłego powietrza trzymając szkiełko w palcach nad palnikiem. Utrwalenie preparatu osiąga się przez trzykrotne przeciągnięcie spodu szkiełka przez płomień palnika. Można też zalać szkiełko np. alkoholem metylowym i pozostawić do jego całkowitego odparowania. W trakcie wykonywania rozmazu wszystkie czynności należy wykonywać w pobliżu palnika, pamiętając o opalaniu ezy i wylotów probówek w trakcie pobierania materiału. Barwienie preparatów trwałych Bakterie najczęściej oglądamy w preparatach barwionych. Możemy w nich zaobserwować cechy morfologiczne komórek bakteryjnych, takie jak wymiar, kształt, sposób układania się komórek i nieliczne struktury anatomiczne. Barwienie pozwala także na różnicowanie bakterii między sobą i odróżnienie ich od składników otoczenia, w którym się znajdują. Barwniki wykorzystywane w pracowni mikrobiologicznej dzielimy na barwniki kwaśne i barwniki zasadowe. Barwniki kwaśne to sole, w których kationem jest metal, a anion jest jonem barwnym. Do najczęściej wykorzystywanych należą nigrozyna, tusz chiński, kolargol, zieleń malachitowa i eozyna. W barwnikach zasadowych jonem barwnym jest kation. Do najczęściej wykorzystywanych zaliczamy fiolet krystaliczny, fuksynę zasadową, safraninę i błękit metylenowy. Mechanizm barwienia polega na adsorpcji barwnika na powierzchni komórki i na łączeniu się go ze związkami chemicznymi, głównie białkami, wchodzącymi w skład komórki bakteryjnej. W ph hodowli zwykle obojętnym lub lekko zasadowym białka bakteryjne mają ładunek ujemny. Kwasy nukleinowe, 17

z którymi też będą łączyć się barwniki, w tych warunkach również wykazują ujemne naładowanie. Dlatego właśnie do barwienia bakterii używa się barwników zasadowych. Barwniki kwaśne stosowane są do barwienia tła otoczenia, w którym znajdują bakterie. Barwienie komórek bakteryjnych określamy barwieniem pozytywnym. Barwienie tła, otoczenia, w którym znajdują się komórki, określamy barwieniem negatywnym. Metoda Grama Barwienie metodą Grama jest podstawowym barwieniem różnicującym stosowanym w mikrobiologii, dzielącym bakterie na dwie grupy: gramdodatnie i gramujemne. W metodzie tej wykorzystuje się kolejno następujące odczynniki: barwnik podstawowy fenolowy roztwór fioletu krystalicznego (gencjana); zaprawę w postaci roztworu jodu w jodku potasu (płyn Lugola); odbarwiacz - alkohol etylowy; barwnik kontrastowy - alkoholowo-wodny roztwór fuksyny zasadowej (fuksyna 1:10). Wykonanie barwienia - na utrwalony preparat należy nalać świeżo przesączony przez bibułę roztwór gencjany na 2 minuty; - preparat spłukać wodą; - nalać płyn Lugola na 1 minutę; - spłukać wodą; - odbarwiać alkoholem przez 15-20 sekund; - spłukać wodą; - dobarwić przez zalanie na 20 sekund roztworem fuksyny; - spłukać wodą; - osuszyć lekko odciskając w bibule. Wynik barwienia: Bakterie gramdodatnie fioletowogranatowe, gramujemne - różowe. O wyniku barwienia w metodzie Grama decyduje grubość warstwy peptydoglikanu ściany komórkowej. Warstwa peptydoglikanu bakterii 18

gramdodatnich jest grubsza niż u bakterii gramujemnych. Fiolet krystaliczny przedostaje się do wnętrza komórki i łącząc się z jodem, tworzy nierozpuszczalny w wodzie kompleks, który zabarwia ją na kolor fioletowy. Alkohol stosowany jako odbarwiacz, rozpuszcza błonę cytoplazmatyczną bakterii gramdodatnich oraz błonę cytoplazmatyczną i błonę zewnętrzną bakterii gramujemnych. Powoduje on również odwodnienie peptydoglikanu, uszczelniając w ten sposób ścianę komórkową. Gruba warstwa peptydoglikanu bakterii gramdodatnich skutecznie zatrzymuje barwny kompleks jodu z fioletem krystalicznym. W przypadku bakterii gramujemnych kompleks ten wydostaje się na zewnątrz przez cienką warstwę peptydoglikanu. Fuksyna jako barwnik kontrastowy zabarwia komórki bakterii gramujemnych na różowo. W preparatach, w których obok bakterii znajdują się grzyby chorobotwórcze (drożdżopodobne) barwią się one gramdodatnio, ale nie ma to związku z budową ich osłon.. Zadania do wykonania Zadanie 1 Przygotowanie i barwienie prapratów Otrzymujesz hodowlę stałą jednego z drobnoustrojów: Escherichia coli, Bacillus subtilis, Staphylococcus aureus lub Candida albicans w płytce Petriego. Drobnoustroje posiane zostały w sposób pasmowy. - Wykonaj preparat z hodowli jednego z drobnoustrojów i zabarw go metodą Grama. - Nastaw i obejrzy go pod mikroskopem wykorzystując obiektyw immersyjny. Narysuj obraz mikroskopowy. - Określ powiększenie oglądanego preparatu, kształt i sposób układania się komórek. Zwróć uwagę na różnice w wielkości komórek bakteryjnych i komórek drożdży. Czy badany drobnoustrój okazał się gramdodatni czy gramujemny? 19

Powiększenie... gram... 20

Wypełnienie poniższej tabeli pozwoli ci zapamiętać sposób reagowania bakterii na odczynniki wykorzystywane w metodzie Grama. Napisz, jaką barwę przyjmują komórki lub jakie zachodzą reakcje. Używane odczynniki Bakterie gramdodatnie Bakterie gramujemne Fenolowy roztwór fioletu krystalicznego (Gencjana) Roztwór jodu w jodku potasu (płyn Lugola) Alkohol etylowy Alkoholowo-wodny roztwór fuksyny zasadowej (Fuksyna 1:10) 21

22

Rozdział 2 Pożywki i hodowla drobnoustrojów Cześć teoretyczna Czynniki warunkujące wzrost na podłożach Drobnoustroje mogą się rozwijać tylko w takich środowiskach, które zaspokajają ich wymagania pokarmowe. Pobrane składniki są źródłem substancji budulcowych komórki oraz energii potrzebnej dla rozmnażania i wzrostu. Do elementów pokarmowych, bez których wzrost nie jest możliwy należą: węgiel (C), azot (N), fosfor (P), siarka (S), tlen (O), wodór (H). Pierwiastki te wchodzą w skład większości związków organicznych tworzących komórkę i określane są jako pierwiastki budulcowe lub biogenne. Węgiel (C) jest budulcem wszystkich organicznych związków występujących w komórce. Źródłem węgła dla organizmów samożywnych (autotroficznych) może być dwutlenek węgla (CO 2 ). Większość drobnoustrojów pozyskuje jednak ten pierwiastek z jego organicznych połączeń są heterotrofami. Do łatwo przyswajalnych źródeł węgla należą węglowodany (glukoza, laktoza, maltoza, skrobia, glikogen, celuloza). Do stosunkowo łatwo przyswajalnych źródeł węgla należą też kwasy organiczne i alkohole jedno- i wielowodorotlenowe (glicerol, mannitol). Niektóre bakterie wyspecjalizowały się w pozyskiwaniu węgla z jego bardzo specyficznych źródeł metan, etanol, węglowodory aromatyczne czy lignina. Azot (N) wchodzi w skład bakteryjnych białek, aminocukrów, zasad purynowych i pirymidynowych, które tworzą nukleotydy i kwasy nukleinowe. Większość drobnoustrojów wykorzystuje azot z połączeń nieorganicznych w postaci soli amonowych, azotynów, azotanów. Sole amonowe są najlepiej przyswajalnym źródłem azotu. Nieliczne grupy bakterii mogą pobierać azot atmosferyczny. Mikroorganizmy mogą także czerpać azot ze związków organicznych aminokwasy, zasady purynowe i pirymidynowe. 23

Fosfor (P) wchodzi w skład nukleotydów, tworzących kwasy nukleinowe, fosfolipidów i kwasów tejchojowych i lipotejchojowych. Powszechnym źródłem fosforu dla bakterii są nieorganiczne fosforany wykorzystywane przez komórkę do syntezy ATP. Siarka (S) jest składnikiem aminokwasów siarkowych (cystyna, cysteina, metionina), które są elementem składowym wielu białek. Siarka jest przyswajalna przez mikroorganizmy tylko w formie zredukowanej. Najczęściej wykorzystywanym źródłem siarki są siarczany. Niektóre bakterie wykorzystują siarkowodór. Najchętniej wykorzystywanym przez drobnoustroje organicznym źródłem tego pierwiastka jest cysteina. Jego źródłem mogą być także pozostałe aminokwasy siarkowe. Tlen (O) i wodór (H) występują we wszystkich związkach organicznych komórki. Wchodzą także w skład wody, która jest podstawowym rozpuszczalnikiem substancji komórkowych. Pewne grupy bakterii nie są zdolne do wzrostu, jeśli nie dostarczymy im gotowych związków, które nazywamy czynnikami wzrostowymi. Należą do nich witaminy, szczególnie z grupy B, zasady purynowe i pirymidynowe, a także niekiedy cholesterol, hem, hemina, NAD, NADP i nienasycone kwasy tłuszczowe. Drobnoustroje do wzrostu wymagają znacznych ilości wody. W wodzie rozpuszczone są związki odżywcze. Woda jest także środowiskiem, w którym zachodzą procesy metaboliczne, a także jest istotnym źródłem wodoru i tlenu. Większość mikroorganizmów nie wzrasta, jeśli zawartość wody w środowisku jest niższa niż 20%. Zawartość wody w podłożach hodowlanych wynosi 50-90%. Wzrost drobnoustrojów zależny jest także od obecności soli mineralnych. Jony Mg 2+, Fe 2+, Ca 2+, Mn 2+, Zn 2+ są aktywatorami niektórych reakcji enzymatycznych lub grupami prostetycznymi enzymów. Sole mineralne są również czynnikami regulującymi ciśnienie osmotyczne komórki. Podłoża do hodowli drobnoustrojów Pożywki (podłoża) służą do hodowli mikroorganizmów w warunkach laboratoryjnych. Odpowiednie dobranie składu podłoża pozwala na przeniesienie ich z naturalnych środowisk (organizm człowieka, gleba, 24

woda) i namnożenie. Drobnoustroje hodujemy na stałych lub w płynnych pożywkach, które umieszczone zostały w naczyniach hodowlanych (płytki Petriego, kolby Erlenmayera, probówki). Wzrost i rozwój drobnoustrojów na pożywkach, a szczególnie bakterii pozwala na ich wyodrębnienie i zbadanie ich cech morfologicznych, fizjologicznych, biochemicznych i serologicznych. Wiele drobnoustrojów wyrasta na sztucznych podłożach. Nie ma jednak uniwersalnej pożywki umożliwiającej ich wzrost. Pożywki stosowane do namnażania drobnoustrojów powinny: zawierać odpowiednie składniki pokarmowe, mieć odpowiednią wilgotność, mieć odpowiednie ph, mieć odpowiednie ciśnienie osmotyczne, być jałowe. Biorąc pod uwagę ich skład chemiczny, podłoża bakteriologiczne dzielimy na syntetyczne (ściśle zdefiniowane chemiczne) i złożone (kompleksowe). Skład pożywek syntetycznych jest dokładnie zdefiniowany i oparty na syntetycznych związkach organicznych i nieorganicznych. Jest więc zawsze możliwy do dokładnego odtworzenia. Pożywki te znajdują niekiedy zastosowanie w laboratoriach badawczych. Pożywki złożone to podłoża zawierające dodatkowo surowce pochodzenia naturalnego, których skład nie jest dokładnie określony. Są to ekstrakty mięsne, hydrolizaty kwaśne i enzymatyczne białek i inne składniki. Podłoża złożone mają szerokie zastosowanie w laboratoriach diagnostycznych i naukowych. Pożywki dzielimy na proste (podstawowe), stosowane do hodowli drobnoustrojów o małych wymaganiach pokarmowych i wzbogacone, które służą do hodowli drobnoustrojów o dużych wymaganiach odżywczych. Podstawową pożywką płynną dla bakterii jest bulion odżywczy, a stałą agar odżywczy. Bulion odżywczy zawiera wyciąg mięsny, pepton i NaCl. Poprzez dodanie do bulionu odżywczego agaru w stężeniu 1,5-2% otrzymujemy podłoże stałe. Agar to wielocukier otrzymywany z glonów 25

morskich. Silnie chłonie wodę, upłynnia się w temperaturze 100 C, a zestala w temperaturze 45-48 C. W temperaturze 37 C, a więc optymalnej dla wzrostu większości bakterii ma konsystencję stałą. Służy on do zestalenia pożywki. Nie jest wykorzystywany przez bakterie jako składnik odżywczy. Agar odżywczy przygotowywany jest w postaci skosów agarowych, słupków lub płytek agarowych. Grzyby, zarówno drożdżopodobne, jak i nitkowate mają niewielkie wymagania pokarmowe i rosną dobrze na prostych podłożach zawierających pepton i węglowodany. Najczęściej stosowaną pożywką do izolacji lub hodowli grzybów chorobotwórczych jest podłoże Sabouraud (płynne lub stałe), zawierające pepton i 4% glukozy lub maltozy. Podłoża wzbogacone to najczęściej podłoża podstawowe, zawierające dodatkowe składniki odżywcze. Elementami wzbogacającymi pożywki dla bakterii mogą być: węglowodany (np. glukoza), białka zwierzęce (surowica lub krew), hydrolizaty białek (np. kazeiny). Powszechnie wykorzystywanym w badaniach bakteriologicznych podłożem wzbogaconym jest agar z krwią. Zawiera on 5-10% odwłóknionej jałowej krwi (najczęściej baraniej), zmieszanej z roztopionym agarem odżywczym. Po wylaniu na płytkę Petriego otrzymujemy tak zwaną płytkę krwawą. Innym, często wykorzystywanym podłożem wzbogaconym jest agar czekoladowy. Zawiera on agar odżywczy i zdenaturowaną termicznie krew. Po zestaleniu podłoża ma ono barwę czekoladową, stąd jego nazwa. Pożywki mogą zawierać dodatkowe składniki, które wpływają na rozwój hodowanych na nich bakterii. Ze względu na wynikające z ich składu zastosowanie, podłoża możemy podzielić na: namnażające lub namnażająco-wybiórcze, wybiórcze (selektywne), diagnostyczne (różnicujące), transportowe. Pożywki namnażające lub namnażająco-wybiórcze są to najczęściej podłoża płynne, wykorzystywane do namnażania bakterii występujących 26

w niewielkiej ilości w badanej próbce, często jako pojedyncze komórki, w licznej populacji bakterii towarzyszących. Skład pożywki i warunki hodowli umożliwiają namnożenie się tylko bakterii poszukiwanych. Pożywki wybiórcze (selektywne), oprócz składników odżywczych, zawierają składniki wybiórcze, które powodują całkowite zahamowanie wzrostu pewnych gatunków bakterii lub znaczne ograniczenie ich wzrostu. Czynnikami decydującymi o wybiórczości podłoża może być azydek sodu, sole kwasów żółciowych niektóre barwniki i antybiotyki. Są to najczęściej podłoża stałe. Przykładem podłoża wybiórczego jest podłoże Loewensteina-Jensena do hodowli prątków gruźlicy. Wybiórcze podłoża są też stosowane do hodowli grzybów, ze względu na stosunkowo wolny ich wzrost, szczególne do hodowli grzybów nitkowatych. Hodowane są one na podłożach o kwaśnym ph i wysokim ciśnieniu osmotycznym (stężenie sacharozy nawet do 50%). Do podłoża dodaje się również antybiotyki przeciwbakteryjne. Zapobiega to wzrostowi szybciej rosnących bakterii. Pożywki różnicujące (diagnostyczne) pozwalają na zmierzające do identyfikacji, różnicowanie bakterii i niektórych tylko grzybów. Zawierają one substrat diagnostyczny, który może być rozłożony enzymatycznie tylko przez określone gatunki bakterii. Do podłoża często dodawany jest wskaźnik, który na przykład zmienia swoje zabarwienie w zależności od ph pożywki. Dlatego właśnie rozkład substratu manifestuje się zmianą zabarwienia pożywki (podłoża stałe lub podłoża płynne) lub odpowiednim zabarwieniem wyrosłych kolonii (podłoża stałe). Stałe podłoża różnicujące mogą być jednocześnie podłożami wybiórczym dla określonej grupy bakterii i są nazywane wybiórczo-różnicującymi. Przykładem takiej pożywki może być podłoże SS (Salmonella-Shigella) służące do izolacji pałeczek z rodzajów Salmonella i Shigella oraz podłoże Chapmana służące do izolacji gronkowców. Pożywki transportowe nie zawierają składników pokarmowych. Zawierają składniki optymalne dla przeżycia bakterii, w tym roztwory buforowe i sole mineralne. Zadaniem tych pożywek jest utrzymanie żywotności bakterii w próbce, zanim trafi ona do laboratorium mikrobiologicznego. 27

Na rynku dostępne są podłoża o wystandaryzowanym składzie, jałowe i gotowe do użycia, w jednorazowych naczyniach, o określonej dacie przydatności. Zastosowanie gotowych podłoży znacznie skraca czas przygotowań do badań mikrobiologicznych. Można też je przygotowywać samodzielnie, korzystając z pożywek w proszku o wystandaryzowanym składzie i innych chemicznych składników. Własnoręczne komponowanie pożywek wymaga zastosowania procedur i kontroli zapewniających powtarzalność ich składu, pozwalającą na porównywanie wyników hodowli otrzymywanych w różnym czasie i w różnych laboratoriach. Bezpośrednio po przygotowaniu, takie pożywki należy wyjałowić, stanowią bowiem podłoże wzrostu także dla drobnoustrojów licznie obecnych w użytych składnikach i otoczeniu. Sterylizacji tej dokonuje się najczęściej w autoklawie lub w aparacie Kocha. Optymalny czas hodowli W podłożu zawierającym niezbędne do wzrostu składniki, bakterie podwajają swoją masę i replikują swój materiał genetyczny, co w konsekwencji prowadzi do ich podziału. Wzrost populacji bakterii odbywa się zgodnie z postępem geometrycznym (2 0,2 1,2 2, 2 3 2 n ). Czas generacji (okres międzypodziałowy) jest to czas potrzebny do podwojenia liczby komórek w populacji. Szybkość wzrostu bakterii jest cechą charakterystyczną rodzaju (gatunku). Zależy ona także od rodzaju podłoża wzrostowego oraz warunków środowiskowych. W optymalnych warunkach wzrostu w laboratorium okres międzypodziałowy większości bakterii wynosi od 20 do 40 minut, ale może też być znacznie dłuższy - od kilku do kilkunastu godzin. Stąd, czas potrzebny na wyhodowanie bakterii na pożywce tak, aby ich wzrost był widoczny gołym okiem jest różny, ale dla większości bakterii chorobotwórczych wynosi 18-24 godziny. Hodowla grzybów chorobotwórczych wymaga dłuższego czasu. Czas potrzebny na wyhodowanie grzybów drożdżopodobnych wynosi 48-72 godzin, ale grzyby pleśniowe wymagają hodowli przez 1-2 tygodni. 28

Krzywa wzrostu bakterii w hodowli płynnej Bakterie na podłożach płynnych można namnażać w warunkach hodowli okresowej (zwykłej) lub ciągłej. W hodowli okresowej bakterie namnażają się w systemie zamkniętym (probówki, kolbki, butelki, bioreaktory) do momentu wyczerpania substancji odżywczych zawartych w pożywce lub nagromadzenia w niej dużej ilości toksycznych dla bakterii produktów ich metabolizmu. W hodowli ciągłej, którą prowadzi się w specjalnych bioreaktorach, wzrost bakterii można utrzymywać nieskończenie długo. Możliwe jest to na wskutek ciągłego dostarczania do bioreaktora świeżej pożywki z jednoczesnym odprowadzeniem takiej samej objętości pożywki zawierającej wyrosłe bakterie i produkty ich metabolizmu. Objętość płynu hodowlanego w trakcie prowadzenia hodowli utrzymuje się na stałym poziomie. Wzrost bakterii w hodowli okresowej można przedstawić graficznie pod postacią krzywej, którą nazywamy krzywą wzrostu hodowli bakteryjnej. Jest to krzywa w układzie półlogarytmicznym. Opisuje ona zależność logarytmu dziesiętnego liczby żywych komórek bakterii od czasu hodowli i ilustruje wzrost populacji (rycina 1). Obraz krzywej wzrostu dla większości bakterii jest bardzo podobny i można w nim wyróżnić sześć faz. Czas trwania poszczególnych faz wzrostu jest zależny od rodzaju bakterii i warunków hodowli. Poszczególne fazy wzrostu różnią się częstością podziałów komórek i szybkością ich wymierania. Faza pierwsza, nazywana jest fazą zastoju. Bakterie przystosowuj swój metabolizm do nowego środowiska. Wzrasta ilość rybosomów i zawartość RNA. Pojedyncze komórki powiększają swój wymiar i przygotowują się do podziału. Faza druga - przyspieszonego wzrostu. Komórki wykazują intensywny metabolizm. Rozpoczynają się podziały komórkowe. Faza trzecia, nazywana fazą wzrostu wykładniczego (logarytmicznego), jest okresem rzeczywistego rozwoju hodowli. Metabolizm komórek jest bardzo intensywny. Liczba żywych komórek przyrasta w postępie geometrycznym. W populacji prawie wszystkie komórki są żywe. W tej fazie wzrostu bakterie są najbardziej wrażliwe na działanie fizycznych i chemicznych czynników środowiskowych. 29

lg liczby żywych komórek 4 5 5 6 3 1 2 czas hodowli Rycina 1. Krzywa wzrostu bakterii w hodowli okresowej: 1- faza zastoju, 2 faza przyspieszonego wzrostu, 3 faza wzrostu logarytmicznego, 4 faza zwolnionego wzrostu, 5 faza stacjonarna, 6 faza zamierania Faza czwarta jest fazą zwolnionego wzrostu. Rozmiar komórek maleje. Zmniejsza się ilość rybosomów i zawartość RNA. Zwiększa się liczba komórek martwych. Częstość podziałów maleje. Faza piąta, nazywana fazą stacjonarną (równowagi), charakteryzuje się stałą liczbą żywych komórek w hodowli. Z powodu braku substancji pokarmowych komórki zużywają własne materiały zapasowe. Sporadyczne podziały komórkowe rekompensują ubytki komórek spowodowane ich wymieraniem. Faza szósta zamierania. Wzrasta liczba martwych komórek. Zaczynają się procesy autolizy, czyli samorozpuszczania się bakterii pod wpływem własnych enzymów. Zmniejsza się liczba żywych komórek i ogólna biomasa hodowli. Brak podziałów komórkowych. Wzrost na podłożach płynnych i stałych Wygląd wzrostu na podłożach może stanowić ważne kryterium przy identyfikacji bakterii i grzybów chorobotwórczych. 30

Na podłożach płynnych drobnoustroje wyrastają w postaci jednolitego zmętnienia, osadu na dnie naczynia, kożuszka lub błonki na powierzchni płynu. Czasami zmętnieniu towarzyszy delikatny osad lub zagęszczenie przy powierzchni, a na granicy faz (pożywka-powietrze) tworzy się przylegająca do ścianek naczynia warstwa biofilmu. Na podłożach stałych możemy oceniać wygląd kolonii. Istotna może być też ocena obfitości wzrostu lub obserwacja zdolności bakterii do wzrostu mgławicowego. Kolonię definiujemy jako widoczne makroskopowo na powierzchni lub w głębi stałej pożywki skupisko bakterii wyrosłe z jednej jednostki wzrostowej (jtk jednostka tworząca kolonie; cfu ang. colony forming unit). Przez jednostkę wzrostową rozumiemy jedną lub kilka komórek bakteryjnych, które nie rozdzieliły się po podziale (układ popodziałowy), a także przetrwalnik. Umiejętność oceny morfologii kolonii jest bardzo ważna, gdyż w przypadku niektórych bakterii może w istotny sposób ważyć na ich identyfikacji, jest też istotna przy określaniu czystości hodowli. W określonych warunkach środowiska kolonie charakteryzują się stałymi cechami. W przypadku grzybów drożdżopodobnych tworzą się kolonie bardzo podobne do kolonii bakteryjnych, zaś grzyby pleśniowe tworzą kolonie puszyste, często kolorowe, o pomarszczonej strukturze. W przypadku tych ostatnich, zaczątek kolonii mogą stanowić znaczne, wielokomórkowe fragmenty grzybni, ale także zarodniki. Definicja kolonii bakteryjnej nie jest zatem w pełni do tych kolonii przystająca. Metody Opis kolonii Dla celów diagnostycznych opisuje się kolonie wyrosłe na takich podłożach, które nie powodują ich nienaturalnego zabarwienia w wyniku oddziaływania zawartych w nich wskaźników czy barwników. Niekiedy jednak istotny także bywa opis ich wyglądu na podłożach diagnostycznych. 31

Należy opisywać kolonie oddalone od pozostałych tak, aby ich wzrost nie był ograniczony przez zbyt liczne sąsiedztwo. W opisie kolonii należy wziąć pod uwagę następujące jej elementy: wielkość - średnica (mm); kształt - okrągła, owalna, nitkowata, rozgałęziona nieregularna,.. ; brzeg - równy, postrzępiony, falisty, ząbkowany,... ; powierzchnię - gładka, lśniąca, matowa, pomarszczona,... ; wzniesienie (profil kolonii) - płaska, wypukła, pępkowata, grudkowata, wrastająca w podłoże,... ; przejrzystość - przezroczysta, opalizująca, mętna,... ; barwę - biała, kremowa, szara, czerwona,... ; otoczenie kolonii - zabarwienie, zmiana cech podłoża. Zadania do wykonania Zadanie 1. Charakterystyka kolonii bakteryjnej - Obejrzyj płytkę z podłożem agarowym, na której wyrosły pojedyncze kolonie. Powstały one w wyniku rozmnożenia się komórek bakterii i przetrwalników, które opadły na podłoże (sedymentowały) z powietrza. - Wybierz jedną kolonię i opisz ją uwzględniając cechy opisane wyżej. 32

Rozdział 3 Techniki posiewu bakterii na podłoża. Otrzymywanie czystych hodowli. Część teoretyczna Populację bakterii rosnącą na podłożu stałym lub płynnym nazywamy hodowlą. Hodowlę składającą się z różnych gatunków bakterii nazywamy hodowlą mieszaną. Czystą hodowlą nazywamy hodowlę bakterii jednego rodzaju. Szczep to populacja drobnoustrojów w obrębie gatunku wyróżniająca się określonymi cechami. Szczepy wyprowadzone z pojedynczej komórki nazywamy klonami. W większości przypadków, przy badaniu bakteriologicznym wody, żywności, wymazów pobranych od pacjentów, zanieczyszczonych leków czy kosmetyków, spodziewamy się w próbce więcej niż jednego rodzaju drobnoustrojów. Ocena drobnoustrojów występujących w badanym materiale może nastąpić dopiero po ich wyodrębnieniu i uzyskaniu czystych hodowli. Do tego celu wykorzystuje się metodę posiewu redukcyjnego. Taki typ posiewu pozwala na ocenę morfologii wyrosłych kolonii. Zakłada się, choć jest to pewne uproszczenie, że każda z nich powstaje z jednej jednostki wzrostowej (często jednej komórki). A zatem, ile typów kolonii, tyle rodzajów bakterii w hodowli. Ponieważ morfologia kolonii różnych gatunków czy nawet rodzajów może być zbliżona, czasem pomocnym w odróżnieniu kolonii jest posiew redukcyjny na płytkę z podłożem diagnostycznym. Izolacja pojedynczej kolonii z posiewu redukcyjnego prowadzi zwykle do uzyskania hodowli czystej. Metody Posiew bakterii na podłoża Materiał zawierający bakterie posiewa się na podłoża stałe (skos agarowy, płytka agarowa) lub płynne (bulion) ezą, pipetą lub wacikiem. Posiewając 33

ezą, należy ją wyjałowić wyżarzając w płomieniu palnika przed i po wykonaniu posiewu. Używamy też wyjałowionych, odpowiednio opakowanych pipet szklanych, końcówek do pipet automatycznych lub wacików. W trakcie posiewania bakterii na podłoża płynne należy także pamiętać o opalaniu wylotu naczyń w płomieniu palnika po otwarciu i przed ich zamknięciem. Ma to zapobiec zakażeniu pożywki drobnoustrojami z zewnątrz i zapewnić bezpieczeństwo osobie pracującej. Każda próbka pobierana do posiewu z hodowli lub zawiesiny bakterii, którą zakażamy świeże podłoże stanowi inokulum. Posiew na podłoże płynne ezą polega na uwolnieniu z niej materiału stanowiącego inokulum do pożywki przez pocieranie o ścianki naczynia (probówki lub kolbki). Przy posiewaniu do naczyń zawierających większe objętości pożywki konieczne jest zachowanie odpowiednich proporcji między wielkością inokulum a objętością podłoża. Zwykle stosuje się zasadę, że inokulum stanowi 5% końcowej objętości pożywki. Posiewu możemy dokonywać pipetą wprowadzając np. 5 ml hodowli stanowiącej inokulum do 95 ml pożywki. Posiewu na podłoża stałe na płytkach Petriego dokonuje w różny sposób zależnie od celu takiego posiewu. Ważnym, często stosowanym przy izolacji bakterii sposobem, prowadzącym do otrzymania pojedynczych kolonii jest posiew redukcyjny. Posiew ten wykonujemy tak, aby w kolejnych sektorach na powierzchni płytki znajdowało się coraz mniej bakterii. Sposób wykonania takiego posiewu przedstawia rycina 1. W poszczególnych etapach raz naniesiony materiał zostaje rozprowadzany na kolejne sektory płytki. Każdorazowe opalanie ezy przed rozsianiem bakterii w kolejnych strefach powoduje redukcję ich liczby do takiej ilości, przy której w ostatniej strefie uzyskany zostanie wzrost w postaci pojedynczych kolonii. Czasem wykonuje się posiew redukcyjny z materiału z wacika. Oznacza to, że pierwsza jego strefa posiana jest wacikiem, którym np. pobrano materiał kliniczny wymaz, a następne już w klasyczny sposób ezą z zachowaniem zasady jej przepalania w trakcie posiewu. 34

Można wykonać na płytce także posiew pasmowy lub punktowy, który pozwala umieścić na płytce wiele próbek, których cechy chcemy porównywać. Polega on na naniesieniu na płytkę inokulum z ezy w postaci pasma różnej długości. Czasem istnieje potrzeba zasiania całej powierzchni płytki i uzyskania wzrostu w postaci jednolitej murawy. Takiego posiewu można dokonać wacikiem (tzw. wymazówką). Inokulum stanowi zwykle próbka pobrana z podłoża płynnego (nadmiar płynu z wacika należy w trakcie pobierania odcisnąć o ścianki naczynia), którą rozprowadza się równomiernie na powierzchni podłoża w płytce. Czasem zawiesina stanowiąca inokulum w tej metodzie posiewu jest w odpowiedni sposób standaryzowana. Inokulum o określonej objętości, zwykle 0,1 ml można także rozprowadzić głaszczką lub odpowiednio zagiętą ezą. Rycina 1. Posiew redukcyjny A B C D 35

Przy posiewie na podłoże stałe w postaci skosu agarowego w probówce należy wprowadzić ezę z inokulum do dna probówki i rozprowadzić na powierzchni skosu. Prowadzi się w tym celu ezę zygzakowatym ruchem od ścianki do ścianki próbówki, przesuwając ją ku wylotowi naczynia. W zależności od rodzaju posiewanego materiału i wykorzystywanego podłoża spotykamy się z następującymi możliwościami przesiewania bakterii. Na pożywkę płynną (pipeta, eza) Z pożywki płynnej Na skos agarowy (eza) Na płytkę agarową (eza, wacik, pipeta) Na pożywkę płynną (eza) Z pożywki stałej (płytka agarowa, skos agarowy) Na skos (eza) Na płytkę agarową (eza) Otrzymywanie czystych hodowli Postępowanie zmierzające do otrzymania czystych hodowli z nieznanych próbek sprowadza się do następujących kroków. 36

Badany materiał posiewa się redukcyjnie na odpowiednio dobrane podłoże. Po inkubacji (czasem wydłużonej nawet do 5 dni) w temperaturze optymalnej dla oczekiwanych drobnoustrojów ocenia się morfologię wyrosłych kolonii. Obecność różnic w ich wyglądzie wskazuje, że mamy do czynienia z hodowlą mieszaną. Izoluje się wtedy pojedyncze kolonie i posiewa się je redukcyjnie na oddzielne płytki. Otrzymana w wyniku takiego posiewu hodowla może być uznana za czystą, jeśli kolonie posiadają jednakową morfologię. Namnożona (na skosie, w pożywce płynnej lub w inny sposób) pojedyncza kolonia z takiej płytki może być materiałem dla wykonywania prób i posiewów identyfikacyjnych, czy służących do określenia właściwości fizjologicznych, biochemicznych i antygenowych bakterii. Szybką, choć czasem zawodną metodą sprawdzenia czystości hodowli płynnej jest ocena morfologii komórek tworzących ją bakterii w preparatach barwionych metodą Grama. Zadania do wykonania Zadanie 1. Otrzymywanie czystej hodowli - Materiał z otrzymanej hodowli płynnej posiej redukcyjnie na płytkę agarową. - Podpisz płytkę, inkubuj w cieplarce (37 C, 24 godziny). - Obejrzyj posiew zwracając szczególną uwagę na pojedyncze kolonie w trzeciej i czwartej strefie posiewu. - Opisz każdy z widocznych rodzajów kolonii. - Wykonaj z każdej z nich preparat barwiony metodą Grama i uzupełnij opis kolonii o morfologię komórki. - Każdą z wybranych kolonii posiej redukcyjnie na nową płytkę. Opisz płytkę, inkubuj w cieplarce (37 C, 24 godziny). 37