Enzymy DNA-zależne, katalizujące syntezę DNA wykazują aktywność polimerazy zawsze w kierunku 5 3 wykazują aktywność polimerazy zawsze wobec jednoniciowej cząsteczki DNA do utworzenia kompleksu z ssdna wymagają krótkiego startera DNA lub RNA z końcem 3 -OH - do syntezy DNA (wydłużania startera) wymagają obecności nukleotydów (deoksynukleozydo-trójfosforanów) Mogą wykazywać aktywność egzonukleaz (degradacja nukleotydów) zarówno wobec cząsteczek dwu-jak i jednoniciowego DNA oraz RNA Polimeraza I (polimeraza Kornberga) Nagroda Nobla z dziedziny fizjologii i medycyny (1959) za odkrycie mechanizmu syntezy biologicznej DNA i RNA otrzymywana z E. coli (gen pola) Artur Kornberg Pojedynczy polipeptyd o masie cząsteczkowej 109kD w komórce pełni funkcje naprawcze DNA polimerazy (stopień syntezy:16-20 nukleotydów/sek; długość amplifikowanego fragmentu na nici DNA: 3-200 nukleotydów), wymagania: ph 7.4; jony Mg 2+ ; temp: 22-25 o C egzonukleazy 5 3 dwuniciowego DNA lub kompleksów DNA- RNA nick translation- aktywność egzonukleazy 5 3 Po nacięciu podwójnej helisy przez DNazęI powstaje znacznik - wolny koniec 3 OH, od którego polimeraza I rozpoczyna syntezę łańcucha, wykazując jednocześnie aktywność egzonukleazy 5 3 - w ten sposób zastępuje starą nić nicią nową aktywność egzonukleazy 3 5 1
Polimeraza IK (fragment Klenowa) otrzymywana z rekombinowanej E. coli (gen polb) lub po proteolizie (subtilizyną) polimerazy Hans Klenow Kornberga pojedynczy polipeptyd o masie cząsteczkowej 75kD w komórce pełni funkcje naprawcze DNA polimerazy (stopień syntezy:40 nukleotydów/sek; długość amplifikowanego fragmentu na nici DNA: 1500 nukleotydów), wymagania: ph 7.4; jony Mg 2+ ; temp: 22-37 o C Wypełnianie dwuniciowego DNA z 5 - jednoniciowym lepkim końcem synteza drugiej nici ssdna aktywność polimerazy 5 3 Polimeraza III (typ Taq; typ Pwo) otrzymywana z bakterii E. coli zrekombinowanych plazmidem z genem polc Thermus aquaticus lub Pyrococcus wosei polipeptyd heteromultimeryczny o masie cząsteczkowej ok 900kD w komórce pełni funkcje replikacji DNA polimerazy (stopień syntezy:250-1000 nukleotydów/sek; długość amplifikowanego fragmentu na nici DNA: >500 000 nukleotydów), odłącza się od matrycy po zakończeniu replikacji wymagania: ph 7.4; jony Mg 2+ ; temp: 37-94 o C (opt. 80 o C)* egzonukleazy 5 3 jedno- i dwuniciowego DNA lub hybryd DNA-RNA 2
aktywność polimerazy zawsze w kierunku 5 3 POLIMERAZY DNA- FAGI Polimeraza faga T4 otrzymywana ze zrekombinowanej E. coli lub zakażonych bakteriofagiem T4 polipeptyd o masie cząsteczkowej 114kDa DNA polimerazy wymagania: ph 8.0-9.0; jony Mg 2+ ; temp: 37 o C degraduje nukleotydy od końca 3 tworząc lepkie końce POLIMERAZY DNA- FAGI Polimeraza faga T7 otrzymywana z E. coli zakażonych bakteriofagiem T7 dimer o masie cząsteczkowej 96kDa (84kDa- produkt genu 5 faga T7, 12kDa tioredoksyna E.colibiałko zapobiegające zbyt wczesnej dysocjacji podczas replikacji) DNA polimerazy (stopień syntezy: 300 nukleotydów/sek) wymagania: ph 8.0-9.0; jony Mg 2+ ; temp: 37 o C używana zamiennie z fragmentem Klenowa 3
POLIMERAZY DNA- WIRUSY Odwrotna transkryptaza otrzymywana ze zrekombinowanej E. coli (gen AMVpol) lub od kurcząt infekowanych wirusem AMV (Avian Myeloblastosis Virus) dimer o masie cząsteczkowej ok 156kD DNA/RNA wymagania: jony Mg 2+ ; temp: 42 o C egzonukleazy 5 3 oraz 3 5 specyficznej dla RNA w hybrydzie DNA-RNA POLIMERAZY DNA- EUCARYOTA Polimeraza α polipeptyd heteromultimeryczny złożony z 4 podjednostek: 180kDa aktywność polimerazy DNA 55kDa i 48kDa tworzą razem prymazę 68kDa spaja kompleks DNA polimerazy- syntetyzuje startery złożone z 10 nukleotydów RNA (prymaza) i 20-30 nukleotydów DNA (polimeraza) NIE MA AKTYWNOŚCI EGZONUKLEAZY POLIMERAZY DNA- EUCARYOTA Polimerazy δ i ε główne polimerazy replikacyjne każda złożona z 4 podjednostek: δ- (p125, p66, p50, p12) ε- (p256, p80, p23, p22) DNA polimerazy Polimeraza δ odpowiada za replikację nici opóźnionej Polimeraza ε odpowiada za replikację nici wiodącej 4
ELONGACJA DNA Rodzaj polimerazy DNA Organizmy Liczba podjednostek Aktywność Funkcja Polimeraza I Procaryota 1 3-5 oraz 5-3 Replikacja (usuwanie starterów RNA) i naprawa DNA Polimeraza II Procaryota 1 3-5 Naprawa DNA Polimeraza III Procaryota ok 10 3-5 Replikacja DNA* Polimeraza α Eucaryota 4 - Synteza starterów RNA Polimeraza β Eucaryota 1 - Naprawa DNA Polimeraza γ Eucaryota 2 3-5 Replikacja mtdna Polimeraza δ Eucaryota 2 lub 3 3-5 Replikacja DNA* Polimeraza ε Eucaryota min 1 3-5 Replikacja DNA (?) 5