RZECZPOSPOLITA POLSKA (12) OPIS PATENTOWY (19) PL (11) 176000 (13) B1 Urząd Patentowy Rzeczypospolitej Polskiej (21) Numer zgłoszenia: 306106 (22) Data zgłoszenia: 01.12.1994 (51) IntCl6: A61L 27/00 (54)Sposób wytwarzania biokompatybilnej membrany hydrożelowej przeznaczonej do konstruowania hybrydowych sztucznych organów (43) Zgłoszenie ogłoszono: 10.06.1996 BUP 12/96 (73) Uprawniony z patentu: Politechnika Łódzka, Łódź, PL (72) Twórca wynalazku: Krystyna Burczak, Łódź, PL (45) O udzieleniu patentu ogłoszono: 31.03.1999 WUP 03/99 (74) Pełnomocnik: Bałczewski Zbigniew W., Politechnika Łódzka PL 176000 B1 (57) 1. Sposób wytwarzania biokompatybilnej membrany hydrożelowej, przeznaczonej do konstruowania hybrydowych sztucznych organów z hydrożelu polimerowego, który osadza się na siatce wzmacniającej, znamienny tym, że sporządza się 2-9% roztwór polialkoholu winylowego, korzystnie polialkoholu winylowego o stopniu polimeryzacji 1500-8000 i zawartości grup octanowych 0,1-3% molowych, w wodzie destylowanej, roztwór ten miesza się następnie ze środkiem sieciującym, korzystnie w postaci aldehydu glutarowego, stosowanym w ilości 0,007-0,037 mola/mol merów polimeru oraz z kwaśnym katalizatorem stosowanym w ilości 40-80μl/g roztworu polimeru, powstałą mieszaninę odpowietrza się i nanosi na siatkę poliamidową lub poliestrową o grubości monofilamentu 40-115μm i powierzchni otwartej równej 25-57%, uprzednio poddaną odtłuszczeniu alkoholem metylowym, wysuszoną oraz poddaną obróbce plazmą powietrza lub plazmą argonową, po czym siatkę z naniesionym na nią polimerem pozostawia się nad lustrem parującej ciepłej wody w zamkniętym naczyniu w temperaturze pokojowej lub podwyższonej w czasie od kilkunastu do 24 godzin, oczyszcza z resztek nie przereagowanego aldehydu oraz poddaje sterylizacji termicznej lub radiacyjnej.
Sposób wytwarzania biokompatybilnej membrany hydrożelowej, przeznaczonej do konstruowania hybrydowych sztucznych organów Zastrzeżenia patentowe 1. Sposób wytwarzania biokompatybilnej membrany hydrożelowej, przeznaczonej do konstruowania hybrydowych sztucznych organów z hydrożelu polimerowego, który osadza się na siatce wzmacniającej, znamienny tym, że sporządza się 2-9% roztwór polialkoholu winylowego, korzystnie polialkoholu winylowego o stopniu polimeryzacji 1500-8000 i zawartości grup octanowych 0,1-3% molowych, w wodzie destylowanej, roztwór ten miesza się następnie ze środkiem sieciującym, korzystnie w postaci aldehydu glutarowego, stosowanym w ilości 0,007-0,037 mola/mol merów polimeru oraz z kwaśnym katalizatorem stosowanym w ilości 40-80μl/g roztworu polimeru, powstałą mieszaninę odpowietrza się i nanosi na siatkę poliamidową lub poliestrową o grubości monofilamentu 40-115μm i powierzchni otwartej równej 25-57%, uprzednio poddaną odtłuszczeniu alkoholem metylowym, wysuszoną oraz poddaną obróbce plazmą powietrza, lub plazmą argonową, po czym siatkę z naniesionym na nią polimerem pozostawia się nad lustrem parującej ciepłej wody w zamkniętym naczyniu w temperaturze pokojowej lub podwyższonej w czasie od kilkunastu do 24 godzin, oczyszcza z resztek nie przereagowanego aldehydu oraz poddaje sterylizacji termicznej lub radiacyjnej. 2. Sposób według zastrz. 1. znamienny tym, że roztwór polialkoholu winylowego w wodzie destylowanej sporządza się na drodze ogrzewania mieszaniny polimeru i wody pod ciśnieniem atmosferycznym w czasie 6-9 godzin bądź w autoklawie pod ciśnieniem 1520 hpa w temperaturze 120 C w czasie 1-2 godzin. 3. Sposób według zastrz. 1. znamienny tym, że proces odpowietrzania mieszaniny roztworu polialkoholu winylowego, środka sieciującego i kwaśnego katalizatora prowadzi się korzystnie w wirówce z chłodzeniem, obracającej się z szybkością 3000-5000 obrotów/minutę w czasie 2-5 minut. 4. Sposób według zastrz. 1. znamienny tym, że proces obróbki siatki poliamidowej lub poliestrowej plazmą powietrza prowadzi się w czasie 15-45 s przy napięciu między elektrodami 15-20 kv. 5. Sposób według zastrz. 1. znamienny tym, że siatkę poliamidową lub poliestrową odtłuszcza się na drodze 72-godzinnej ekstrakcji alkoholem metylowym. * * * Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarzania biokompatybilnej membrany hydrożelowej przeznaczonej do konstruowania hybrydowych sztucznych organów, zwłaszcza implantowanych do otrzewnej. Hybrydowy sztuczny organ jest to system terapeutyczny, który stanowią żywe komórki, na przykład wyspy trzustkowe Langerhansa bądź hepatocyty lub organelle, na przykład mikrosomy wątroby, opłaszczone biokompatybilną, półprzepuszczalną membraną polimerową. Hybrydowe sztuczne organy implantuje się do organizmu biorcy w celu wspomożenia lub zastąpienia upośledzonego lub całkowicie uszkodzonego organu metabolitycznego. Zadaniem biokompatybilnej, półprzepuszczalnej membrany polimerowej, na przykład biokompatybilnej membrany hydrożelowej, jest zabezpieczenie tkanki dawcy prze uszkodzeniem mechanicznym, zabezpieczenie przed dostępem lub maksymalne ograniczenie dostępu do opłaszczonej tkanki składników humoralnych i komórkowych układu immunologicznego biorcy, przy czym membrana musi równocześnie umożliwiać swobodny transport cząstek nutrientów, elektrolitów, tlenu i bioaktywnych produktów sekrecyjnych opłaszczonych komórek dawcy.
176 000 3 Biokompatybilność membrany oznacza, iż przy jej użyciu występuje tylko minimalne oddziaływanie wzajemne między nią i otaczającymi implant tkankami, co eliminuje niebezpieczeństwo wystąpienia chronicznego stanu zapalnego oraz nadmiernego otorbienia implantowanego hybrydowego sztucznego organu przez tkankę kolagenową powstającą w procesie gojenia rany. Znane są membrany do sporządzania hybrydowych sztucznych organów, wykonane z nie usieciowanych polimerów hydrofobowych takich, jak polichlorek winylu, kopolimer polichlorku winylu i poliakrylonitrylu, poliakrylonitryl, poliwęglan, zawierających dodatek substancji hydrofilowych. Membrany te implantowane do organizmu biorcy wykazują krótkotrwałą biokompatybilność, w wyniku czego ich pory po krótkim czasie ulegają zapchaniu proteinami adsorbowanymi z organizmu biorcy. Membrany te są opisane, między innymi, w czasopiśmie Diabetes, 41, 1503-1510(1992). Znane są także, z czasopisma Journal of Biomedical Material Research, 17, 855-864 (1983), membrany hydrożelowe z makroporowatego hydrożelu polimetakrylanu dihydroksyetylu, osadzonego na wzmacniającej siatce poliamidowej. Membrany te nie wykazują cechy biokompatybilności. Sposób wytwarzania biokompatybilnej membrany żelowej, przeznaczonej do konstruowania hybrydowych sztucznych organów, z hydrożelu polimerowego, który osadza się na siatce wzmacniającej, według wynalazku polega na tym, że sporządza się 2-9% roztwór polialkoholu winylowego, korzystnie polialkoholu winylowego o stopniu polimeryzacji 1500-8000 i zawartości grup octanowych 0,1-3% molowych, w wodzie destylowanej, roztwór ten miesza się następnie ze środkiem sieciującym, korzystnie w postaci aldehydu glutarowego, stosowanym w ilości 0,007-0,037 mola/mol merów polimeru oraz z kwaśnym katalizatorem stosowanym w ilości 40-80μl/g roztworu polimeru, powstałą mieszaninę odpowietrza się i nanosi na siatkę poliamidową lub poliestrową o grubości monofilamentu 40-115μm i powierzchni otwartej równej 25-57%, uprzednio poddaną odtłuszczeniu alkoholem metylowym, wysuszoną oraz poddaną obróbce plazmą powietrza lub plazmą argonową, po czym siatkę z naniesionym na nią polimerem pozostawia się nad lustrem parującej ciepłej wody w zamkniętym naczyniu w temperaturze pokojowej lub podwyższonej w czasie od kilkunastu do 24 godzin, oczyszcza z resztek nie przereagowanego aldehydu oraz poddaje sterylizacji termicznej lub radiacyjnej. Roztwór polialkoholu winylowego w wodzie destylowanej sporządza się na drodze ogrzewania mieszaniny polimeru i wody pod ciśnieniem atmosferycznym w czasie 6-9 godzin bądź w autoklawie pod ciśnieniem 1520 hpa w temperaturze 120 C w czasie 1-2 godzin. Proces odpowietrzania mieszaniny roztworu polialkoholu winylowego, środka sieciującego i katalizatora prowadzi się korzystnie w wirówce z chłodzeniem, obracającej się z szybkością 3000-5000 obrotów/minutę w czasie 2-5 minut. Proces obróbki siatki poliamidowej lub poliestrowej plazmą powietrza prowadzi się w czasie 15-45 s przy napięciu między elektrodami 15-20 kv. Siatkę odtłuszcza się na drodze 72-godzinnej ekstrakcji alkoholem metylowym. Membrana hydrożelowa otrzymana sposobem według wynalazku jest miękka, nie drażni tkanek, jest nietoksyczna, nie ulga biodegradacji w organizmie. Hydrożel polialkoholu winylowego usieciowanego chemicznie na siatce zawiera znaczne ilości wody, która stanowi medium do transportu czyli dyfuzji ważnych dla odżywienia, metabolizmu i sekrecji opłaszczonych membraną żywych komórek. Sposobem według wynalazku otrzymuje się sieć hydrożelu polimerowego o wielkości oczek zapewniającej skuteczne zabezpieczenie opłaszczonej membraną tkanki przed dostępem składników humoralnych i komórkowych układu immunologicznego biorcy. Membrana otrzymana sposobem według wynalazku może być przechowywana w czasie 2-3 miesięcy w 1% wodnym roztworze nadtlenku wodoru, 0,05% roztworze wodnym azydku sodowego bądź w 70% wodnym roztworze alkoholu etylowego, przy czym przed użyciem do opłaszczania żywych komórek musi być odmyta od użytych do jej przechowywania chemikaliów w jałowym buforze fosforanowym o ph = 7,4. Sposób według wynalazku ilustrują bliżej podane niżej przykłady. Przykład I. 1g polialkoholu winylowego o stopniu polimeryzacji około 1350 zmieszano z 9 g wody destylowanej i następnie poddano ogrzewaniu w autoklawie pod ciśnienie 1520 hpa
4 176 000 w temperaturze 120 C w czasie 1,5 godziny, 3 g otrzymanego w ten sposób roztworu polialkoholu winylowego zmieszano z 20μl 25% roztworu wodnego aldehydu glutarowego jako środka sieciującego oraz z 180 μl 0,5 N kwasu solnego jako katalizatora reakcji sieciowania, po czym mieszaninę tę poddano wirowaniu w czasie 2 minut w wirówce laboratoryjnej obracającej się z prędkością 4000 obrotów/minutę w celu usunięcia z niej pęcherzyków powietrza. Równocześnie siateczkę poliamidową o grubości 40 μm i przestrzeni wolnej równej 36% poddano 72-godzinnej ekstrakcji alkoholem metylowym, wysuszono o poddano obustronnie obróbce plazmą powietrza w czasie 20 s przy napięciu między elektrodami 15 kv. Tak przygotowaną siateczkę zanurzono w przygotowanej uprzednio mieszaninie roztworu polimeru, środka sieciującego i kwaśnego katalizatora i pozostawiono na kilka minut do obcieknięcia, po czym siatkę z naniesionym na niej polimerem umieszczono w zamkniętym szklanym naczyniu nad lustrem parującej wody destylowanej o temperaturze 37 C na czas 24 godzin. Otrzymaną membranę hydrożelową oczyszczono z resztek nie przereagowanego aldehydu glutarowego i poddano sterylizacji termicznej w wyniku 2-godzinnego gotowania jej w wodzie destylowanej. Stwierdzono, iż zawartość wody w hydrożelu spęcznionej w wodzie o temperaturze 37 C membrany wynosiła 91,4%. Grubość spęcznionej membrany wynosiła 0,12 mm, zaś współczynnik dyfuzji glukozy przez sporządzoną membranę wynosiła 3,5 x 10-6 cm2/s w temperaturze 37 C. Przykład II. Postępując jak w przykładzie I sporządzono 8% roztwór polialkoholu winylowego o stopniu polimeryzacji 1350, w wodzie destylowanej. 3 g tego roztworu zmieszano następnie z 15 μl 25% roztworu wodnego aldehydu glutarowego oraz ze 180 μl 0,5 N kwasu solnego i poddano odpowietrzeniu jak w przykładzie I. Równocześnie postępując jak w przykładzie I przygotowano siateczkę poliamidową o grubości monofilamentu 40μm i przestrzeni wolnej równej 36%. Dalej postępowano także jak w przykładzie I. Otrzymaną membranę hydrożelową oczyszczono z resztek nie przereagowanego aldehydu glutarowego oraz sterylizowano termicznie postępując jak w przykładzie I. Stwierdzono, iż zawartość wody w hydrożelu spęcznionej w wodzie membrany wynosiła 91,2%, zaś grubość wytworzonej membrany wynosiła 0,14 mm. Współczynnik dyfuzji glukozy przez sporządzoną membranę wynosił 3,9 x 10-6 cm2/s w temperaturze 37 C. Przykład III. Postępując jak w przykładzie I przygotowano 6% roztwór polialkoholu winylowego o stopniu polimeryzacji 1350, w wodzie destylowanej. Następnie sporządzono mieszaninę 3 g przygotowanego roztworu polimeru ze 180 μl 0,5 N kwasu solnego oraz z 10 μl 25% roztworu wodnego aldehydu glutarowego, którą odpowietrzono jak w przykładzie I. Równocześnie postępując jak w przykładzie I przygotowano siateczkę poliamidową o grubości monofilamentu 40μm i przestrzeni równej 36%. Dalej postępowano także jak w przykładzie I. Otrzymaną membranę hydrożelową oczyszczono z resztek nie przereagowanego aldehydu glutarowego oraz poddano sterylizacji radiacyjnej dawkami promieniowania jonizującego Co: 1,5,2,0 i 2,5 Mrad. Zawartość wody w hydrożelu membrany spęcznionej w wodzie o temperaturze 37 C wynosiła około 94,5%. W trakcie sterylizacji radiacyjnej następowało dodatkowe radiacyjne sieciowanie polialkoholu winylowego, w wyniku którego nastąpiło obniżenie zawartości wody w hydrożelu odpowiednio: - po zastosowaniu dawki 1,5 Mrad do 90,9%, - po zastosowaniu dawki 2,0 Mrad do 89,9%, - po zastosowaniu dawki 2,5 Mrad do 89,0%. Przykład IV. 3 g 3% roztworu polialkoholu winylowego o masie cząsteczkowej - około 2,5 x 105, w wodzie destylowanej, przygotowanego jak w przykładzie I, zmieszano z 10 μl 25% roztworu wodnego aldehydu glutarowego i 120 μl 0,5 kwasu solnego i poddano odpowietrzeniu jak w przykładzie I. Równocześnie postępując jak w przykładzie I przygotowano siateczkę poliestrową o grubości monofilamentu 60μm i powierzchni wolnej równej 57%. Dalej postępowano jak w przykładzie I. Otrzymaną membranę hydrożelową oczyszczono z resztek nie przereagowanego aldehydu glutarowego i poddano sterylizacji termicznej na drodze 2-godzinnego gotowania jej w wodzie destylowanej. Zawartość wody w hydrożelu membrany spęcznionej w wodzie o temperaturze 37 C wynosiła 95,5%. Zbadano współczynniki dyfuzji glukozy, insuliny, albuminy i immunoglobuliny G przenikających wytworzoną membranę w
176 000 5 temperaturze 37 C. Współczynniki te wynosiły odpowiednio: 3,0 x 10-6 cm2/s, około 6,0 x 10-7 cm2/s, około 2,0 x 10"7 cm2/s i około 5,5 x 10-8 cm2/s. Membrany otrzymane w przykładach I-IV implantowano do otrzewnej zwierząt laboratoryjnych na okres 4 miesięcy. Oceny makroskopowe implantów, po usunięciu ich z otrzewnej wykazały, iż były one otorbione w stopniu minimalnym. Grubość tkanki kolagenowej wynosiła około 0,5 mm, przy czym tkanka ta nie przylegała do membran hydrożelowych i powierzchnie membran pozostały czyste.
176 000 Departament Wydawnictw UP RP. Nakład 90 egz. Cena 2,00 zł