Ocena limfocytów T regulatorowych, cytotoksycznych i komórek dendrytycznych u chorych na raka jajnika przed oraz po menopauzie

Ginekol Pol. 2016, 87, 11-18 P R A C E O R Y G I N A L N E Ocena limfocytów T regulatorowych, cytotoksycznych i komórek dendrytycznych u chorych na raka jajnika przed oraz po menopauzie Assessment of regulatory T cells, cytotoxic lymphocytes and dendritic cells in ovarian cancer patients before and after menopause I Katedra i Klinika Ginekologii Onkologicznej i Ginekologii, Uniwersytet Medyczny w Lublinie, Polska Streszczenie Cel: Celem pracy była ocena odsetka limfocytów T regulatorowych (Treg), cytotoksycznych CD8 + oraz mieloidalnych (M) i plazmocytoidalnych (P) komórek dendrytycznych (DC) we krwi obwodowej i płynie otrzewnowym (PO) chorych na raka jajnika z uwzględnieniem statusu menopauzalnego pacjentek. Materiały i metody: Materiał badany stanowiła krew obwodowa (n=74) oraz PO (n=57) uzyskane od chorych na raka jajnika. Odsetek Treg, MDC, PDC oraz limfocytów cytotoksycznych oceniono metodą cytometrii przepływowej. Analizy statystycznej dokonano przy użyciu programu Statistica 10.0 PL. Wyniki: Odsetek Treg był istotnie wyższy w PO chorych przed menopauzą w porównaniu do chorych po menopauzie, natomiast we krwi obwodowej nie różnił się istotnie. U kobiet przed i po menopauzie odsetek Treg w PO był istotnie wyższy niż we krwi obwodowej. Odsetek MDC, PDC oraz limfocytów cytotoksycznych nie różnił się istotnie u chorych przed i po menopauzie, zarówno we krwi obwodowej jak i w PO. Odsetek MDC, PDC i limfocytów CD8+ był istotnie wyższy w PO w porównaniu do krwi obwodowej. Wnioski: Przeprowadzone badania wskazują na akumulację Treg w płynie otrzewnowym chorych na raka jajnika, zarówno przed jak i po menopauzie. Szczególnie zjawisko to jest nasilone u chorych przed menopauzą. Status menopauzalny chorych na raka jajnika nie wpływa na zmiany w odsetkach MDC, PDC i limfocytów cytotoksycznych we krwi obwodowej i w PO. Słowa kluczowe: rak jajnika / menopauza / limfocyty T regulatorowe / / komórki dendrytyczne / limfocyty cytotoksyczne / Autor do korespondencji: Justyna A. Surówka I Katedra i Klinika Ginekologii Onkologicznej i Ginekologii Uniwersytetu Medycznego w Lublinie 20-081 Lublin, ul. Staszica 16, Polska tel. 81 53278 47, fax 81 5320608 e-mail: justyna.surowka@gmail.com Otrzymano: 22.10.2015 Zaakceptowano do druku: 13.11.2015 Nr 1/2016 Polskie Towarzystwo Ginekologiczne 11

P R A C E O R Y G I N A L N E Ginekol Pol. 2016, 87, 11-18 Abstract Objectives: The aim of the study was to assess the percentage of regulatory T cells (Treg), myeloid (M) and plasmacytoid (P) dendritic cells (DC), and cytotoxic CD8 + T cells in the peripheral blood (PB) and peritoneal fluid (PF) of patients with ovarian cancer with reference to their menopausal status. Materials and methods: Peripheral blood (n=74) and peritoneal fluid (n=57) samples were obtained from ovarian cancer patients. The percentage of Treg, MDC, PDC, and cytotoxic T cells was assessed using flow cytometry. Statistical analysis was performed using Statistica 10.0 PL software. Results: The percentage of Treg was significantly higher in PF of the premenopausal patients, but no such difference was observed in the peripheral blood. In the post- and pre-menopausal patients, the percentage of Treg was significantly higher in the peritoneal fluid than in PB. The percentage of MDC, PDC, and cytotoxic T cells, both in PB and PF, did not differ significantly between the pre-and post-menopausal subjects. The percentage of MDC, PDC, and cytotoxic T cells was higher in PF than PB. Conclusions: The results of the study show an accumulation of Treg in the peritoneal fluid of the pre- and post-menopausal ovarian cancer patients. A higher percentage of Treg has been observed especially in the premenopausal women. The menopausal status of women with ovarian cancer does not influence the percentage of MDC, PDC, and cytotoxic T cells in both, the peripheral blood and the peritoneal fluid. Key words: ovarian cancer / menopause / regulatory T cells / dendritic cells / / cytotoxic T cells / Wstęp 5 5 5 5 5 - - - - - - - - - - - - - - 12 Polskie Towarzystwo Ginekologiczne Nr 1/2016

Ginekol Pol. 2016, 87, 11-18 P R A C E O R Y G I N A L N E - Cel Materiał i metody - - - Metodyka - - - - - - - - Tabela I. Charakterystyka grupy badanej. Charakterystyka grupy badanej Liczba pacjentek (%) I 8 (10,8%) II 17 (23,0%) III 34 (45,9%) IV 15 (20,3%) Shiha[3] I 31 (41,9%) II 43 (58,1%) 20 (27,0%) po menopauzie 54 (73,0%) >10 25 (46,3%) <10 29 (53,7%) Mediana (Min-Max) Wiek 55 (22-85) 2 (0-6) - - Oznaczanie odsetka limfocytów T regulatorowych we - - - - - Nr 1/2016 Polskie Towarzystwo Ginekologiczne 13

P R A C E O R Y G I N A L N E Ginekol Pol. 2016, 87, 11-18 Tabela II. Odsetek MDC, PDC oraz limfocytów cytotoksycznych we krwi obwodowej i PO u chorych na raka jajnika. Mediana Min Max Mediana Min Max p % MDC 0,19 0,03 0,71 0,87 0,04 3,34 <0,0001 % PDC 0,19 0,02 0,88 1,19 0,07 6,85 <0,0001 MDC/PDC 0,85 0,05 5,60 0,68 0,06 8,30 >0,05 % CD8 32,03 0,95 72,66 35,05 1,01 87,84 0,02 - Analiza cytometryczna MDC, PDC i limfocytów cytotoksycznych CD8 + - - - - - - - Analiza statystyczna - - - Tabela III. Zależność pomiędzy Treg a MDC i PDC we krwi obwodowej i PO chorych na raka jajnika. Treg i MDC 0,07 0,63 Treg i PDC 0,01 0,91 Treg i MDC/PDC -0,01 0,90 Treg i MDC 0,09 0,60 Treg i PDC 0,22 0,19 Treg i MDC/PDC -0,07 0,68 Wyniki R 1. Ocena komórek Treg we krwi obwodowej i PO oraz porównanie populacji komórek Treg u chorych przed oraz po menopauzie. 2. Porównanie odsetka Treg we krwi obwodowej i PO u chorych przed oraz po menopauzie. p 14 Polskie Towarzystwo Ginekologiczne Nr 1/2016

Ginekol Pol. 2016, 87, 11-18 P R A C E O R Y G I N A L N E Wykres 1. Porównanie odsetka Treg we krwi obwodowej u chorych przed i po menopauzie. Wykres 4. Porównanie odsetka komórek Treg we krwi obwodowej oraz PO u chorych po menopauzie. Wykres 2. Porównanie odsetka Treg w PO u chorych przed i po menopauzie. Wykres 5. Stosunek odsetków limfocytów cytotoksycznych CD8 + do Treg krwi obwodowej w zależności od statusu menopauzalnego pacjentek. Wykres 3. Porównanie odsetka komórek Treg we krwi obwodowej oraz PO u chorych przed menopauzą. Wykres 6. Stosunek limfocytów cytotoksycznych CD8 + do Treg PO w zależności od statusu menopauzalnego pacjentek. Nr 1/2016 Polskie Towarzystwo Ginekologiczne 15

P R A C E O R Y G I N A L N E Ginekol Pol. 2016, 87, 11-18 3. Ocena odsetka MDC, PDC oraz limfocytów cytotoksycznych we krwi obwodowej i PO u chorych na raka jajnika. - 4. Stosunek limfocytów cytotoksycznych CD8 + do Treg a status menopauzalny chorych na raka jajnika. obwodowej i PO chorych na raka jajnika. - kiem Treg, MDC, PDC oraz stosunkiem CD8 + do Treg we krwi obwodowej i PO chorych na raka jajnika. - Dyskusja - - - - - - - - - - - - - - - - - 16 Polskie Towarzystwo Ginekologiczne Nr 1/2016

Ginekol Pol. 2016, 87, 11-18 P R A C E O R Y G I N A L N E - - - - - - - - - - - - Wnioski - - Oświadczenie autorów: 1. Justyna A. Surówka współautor koncepcji i założeń pracy, izolacja analizowanych populacji komórek, akwizycja i i analiza cytometryczna, przygotowanie manuskryptu i piśmiennictwa autor zgłaszający i odpowiedzialny za manuskrypt. 2. Iwona Wertel współautor koncepcji i założeń pracy, analiza wyników, akceptacja ostatecznego kształtu manuskryptu. 3. Grzegorz Polak udział w procesie leczniczym, zbieranie danych klinicznych pacjentek. 4. Karolina Okła wykonanie obliczeń statystycznych 5. Monika Bilska udział w procesie leczniczym, zbieranie materiału do badań. 6. Jan Kotarski udział w procesie leczniczym, akceptacja ostatecznego kształtu manuskryptu Źródło finansowania: Praca finansowana z grantu NN 407160940. Konflikt interesów: Autorzy nie zgłaszają konfliktu interesów oraz nie otrzymali żadnego wynagrodzenia związanego z powstawaniem pracy. Piśmiennictwo 1. Didkowska J, Wojciechowska U. Zachorowania i zgony na nowotwory złośliwe w Polsce. Krajowy Rejestr Nowotworów, Centrum Onkologii - Instytut im. Marii Skłodowskiej - Curie. http:// onkologia.org.pl/nowotwory-jajnika-c56/ (access: 2015.06.25). 2. Prat J. Staging classification for cancer of the ovary, fallopian tube, and peritoneum. Int J Gynecol Obstet. 2014, 124, 1-5. 3. Shih I-M, Kurman RJ. Ovarian Tumorigenesis: A Proposed Model Based on Morphological and Molecular Genetic Analysis. Am J Pathol. 2004, 16 (5), 1511-1518. 4. Latha TS, Panati K, Gowd DS, [et al.]. Ovarian cancer biology and immunotherapy. Int Rev Immunol. 2014, 33 (5), 428-440. Nr 1/2016 Polskie Towarzystwo Ginekologiczne 17

P R A C E O R Y G I N A L N E Ginekol Pol. 2016, 87, 11-18 5. Sakaguchi S, Sakaguchi N, Asano N, [et al.]. Immunologic self-tolerance maintained by activated T cells expressing IL- 2 receptor -chains (CD25): breakdown of a single mechanism of self- tolerance causes various autoimmune diseases. J Immunol. 1995, 155 (3), 1151-1164. 6. Ziegler SF1, Buckner JH. Influence of FOXP3 on CD4+CD25+ regulatory T cells. Expert Rev Clin Immunol. 2006, 2 (4), 639-647. 7. Curiel TJ. Regulatory T-cell development: is Foxp3 the decider? Nat Med. 2007, 13 (3), 250-253. 8. Yagi H, Nomura T, Nakamura K, [et al.]. Crucial role of FOXP3 in the development and function of human CD25+CD4+ regulatory T cells. Int Immunol. 2004, 16 (11), 1643-1656. 9. Trzonkowski P, Szmit E, Myśliwska J, [et al.]. CD4+CD25+ T regulatory cells inhibit cytotoxic activity of T CD8+ and NK lymphocytes in the direct cell-to-cell interaction. Clin Immunol. 2004, 112 (3), 258-267. 10. Bluestone JA, Tang Q. How do CD4+CD25+ regulatory T cells control autoimmunity? Curr Opin Immunol. 2005, 17 (6), 638-642. 11. Dietl J, Engel JB, Wischhusen J. The role of regulatory T cells in ovarian cancer. Int J Gynecol Cancer. 2007, 17 (4), 764-770. 12. Ladoire S, Martin F, Ghiringhelli F. Prognostic role of FOXP3+ regulatory T cells infiltrating human carcinomas: the paradox of colorectal cancer. Cancer Immunol Immunother. 2011, 60 (7), 909-918. 13. Curiel TJ, Coukos G, Zou L, [et al.]. Specific recruitment of regulatory T cells in ovarian carcinoma fosters immune privilege and predicts reduced survival. Nat Med. 2004, 10, 942-949. 14. Trzonkowski P, Szmit E, Myśliwska J, [et al.]. CD4+CD25+ T regulatory cells inhibit cytotoxic activity of CTL and NK cells in humans impact of immunosenescence. Clinical Immunology. 2006, 119, 307-316. 15. Mjösberg J, Svensson J, Johansson E, [et al.]. Systemic reduction of functionally suppressive CD4dimCD25highFoxp3+ Tregs in human second trimester pregnancy is induced by progesterone and 17beta-estradiol. J Immunol. 2009, 183 (1), 759-769. 16. Vacchelli E, Vitale I, Eggermont A, [et al.]. Trial watch: Dendritic cell-based interventions for cancer therapy. Oncoimmunology. 2013, 2 (10), e25771. Epub 2013 Jul 29. 17. Robinson SP, Patterson S, English N, [et al.]. Human peripheral blood contains two distinct lineages of dendritic cells. Eur J Immunol. 1999, 29, 1743-1751. 18. Kryczek I, Banerjee M, Cheng P, [et al.]. Phenotype, distribution, generation, and functional and clinical relevance of Th17 cells in the human tumor environments. Blood. 2009, 114 (6), 1141-1149. 19. Merad M, Sathe P, Helft J, [et al.]. The dendritic cell lineage: ontogeny and function of dendritic cells and their subsets in the steady state and the inflamed setting. Annu Rev Immunol. 2013, 31, 563-604. 20. Labidi-Galy SI, Sisirak V, Meeus P, [et al.]. Quantitative and functional alterations of plasmacytoid dendritic cells contribute to immune tolerance in ovarian cancer. Cancer Res. 2011, 15, 5423-5434. 21. Wei S, Kryczek I, Zou L, [et al.]. Plasmacytoid dendritic cells induce CD8 +regulatory T cells in human ovarian carcinoma. Cancer Res. 2005, 15, 5020-5026. 22. Wertel I, Polak G, Tarkowski R, [et al.]. SDF-1alpha/CXCL12 and dendritic cells in ovarian cancer microenvironment. Ginekol Pol. 2011, 82 (6), 421-425. 23. Straub RH. The complex role of estrogens in inflammation. Endocr Rev. 2007, 28 (5), 521-574. 24. Sawan S, Burt DJ, Stern PL, [et al.]. Circulating regulatory T cells in endometrial cancer: a role for age and menopausal status. Immunol Invest. 2011, 40 (1), 62-75. 25. Xiong YH, Yuan Z, He L. Effects of estrogen on CD4(+) CD25(+) regulatory T cell in peripheral blood during pregnancy. Asian Pac J Trop Med. 2013, 6 (9), 748-752. 26. Arruvito L, Sanz M, Banham AH, [et al.]. Expansion of CD4+CD25+and FOXP3+ regulatory T cells during the follicular phase of the menstrual cycle: implications for human reproduction. J Immunol. 2007, 178 (4), 2572-2578. 27. Hampras SS, Nesline M, Wallace PK, [et al.]. Predictors of immunosuppressive regulatory T lymphocytes in healthy women. J Cancer Epidemiol. 2012, 2012:191090. Epub 2012 Aug 26. 28. Prieto GA, Rosenstein Y. Oestradiol potentiates the suppressive function of human CD4 CD25 regulatory T cells by promoting their proliferation. Immunology. 2006, 118 (1), 58-65. 29. Chen FC, Oskay-Ozcelik G, Bühling KJ, [et al.]. Prognostic value of serum and ascites levels of estradiol, FSH, LH and prolactin in ovarian cancer. Anticancer Res. 2009, 29 (5), 1575-1578. 30. Zhang L, Conejo-Garcia JR, Katsaros D, [et al.]. Intratumoral T cells, recurrence, and survival in epithelial ovarian cancer. N Engl J Med. 2003, 348 (3), 203-213. 31. Sato E, Olson SH, Ahn J, [et al.]. Intraepithelial CD8+ tumor-infiltrating lymphocytes and a high CD8+/regulatory T cell ratio are associated with favorable prognosis in ovarian cancer. Proc Natl Acad Sci U S A. 2005, 102 (51), 18538-18543. 32. Preston CC, Maurer MJ, Oberg AL, [et al.]. The ratios of CD8+ T cells to CD4+CD25+ FOXP3+ and FOXP3- T cells correlate with poor clinical outcome in human serous ovarian cancer. PLoS One. 2013, 8 (11), e80063. 33. Conrad C, Gregorio J, Wang YH, [et al.]. Plasmacytoid dendritic cells promote immunosuppression in ovarian cancer via ICOS costimulation of Foxp3(+) T-regulatory cells. Cancer Res. 2012, 72 (20), 5240-5249. 34. Kyurkchiev D, Ivanova-Todorova E, Hayrabedyan S, [et al.]. Female sex steroid hormones modify some regulatory properties of monocyte-derived dendritic cells. Am J Reprod Immunol. 2007, 58 (5), 425-433. 35. Uemura Y, Liu TY, Narita Y, [et al.]. 17 Beta-estradiol (E2) plus tumor necrosis factor-alpha induces a distorted maturation of human monocyte-derived dendritic cells and promotes their capacity to initiate T-helper 2 responses. Hum Immunol. 2008, 69 (3), 149-157. K O M U N I K A T Warsztaty Onkologii Ginekologicznej Postępowanie w nawrotach nowotworów narządów płciowych 03-04 czerwca 2016 Poznań, Hotel Park, ul. Baraniaka 77 T E M A T Y K A SESJA I Nawroty stanów przedrakowych i wczesnych postaci nowotworów narządów płciowych CIN nawroty rozpoznanie i leczenie Testy HPV a CIN, AIS i rak szyjki macicy FIGO IA Nawroty rozrostów i raka endometrium u młodych kobiet leczonych zachowawczo; czy nadal jest możliwe postępowanie zachowawcze? Nawroty raka szyjki macicy i nowotworów jajnika po postępowaniu zachowującym płodność Sesja II Rozpoznawanie nawrotów Objawy kliniczne nawrotu, nawroty markerowe, jak i kiedy rozpocząć leczenie? CT, NMR, 18F-FDG PET/CT w rozpoznawaniu nawrotów Czy ultrasonografia jest przydatna w rozpoznawaniu nawrotów? Organizatorzy: Polskie Towarzystwo Ginekologiczne, Sekcja Ginekologii Onkologicznej Klinika Onkologii Ginekologicznej UM w Poznaniu Komitet naukowy Prof. Ewa Nowak-Markwitz Prof. Marek Spaczyński Rejestracja i współpraca z firmami: www.onkologia-online.pl/konferencje/poznan Kazimierz Ciekański tel. 534 694 964 w godz. 9-16 Sesja III Leczenie nawrotów nowotworów narządów płciowych kiedy zakończyć terapię? Czy i kiedy jest możliwe postępowanie chirurgiczne w nawrotach raka szyjki macicy? Nawroty raka endometrium kiedy operować? Nawrotowy rak szyjki macicy i endometrium kiedy można leczyć radioterapią? Terapia systemowa i celowana w nawrotowym i przetrwałym raku szyjki macicy Nawrotowy platynowrażliwy rak jajnika i późne nawroty jak leczyć? Nawrotowy platynooporny rak jajnika, czym i jak długo leczyć? Nawroty mięsaków macicy i jajnika leczenie chirurgiczne i systemowe Terapia hormonalna nawrotów nowotwór narządów płciowych Nawroty ziarniszczaka i nowotworów germinalnych jak monitorować nawrót, postępowanie Krwawienia z zaawansowanych nowotworów, czy radiologia inwazyjna może być pomocna? Leczenie przeciwbólowe nieuleczalnie chorych Partner medialny: Online Hematologia 18 Polskie Towarzystwo Ginekologiczne Nr 1/2016